--PAGE_BREAK--4 г печени животного гомогенизируют на льду в 20 мл буфера. Гомогенат центрифугируют 10 мин при 1000 об/мин для удаления пленок. В пробирку отбирают 200 мкл центрифугированного гомогената и добавляют 3,8 мл буфера. Перешивают и помещают на лед, в дальнейшем используя для определения активности и количества белка в гомогенате.
Все дальнейшие операции производят на льду. Измеряют объем оставшегося центрифугированного гомогената. Добавляют кристаллический сульфат аммония до достижения 10 % концентрации и тщательно перемешивают. Выпавший осадок отделяют центрифугированием при 4000 об/мин в течении 10 мин. Надосадочную жидкость осторожно сливают и измеряют объем. К осадку добавляют исходный буфер до полного растворения, затем разводят этим же буфером в 10 раз и помещают на лед, в дальнейшем используя для определения активности и количества белка.
К надосадочной жидкости добавляют кристаллический сульфат аммония до достижения 20 % концентрации, центрифугируют, отделяют осадок, растворяют его в буфере, разводят в два раза буфером и помещают на лед. Повторяют операцию по высаливанию, добавляя сульфат аммония к надосадочной жидкости до достижения 60 % концентрации. Осадок, отделенный центрифугированием ресуспендируют в исходном буфере и разбавляют в десять раз. Во всех фракциях, гомогенате и конечном супернатанте определяют активность по следующей схеме.
Опыт ( – )
Контроль ( + )
150 мкл буфера
140 мкл буфера
50 мкл гомогената
50 мкл гомогената
–
10 мкл раствора ФМСФ (добавляют специально откалиброванной стеклянной пипеткой)
Преинкубация 8 минут при 37°С
50 мкл раствора DNS-FLR
50 мкл раствора DNS-FLR
Инкубация 30 мин при 37°С
50 мкл 1 н HCl
50 мкл 1 н HCl
После окончания реакции в каждую пробирку добавляют 1,5 мл хлороформа и интенсивно встряхивают штатив в течение 60 сек. Затем пробы центрифугируют 10 мин при 1000 об/мин для разделения фаз. Отбирают хлороформную фракцию и измеряют величину флюоресценции на флюориметре (λех=360 нм, λем=530 нм). Количество белка в пробе определяют методом Лоури. Активность ФМСФ-КН рассчитывают как разность флюоресценции проб, не содержащих ФМСФ, и проб, содержащих ФМСФ, и выражают в нМ продукта, образовавшегося за 1 мин инкубации на 1 мг белка. Формула для расчета активности:
а =
Содержание отчета
1. Определите степень очистки ФМСФ-КП.
Фракция
Гомогенат
10%
20%
30%
40%
50%
60%
Активность
Степень
очистки
100%
Работа 8. Частичная очистка ФМСФ-КП из печени крыс методом гель-фильтрации
Оборудование и реактивы: пробирки, автоматическая пипетка, гомогенизатор, стеклянные стаканы на 50 и 100 мл, колонка для гель-фильтрации высотой 15 см, шприц, набор для определения фенилметилсульфонилфторид-ингибируемой карбоксипептидазы (ФМСФ‑КП): откалиброванная по спирту пипетка на 10 мкл, пипетка на 2 мл, стеклянная воронка, цилиндр на 250 мл с притертой пробкой, гомогенизатор, 50 мМ натрий-ацетатный буфер с 50 мМ NaCl (рН 5,6), спиртовой раствор ФМСФ, раствор дансил-фен-лей-арг (DNS-FLR), 1 н HCl, хлороформ, сефадекс G‑75, 0,9% раствор NaCl, набор растворов для определения белка по Лоури, печень животного.
Сефадекс G-75 суспендируют в 5-10 кратном объеме дистиллированной воды и оставляют для набухания на 3 часа. Затем перемешивают до однородной массы, дают отстояться. После оседания основной массы геля осторожно декантируют надосадочную жидкость с неосевшими обломками гранул. Суспендирование и последующую декантацию (отмучивание) повторяют 3-4 раза.
Колонку закрепляют в вертикальном положении, закрывают нижний конец пробкой со вставленным фитингом, помещают в основание колонки кружок фильтровальной бумаги, размер которого должен точно соответствовать внутреннему размеру колонки. Заливают примерно 2 мл раствора NaCl, дают заполниться фитингу и через воронку по стенке заливают густую суспензию геля. Открывают зажим колонки и дают раствору свободно вытекать, следя за тем, чтобы колонка не обсохла. Суспензию геля прибавляют до тех пор, пока его высота в колонке не достигнет нужного уровня, верхняя поверхность геля (стартовая зона) должна быть строго горизонтальной. Затем на поверхность геля помещают кружок фильтровальной бумаги. Колонку промывают (уравновешивают) 1 объемом NаС1.
100 мг печени животного гомогенизируют на льду в 10 мл буфера. Гомогенат центрифугируют 10 мин при 1000 об/мин для удаления пленок. Центрифугированный гомогенат помещают на лед, в дальнейшем используя для определения активности и количества белка в гомогенате.
Открывают зажим колонки и сливают столб раствора NaCl, находящийся над сефадексом. Когда нижний мениск раствора коснется поверхности кружка фильтровальной бумаги, на колонку осторожно с помощью шприца наносят 1 мл центрифугированного гомогената. Дают образцу впитаться и затем быстро смывают остатки образца со стенок колонки тем же объёмом растворителя, снова дают впитаться. Затем заполняют колонку раствором NaCl, закрывают верхней пробкой с иглой и подсоединяют фитингом к сосуду, из которого поступает элюирующий раствор. С момента нанесения образца на колонку собирают 10 фракций объемом 1 мл.
Во 2, 4, 5, 6, 7, 9 фракциях и в разведенном гомогенате измеряют активность ФМСФ-КП по следующей схеме.
Опыт ( – )
Контроль ( + )
150 мкл буфера
140 мкл буфера
50 мкл гомогената
50 мкл гомогената
–
10 мкл раствора ФМСФ (добавляют специально откалиброванной стеклянной пипеткой)
Преинкубация 8 минут при 37°С
50 мкл раствора DNS-FLR
50 мкл раствора DNS-FLR
Инкубация 30 мин при 37°С
50 мкл 1 н HCl
50 мкл 1 н HCl
После окончания реакции в каждую пробирку добавляют 1,5 мл хлороформа и интенсивно встряхивают штатив в течение 60 сек. Затем пробы центрифугируют 10 мин при 1000 об/мин для разделения фаз. Отбирают хлороформную фракцию и измеряют величину флюоресценции на флюориметре (λех=360 нм, λем=530 нм). Количество белка в пробе определяют по Лоури.
Активность ФМСФ-КН рассчитывают как разность флюоресценции проб не содержащих ФМСФ и проб, содержащих ФМСФ, и выражают в нМ продукта, образовавшегося за 1 мин инкубации на 1 мг белка. Формула для расчета активности:
а =
Содержание отчета
1. Определите степень очистки ФМСФ-КП.
Фракция
Гомогенат
2
4
5
6
7
9
Активность
Степень
очистки
100%
Работа 9. Частичная очистка ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы из печени методом ионообменной хроматографии (на карбоксиметилцеллюлозе)
Оборудование и реактивы: пробирки; автоматическая пипетка; гомогенизатор; стеклянные стаканы на 50 и 100 мл; колонка для ионно-обменной хроматографии высотой 15 см; шприц; набор для определения фенилметилсульфонилфторид-ингибируемой карбоксипептидазы (ФМСФ‑КП): откалиброванная по спирту пипетка на 10 мкл, пипетка на 2 мл, стеклянная воронка, цилиндр на 250 мл с притертой пробкой; гомогенизатор; 50 мМ натрий-ацетатный буфер с 50 мМ NaCl (рН 5,6); 0,05 М натрий-ацетатный буфер, содержащий 0,05 М NaCl, pH 3,5 и 6,0; спиртовой раствор ФМСФ, раствор дансил-фен-лей-арг (DNS-FLR); 1 н HCl, хлороформ; карбоксиметилцеллюлоза (КМЦ); набор растворов для определения белка по Лоури, печень животного.
Колонку для хроматографии закрепляют в вертикальном положении, закрывают нижний конец пробкой со вставленным фитингом, помещают в основание колонки кружок фильтровальной бумаги, размер которого должен точно соответствовать внутреннему размеру колонки. Заливают примерно 2 мл раствора 0,05 М натрий-ацетатного буфера, содержащего 0,05 М NaCl, pH 3,5, дают заполниться фитингу и через воронку по стенке заливают густую суспензию КМЦ. Открывают зажим колонки и дают раствору свободно вытекать, следя за тем, чтобы колонка не обсохла. Суспензию КМЦ прибавляют до тех пор, пока его высота в колонке не достигнет нужного уровня, верхняя поверхность геля (стартовая зона) должна быть строго горизонтальной. Затем на поверхность геля помещают кружок фильтровальной бумаги. Колонку промывают (уравновешивают) 20 мл 0,05 М натрий-ацетатного буфера, содержащего 0,05 М NaCl, pH 3,5.
2 г печени животного гомогенизируют на льду в 10 мл буфера. Гомогенат центрифугируют 10 мин при 1000 об/мин для удаления пленок. В пробирку отбирают 200 мкл центрифугированного гомогената и добавляют 3,8 мл буфера. Перешивают и помещают на лед, в дальнейшем используя для определения активности и количества белка в гомогенате.
Открывают зажим колонки и сливают столбик буфера, находящийся над гелем. Когда нижний мениск раствора коснется поверхности кружка фильтровальной бумаги, на колонку осторожно с помощью шприца наносят 1 мл центрифугированного гомогената. Дают образцу впитаться и затем быстро смывают остатки образца со стенок колонки тем же объёмом растворителя. Затем заполняют колонку раствором 0,05 М натрий-ацетатного буфера, содержащего 0,05 М NaCl, pH 3,5, закрывают верхней пробкой с иглой и подсоединяют фитингом к сосуду, из которого поступает элюирующий раствор. Для удаления несвязавшихся белков колонку промывают 50 мл буфера.
Затем фермент элюируют 0,05 М натрий-ацетатным буфером с 0,05 М NaCl, pH 6,0. С момента нанесения этого буфера на колонку собирают 10 фракций объемом 3 мл.
Во 2, 3, 4, 5, 6, 9 фракциях и в разведенном гомогенате измеряют активность ФМСФ-КП по следующей схеме.
Опыт ( – )
Контроль ( + )
150 мкл буфера
140 мкл буфера
50 мкл гомогената
50 мкл гомогената
–
10 мкл раствора ФМСФ (добавляют специально откалиброванной стеклянной пипеткой)
Преинкубация 8 минут при 37 °С
50 мкл раствора DNS-FLR
50 мкл раствора DNS-FLR
Инкубация 30 мин при 37 °С
50 мкл 1 н HCl
50 мкл 1 н HCl
После окончания реакции в каждую пробирку добавляют 1,5 мл хлороформа и интенсивно встряхивают штатив в течение 60 сек. Затем пробы центрифугируют 10 мин при 1000 об/мин для разделения фаз. Отбирают хлороформную фракцию и измеряют величину флюоресценции на флюориметре (λех=360 нм, λем=530 нм). Количество белка в пробе определяют по Лоури. Активность ФМСФ-КН рассчитывают как разность флюоресценции проб не содержащих ФМСФ и проб, содержащих ФМСФ, и выражают в нмоль продукта, образовавшегося за 1 мин инкубации на 1 мг белка. Формула для расчета активности:
а =
Содержание отчета
1. Определите степень очистки ФМСФ-КП
Фракция
Гомогенат
2
4
5
6
7
9
Активность
Степень
очистки
100 %
Работа 10. Частичная очистка ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы из печени методом ионообменной хроматографии (на диэтиламиноэтилцеллюлозе)
Оборудование и реактивы: пробирки; автоматическая пипетка; гомогенизатор; стеклянные стаканы на 50 и 100 мл; колонка для ионно-обменной хроматографии высотой 15 см; шприц; набор для определения фенилметилсульфонилфторид-ингибируемой карбоксипептидазы (ФМСФ‑КП): откалиброванная по спирту пипетка на 10 мкл, пипетка на 2 мл, стеклянная воронка, цилиндр на 250 мл с притертой пробкой; гомогенизатор; 50 мМ натрий-ацетатный буфер с 50 мМ NaCl (рН 5,6); 0,05 М натрий-ацетатный буфер, содержащий 0,05 М NaCl, pH 6,0; 1 М натрий-ацетатный буфер, содержащий 0,05 М NaCl, pH 3,7; спиртовой раствор ФМСФ, раствор дансил-фен-лей-арг (DNS-FLR); 1 н HCl, хлороформ; диэтиламиноэтилцеллюлоза (ДЭАЭЦ); набор растворов для определения белка по Лоури, печень животного.
Колонку для хроматографии закрепляют в вертикальном положении, закрывают нижний конец пробкой со вставленным фитингом, помещают в основание колонки кружок фильтровальной бумаги, размер которого должен точно соответствовать внутреннему размеру колонки. Заливают примерно 2 мл раствора 0,05 М натрий-ацетатного буфера, содержащего 0,05 М NaCl, pH 6,0, дают заполниться фитингу и через воронку по стенке заливают густую суспензию ДЭАЭЦ. Открывают зажим колонки и дают раствору свободно вытекать, следя за тем, чтобы колонка не обсохла. Суспензию ДЭАЭЦ прибавляют до тех пор, пока ее высота в колонке не достигнет нужного уровня, верхняя поверхность геля (стартовая зона) должна быть строго горизонтальной. Затем на поверхность геля помещают кружок фильтровальной бумаги. Колонку промывают (уравновешивают) 20 мл 0,05 М натрий-ацетатного буфера, содержащего 0,05 М NaCl, pH 6,0.
4 г печени животного гомогенизируют на льду в 10 мл буфера. Гомогенат центрифугируют 10 мин при 1000 об/мин для удаления пленок. В пробирку отбирают 100 мкл центрифугированного гомогената и добавляют 4,9 мл буфера. Перешивают и помещают на лед, в дальнейшем используя для определения активности и количества белка в гомогенате.
Открывают зажим колонки и сливают столбик буфера, находящийся над гелем. Когда нижний мениск раствора коснется поверхности кружка фильтровальной бумаги, на колонку осторожно с помощью шприца наносят 1 мл центрифугированного гомогената. Дают образцу впитаться и затем быстро смывают остатки образца со стенок колонки тем же объёмом растворителя. Затем заполняют колонку раствором 0,05 М натрий-ацетатного буфера, содержащего 0,05 М NaCl, pH 6,0, закрывают верхней пробкой с иглой и подсоединяют фитингом к сосуду, из которого поступает элюирующий раствор. Для удаления несвязавшихся белков колонку промывают 50 мл буфера.
Затем фермент элюируют 1 М натрий-ацетатным буфером с 0,05 М NaCl, pH 3,7. С момента этого буфера на колонку собирают 12 фракций объемом 2 мл.
Во 2, 4, 5, 6, 9, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 фракциях и в разведенном гомогенате измеряют активность ФМСФ-КП по следующей схеме.
Опыт ( – )
Контроль ( + )
150 мкл буфера
140 мкл буфера
50 мкл гомогената
50 мкл гомогената
–
10 мкл раствора ФМСФ (добавляют специально откалиброванной стеклянной пипеткой)
Преинкубация 8 минут при 37°С
50 мкл раствора DNS-FLR
50 мкл раствора DNS-FLR
Инкубация 30 мин при 37°С
50 мкл 1 н HCl
50 мкл 1 н HCl
После окончания реакции в каждую пробирку добавляют 1,5 мл хлороформа и интенсивно встряхивают штатив в течение 60 сек. Затем пробирки помещают в центрифуги и центрифугируют их 10 мин при 1000 об/мин для разделения фаз. Отбирают хлороформную фракцию и измеряют величину флюоресценции на флюориметре (λех=360 нм, λем=530 нм). Количество белка в пробе определяют по Лоури. Активность ФМСФ-КН рассчитывают как разность флюоресценции проб, не содержащих ФМСФ и проб, содержащих ФМСФ, и выражают в нМ продукта, образовавшегося за 1 мин инкубации на 1 мг белка. Формула для расчета активности:
а =
Содержание отчета
1. Определите степень очистки ФМСФ-КП.
Фракция
Гомогенат
2
4
5
6
7
9
Активность
Степень
очистки
100%
Фракция
12
14
16
18
20
22
24
Активность
Степень
очистки
Работа 11. Изучение субклеточного распределения ДНКазы (фермента-маркера ядерной фракции) в животных тканях
Оборудование и реактивы: центрифуга с охлаждением; ФЭК; гомогенизатор; печень животного; пипетки; ДНК; 0,1 М NaOH; 0,01% раствор крезолового красного; 0,32 М р-р сахарозы, содержащий 0,01 М трис-буфер рН 7,4 (среда А); 0,32 М р-р сахарозы, содержащий 0,01 μМ MgCl2∙6H2O рН 5,0 (среда Б); набор растворов для определения белка по Лоури.
продолжение
--PAGE_BREAK--Навеску ткани 2 г переносят в стакан гомогенизатора и добавляют 20 мл среды Б, гомогенизируют. Отбирают 2 мл на определение активности фермента и содержания белка в гомогенате. Центрифугирование и отбор фракций для анализа производят по следующей схеме.
Ресуспендирование проводят гомогенизированием полученных осадков в 4-6 мл среды гомогенизации (б), затем полученную суспензию переносят количественно в мерный цилиндр на 20 мл и объем суспензии доводят до 18 мл; таким образом, концентрация субклеточных структур достигает исходной (как в гомогенате) концентрации.
Активность ДНКазы определяют в исходном гомогенате, ядерной, митохондриальной, лизосомальной, микросомальной и растворимой клеточной фракции по следующей схеме.
1 мл раствора ДНК (1 мг/мл)
1 мл 0,01% раствора крезолового красного
1 мл буфера А
Преинкубация 8 минут при 37 °С
1 мл нагретого раствора фракции
Смесь быстро переливают в фотометрическую кювету (L=1 см) и измеряют оптическую плотность на ФЭК при 590 нм против буфера А. После измерения смесь немедленно переливают в исходную пробирку и инкубируют 20 мин при 37°С. Измеряют оптическую плотность системы после инкубации. Количество белка определяют по Лоури.
Содержание отчета
1. Расчет полученных данных представляют в виде таблицы.
Фракции
Г
Я
ТМ
ЛМ
Р
С
Анализируемые пробы
Оп. Кн.
Оп. Кн.
Оп. Кн.
Оп. Кн.
Оп. Кн.
Оп. Кн.
Оптическая плотность,
в каждой параллели и среднее
Аоп – Акн
Активность на 1 мг ткани
Активность фракции в % от гомогената
100 %
Количество белка на 1 мг ткани
Белок в % от белка гомогената
100 %
Относительная удельная активность фракций
Работа 12. Изучение субклеточного распределения кислых протеаз (ферментов-маркеров лизосом) в животных тканях
Оборудование и реактивы: центрифуга; печень животного; пипетки; 0,01 М фосфатный буфер, содержащий 0,32 М сахарозы, рН 7,55; 100 мМ натрий-ацетатный буфер рН 3,3; 8% раствор гемоглобина; 5% раствор трихлоруксусной кислоты (ТХУ); тирозин кристаллический; 0,32 М р-р сахарозы, содержащий 0,01 М трис-буфер рН 7,4 (среда А); 0,32 М р-р сахарозы, содержащий 0,01 μМ MgCl2∙6H2O рН 5,0 (среда Б).
Навеску ткани 2 г переносят в стакан гомогенизатора и добавляют 20 мл среды Б, гомогенизируют. Отбирают 2 мл на определение активности фермента и содержания белка в гомогенате. Центрифугирование и отбор фракций для анализа производят по схеме, приведенной в работе № 11.
Активность кислых протеаз определяют в исходном гомогенате, ядерной, митохондриальной, лизосомальной, микросомальной и растворимой клеточной фракции по следующей схеме.
опыт
контроль
200 мкл фракции
200 мкл фракции
600 мкл NaAc буфера, рН 3,3
800 мкл NaAc буфера, рН 3,3
Преинкубация 8 минут при 37°С
200 мкл 8% раствора гемоглобина
–
Инкубация 40 минут при 37°С
1 мл 5 % ТХУ
1 мл 5 % ТХУ
Пробы центрифугируют 30 мин при 4000 об/мин. Отбирают 1 мл надосадочной жидкости и определяют количество образовавшегося тирозина спектрофотометрически при 280 нм. Количество белка в супернатанте определяют спектрофотометрически при 280 нм. Активность фермента определяют по калибровочному графику.
Построение калибровочного графика
Готовят рабочий раствор тирозина с концентрацией 100 мкг/мл. Затем производят его разведение в соответствии со схемой.
№ пробирки
V р-ра тир
V р-ра воды
Конц, мкг/мл
Dср
1
0,5
4,5
2
1
4
3
1,5
3,5
4
2,0
3
5
2,5
2,5
6
3,0
2,0
7
3,5
1,5
8
4,0
1,0
9
4,5
0,5
10
5,0
0,0
Содержание отчета
1. Расчет полученных данных представляют в виде таблицы.
Фракции
Г
Я
ТМ
ЛМ
Р
С
Анализируемые пробы
Оп. Кн.
Оп. Кн.
Оп. Кн.
Оп. Кн.
Оп. Кн.
Оп. Кн.
Оптическая плотность,
в каждой параллели и среднее
Аоп – Акн
Количество тирозина по
калибровочной кривой
Активность на 1 мг ткани
Активность фракции в % от гомогената
100%
Количество белка на 1 мг ткани
Белок в % от белка гомогената
100%
Относительная удельная активность фракций
Работа 13. Изучение субклеточного распределения сукцинатдегидрогеназы (маркера митохондрий) в животных тканях
Оборудование и реактивы: центрифуга; печень животного; пипетки; буфер фосфатный 0,067 М (субстратный), рН 7,55; 0,5 М раствор сукцината натрия в субстратном буфере; 0,32 М р-р сахарозы, содержащий 0,01 М трис-буфер рН 7,4 (среда А); 0,32 М р-р сахарозы, содержащий 0,01 μМ MgCl2∙6H2O рН 5,0 (среда Б); 0,02 М раствор феназинметасульфата*; 0,001 М раствор 2,6-дихлорфенолиндофенола (ДХФИФ)**.
* Приготовление раствора феназинметасульфата. 12 мг вещества переносят в стеклянную пробирку, добавляют 2 мл дистиллированной воды, закрывают пробкой и перемешивают. РЕАКТИВ ГОТОВЯТ В ДЕНЬ ОПЫТА.
** Приготовление раствора ДХФИФ. 17 мг вещества растворяют в колбе на 50 мл. РЕАКТИВ ГОТОВЯТ В ДЕНЬ ОПЫТА.
Навеску ткани 2 г переносят в стакан гомогенизатора и добавляют 20 мл среды Б, гомогенизируют. Отбирают 2 мл на определение активности фермента и содержания белка в гомогенате. Центрифугирование и отбор фракций для анализа производят по схеме, приведенной в работе № 11.
Активность сукцинатдегидрогеназы определяют в исходном гомогенате, ядерной, митохондриальной, лизосомальной, микросомальной и растворимой клеточной фракции по одной из следующих схем:
а) кинетическая схема определения активности.
опыт
контроль
400 мкл субстратного буфера
600 мкл субстратного буфера
200 мкл сукцината натрия
на субстратном буфере
–
200 мкл 0,02 М феназинметасульфата
200 мкл 0,02 М феназинметасульфата
200 мкл 0,001 М ДХФИФ
НЕПОСРЕДСТВЕННО
ПЕРЕД ОПЫТОМ
200 мкл 0,001 М ДХФИФ
НЕПОСРЕДСТВЕННО
ПЕРЕД ОПЫТОМ
Инкубация на водяной бане 3 мин при 37 °С
3 мл фракции,
НАГРЕТОЙ ДО 37 °С
3 мл фракции,
НАГРЕТОЙ ДО 37 °С
Смесь быстро перемешивают и немедленно переливают в кювету (l = 1 см), на секундомере отмечают время начала реакции. Измеряют оптическую плотность системы на фотоэлектроколориметре или спектрофотометре при 600 нм каждые 20 сек в течении 3 мин. Аналогичным образом измеряют снижение оптической плотности в контрольных пробах, не содержащих сукцината. Белок определяют по Лоури. При расчете истинной активности сукцинатдегидрогеназы величины эндогенной активности вычитают из величин, выражающих активность сукцинатдегидрогеназы в пробах, содержащих сукцинат.
Активность выражают в нмолях окисленного сукцината за 1 мин на 1 мг белка, учитывая, что снижение оптической плотности на 1,0 эквивалентно восстановлению 60 нмолей 2,6-ДХФИФ, а количество восстановленного красителя пропорционально количеству окисленного сукцината.
б) стационарная схема определения активности.
опыт
контроль
400 мкл субстратного буфера
600 мкл субстратного буфера
200 мкл сукцината натрия
на субстратном буфере
–
200 мкл 0,02 М феназинметасульфата
200 мкл 0,02 М феназинметасульфата
200 мкл 0,001 М ДХФИФ
НЕПОСРЕДСТВЕННО
ПЕРЕД ОПЫТОМ
200 мкл 0,001 М ДХФИФ
НЕПОСРЕДСТВЕННО
ПЕРЕД ОПЫТОМ
Инкубация на водяной бане 3 мин при 37 °С
3 мл фракции,
НАГРЕТОЙ ДО 37 °С
3 мл фракции,
НАГРЕТОЙ ДО 37 °С
Инкубация на водяной бане 30 мин при 37°С
1 мл 1 н HCl
1 мл 1 н HCl
Затем пробы переливают в центрифужные пробирки и центрифугируют 10 мин про 4000 об/мин. Измеряют оптическую плотность системы на фотоэлектроколориметре или спектрофотометре при 600 нм. Белок определяют по Лоури. При расчете истинной активности сукцинатдегидрогеназы величины эндогенной активности вычитают из величин, выражающих активность сукцинатдегидрогеназы в пробах, содержащих сукцинат.
Активность выражают в нмолях окисленного сукцината за 1 мин на 1 мг белка, учитывая, что снижение оптической плотности на 1,0 эквивалентно восстановлению 60 нмолей 2,6-ДХФИФ, а количество восстановленного красителя пропорционально количеству окисленного сукцината.
Содержание отчета
1. Расчет полученных данных представляют в виде таблицы.
Фракции
Г
Я
ТМ
ЛМ
Р
С
Анализируемые пробы
Оп. Кн.
Оп. Кн.
Оп. Кн.
Оп. Кн.
Оп. Кн.
Оп. Кн.
Оптическая плотность,
в каждой параллели и среднее
Аоп – Акн
Количество сукцината
Активность на 1 мг ткани
Активность фракции в % от гомогената
100%
Количество белка на 1 мг ткани
Белок в % от белка гомогената
100%
Относительная удельная активность фракций
Работа 14. Изучение субклеточного распределения глюкозо-6-фосфатазы (маркера микросомальной фракции) в животных тканях
Оборудование и реактивы: центрифуга; печень животного; пипетки; 0,1 М цитратный буфер рН 6,5; 0,08 М раствор глюкозо-6-фосфата (Г-6-Ф) в 0,1 М цитратном буфере****; 10% раствор трихлоруксусной кислоты (ТХУ); раствор молибдата аммония*; восстанавливающий раствор**; стандартный раствор фосфора (5∙10-5 М)***.
* Приготовление раствора молибдата аммония. 2,5 г молибдата аммония растворяют в 50 мл воды; 14 мл конц. серной кислоты приливают к 200 мл воды. Разбавленную кислоту наливают в раствор молибдата и доводят объем до 1000 мл.
** Приготовление восстанавливающего раствора. К 1,8 г Na2SO3 приливают 11,3 мл 1 н HCl и 5 мл воды. Затем растворяют 25 мг 1-амино-2-нафтол-4-сульфокислоты и доводят общий объем до 25 мл. ГОТОВЯТ В ДЕНЬ ОПЫТА.
*** Приготовление стандартного раствора фосфора. 68 мг КН2РО4 растворяют в 20 мл воды и добавляют 10 мл конц. серной кислоты и доводят объем до 1000 мл.
**** Приготовление раствора Г-6-Ф. 55 мг глюкозо-6-фосфата растворяют в 2 мл 0,1 М цитратного буфера рН 6,5. ГОТОВЯТ В ДЕНЬ ОПЫТА.
Навеску ткани 2 г переносят в стакан гомогенизатора и добавляют 20 мл среды Б, гомогенизируют. Отбирают 2 мл на определение активности фермента и содержания белка в гомогенате. Центрифугирование и отбор фракций для анализа производят по схеме, приведенной в работе № 11.
Активность глюкозо-6-фосфатазы определяют в исходном гомогенате, ядерной, митохондриальной, лизосомальной, микросомальной и растворимой клеточной фракции по следующей схеме.
опыт
контроль 1
контроль 2
100 мкл фракции
100 мкл фракции
100 мкл буфера
Инкубация 10 мин
при 37°С
–
–
100 мкл Г-6-Ф
100 мкл буфера
100 мкл Г-6-Ф
Инкубация 20 мин при 37°С
2 мл 10 % ТХУ
Центрифугируют 10 мин при 4000 об/мин. Далее в стеклянных пробирках производят смешение согласно схеме.
опыт
контроль 1
контроль 2
стандарт
1 мл надосадочной жидкости
1 мл станд. р-ра фосфора
5 мл раствора молибдата
Затем в каждую пробирку через промежутки времени, необходимые для дальнейшего колориметрического измерения, приливают по 1 мл восстанавливающего раствора.
Каждую пробу оставляют на 15 мин при комнатной температуре и затем промеряют экстинкцию при 750 нм на ФЭК. Количество белка определяют по Лоури. Активность фермента выражают в ммолях фосфата, отщепленного за 1 мин инкубации на 1 мг белка.
Содержание отчета
1. Обоснуйте наличие в данной методике двух контролей и стандарта.
2. Расчет полученных данных представляют в виде таблицы:
Фракции
Г
Я
ТМ
ЛМ
Р
С
Анализируемые пробы
Оп. Кн.
Оп. Кн.
Оп. Кн.
Оп. Кн.
Оп. Кн.
Оп. Кн.
Оптическая плотность,
в каждой параллели и среднее
Аоп – Акн
Количество фосфата
Активность на 1 мг ткани
Активность фракции в % от гомогената
100%
Количество белка на 1 мг ткани
Белок в % от белка гомогената
100%
Относительная удельная активность фракций
продолжение
--PAGE_BREAK--