На правах рукописиКУТЛУБЕРДИНА ДИАНА РЕНАТОВНААНТАГОНИСТИЧЕСКИЕ штаммЫ BACILLUS SUBTILIS COHN КАК АГЕНТЫ БИОКОНТРОЛЯ ГРИБОВ РОДА FUSARIUM LINK03.02.03 – микробиологияАВТОРЕФЕРАТдиссертации на соискание ученой степеникандидата биологических наукСАРАТОВ – 2010 Работа выполнена в Федеральном государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Башкирский государственный аграрный университет»Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Хайруллин Рамиль МагзинуровичОфициальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Тихомирова Елена Ивановнакандидат биологических наук Ксенофонтова Оксана ЮрьевнаВедущая организация: Учреждение Российской академии наук Институт биологии Уфимского научного центра РАНЗащита диссертации состоится: 23 декабря 2010 г в 12.00 часов на заседании диссертационного совета Д 220.061.04 при ФГОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет имени Н.И. Вавилова» по адресу: 410005, Саратов, ул. Соколовая, 335, диссертационный зал.С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГОУ ВПО «Саратовский ГАУ им. Н.И. Вавилова».Автореферат диссертации разослан 22 ноября 2010 г. и размещен на сайте: www.sgau.ruОтзывы на автореферат направлять по адресу: 410012, г. Саратов, Театральная пл., 1, ученому секретарю диссертационного советаУченый секретарь диссертационного совета,доктор биологических наук, профессор Л.В. Карпунина^ ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫАктуальность темы. Микробный антагонизм, сущность которого заключается в подавлении одних видов микроорганизмов другими, хорошо известен как природное явление и используется в различных целях в медицине, ветеринарии и растениеводстве (Малик, Панин, 2001; Недорезков, 2003; Мелентьев, 2007; Похиленко, Перелыгин, 2007). В последнее время большое внимание уделяется изучению механизмов биоконтроля возбудителей различных заболеваний растений с помощью микробов-антагонистов и разработке на их основе способов регуляции болезнеустойчивости и продуктивности сельскохозяйственных культур (Кожемяков, Тимофеева, 2007; Монастырский, 2008). Среди микробов-антагонистов хорошо известны бактерии ^ Bacillus subtilis Cohn, способные подавлять развитие различных микроорганизмов – патогенов растений (Недорезков, 2003). Известно, что некоторые виды грибных фитопатогенов опасны способностью не только снижать продуктивность растения, но и ухудшать качество продукции. К таким фитопатогенам относятся грибы рода Fusarium Link, вызывающие фузариоз колоса злаков, который может приводить к накоплению в зерне фузариотоксинов и вызывать алиментарные токсикозы человека и животных (Грушко, Линченко, Хан, 2005). Поражение зерна пшеницы фузариозом в последние годы возрастает, равно как и тенденция загрязнения продовольствия микотоксинами (Kononenko, Burkin, 2006; Безбородова, Подчезерцева, 2009; Монастырский, Першакова, Кузнецова, 2009). Проблема снижения распространенности фузариоза не теряет остроту из-за «неподатливости» вызывающих его грибов к искоренению химическими фунгицидами (Тютерев, 2006). В связи с вышесказанным актуальным является изучение природных механизмов регуляции плотности популяции фитопатогенов рода Fusarium, эффективными агентами биоконтроля которых могут выступать антагонистические бактерии B. subtilis благодаря их способности продуцировать антибиотики (Thimon et al., 1992) и/или фунгистатичные ферменты (Мелентьев, 2007). Значительный интерес среди таких бактерий представляют эндофитные штаммы, способные заселять внутренние растительные ткани и препятствовать внедрению фитопатогенов без существенного вреда для растения-хозяина (Chen, Bauske, Musson, 1995).Целью работы являлось изучение биологических свойств эндофитных антагонистических штаммов ^ B. subtilis и обоснование возможности их использования как агентов биоконтроля грибов рода Fusarium, заражающих зерно яровой пшеницы. Для достижения цели были решены следующие задачи: 1. Оценить распространенность и выявить основные виды грибов рода Fusarium, встречающихся в семенах яровой пшеницы (Triticum aestivum L.) в Республике Башкортостан. 2. Изучить особенности взаимоотношений антагонистических эндофитных штаммов бактерий B. subtilis с грибами рода Fusarium. 3. Определить влияние клеток антагонистических бактерий B. subtilis, а также антибиотиков итурина и сурфактина на спороношение грибов рода Fusarium. 4. Выявить влияние бактерий-антагонистов на формирование устойчивости пшеницы к фитотоксичным метаболитам грибов рода Fusarium. 5. Определить перспективный штамм B. subtilis для разработки препарата против фузариозной инфекции зерна и оценить его безопасность. 6. Оценить эффективность применения перспективного штамма ^ B. subtilis в качестве основы препарата для биоконтроля фузариозной инфекции зерна пшеницы.Научная новизна. Исследованы особенности взаимоотношений антагонистических штаммов бактерий ^ B. subtilis, выделенных из внутренних тканей пшеницы, с грибами рода Fusarium, заражающими зерно этой же культуры. В зерне пшеницы, репродуцированном в Республике Башкортостан, идентифицировано 11 видов грибов рода Fusarium, 3 из которых (F. acuminatum (Ellis&Everh), F. tricinctum (Corda) Sacc.), F. equiseti (Corda) Sacc.) ранее не были описаны в указанном регионе как возбудители фузариоза. Выявлено, что самыми распространенными и доминирующими видами в структуре фитопатогенного комплекса этих грибов, формирующегося в зерне пшеницы, являются F. sporotrichioides (Sherb.), представленный генетически разнородными изолятами, и F. poae (Peck.) Wollenw., представленный однородными популяциями, характерными для определенной зоны. Выявлено, что штаммы B. subtilis проявляют различную степень антагонистической активности по отношению к фузариевым грибам, а последние, в свою очередь, различаются чувствительностью к бактериям – продуцентам антибиотических веществ. Показано, что высоко антагонистические штаммы B. subtilis, а также антибиотики итурин и сурфактин ускоряют образование макроконидий у^ F. avenaceum (Fr.) Sacc. и F. sporotrichioides. Выявлено, что подавление роста грибов рода Fusarium бактериями B. subtilis связано с ингибированием прорастания грибных конидий. Впервые показана способность антагонистических штаммов B. subtilis повышать устойчивость пшеницы к действию фитотоксинов грибов рода Fusarium. Изучено влияние инокуляции семян пшеницы препаратом нового штамма эндофитных бактерий B. subtilis 11РН на распространенность и видовой состав фузариевых грибов в зерне пшеницы и показана эффективность его применения в качестве основы биопрепарата для биоконтроля фузариозной инфекции зерна. Показано, что обработка семян изученными биопрепаратами, а также системным фунгицидом на основе тебуконазола приводит к преобладанию в инфицированном зерне нового урожая видов F. sporotrichioides и F. poae в сравнении с другими.Практическая значимость работы. Исследования взаимоотношений эндофитных антагонистических штаммов ^ B. subtilis с грибами рода Fusarium позволяют разрабатывать новые способы и средства экологически безопасного биоконтроля указанных грибов. Штамм B. subtilis 11РН может быть использован в качестве основы препарата для биоконтроля фузариозной инфекции зерна пшеницы, не уступающего по эффективности химическим фунгицидам на основе тебуконазола и рекомендуемого для включения в план регистрационных испытаний пестицидов на территории Российской Федерации. Изоляты грибов рода Fusarium, выделенные из зерна пшеницы, репродуцированной в разных зонах республики, используются сотрудниками лаборатории биотехнологии научно-образовательного центра Башкирского ГАУ для микробиологических разработок, а также студентами при выполнении курсовых и дипломных работ. Результаты диссертационной работы используются в учебном процессе при чтении лекций по дисциплинам «Сельскохозяйственная микробиология», «Биотехнология в растениеводстве», «Фитопатология», а также проведении лабораторно-практических занятий.^ Основные положения, выносимые на защиту. 1. В Республике Башкортостан в зерне яровой пшеницы наиболее распространенными и доминирующими являются виды F. sporotrichioides и F. poae. Вид F. sporotrichioides представлен генетически разнородными изолятами, не формирующими популяции, характерные для одной природно-сельскохозяйственной зоны или однородные внутри зоны. В отличие от этого вид F. poae представлен однородными популяциями, характерными для определенной зоны. 2. Устойчивость фитопатогенных грибов рода Fusarium к антагонистическим штаммам B. subtilis видоспецифична, также как и специфична антагонистическая активность эндофитных представителей B. subtilis к этим грибам. 3. Эндофитные штаммы B. subtilis способны повышать устойчивость пшеницы к фитотоксичным метаболитам грибов рода Fusarium. 4. Антагонистический штамм B. subtilis 11РН является не вирулентным, не токсичным и не токсигенным и может служить основой нового препарата для защиты яровой пшеницы от фузариозной инфекции зерна, не уступающего по биологической эффективности химическим фунгицидам раксил или террасил. 5. Обработка семян яровой пшеницы биопрепаратами на основе штамма ^ B. subtilis 11РН или штаммов Pseudomonas fluorescens (бинорам), а также химическим фунгицидом на основе тебуконазола (раксил, террасил) повышает встречаемость в зерне нового урожая видов F. sporotrichioides и F. poae в сравнении с другими видами грибов рода Fusarium.Работа выполнена в Башкирском ГАУ в рамках заказа Минсельхоза России за счет средств Федерального бюджета по теме «Разработка полифункциональных биофунгицидов для растениеводства» (№ госрегистрации 01200853490).^ Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на: II Всероссийской конференции «Современные проблемы иммунитета растений к вредным организмам» (Санкт-Петербург, 2008); IV Межрегиональной конференции молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой» (Саратов, 2008); Междисциплинарном микологическом форуме «Иммунопатология, аллергология, инфектология» (Москва, 2009); Всероссийской научно-практической конференции «Проблемы региональной экологии в условиях устойчивого развития» (Киров, 2009); Всероссийской научной школе для молодежи «Инновационные методы и подходы в изучении естественной и антропогенной динамики окружающей среды» (Киров, 2009); Всероссийской конференции «Проблемы и перспективы изучения естественных и антропогенных систем Урала и прилегающих регионов» (Стерлитамак, 2010).Публикации. По результатам исследований опубликовано 13 работ, из которых 3 – в журналах, рекомендованных ВАК РФ.^ Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, двух глав: обзора литературы и экспериментальной части, включающей объекты и методы исследований, результаты исследований и их обсуждение; а также заключения, выводов и списка использованных литературных источников. Работа изложена на 147 страницах, содержит 9 рисунков, 25 таблиц. Список использованных литературных источников включает 285 наименований, в том числе 173 зарубежных.^ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬОбъекты, материалы и методы исследования В работе использовали 20 новых антагонистических штаммов B. subtilis, выделенных сотрудниками лаборатории биотехнологии Башкирского ГАУ из внутренних тканей визуально здоровых растений пшеницы; 3 штамма B. subtilis 11ВМ, B. subtilis 11В и B. subtilis 26Д, предоставленные обществом с ограниченной ответственностью научно-производственным предприятием «БИОФОРТ»; штамм ^ B. subtilis М1, полученный из коллекции Башкирского ГАУ; 11 видов грибов Fusarium poae, F. sporotrichioides, F. avenaceum, F. graminearum Schwabe, F. culmorum (W.G.Sm.) Sacc., F. acuminatum, F. tricinctum, F. equiseti, F. solani (Mart.) Sacc., F. sambucinum Fuckel, F. oxysporum Schltdl., выделенные из зерна мягкой яровой пшеницы (Triticum aestivum L.), репродуцированной в северной и южной лесостепи, а также предуральской степи Республики Башкортостан; а также штаммы F. avenaceum 45, F. culmorum 63, F. graminearum 68, F. sambucinum 480, F. oxysporum 80, F. solani 55, F. sporotrichioides 57, полученные из коллекции Всероссийского научно-исследовательского института сельскохозяйственной микробиологии, г. С.-Пб.-Пушкин. Фитоэкспертизу семян проводили по методу Н.А. Наумовой (1970) и J. de Tempe (1961), отбирая зерно в фазу полной спелости (Иващенко, Шипилова, 2004). Виды грибов устанавливали по таксономии В. Герлаха (Gerlach, Nirenberg, 1982) и К. Буса (Booth, 1979). Распространенность и частоту встречаемости видов определяли согласно работе Н.П. Шипиловой с соавт. (1998). Зараженность оценивали по методике Дж. Пилат (Pelhate, 1979). ДНК экстрагировали смесью хлороформа с октанолом (Мироненко, Булат, 2002). ПЦР проводили в термоциклере PTC-150 MiniCycler (MJ Research, Watertown, Mass.), используя ДНК-полимеразу T. aquaticus (McPherson et al., 1995). Электрофорез проводили в приборах Sub-Cell GT WIDI MINI (Bio-Rad, США). Гели документировали при помощи видеосистемы («АО ДНК-технология», Россия, программа Gel Imager 2). Фитотоксичные метаболиты грибов получали, культивируя их в колбах с жидкой средой Чапека при 25°С на шейкере BIOSAN ES-20. Фитотоксичность культурального фильтрата (КФ) оценивали, проращивая в нем семена и анализируя всхожесть и размеры проростков пшеницы. Антагонизм штаммов B. subtilis изучали методом агаровых блоков (Нетрусов, 2005). Токсико-гигиеническую оценку штамма B. subtilis 11РН проводили в ФГУ «Уфимский НИИ медицины труда и экологии человека» Роспотребнадзора по заказу Башкирского ГАУ. Влияние B. subtilis на рост растений определяли, обрабатывая семена спорами бактерий и проращивая на влажной фильтровальной бумаге в темноте. У проростков измеряли длину главного корня и надземной части. Экспериментальный образец препарата на основе штамма B. subtilis 11РН (1 млрд. КОЕ в 1 мл) получали, используя газо-вихревой биореактор «БИОК» (ЗАО «Саяны», Новосибирск). Расход препарата составлял 1 л, рабочей жидкости – 10 л на 1 т семян. Эталоном служили фунгициды раксил (Bayer, Германия) и террасил. Препарат бинорам (Pseudomonas fluorescens 7Г, 7Г2К, 17-2) предоставлен ООО «Алсико-Агропром» (Москва). Семена обрабатывали вручную за неделю до посева по рекомендациям фирм-изготовителей. Делянки (1 кв. м., 3 повтора) засевали вручную. Результаты обрабатывали с помощью статистических программ Microsoft Office.^ Результаты исследований и их обсуждениеРаспространенность и основные виды грибов рода Fusarium, встречающихся в зерне яровой пшеницы в Республике Башкортостан. Для изучения взаимоотношений эндофитных антагонистических штаммов бактерий ^ B. subtilis с грибами рода Fusarium первоначально была проведена оценка распространенности этих фитопатогенов в зерне пшеницы, а также выявлены основные виды, инфицирующие семена. Так как территория республики крайне неоднородна по климатическим условиям, анализировались образцы зерна пшеницы, репродуцированной в трех разных зонах республики. Установлено, что северная лесостепь является самой неблагополучной зоной по распространенности фузариоза зерна (средняя зараженность 17%, табл. 1). По ходу продвижения на более засушливый юг республики заселенность зерна снижалась, примерно до равной Таблица 1 - Распространенность фузариозной инфекции в зерне яровой пшеницы Район Сорт Зараженность образца, % 2007 2008 2009 Средняя Северная лесостепь Благовещенский Омская 35 11 16 14 14 Иглинский Башкирская 26 13 18 12 14 Казахстанская 10 11 14 16 14 Татышлинский Омская 35 14 18 22 18 Омская 36 26 28 28 27 Среднее значение 15 19 18 17 Южная лесостепь Аургазинский Омская 35 6 10 8 8 Казахстанская 10 4 9 9 7 Дюртюлинский Омская 35 21 14 18 18 Башкирская 24 19 2 7 9 Воронежская 12 11 16 5 11 Казахстанская 10 8 2 2 4 Ирень 6 8 6 7 Жница 4 10 6 7 Илишевский Омская 35 17 14 16 16 Казахстанская 10 3 12 9 8 Ирень 2 0 4 2 Башкирская 26 18 8 12 13 Кармаскалинский Омская 35 17 6 9 11 Башкирская 24 13 17 12 14 Башкирская 26 11 14 14 13 Симбирка 9 9 7 8 Казахстанская 10 8 8 10 9 Кушнаренковский Казахстанская 10 36 17 14 22 Уфимский Омская 35 12 10 11 11 Башкирская 26 8 14 17 13 Казахстанская 10 12 22 11 15 Чекмагушевский Московская 35 11 13 8 11 Среднее значение 12 11 10 11 Предуральская степь Благоварский Омская 35 10 14 7 10 Давлекановский Омская 35 2 2 4 3 Мелеузовский Башкирская 26 14 22 9 15 Казахстанская 10 9 14 10 11 Стерлитамакский Омская 35 2 8 4 5 Симбирка 5 22 6 11 Саратовская 55 4 10 6 7 Чишминский Омская 35 13 26 10 16 Казахстанская 10 9 14 14 12 Экада 70 16 10 20 15 Симбирка 4 20 6 10 Башкирская 26 16 18 4 13 Башкирская 24 12 8 10 10 Среднее значение 9 14 8 11 Средняя 12 15 12 13 степени (11%) в южной лесостепи и предуральской степной зоне. Наибольшая распространенность фузариоза наблюдалась в Дюртюлинском (южная лесостепь) и Чишминском (предуральская степь) районах. Это, вероятно, связано с тем, что местом репродукции анализируемой партии зерна в первом районе служил государственный сортоиспытательный участок, во втором – опытное хозяйство Башкирского НИИСХ, в которых возделываются множество сортов пшеницы из разных регионов страны, что вместе с семенами может привносить и агрессивный фитопатогенный комплекс. Зараженность зерна сильно варьировала в зависимости от сорта пшеницы, например в 2007 г в южной лесостепи от 2% до 36%. Эти данные согласуются с работами О.А. Монастырского с соавт. (2003), Т.К. Шешеговой и А.В. Хариной (2008), И.Б. Абловой (2008) и подтверждают выводы о различии сортов по восприимчивости к фузариозу колоса. Во всех районах преобладала скрытая форма заражения зерновок (внешне здоровые, всхожие, хорошо выполненные семена, имели нормальный блеск, налет гриба отсутствовал). При анализе видового состава идентифицировано 11 видов грибов, в том числе 3 (^ F. acuminatum, F. tricinctum, F. equiseti) – ранее не были описаны, как инфекция зерна яровой пшеницы на территории республики. Поэтому можно сделать вывод о существенном разнообразии видов Fusarium, поражающих зерно на территории республики. Наиболее часто зерновки заселяли F. sporotrichioides и F. poae, продуценты особо опасных фузариотоксинов Т-2 и ниваленола (Гагкаева Гаврилова, Левитин, 2008). Средняя частота встречаемости их в партиях зерна составляла 82% и 70%, соответственно. Во вторую, умеренную по частоте встречаемости группу входили виды F. avenaceum (47%), F. graminearum (41%), F. acuminatum (29%), F. culmorum (12%). Другие виды (F. tricinctum, F. sambucinum, F. oxysporum, F. equiseti) встречались еще реже. По сравнению с прошлым десятилетием, когда явная зараженность зерна не превышала 1-2% (Пирязева, 2001), наметилась тенденция ее роста, также как и смена видового разнообразия грибов рода Fusarium, вызывающих эту инфекцию. Известно, что микроорганизмы интенсивнее развиваются на травмированных семенах в сравнении с семенами крупной фракции (Оробинский, 2006). Анализ фракций зерна разных размеров (проход через сито 2,2 мм и остаток на сите), выявил, что зараженность мелкого зерна, как правило, используемого как фуражное, оказалась примерно в два раза выше, чем семенного и продовольственного (табл. 2). Эта закономерность проявлялась у разных сортов пшеницы, репродуцированной в различных районах южной лесостепи республики. Таблица 2 - Сравнительная характеристика зараженности зерна фузариозом Район Сорт Зараженность фузариозом, % мелкое зерно(менее 2,2 мм) крупное зерно(более 2,2 мм) Илишевский Омская 35 17 8 Уфимский Омская 35 12 7 Дюртюлинский Омская 35 21 10 Кармаскалинский Омская 35 17 13 Кушнаренковский Казахстанская 10 36 17 Дюртюлинский Башкирская 24 19 10 Кармаскалинский Башкирская 24 13 9 Средняя 19 11 Внутривидовая изменчивость F. sporotrichioides и F. poae. Выявлено, что у ДНК всех идентифицированных нами по культурально-морфологическим признакам изолятов F. sporotrichioides и F. poae имелись четкие фрагменты амплификации, соответствующие видам. В 90-х годах появилось сообщение (Тоrр, Langseth, 1999) о выявлении новой разновидности F. poae - F. poae «powderу» («порошистый») в странах северной Европы. Позднее она получила видовой статус по фамилии норвежского миколога Лангсета (W. Langseth) – F. langsethiae Torp et Nirenberg. По составу метаболитов этот гриб сходен с F. sporotrichioides, а по морфологии – с F. poae (Тоrр, Langseth, 1999; Torp, Nirenberg, 2004). Это предполагало возможность инфицирования семян пшеницы указанным новым видом. Однако согласно ДНК-анализа в исследованных образцах зерна вид F. langsethiae не обнаружен. Методом RAPD-анализа с использованием семи разных десятичленных праймеров со случайной последовательностью (Operon Technologies, Inc. Alameda, CA) выявлен значительный внутривидовой полиморфизм у представителей ^ F. sporotrichioides. У изолятов F. рoae внутривидовое разнообразие проявлялось слабее. Изоляты, выделенные в одной зоне, были сходны между собой (рис. 1). Популяции северной лесостепи и предуральской степи отличались друг от друга. Изоляты южной лесостепи распределились равномерно по вышеупомянутым кластерам, не образуя отдельного. М 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Рис. 1. Внутрипопуляционный полиморфизм штаммов ^ F. pоае в северной лесостепи республики. 1-15 – номера изолятов. М – маркеры размера ДНКЕ.С. Квашнина (1978) описала у F. poae «экологические модификации» изолятов, формирующиеся при адаптации к окружающей среде. Эти данные, а также наши результаты свидетельствуют, что географический фактор является одним из определяющих в формировании структуры популяции F. poae. По-видимому, повсеместное распространение и отсутствие строгой зональной приуроченности вида^ F. sporotrichioides объясняется его лучшей приспособленностью к экологическим нишам и отсутствием высокой специфичности к видам хозяев, в то время как вид F. рoae, в основном, выделяется только из злаковых растений (Гагкаева, Гаврилова, Левитин, 2008).^ Взаимоотношения антагонистических штаммов B. subtilis с грибами рода Fusarium. Известно, что фузариоз зерна опасен наличием в нем микотоксинов. Применение химических фунгицидов позволяет частично решить проблему борьбы с фузариозом колоса, однако, в свою очередь, возникает проблема загрязнения зерна пестицидами. Одним из выходов из такой ситуации может быть применение биопрепаратов на основе бактерий-антагонистов. Ранее в лаборатории биотехнологии Башкирского ГАУ из внутренних тканей яровой пшеницы, произрастающей в Республике Башкортостан, были выделены эндофитные штаммы B. subtilis, которые прошли отбор по признаку антагонизма к фитопатогенным грибам (Хайруллин и др., 2008). Поэтому представлялись актуальными анализ взаимоотношений бактерий-антагонистов с изолятами грибов рода Fusarium и оценка возможности использования перспективных штаммов как агентов биоконтроля фузариоза зерна. Установлено, что штаммы B. subtilis проявляли различную степень антагонизма к фузариевым грибам, а последние, в свою очередь, различались чувствительностью к продуцентам антибиотиков. Из 23 штаммов бактерий 3 (11РН, 49РН и 89РН) проявляли наивысшую антагонистическую активность против всех исследованных в работе видов грибов Fusarium. Вторую (среднюю по степени антагонизма) группу составили штаммы 121РН, 161РН, 162РН, 832РН, 11ВМ, 922РН. К штаммам с низкой активностью отнесены НТ, НТ2, М1, 871РН, 11В. Штамм B. subtilis 141РН оказался самым слабым антагонистом. Изучение морфологии грибов на границе зоны подавления роста показало, что бациллы способны подавлять прорастание конидий и угнетать рост мицелия. Выявлено, что один и тот же штамм B. subtilis действует на рост мицелия разных видов грибов неодинаково. Под влиянием метаболитов штамма 121РН у F. sporotrichioides наблюдались утолщения, искривления и разрушения мицелиальных нитей. У ^ F. avenaceum (рис. 2) наблюдалось неполное разделение мицелия на короткие сегменты, а также его деградация. А Б Рис. 2. Влияние антагонистических бактерий на развитие мицелия гриба ^ F. avenaceum: А- контроль, Б - F. avenaceum+B. subtilis 121РН У гриба F. poaе было хорошо заметно истончение и сильное искривление нитей мицелия, а у F. graminearum на мицелии образовывались вздутия. Взаимодействие грибов со штаммом, проявляющим невысокую антагонистическую активность (^ B. subtilis 141РН) не приводили к каким-либо заметным изменениям в структуре мицелия даже вблизи бактериальных клеток. В ходе исследований возникло предположение, что антибиотические метаболиты бацилл, как стресс-факторы, могут стимулировать образование конидий у фузарий. В связи с этим изучали действие клеток (методом агаровых блоков) штамма B. subtilis 89РН к основным видам фузариевых грибов, а также чистых антибиотиков итурин и сурфактин (Sigma, США, метод бумажных дисков), продуцируемых бактериями Bacillus на спорообразование F. sporotrichioides и F. avenaceum. В качестве «эталона сравнения» оценивали действие «голодного агара» и непрерывного ультрафиолетового света (УФО). На 3-й день микроконидии наблюдали во всех вариантах опыта (табл. 3), единичные макроконидии – на среде с антибиотиками и под действием УФО. Действие клеток бацилл, сопоставимые с «эталонами сравнения» отчетливо проявилось на 5-й день, когда в указанных вариантах проявились типичные макроконидии. В случае с действием бактерий на развитие гриба F. avenaceum типичные макроконидии на 5-е сутки появились в вариантах с использованием УФО и живых клеток B. subtilis 89РН. Таким образом, метаболиты высокоантагонистичных штаммов B. subtilis способны не только подавлять рост мицелия фузариевых грибов, но и активизировать процесс образования макроконидий. Таблица 3 – Скорость образования конидий грибом ^ F. sporotrichioides Дни Контроль Голодныйагар УФО ^ B. subtilis 89РН Сурфактин Итурин 1 Посев гриба 2 Нет конидий 3 МК* МК МК, едини-чные МАК МК МК,единичные МАК 4 МК МК, разви-тие МАК** Типичные МК и МАК МК, единичные МАК 5 МК, едини- чные МАК Типичные МК и МАК МК, единичные МАК Примечание: * - микроконидии, ** - макроконидии.^ Протекторный эффект эндофитных штаммов B. subtilis при действии фитотоксичных метаболитов грибов рода Fusarium на проростки пшеницы Ранее исследованиями сотрудников лаборатории биотехнологии Башкирского ГАУ (Мубинов, 2007) было показано, что эндофитные штаммы B. subtilis могут проявлять на растениях антистрессовый эффект. В связи с этим мы изучали протекторный эффект эндофитов при действии на проростки пшеницы фитотоксичных метаболитов грибов рода Fusarium как стрессовых агентов. Метаболиты всех видов грибов обладали фитотоксичностью, которая проявлялась в торможении прорастания семян, ингибировании роста и развития проростков. Самым сильным ингибитором роста был изолят F. sporotrichioides, снижавший всхожесть семян на 35% по сравнению с контролем. Рост корней на неразведенном КФ снижался почти в 4 раза, а колеоптилей – в 2 раза по сравнению с контролем. Фитотоксины КФ ^ F. poae в 4 раза ингибировали рост корней проростков, но не влияли на рост колеоптилей. Аналогично, КФ F. graminearum и F. аvenaceum оказались более токсичными для корней и в меньшей степени для колеоптилей. При разбавлении КФ наблюдалось закономерное увеличение всхожести семян и размеров проростков, как и повышение эффективности протекторного действия бактерий, спорами которых предварительно обрабатывали семена. Так, например, при использовании штамма ^ B. subtilis 11РН корни проростков, растущих на концентрированном КФ F. аvenaceum были длиннее, чем у необработанных проростков на 16%, а колеоптили – на 36%. Наилучшее фитопротекторное действие по отношению к метаболитам F. poae отмечено у штамма B. subtilis 26Д, под действием которого длина корней и колеоптилей при выращивании проростков на разбавленном КФ достигали значений у контрольных семян, необработанных КФ и спорами бацилл. Несмотря на то, что ^ F. sporotrichioides и F. poae являются представителями одной секции Sporotrichiella, первый вид оказался более токсичным для проростков пшеницы, чем второй. Это может быть связано с тем, что Т-2 токсин, синтезируемый F. sporotrichioides, является наиболее токсичным по отношению к растениям пшеницы по сравнению с токсинами, продуцируемыми F. poae.^ Токсико-гигиеническая оценка штамма B.subtilis 11РН. При токсико-гигиенической оценке штамма изучались вирулентность, токсичность и токсигенность, способность к диссеминации в организме, дисбиотическое влияние, действие на иммунную систему, местное раздражающее действие. Установлено, что штамм B. subtilis 11РН относится к группе не вирулентных, не токсичных и не токсигенных. Оценка способности штамма к диссеминации в организме показала, что поведенческие реакции подопытных и контрольных животных существенно не различались, отмечалась лишь некоторая тенденция к снижению показателя норкового рефлекса в подопытной группе. Клеточный состав периферической крови также не имел достоверных колебаний. В сыворотке крови подопытной группы крыс выявлено возрастание ферментативной активности щелочной фосфатазы, что свидетельствует об активации детоксикационных процессов в гепатоцитах и может быть связано с усилением реакций метаболизма чужеродных белков и обеспечением гомеостаза. Диссеминация микроорганизма во внутренние органы не обнаружена. Установлено, что продолжительное введение культуры штамма не оказывает влияния на кишечную микрофлору. Количественный и качественный состав микробиоценоза, выделенного из кишечника животных, не имел существенных различий с фоновыми данными и микрофлорой контрольной группы. Выявлено, что штамм обладает слабым аллергенным действием. При этом не отмечается местный раздражающий эффект на слизистые оболочки глаз при контакте с клетками бактерий. Согласно заключения Уфимского НИИ МТиЭЧ Роспотребнадзора штамм является безопасным по основным параметрам, определяемым в такого рода исследованиях и может быть использован в качестве промышленного при соблюдении норм и правил санитарного законодательства.^ Эффективность применения препарата на основе штамма B. subtilis 11РН для биоконтроля фузариоза зерна. В связи с высокой антагонистической активностью штамма B. subtilis 11РН к грибам рода Fusarium, на основании его токсико-гигиенической оценки, а также способности подавлять распространение вредоносного для пшеницы гриба Tilletia caries (DC.)Tul (Хайруллин и др., 2009) мы изучали возможность его использования в качестве действующей основы препарата для биоконтроля фузариоза зерна яровой пшеницы в условиях республики. Для этого семена с самой высокой степенью заражения фузариозом (17% в 2007 г и 28% в 2008 г) обрабатывали препаратом, содержащим споры штамма в концентрации 1 млрд. КОЕ/мл и высевали в трех разных природно-сельскохозяйственных зонах. При исходно одинаковой зараженности семян распространенность инфекции в зерне нового урожая и эффективность препарата зависели от зоны (табл. 4). Таблица 4 – Влияние препаратов на распространенность грибов рода Fusarium в зерне исследованных сортов пшеницы в 2008 г (%) Зоны Варианты Контроль Раксил Бинорам (^ Pseudomonas fluorescens) В. subtilis 11РН Северная лесостепь 12 9 16 7 Южная лесостепь 14 11 8 7 Предуральская степь 10 5 12 7 В предуральской степи эффективнее было применение препарата раксил, в южной лесостепи – биопрепаратов, а в северной - нового препарата на основе штаммам В. subtilis 11РН. В 2009 г опыты повторяли (табл. 5), включая обработку колоса после цветения пшеницы. Эффективность обработки семян и колоса была несущественно выше, чем только обработка семян. В предуральской степи применение биопрепарата не уступало фунгицидам по эффективности снижения фуазриозной инфекции, а в северной лесостепи – на 40% превышало её. Таблица 5 – Влияние препаратов на распространенность грибов рода Fusarium в зерне исследованных сортов пшеницы в 2009 г (%) Зоны Контроль (вода) Препарат семена семена + колос Террасил Террасил + фоликур ^ В. subtilis 11РН В. subtilis 11РН + В. subtilis 11РН СЛ* 20 21 15 14 11 10 ПС 5 7 4 3 4 3 Примечание: * - северная лесостепь; ** - предуральская степь. Урожайность зерна пшеницы на делянках, где семена были обработаны препаратом на основе штамма ^ B. subtilis 11РН, была выше, чем на контрольных и, в среднем, практически одинакова, что и при обработке семян химическим эталоном (табл. 6). Таким образом, экспериментальный микробиологический препарат представляется перспективным для регистрационных испытаний с целью включения его в Государственный каталог пестицидов и агрохимикатов, разрешенных к применению на территории Российской Федерации. Таблица 6 – Влияние обработки семян препаратами на урожайность пшеницы (г/м2) Зона Контроль Раксил ^ B. subtilis 11РН Башкирская-26, 2008 г Северная лесостепь 160±9 212±11 212±7 Южная лесостепь 155±10 155±12 213±8 Предуральская степь 165±13 170±10 182±12 Среднее значение 160 179 202 Казахстанская-10, 2008 г Северная лесостепь 161±11 220±7 200±7 Южная лесостепь 180±11 153±8 183±13 Предуральская степь 186±13 253±8 223±8 Среднее значение 176 209 202 Омская-36, 2009 г Северная лесостепь 215±14 275±13 285±8 Предуральская степь 300±11 311±6 320±9 Среднее значение 258 293 303 ^ Влияние бактериального препарата на структуру фузариозного фитопатогенного комплекса в зерне пшеницы. Применение эндофитных штаммов бактерий, способных проникать внутрь тканей растений и подавлять в них развитие фитопатогенов вплоть до созревания зерна (Недорезков, 2003) как агентов биоконтроля может менять видовой состав грибов в зерне нового урожая. В связи с этим мы исследовали встречаемость разных видов грибов Fusarium в репродуцированных семенах (рис. 3). При обработке семян препаратом на основе ^ B. subtilis 11H встречаемость грибов F. poae и F.sporotrichioides увеличилась до 83%, химическим препаратом террасил – до 70%, тогда как в контроле соотношение этих двух видов с другими было 1:1. Аналогичная закономерность наблюдалась также и при двукратной обработке растений, первоначально протравливанием семян, а затем опрыскиванием колоса. Согласно данным польских исследователей (Plaskowska, Chrzanowska-Drozdz, 2009), обработка семян твердой пшеницы фунгицидами также приводит к элиминации в зерне одних видов и повышает распространение других видов грибов, в том числе и рода Fusarium. Мы полагаем, что к такому результату могут привести, как изначальные ра