Изучение вопросов биотехнологии в курсе химии средней школы

Изучение вопросовбиотехнологии в курсе химии средней школы


Введение
 
Актуальностьисследования: в настоящее время российское химическое образование претерпеваетглубокие изменения. Возросла необходимость в новых методических разработках,отражающих современное состояние науки. Особого внимания заслуживаетинформация, касающаяся интеграционных тенденций между различными отраслямизнания. Конкретизировать изложенные положения позволяет целый спектр тем,затрагивающих различные направления биологических наук. Одно из первых местзанимают новые направления биотехнологии, прежде всего генетическая инженерия,которая привела к «биотехнологическому буму», свидетелями которого мы являемся.
Такимобразом, для ориентации человека в новой информационной и материально-техническойсреде обитания, формирования реалистического взгляда на окружающий мирнеобходима постановка новых задач обучения. Преодоление абстрактности иоторванности учебного материала от жизни, которые влекут к потерепознавательного интереса, – приоритетная задача обучения. Наличиепознавательного интереса является важным условием формирования высокогокачества знаний.
Другойстороной абстрактности при изучении биологии является недооценка её роли ввозникновении и решении глобальных продовольственных, сырьевых, экологическихпроблем настоящего и будущего. Кому как не биотехнологии, вышедшей из недрхимии и биологии, заниматься этими проблемами. Сегодня нам ясно, что открытиябиохимии глубоко скажутся на судьбе человечества.
Учитываяразопщённость и поверхностность вопросов биотехнологии почти во всех предложенныхпрограммах (см. главу 2) целью работы является разработка элективногокурса по теме «основы биотехнологии» а также комплекса фрагментов включенияданного материала в общепринятые биологические программы.
Объектисследования: место и процесс применения изучаемой темы в структуребиологического образования.
Предметомисследования является разработка методических рекомендаций к изучению темы«основы биотехнологии».
Длядостижения цели были поставлены следующие задачи:
1. Проанализироватьметодическую литературу, обосновать актуальность темы.
2. Проанализироватьлитературу, дающую обзор основных вопросов биотехнологии.
3. Подобратьматериал к проведению уроков по данной теме и разработать методическиерекомендации по его использованию.
4. Подобратьлабораторные работы, которые следует включить в изучение данной темы.
5. Провестипедагогический эксперимент.
Поставленныезадачи решались с использованием методов, соответствующих объекту и предметуисследования
Теоретические
· Анализлитературы по теме, систематизация теоретического материала
· Теоретико-методическийанализ проблемы
Эмпирические
· Общепедагогические:наблюдение и самонаблюдение, беседа
· Химические:лабораторный эксперимент
Также былавыдвинута гипотеза: при включении материала биотехнологического уклона вучебный процесс предполагаем повышение познавательного интереса и мотивации кобучению у учащихся.

1. Основыбиотехнологии (литературный обзор)
 
1.1 Основыгенетической инженерии
Историяразвития генетической инженерии
Генетическаяинженерия – раздел молекулярной генетики, исследующий возможности и способысоздания лабораторным путем (in vitro) генетических структур и наследственноизмененных организмов, т.е. создания искусственных генетических программ, спомощью которых направленно конструируются молекулярные генетические системывне организма с последующим их введением в живой организм (А.А. Баев). Обычноупотребляются два названия данного научного направления – генетическая инженерияи генная инженерия, являющиеся как бы синонимами[7]. Однако их смысловоесодержание неодинаково: генетическую инженерию связывают с генетикой, а геннаяимеет отношение только к генам. Кроме того, генетическая инженерия точнеераскрывает содержание дисциплины – создание генетических программ, основнаязадача которых – создание in vitro молекул ДНК посредством соединения фрагментовДНК, которые в естественных условиях чаще не сочетаются благодаря межвидовымбарьерам (рекомбинантные ДНК). Молекула рекомбинантной ДНК представляетсобой соединенные в бесклеточной системе два компонента: вектор (смотри ниже), обеспечивающиймеханизм репликации и экспрессии, и фрагмент клонируемой («чужеродной») ДНК,содержащий интересующие исследователя генетические элементы. Согласноопределению национальных институтов здоровья США, «рекомбинантными ДНК называютмолекулы ДНК, полученные вне живой клетки путем соединения природных илисинтетических фрагментов ДНК с молекулами, способными реплицироваться вклетке». Первая рекомбинантная ДНК получена в 1972 г. (П. Бергом ссотр.) и была составлена из фрагмента ДНК обезьяньего вируса ОВ40 ибактериофага λ dvgal с галактозным опероном E. coli. Формально 1972 г.следует считать датой рождения генетической инженерии.
Генетическая инженерияимеет яркую историю благодаря тому общественному резонансу, который она вызвалас самых первых своих шагов. Начало этим событиям положило послание участниковГордоновской конференции (1973) президиуму АН США, в котором говорилось овозможной опасности технологий рекомбинантных ДНК для здоровья человека.Возможные блага генетической инженерии признавались с самого начала, норазногласия по данной проблеме не затихли и сейчас. В таблице 1 перечисленыосновные этапы становления и развития генетической инженерии.
Таблица 1. Основныеэтапы развития генетической инженерииГод Автор Содержание открытия 1869 Ф. Мишер Выделена ДНК из ядер клеток гноя 1880 А. Коссель[5] Выделение азотистых оснований 1928 Гриффитс[3] Явление бактериальной трансформации 1929 П. Левин, Е. Лондон Выделение 2-D-дезоксирибозы 1930 Эвери, Мак-Карти и Мак-Леод Выделение вещества гена 1938 Беренс Локализация н.к. 1940 Браун и Тодд Принципы химического строения полинуклеотидной цепи. 1950 Э. Чаргафф Закономерности нуклеотидных отношений 1953 Д. Уотсон, Ф. Крик Сконструирована модель двойной спирали ДНК на основании результатов рентгеноструктурного анализа ДНК 1956 Волкин, Астрахан и Херши Открытие и-РНК 1957 А. Корнберг Синтез ДНК in vitro 1961 А. Мармур и П. Доти Открыто явление ренатурации ДНК и установлены точность и специфичность реакции гибридизации нуклеиновых кислот 1962 В. Арбер Впервые получены сведения о ферментах рестрикции ДНК 1968 М. Мезельсон и Е. Юань Выделена первая рестриктаза 1966
М. Ниренберг, С. Очоа,
Г. Корана Расшифрован генетический код 1967 М. Геллерт Открыта ДНК-лигаза 1970 Г. Тёмин, С. Мизутани Открыта ревертаза 1972–1973 Г. Бойер, С. Коэн, П. Берг Разработана технология клонирования ДНК 1975–1977
Ф. Сэнгер, Р. Баррел,
А. Максам, В. Гилберт Разработаны методы быстрого определения нуклеотидной последовательности 1979 Г. Корана Синтезирован ген тирзиновой супрессорной РНК 1981–1982 Р. Пальмитер, Р. Бринстер, А. Спрэдлинг, Г. Рубин Получена трансгенная мышь. Получены трансгенные экземпляры дрозофилы 1993
Л.К. Эрнст, Г. Брем,
И.В. Прокофьев Получены трансгенные овцы с геном химозина
Биотехнологиярекомбинантных ДНК
Технологиярекомбинантных ДНК включает набор, как новых методов, так и заимствованных издругих дисциплин, в частности из генетики микроорганизмов. Эти методысущественно расширяют возможности генетических исследований. К наиболее важнымметодам биотехнологии рекомбинантных ДНК следует отнести следующие:
1. Специфическоерасщепление ДНК рестрикцирующими нуклеазами, что в значительной степениускоряет выделение различных генов и манипуляции с ними.
2. Быстроесеквенирование всех нуклеотидов в очищенном фрагменте ДНК, позволяющееопределить точные границы гена и кодируемую им аминокислотнуюпоследовательность полипептида.
3. Гибридизациянуклеиновых кислот, позволяющая с большой точностью выявить специфическиенуклеотидные последовательности на основе их способности связыватькомплементарные основания.
4. КлонированиеДНК, суть которого сводится к введению ДНК-фрагмента в самореплицирующийсягенетический аппарат (плазмиду или вирус), который используют для трансформациибактерий. Бактериальная клетка после трансформации способна воспроизводить этотфрагмент во многих миллионах идентичных копий.
5. Генетическаяинженерия, позволяющая получать модифицированные версии генов(сайт-спецефический мутагенез и т.д.) и затем внедрять их в клетки илиорганизмы.
РасщеплениеДНК в специфических участках нуклеотидных последовательностей осуществляетсяособыми ферментами – рестрикцирующими нуклеазами, способными разрушитьчужеродную ДНК. Каждый фермент, способный разрушить чужеродную ДНК, опознает вней специфическую последовательность из 4–6 нуклеотидов (сайт узнавания).Соответствующие последовательности в геноме бактерий замаскированыметилированием остатков с помощью метилаз.
Для успешногорешения задач генетической инженерии очень важно быстро секвенировать(определять последовательность нуклеотидов) любых очищенных фрагментов ДНК[8].В середине 70-х г. в этой области произошел решительный перелом, связанный соткрытием рестриктаз и усовершенствованием метода гель-электрофореза, когдастало возможным разделять достаточно протяженные фрагменты ДНК, отличающиесяразмером всего на один нуклеотид. С помощью рестриктаз ДНК стали разрезать наопределенные блоки и определять в них позиции нуклеотидов химическими (А. Максами У. Гилберт 1976) или энзиматическими (Сангер и Коулсон 1975) методами.
Важнейший методполучения рекомбинантных ДНК основан на способности нуклеиновых кислотбыстро восстанавливать свою структуру после нагревания до 100ºС в сильнощелочной среде (рН 13) [9]. При нагревании до 100ºС комплементарные парыоснований разрушаются, и ДНК диссоциирует на две раздельные цепи. Этот процессназван денатурацией ДНК («плавлением»). Выдерживание комплементарных цепей притемпературе 65ºС приводит к их спариванию и восстановлению структурыдвойной спирали (гибридизация, ренатурация, или «отжиг»).
Обмен генами,а также введение в клетку гена другого вида организма осуществляют посредством генетическойрекомбинации in vitro.
Дляэффективного введения (трансформации) необходимо иметь достаточное число копийнуклеотидных последовательностей.
Полимеразнаяцепная реакция (ПЦР) – это метод амплификации фрагментов нуклеиновых кислот in vitro, с помощью которогоможно достаточно быстро (в течение нескольких часов) получить миллионы копийопределенных нуклеотидных последовательностей (генов) [9]. Метод был предложенв 1985 г. К. Мюллисом (биотехнологическая корпорация «Cetus», США) и получил широкоераспространение в 1988 г., когда Р. Сайки с соавт. была опубликованаосновополагающая работа по теории ПЦР и её оптимизации. Метод ПЦР, названный«изобретением века» и очень скоро, в 1993 г., отмеченный Нобелевскойпремией, ускорил реализацию программы «Геном человека», а также способствовалвнедрению в практику клинической диагностики многих заболеванийвысокоэффективных диагностических наборов нового поколения.
В методе ПЦРдля амплификации фрагментов ДНК используют термоустойчивую ДНК-полимеразу изтермофильной бактерии Thermusaquaticus (Taq-полимеразу), которая вприсутствии всех 4 видов дезоксирибонуклеозидтрифосфатов и коротких 20–30-членныхзатравок (праймеров) осуществляет синтез комплементарных последовательностейДНК. ПЦР имеет циклический, включающих нагревание и охлаждение проб, и цепнойхарактер, так как синтезированные фрагменты ДНК в дальнейшем сами служат матрицей,на которой идет синтез. Повторяя циклы амплификации 30–40 раз, за 1,5 – 3 чполучают миллионы копий фрагментов ДНК.
Лигазнаяцепная реакция проводится по принципу, аналогичному ПЦР, но вместо Taq-полимеразы и dNTP используетсятермостабильная ДНК-лигаза и 4 специфических олигонуклеотида, добавляемых вреакционную смесь в избытке. Каждые 2 олигонуклеотида комплементарны камплифицируемому фрагменту ДНК-матрицы и непосредственно примыкают друг кдругу; одновременно они комплементарны и другой паре олигонуклеотидов.
NASBA-метод (Nucleic Acid Sequence – Base Amplification), разработанный впоследние годы, является наиболее универсальным методом амплификации как ДНК,так и РНК. Этот метод, в отличие от ПЦР, является изотермальным иосуществляется при 41ºС. Основными компонентами NASBA-системы являютсяРНК-полимераза фага Т7, РНКаза Н (гидролизует РНК в составе гибрида РНК: ДНК, ноне атакует свободную ДНК) и обратная транскриптаза вируса птичьегомиелобластоза. В систему входят также нуклеозидтрифосфаты и два специфическихпраймера, один из которых содержит участок, представляющий собойпоследовательность (промотор), распознаваемую РНК-полимеразой.
Один изважных этапов конструирования молекулы ДНК – лигирование (или сшивание) генов спомощью фермента ДНК – лигазы. Сшивание фрагментов ДНК, содержащих нужные гены,осуществляют двумя основными методами: а) по «липким» концам; б) с помощьюискусственно достроенных «липких» концов.
Сшиваниегенов(фрагментов) (рис. 1) ДНК по «липким» концам, т.е. взаимнокомплементарнымучасткам, длиной из 4–6 пар нуклеотидов, достаточно легко осуществляется ферментомДНК-лигазой с образованием ковалентной фосфодиэфирной связи между соседниминуклеотидами:
– – А ТГ Ц А А Т Т             Ц А Г Т Ц – – – – – –
Т А Ц Г                ТТ А А Г Т Ц А Г – – – – – –
/>Сшивание           ДНК-лигаза
А Т Г Ц А А ТТ – Ц А Г Т Ц
Т А Ц Г – Т ТА А – Г Т Ц А Г
Рис. 1. Сшиваниегенов
Приотсутствии комплементарных «липких» концов у сшиваемых фрагментов ихдостраивают, т.е. синтезируют искусственно ферментативным путем (коннекторныйметод получения гибридных молекул ДНК), используя концевую (терминальную)дезоксинуклеотидилтрансферазу из тимуса теленка или поли(А) – полимеразу E.coli.
Также, длястыковки фрагментов применяют так называемые линкеры (рис. 2) (или«переходники») – короткие участки ДНК, имеющие разные «липкие» концы:
– А Т ГЦ А А Т Т       Ц Т Г А Г А Т Ц Ц А            Т А Ц Г
Т А Ц Г Т Т АА          Г А Ц Т Ц Т А Г Г Т             А Т Г Ц
Фрагмент 1                            Линкер                Фрагмент 2
Рис. 2. Объединениефрагментов линкерами
Линкерныефрагменты не только обеспечивают объединение генов, но и обусловливают ихэкспрессию, в связи с чем, часто в середину линкера помещают какой-либорегуляторный генетический элемент, например промотор, или участок связывания срибосомой.
После тогокак рекомбинантная ДНК сшита, ее вводят в живые клетки. При этом рекомбинантныеДНК становятся составной частью генетического аппарата реципиентного организмаи, кроме того, они привносят в него новые генетические ифизиолого-биохимические свойства, полезные для человека. Но поскольку она не способнак самовоспроизведению, её разрушают внутриклеточные нуклеазы. Для того чтобырекомбинантная ДНК стала составной частью генетического аппарата клетки, онадолжна либо встроиться (интегрироваться) в её геном и реплицирваться за егосчет, либо быть способной к автономной репликации. Принято молекулы ДНК,способные акцептировать чужеродную ДНК и автономно реплицироваться, называть векторнымимолекулами. К числу векторов относят плазмиды, бактериофаги, вирусыживотных. Векторы должны обладать следующими особенностями:
1.  Иметь субстратные участкидля определенных эндонуклеаз рестрикции.
2.  Иметь свойства репликона.
3.  Содержать один илинесколько маркерных генов, которые после проникновения вектора в клетку придаютей фенотип, свидетельствующий о присутствии вектора.
Такимобразом, все векторы обеспечивают репликацию встроенных генов, их экспрессию,интеграцию в хромосому клетки и т.д. Чаще других в генетической инженерии вкачестве векторов используют плазмиды. Плазмидами называют стабильнонаследуемые бактериальные репликоны (внехромосомные элементы наследственности).Они представляют собой двуцепочечные кольцевые молекулы ДНК с вариабельными молекулярнымимассами. Они детерминируют разные свойства: резистентность к антибиотикам (R-плазмиды); биодеградацию(D-плазмиды) и др.Например, плазмиды стафилококков несут гены устойчивости к пенициллину,соединениям ртути и др. Количество плазмид в клетке может колебаться от однойдо более ста.
Первыйплазмидный вектор был получен С. Коэном (1973). Его источником былаплазмида E. coli R6-5 c Mr 65 кДа. Плазмида сталародоначальником серии векторов и других структур.
Плазмида pBR313 содержит уникальныеучастки расщеплений нескольких рестриктаз (рис. 3).

/>
Рис. 3.Схема использования плазмиды pBR322 для отбора клеток, содержащих рекомбинантныеплазмиды[14].
Возможностиплазмид для генетической инженерии не беспредельны, что связано с их небольшимиразмерами. Когда нужно клонировать крупные фрагменты ДНК, удобнее использоватьвекторы на основе бактериофага λ. Геном фага λ досконально изучен[9].В центральной части линейного генома фага содержится область, необязательнаядля литической инфекции, которую и используют для вставки клонируемой ДНК. ДНКфага λ разрезают с помощью рестриктазы Eco RI, удаляют необязательнуюцентральную область и на её место встраивают нужный фрагмент ДНК, получая,таким образом, конкамер – предшественник для упаковки фаговой ДНК взрелые фаговые частицы. Фаг λ очень пластичен: без нарушения развития фагаиз него можно убрать до 25% ДНК или пристроить до 6% лишней ДНК. В этот фаговыйвектор можно встраивать до 23 000 н.п.
В техслучаях, когда не хватает возможностей фага, используют ещё более крупные векторы– космиды. В состав космид входят: ген (маркер) резистентности кантибиотикам, репликон плазмиды и фрагмент ДНК фага λ (так называемый cos-участок). Этот фрагментпредставляет собой однонитевые комплементарные участки на концах фаговой ДНК, т.е.«липкие концы».
Ещё один видвекторов – фазмиды, искусственные гибриды между фагом и плазмидой. Послевстройки чужеродной ДНК они в одних условиях могут размножаться как фаги, а вдругих – как плазмиды.
Векторы наоснове нитевидных фагов применяют тогда, когда удобнее работать с одной цепью ДНК.Так, фага М13 и fd содержат кольцевую одноцепопочечную ДНК с полностью изученнымипоследовательностями нуклеотидов.
Дрожжи Saccharomycescerevisiae представляют собойперспективные модели для экспериментов с рекомбинантными ДНК. Их гаплоидныйгеном содержит 1,4 х 107 н.п. (в 3 раза больше, чем у E.coli), распределенных по 17хромосомам. Дрожжи не инфицируются вирусами, но в их клетках выявлена плазмида,используемая в качестве вектора – 2 мкм-плазмидная ДНК. Важной особенностьюдрожжевых систем является то обстоятельство, что клонируемые фрагменты ДНКспособны к рекомбинации с гомологичными участками дрожжевого генома, что ведетк стабильной сайт-специфической трансформации последнего (независимо отсохранения или утраты вектора).
Векторныеплазмиды и векторные вирусы со встроенными чужеродными генами часто называют гибридными(или химерными) плазмидами (или фагами). После конструированиярекомбинантных ДНК их с помощью трансформации вводят в реципиентный организм:бактериальную, грибную, растительную или животную клетку. Трансформацияпредусматривает предварительную обработку клеток соединениями(CaCl2), обусловливающимипроникновение ДНК внутрь клеток с последующим их помещением в среду, в которойспособны существовать только клетки, получившие векторную молекулу, например всреду с определенным антибиотиком.
Процессинфицирования клеток с помощью чужеродных ДНК, приводящий к образованию зрелогофагового потомства, назван трансфекцией.
Однакоэффективность проникновения экзогенной ДНК в клетку довольно низка. Поэтомусреди бактерий, подвергшихся трансформации, только небольшая часть оказываетсятрансформированной. Отделение её от общей массы возможно также в процессеклонирования. Для клонирования бактериальную суспензию определеннойконцентрации выливают на твердую питательную среду, например на агар спитательными добавками в чашке Петри из расчета 5–10 бактерий на 1 см2поверхности. Бактериальная клетка на поверхности агара начинает делиться собразованием в итоге маленькой колонии, похожей на шляпку гриба. Эта колонияназывается клоном, причем из каждой клетки образуется свой клон, всеклетки которого имеют свойства бактерии-родоначальника.
Рекомбинантныеклоны могут быть идентифицированы по синтезируемому ими продукту (иммунологическийметод Брума–Джилберта) [4]. Но чаще приходится идентифицировать непосредственнонуклеотидную вставку с использованием методов гибридизации (Грюнштейн – Хогнесс)[18]. (рис. 4).

/>
Рис. 4.Метод радиоавтографии в применении к поиску рекомбинантных клонов[14].
Из фрагментоввирусных и бактериальных хромосом уже выделен целый ряд генов. Что же касаетсявыделения специфических генов из фрагментированных эукариотических хромосом, тореализация этой процедуры все еще остается сложной и трудоемкой задачей.Существует два основных подхода для получения специфических генов, подлежащихзатем рекомбинации и клонированию. В одном из них, который получил название«шотган» (от англ. shotgun – дробовик), всю клеточную ДНК обрабатывают рестриктирующейэндонуклеазой, образующей в местах разрыва выступающие концы. Полученныефрагменты ДНК встраивают затем в плазмиды E.coli, «раскрытые» (т.е.переведенные в линейную форму) с помощью той же самой рестриктирующейэндонуклеазы. В результате образуется чрезвычайно сложная смесь, состоящая,вероятно, из тысяч разных рекомбинантных плазмид, среди которых лишь одна можетсодержать нужный ген. Для поиска плазмиды, несущей этот ген, разработаныспециальные процедуры, которые называют скринингом.
Другойподход, используемый для получения нужных генов, состоит в конструировании намРНК-матрице комплементарной по отношению к ней ДНК (кДНК) [11].Теперьспецифическую мРНК, кодирующую белок, ген которого надо получить, можноиспользовать в качестве матрицы для ферментативного синтеза кДНК с помощьюобратной транскриптазы (ревертазы). (рис. 5).
Послерасщепления гибрида ДНК-РНК, используя видоизменённую протеазами ДНК-полимеразуE.coli – фрагмент Клёнова,синтезируют двухцепочечную ДНК.
Послерасщепления «шпильки» остается синтетическая двуцепочечная кДНК,соответствующая белку, кодируемому интересующим нас геном. Заметим, однако, чтоесли эту синтетическую кДНК получали с эукариотической мРНК, то она неидентична природному гену этого белка, поскольку не содержит ни интронов, т.е.вставочных последовательностей, ни стартовых и терминирующих сигналов, присущихгенам большинства эукариотических белков. И для экспрессии такого гена в клеткахпрокариот необходимо, чтобы он находился под контролем прокариотическихрегуляторных элементов. В связи с этим для осуществления экспрессиисоответствующая кДНК присоединяется к регуляторным элементамбактерии-промотору, оператору и рибосом-связывающему участку.
Насовременном этапе также возможен химико-ферментативный синтез полинуклеотидныхпоследовательностей. Синтез гена впервые был осуществлён в 1970 году влаборатории Х.Г. Кораны.

/>
Рис. 5.Схема подготовки кДНК для клонирования[14].
Клонированиеи экспрессия генов в различных организмах
В настоящеевремя разработаны системы клонирования в бактериях, дрожжах, грибах, растенияхи млекопитающих. Особый интерес с экономической точки зрения представляютсистемы клонирования генов в грамположительных бактериях, многие из которыхявляются сверхпродуцентами важнейших химических соединений[7]. Значительныхуспехов в биоиндустрии удалось достичь с клетками Bacillussubtilis, стрептомиценами и Sacchromycescerevisiae.
Векторы дляклонирования в таких системах представляют собой двойные репликоны,способные существовать и в E.coli, и в той клетке хозяина, для которой онипредназначены. С этой целью создают гибридные векторы, содержащие репликонкакой-либо из плазмид E.coli и требуемый репликон (из бактерий,дрожжей и др.), и первоначально клонируют с последующим отбором требуемых геновв хорошо изученной системе. Затем выделенные рекомбинантные плазмиды вводят вновый организм.
Инсулин – гормон поджелудочнойжелезы, регулирующий углеводный обмен и поддерживающий нормальный уровеньсахара в крови. Недостаток этого гормона в организме приводит к одному изтяжелейших заболеваний – сахарному диабету.
Обычноподжелудочная железа крупного рогатого скота и свиней не используется в мяснойи консервной промышленности и поставляется на фармацевтические предприятия, гдепроводят экстракцию гормона. Для получения 100 г. кристаллического инсулина необходимо 800–1000 кг исходного сырья. В 1978 г. появилосьсообщение о получении штамма кишечной палочки, продуцирующего крысиныйпроинсулин (США). В этом же году были синтезированы отдельные цепичеловеческого инсулина посредством экспрессии их синтетических генов в клетках E.coli (рис. 6).
/>
Рис. 6.Экспрессия гена проинсулина человека в составе гибридного белка с β-галактозидазой[14]

Былсинтезирован и ген соматостатина – гормона гипоталамуса. Соматостатинподавляет выделение инсулина и гормона роста человека. В Национальноммедицинском центре «Хоуп» (Калифорния) был осуществлен химико-ферментативныйсинтез гена длиной в 42 нуклеотида, способного кодировать соматостатин.Синтетический ген соматостатина был встроен в плазмиду pBR322 E.coli вблизи конца гена,кодирующего фермент β-галактозидазу. Между двумя генами был помещен кодонметионина. После введения рекомбинантной плазмиды в бактериальную клеткукишечная палочка стала синтезировать гибридный белок. Часть его (соматостатин)затем отщепляли от β-галактозидазы BrCN. Первый синтезсоматостатина генно-инженерным способом был осуществлен в 1977 г. Бойером.Выход гормона составил 10 000 молекул на одну клетку. Из 100 г. биомассы E.coli, выращенной в ферментереобъемом 8 л, удалось выделить 5 мг соматостатина, т.е. столько, сколькоможно его выделить из 100 кг овечьих мозгов.
Соматотропин (или гормон ростачеловека ГРЧ) секретируется передней долей гипофиза. Его недостаток приводит кзаболеванию – гипофизарной карликовости (1 случай на 5000 человек). Обычно егополучают из гипофиза трупов, но в недостаточном количестве. Гормона хватаетлишь для лечения 1/3 случаев гипофизарной карликовости в развитых странах.Препарат из трупного материала представляет собой смесь из нескольких форм. Этоприводило к тому, что у 30% больных, получавших препарат, против гормонавырабатывались антитела, сводившие на нет его биологическую активность.Принимая во внимание это обстоятельство, в настоящее время ГРЧ синтезируютметодами генетической инженерии в специально сконструированных клеткахбактерий. Биосинтез ГРЧ был осуществлен в 1979 г. Д. Гедделем ссотрудниками. Конечный выход гормона составил 2,4 мкг на 1 мл культуры, чтосоставляет 100 000 молекул гормона на клетку.
Проблемавведения генов в клетки млекопитающих очень важна для исследованияфункционирования генов высших эукариот[7].
Предварительноклонированные гены вводят в клетку животных различными путями. Суть одного изних состоит в трансформации клеток требуемым геном, соединенным с одним изгенов, для которых осуществляется селекция. Для идентификации и последующегоразмножения клеток, содержащих интегрированную ДНК, был разработан метод,получивший название метода маркера. Примером может служить метод полученияклеток, дефектных по синтезу фермента тимидинкиназы (ТК--клетки).Такие клетки трансформировались фрагментами ДНК вируса герпеса (HSV), содержащего генфермента ТК, и после трансформации они приобретали способность к синтезуфермента на селективной среде, т.е. становились ТК+-клетками. КлеткиТК+ легко отличаются от клеток ТК-, поскольку способнырасти на средах с аминоптерином (ингибитор, блокирующий определенные стадиибиосинтеза нуклеотидов). Следовательно, в данном случае для трансформацииклеток животных были использованы гибриды бактериальных плазмид с геном ТК извируса герпеса. Для этого предварительно проводили клонирование и идентификациюгенов в клетках E.coli и затем полученная рекомбинантная плазмидавводилась в ТК–клетки.
Представляютнемаловажный интерес микроинъекции ДНК непосредственно в ядро клетки. Еёосуществляют с помощью специальной пипетки (внутренний диаметр её около 1 мкм),а количество инъецированного раствора ДНК составляет 1–2 пкл. Так, плазмиды,содержащие фрагмент вируса герпеса с геном тимидинкиназы, и плазмиды pBR322 были инъецированы вТК-клетки, при этом ТК-ген проник в ядра и нормально в них реплицировался. Микроинъекциюклонированных генов проводят в один или оба пронуклеуса только что оплодотвореннойяйцеклетки мыши. После инъекции яйцеклетку немедленно имплантируют в яйцеводприемной матери или дают возможность развиваться в культуре до стадиибластоцисты, после чего имплантируют в матку. Таким образом, были инъецированыгены интерферона и инсулина человека, ген глобина кролика, ген тимидинкиназноговируса герпеса и кДНК вируса лейкемии мышей. Несмотря на определенные успехи вобласти интеграции чужеродных генов в эмбриональные клетки животных, до сих порне удалось встроить чужеродную ДНК в заданный участок хромосомы, вытеснить гени заменить его новой нуклеотидной последовательность, подчинить новый генсистеме регуляции организма.
Применениеметодов генетической инженерии в животноводстве открывает перспективу измененияряда свойств организма: повышение продуктивности, резистентности кзаболеваниям, увеличение скорости роста, улучшение качества продукции и др.Животных, несущих в своем геноме рекомбинантный (чужеродный) ген, принятоназывать трансгенными, а ген, интегрированный в геном реципиента, – трансгеном.Продукт этого гена (белок) является трансгенным. Благодаря переносу генов утрансгенных животных возникают новые качества, а дальнейшая селекция позволяетзакрепить их в потомстве и создавать трансгенные линии.
Генетическийанализ родившихся трансгенных животных и полученного от них потомства показал,что, несмотря на инъекцию ДНК на ранних стадиях, в трансгенных линиях могутпоявляться так называемые мозаики. К мозаикам относят животных,происходящих из одной зиготы, но имеющих разные генотипы. Подсчитано, что около30% первичных трансгенных животных, полученных методом микроинъекции ДНК, – мозаики,что затрудняет создание чистых трансгенных линий животных.
Первыетрансгенные мыши с ГР были получены в 1982 г. У них отмечалось повышениескорости роста и увеличение конечной живой массы. Однако у трансгенных свиней сгеном ГР (1989) увеличение роста не наблюдалось.
По данным Л.К. Эрнста(1996), у трансгенных свиней с геном рилизинг-фактора гормона роста (РФ ГР)конечная живая масса была на 15,7% выше по сравнению с контрольными животными.Однако у трансгенных овец с генами Гр и РФ ГР, несмотря на повышенный уровеньГР, скорость роста не увеличивалась.
Одна изважнейших задач использования трансгенных животных в медицине – получение биологическиактивных соединений за счет включения в клетки организма генов, вызывающиху них синтез новых белков.
В Эдинбурге в1992 г. были выведены трансгенные овцы с геном α-1-антитрипсиначеловека и β-глобулиновым промотором. Содержание этого белка у разныхтрансгенных овец составляло от 1 до 35 г./л, что соответствует половине всехбелков в молоке. При таком уровне продукции белка может быть получено около 10 кг трансгенного белка от одного животного в год, что достаточно для 50 пациентов при леченииэмфиземы легких. В России группой ученых под руководством Л.К. Эрнстаполучены трансгенные овцы с геном химозина, в 1 л молока которыхсодержится 200–300 мг химозина – основного компонента для производства сыра.Крупное достижение сделано учёными научного центра, в котором была созданапервая клонированная овечка – Долли. Исследователи из института Рослинапроизвели пять поколений птиц, в яичном белке которых содержатся человеческийинтерферон и miR24 антитела для борьбы с меланомой[20].
Генно-инженерныеметоды, в частности технология рекомбинантных ДНК, позволяют создавать новыегенотипы и, следовательно, новые формы растений гораздо быстрее, чемклассические методы селекции. Кроме того, появляется возможностьцеленаправленного изменения генотипа – трансформации – благодаря введениюопределенных генов.
Формальнымявлением генетической инженерии растений считается получение первого в мирехимерного растения – санбина (sunbeen) как результат переноса гена запасного белкабобовых (фазеолина) в геном подсолнечника (sunflower+been) [12].
Получениерастений с новыми свойствами из трансформированных клеток (регенерация)возможно благодаря их свойству тотипотентности, т.е. способности развиваться вцелое растение.
Перенос геновв растительные клетки, так же как и в клетки животных, и их встраивание в геномрастений (трансформация) осуществляются главным образом благодаря специфическимструктурам – векторам.
Некоторыевиды агробактерий (Agrobacteria) могут заражать двудольные растения,вызывая образование опухолей – корончатых галлов (рис. 7).
Одним изсамых сильных индукторов опухолей служит почвенная бактерия A.tumefaciens[12]. Способность этойбактерии к образованию опухоли связана с большой внехромосомной плазмидой,получившей название Ti-плазмида (от англ. tumor inducing – индуцирующие опухоль). Ti-плазмиды – этоестественные векторы для генов, обладающие всеми функциями, необходимыми дляпереноса, стабильного включения и экспрессии генетической информации врастениях. Они имеют широкий круг хозяев.
/>
Послезаражения часть Ti-плазмиды встречается в хромосомах клеток растения-хозяина (М. Монтесюи Д. Шелл [6])
Недостатокэтих плазмид состоит в том, что некоторые гены, находящиеся в Т-ДНК, заставляютрасти клетки растений независимо от гормонов, вносимых в питательную среду, накоторой культивируются данные клетки. В связи с этим очень труднорегенерировать нормальное растение из клеток, содержащих полнуюпоследовательность Т-ДНК. Другой недостаток – большие размеры Ti-плазмиды, из-за которыхзатруднены какие-либо манипуляции с ней, поэтому вставить ген в плазмиду традиционнымиспособами невозможно.
В настоящеевремя конструируются производные Ti-плазмиды, в которых оставляют регуляторныйучасток Т-области, а вместо её структурных генов вшивают структурную частьгена, который надо ввести в растение. Такие гены с позиции их регенерациибезвредны для растений (рис 8).
Существуют идругие бактерии (A.rhizogenes), вызывающие усиленное образование корешков призаражении растений. За этот процесс ответственны содержащиеся в них такназываемые Ri-плазмиды (от англ. root inducing – индуцирующий корни). Ri-плазмиды выгодноотличаются от Тi-плазмид тем, что они служат естественными безвредными векторами,так как трансформированные с их помощью растительные клетки сохраняютспособность к морфогенезу и к регенерации здоровых растений. В связи с этим Ri-плазмиды в данный моментрассматриваются как более перспективные векторы.
Подавляющеебольшинство фитовирусов в качестве носителя генетической информации содержатРНК. Только 1–2% вирусов, инфицирующих растения, относятся к ДНК-содержащим.Именно эти вирусы удобны для использования в технологии рекомбинантных ДНК, атакже в качестве векторов. Наиболее изученный представитель группы вирусов сдвухцепочечной ДНК – вирус мозаики цветной капусты (ВМЦК), поражающий восновном растения семейства крестоцветные. Обычно фитовирусы реплицируются собразованием большого числа копий молекул нуклеиновых кислот – 106 назараженную клетку.

/>
Поэтомуфитовирусы представляют собой очень эффективные средства для получения хорошейэкспрессии чужеродного гена. Однако вирусы в качестве векторов обладают исущественными недостатками: имеют небольшую емкость, патогенны и неспособнывстраиваться в хромосомы хозяина.
Методыпрямого переноса генов в растение возникли благодаря появлению специфическогообъекта – изолированных протопластов, т.е. клеток, лишенных целлюлозной стенки.
1) Трансформациярастительных протопластов осуществляется благодаря комбинации методиккальциевой преципитации ДНК и слияния протопластов. Для трансформации можетбыть использован практически любой ДНК-вектор.
2) Культурупротопластов на начальной стадии её роста заражают агробактериями, которыеиспользуют в качестве векторов.
3) МикроинъекцииДНК. Аналогичен методу микроинъекций животных клеток. Этот метод можнорассматривать как наиболее универсальный. Эффективность трансформациирастительных клеток – 10–20% независимо от типа вектора. Трансформация невидоспецифична, возможен перенос генов в любое растение.
4) Электропорация.Метод основан на повышении проницаемости биомембран за счет действия импульсоввысокого напряжения. В результате молекулы ДНК проникают в клетки через поры вклеточной мембране.
5) Упаковкав липосомы. Это один из методов, позволяющих защитить экзогенный генетическийматериал от разрушения нуклеазами растительной клетки. Липосомы – сферическиетельца, оболочки которых образованы фосфолипидами.
6) Методбиологической баллистики[6]. Это один из самых эффективных методовтрансформации однодольных растений. Исходный материал для трансформации –суспензионная культура, каллусная ткань или 4–5-дневные культивируемые незрелыезародыши однодольных. Метод основан на напылении ДНК-вектора на мельчайшиечастички вольфрама, которыми затем бомбардируют клетки. Бомбардировкаосуществляется с помощью биолистической пушки за счет перепада давления. Частьклеток гибнет, а выжившие клетки трансформируются, затем их культивируют ииспользуют для регенерации растений.
Решениепроблемы создания новых форм растений подразумевает в первую очередь повышениекачества синтезируемых растением продуктов, которые определяют его питательнуюи техническую ценность. В основном это касается запасных белков.
Начиная с 1970 г.стали появляться серьезные работы по изучению генов азотфиксации и их переносув клетки Klebsiellapneumoniae и E.coli. Конструированиеплазмид, несущих nif-гены, позволяет передавать способность к фиксации азота организмам,не обладающим этим свойством. Среди бактерий, кроме E.coli, такой перенососуществлен для бактерий Salmonellatyphimurium, Erwiniaherbicola и других. Однакоподобные манипуляции могут приводить к нежелательным эффектам. Так переносгенов в штамм Erwinia (бактерии, вызывающие гниение растений) может усилить егопатогенное действие.
В настоящеевремя внимание ученых привлекают проблемы введения генов азотфиксации в клеткирастений; создания ризоценозов между небобовыми растениями (особенно злаками) иазотфиксирующими организмами. Наиболее интересна первая проблема – введение nif-генов в клетки растений.Однако её решение сопряжено с рядом трудностей. Основная – разрушениенитрогеназы под воздействием кислорода. У азотфиксирующих микроорганизмовсуществует ряд приспособлений, защищающих бактерии от свободного кислорода.Таким образом, введение только nif-генов в какую-то растительную клетку не решаетпроблемы. Кроме того, сама клетка, в которую переносят гены азотфиксации, можетбыть не приспособлена к синтезу и расходованию большого количества энергии,которое требуется для фиксации азота. Следовательно, более перспективноповышение эффективности фиксации азота в уже существующих природных системах засчет воздействия на гены, контролирующие этот процесс, а также увеличениемощности корневой системы бобовых растений и создание новых азотфиксирующихсистем с помощью методов клеточной инженерии.
Наибольшийурон растениям приносят грибные, бактериальные и вирусные патогенны. В растениисуществуют защитные механизмы, которые в большей или меньшей степени (взависимости от устойчивости растений) начинают действовать в ответ напроникновение фитопатогенов в клетку. Во-первых, начинается синтез соединений,вызывающих гибель патогенов. Примером могут служить специфические белки PRP (pathogen related proteins). Из них наиболееизучены ферменты хитиназы и β-1,3 – глюконазы, которые угнетают ростгрибов и некоторых видов бактерий, разрушая их клеточные стенки. Во-вторых,могут создаваться структурные барьеры, препятствующие распространению инфекции.Это достигается благодаря лигнификации клеточных стенок.
Так, геныхитиназы и глюконазы кодируются одиночными генами. Благодаря этому былиполучены трансгенные растения табака и турнепса, в состав генома которых ввелиген хитиназы. Лабораторные и полевые испытания выявили большую устойчивостьтрансгенных растений. В растения томатов был введен ген защитных пептидовредьки (дефензинов) rs, отвечающих за устойчивость к фитопатогенным грибам.
Другой подходк получению трансгенных растений, устойчивых к вирусной инфекции, состоит вовведении в геном исходных растений гена оболочки вируса. Это приводит кингибированию размножения вируса и снижению инфицированности. Благодаря такомуподходу был получен стойкий антивирусный эффект у растений табака,трансформированных геном оболочки вируса табачной мозаики (ВТМ).
Созданиетрансгенных растений, устойчивых к насекомым, с помощью методов геннойинженерии стало возможным после того, как было обнаружено, что бактерии Bacillusthurengiensis синтезируютспецифический белок – прототоксин, высокотоксичный для насекомых. Попадая вкишечник насекомого, этот белок расщепляется, образуя активную форму токсина. Врезультате насекомое погибает. Ген, ответственный за экспрессию прототоксина,удалось обнаружить, выделить из генома B. thurengiensis и с помощью бинарноговектора ввести в геном растений табака.
Аналогичнымобразом растения томата были трансформированы генами другого инсектицидногобелка – эндотоксина. В итоге были получены первые трансгенные растения, которыене повреждали насекомые (рис. 9).
ИсследователиКолорадского университета (США) выяснили, что повреждению растений призамерзании способствуют бактерии эпифитной (поверхностной) микрофлоры Pseudomonassyringae и Erwiniaherbicola, белки которых служатцентрами кристаллизации[19]. Если обезвредить бактерии стрептомицином, торастения не замерзают при температуре -8ºС. Но стрептомицин дорог ивреден, поэтому выгоднее было изменить генетику данного штамма бактерий,вырезав из генома определенный ген. Растения, инфицированные мутантным штаммомP. syringae, росли при отрицательной температуре. Однакооказалось, что бактерии мутантного штамма более живучи и способны вытеснитьприродный штамм, который, попадая в верхние слои атмосферы, способствуеткристаллизации атмосферной влаги. Вероятно, уничтожение природного штамма моглобы привести к экологической катастрофе.
Нельзя несказать о «неопределённом» влиянии ГМ – продуктов на животные объекты. Всё жеотмечены факты: у крыс, которых в течении девяти месяцев кормили ГМ –картофелем, произошло стойкое нарушение иммунной системы и ЖКТ.

/>
Божьикоровки, которые питались тлями, жившими на ГМ – картофеле, становилисьбесплодными и т.д. Некоторые авторы связывают данные явления с«горизонтальными» потоками генетической информации[19].
Геннуютерапию на современном этапе можно определить как лечение наследственных,мультифакторных и ненаследственных (инфекционных) заболеваний путем введениягенов в клетки пациентов с целью направленного изменения генных дефектов илипридания клеткам новых функций[2]. Первые клинические испытания методов геннойтерапии были предприняты 22 мая 1989 года с целью генетического маркированияопухоль-инфильтрующих лимфоцитов в случае прогрессирующей меланомы. Первыммоногенным наследственным заболеванием, в отношении которого были примененыметоды генной терапии, оказался наследственный иммунодефицит, обусловленныймутацией в гене аденозиндезаминазы (ADA). 14 сентября 1990 годав Бетесде (США) четырехлетней девочке, страдающей этим достаточно редкимзаболеванием (1: 100 000), были пересажены её собственные лимфоциты,предварительно трансформированные вне организма (exvivo) геном ADA (ген ADA + ген neo + ретровирусный вектор).Лечебный эффект наблюдался в течение нескольких месяцев, после чего процедурабыла повторена с интервалом 3–5 месяцев. В результате лечения состояниепациентки настолько улучшилось, что она смогла вести нормальный образ жизни ине бояться случайных инфекций.
В 1997 годучисло допущенных к клиническим испытаниям протоколов составляло уже 175, более2000 пациентов приняли участие в их реализации.
До настоящеговремени интеграция в геном достигалась только при использовании ретровирусныхлибо аденоассоциированных векторов. В последнее время особое внимание уделяетсясозданию векторов на базе искусственных хромосом млекопитающих (Mammalian Artificial Chromosomes). Благодаря наличиюосновных структурных элементов обычных хромосом такие мини-хромосомы длительноудерживаются в клетках и способны нести полноразмерные (геномные) гены и их естественныерегуляторные элементы.
Современныйуровень знаний не позволяет проводить коррекцию генных дефектов на уровнеполовых клеток и клеток ранних доимплантационных зародышей человека в связи среальной опасностью засорения генофонда нежелательными искусственными геннымиконструкциями или внесением мутаций с непредсказуемыми последствиями длябудущего человечества.
1.2 Биотехнологическиепроцессы в пищевой промышленности
Молочныепродукты
В пищевойпромышленности для получения молочных продуктов применяют, главным образом,ферментацию[4]. В сквашивании молока обычно принимают участие стрептококки имолочнокислые бактерии; лактоза при этом превращается в молочную кислоту. Путемиспользования иных реакций, которые сопутствуют главному процессу или идут припоследующей обработке, получают и другие продукты переработки молока. Среди нихпахта, сметана, йогурт и сыр.
В молоке приферментации могут протекать шесть основных реакций, и в результате образуютсямолочная (СН3СН(ОН) СООН), пропионовая (СН3СН2СООН)или лимонная кислота ((НООССН2)2С(ОН) СООН), спирт (С2Н5ОН),масляная кислота (С3Н7СООН) или же происходит колиформноегазообразование. Главная из этих реакций – образование молочной кислоты. На нейоснованы все способы ферментации (сквашивания) молока. Лактоза молокагидролизуется при этом с образованием галактозы и глюкозы. Обычно галактозапревращается в глюкозу ещё до сквашивания. Имеющиеся в молоке бактерии преобразуютглюкозу в молочную кислоту (путь Эмбдена-Мейергофа-Парнаса). Образованиесгустка казеина происходит в изоэлектрической точке этого белка (рН 4,6) поддействием молочной кислоты. Этот процесс лежит в основе сыроварения.
Припроизводстве швейцарского сыра ключевую роль играет маслянокислое брожение собразованием углекислого газа.
С6Н12О6=СН3СН2СН2СООН+2СО2+2Н2
Именно этообуславливает своеобразный вкус (букет) этих сыров и образование глазков.Характерный вкус пахты, сметаны и сливочного масла формируется в результателимоннокислого брожения. Он складывается из составляющих вкусов диацетила (СН3С(О)С(О) СН3), пропионовой и уксусной кислот и близких к ним соединений.Различные процессы ферментации молока проводят сегодня в контролируемыхусловиях. В течение многих прошедших тысячелетий они осуществлялись при участиибактерий, исходно присутствующих в молоке. В наше время для этого используютразнообразные закваски, позволяющие получать молочные продукты нужного качестваи типа. Применяющиеся при этом культуры живых бактерий могут представлять либоодин какой-то штамм определенного вида, либо несколько штаммов и / иливидов.
Хотя свойствасыров чрезвычайно разнообразны, в процессе выработки всех их есть много общего.Первый этап – это подготовка культуры молочнокислых бактерий и засев ею молока.Затем молоко створаживают, для чего обычно применяют фермент реннин. Послеотделения водянистой жидкости (сыворотки) полученную творожистую массуподвергают термообработке и прессуют в формах. Далее сгусток солят и ставят насозревание. На следующем этапе сыры отправляют на созревание или выдержку.Созревание происходит в специальных помещениях с контролируемой температурой идлится до четырех лет. Микроорганизмы и ферменты в ходе этого процессагидролизуют жиры, белки и некоторые другие вещества молодого сыра. В результатеих распада образуются вещества, придающие сырам характерный вкус.
Из молочныхпродуктов проще всего получать масло. В зависимости от сорта производимогомасла используют сливки с концентрацией от 30–32 до 30–40%. При их сбиванииэмульсия масла в воде превращается в эмульсию воды в масле. При производствемасла для улучшения вкуса и лучшей сохранности используют особые культурыбактерий.
Приизготовлении сметаны к сливкам добавляют 0,5–1% закваски, используемой припроизводстве масла. Далее продукт выдерживают, пока концентрация кислоты недостигнет 0,6%.
Известно, чтонекоторые люди не переносят лактозу. Для них можно выпускать молоко,обработанное β-галактозидазой – ферментом, который уменьшает содержаниелактозы. Для этой цели нужно разработать недорогой промышленный способпроизводства такого молока. β-Галактозидазу получают из дрожжей, плесневыхгрибов и бактерий.
Хлебопродукты
Дляпроизводства хлеба до сих пор применяют в основном дрожжи Saccharomycescerevisiae. Обычно их растят вферментерах периодического действия на мелассе (свекловичной или сахарноготростника). В простейшем случае готовят тесто, смешивая муку, воду, дрожжи исоль. При замесе слои теста перемещаются, создаются условия для образованияпузырьков газа и подъема теста. Замешанному тесту дают возможность «подойти», азатем режут на куски нужного веса, формуют и выдерживают во влажной атмосфере.При выдержке и на первой, следующей за ней стадии выпечки образовавшиеся призамесе и формовке «зародыши» газовых пузырьков наполняются углекислым газом. Онвыделяется в ходе анаэробного сбраживания глюкозы и мальтозы муки. Поднявшеесятесто выпекают. В ходе этого термического процесса крахмал желатинизируется,дрожжи погибают, и тесто частично обезвоживается. Помимо углекислого газа прианаэробном брожении образуются органические кислоты, спирты и эфиры. Все онизаметно влияют на формирование вкуса хлеба.
Кромехлебопечения, крахмал используют для получения низкомолекулярных углеводов. Гидролизкрахмала в промышленном масштабе осуществляется разными способами: толькокислотой, кислотой и ферментами и только ферментами. В середине 60-х годов насмену кислотному и кислотно-ферментативному процессам пришел ферментативныйспособ переработки крахмала, основанный на последовательном применении α-амилазыB.subtilis и амилоглюкозидазы A.oryzae или A.niger. Кроме производстваглюкозы, наиболее заметным успехом в этой отрасли промышленности был выпусксмесей глюкозы и фруктозы. Этот продукт известен под названием изоглюкозы иликукурузного сиропа с высоким содержанием фруктозы. Изоглюкоза может заменятьсахарозу в большинстве видов пищи. Изомеризация осуществляется ферментами изразличных организмов. Выбор их определяется тем, насколько просто с нимиработать, нуждаются ли они в кофакторах и стабильны ли (смотри «Основыинженерной энзимологии»).
Бродильныепроизводства
Получениенапитков путем спиртового брожения – одно из древнейших бродильных производств.Первыми из таких напитков были, видимо, вино и пиво. До появления работ Пастерав конце ХIХв. о сути протекающих при брожении процессов и их механизмах было известноочень мало. Пастер показал, что брожение без доступа воздуха осуществляетсяживыми клетками дрожжей, при этом сахар превращается в спирт и углекислый газ.
С6Н12О6=2С2Н5ОН+2СО2
Тогда же былопоказано, что брожение осуществляется под действием каких-то веществ,находящихся внутри дрожжевых клеток. Одно из главных нововведений в областимикробиологии брожения было предложено Хансеном. Хансен выделил чистые культурыдрожжей и использовал их в пивоварении; тем самым он стал пионером применениятаких культур при производстве пива. Сбраживание осуществляется дрожжами рода Saccharomyces. В одних случаяхиспользуется природный сахар (например, содержащийся в винограде, из которогоделают вино), в других сахара получают из крахмала (например, при переработкезерновых культур в пивоварении). Наличие свободных сахаров обязательно дляспиртового брожения при участии Saccharomyces, так как эти виды дрожжейне могут гидролизовать полисахариды. Образование этилового спирта происходит посхеме Эмбдена – Мейергофа – Парнаса.
Традиционнымисточником нужных для этого полисахаридов в пивоварении всегда был ячмень.Ячменный солод и другие компоненты измельчают и смешивают с водой притемпературе до 67ºС. В ходе перемешивания природные ферменты ячменногосолода разрушают углеводы зерна. На заключительной стадии раствор, называемыйсуслом, отделяют от нерастворимых осадков. Добавив хмель, его кипятят в медныхкотлах. После добавления дрожжей всё помещают в бродильный чан. По истеченииопределенного времени брожение заканчивается, дрожжи отделяют от пива ивыдерживают его некоторое время для созревания.
Впроизводстве вина используют сахар виноградного сока. Почти все вино в миределают из винограда одного вида, Vitisvinifera. Виноделие в отличие отпивоварения до самого последнего времени было основано на использовании дикихместных дрожжей. Единственная обработка, которой подвергали виноград до отжима,– окуривание его сернистым газом, чтобы сок не темнел. Кроме того, сернистыйгаз подавляет деятельность невинных дрожжей; это позволяет винным дрожжам,которые менее чувствительны к нему, осуществлять брожение без помех. Приизготовлении красного вина гребни, косточки и кожица до конца брожениянаходятся в виноградном сусле (мусте), а белое вино делают из чистого сока.После завершения спиртового брожения молодое вино хранят в особых условиях,чтобы оно не испортилось. Если вино не предполагается подвергать яблочно-молочнокисломудображиванию, его обрабатывают сернистым газом, что подавляет окислительныепроцессы, вызывающие его потемнение. До этого из вина удаляют дрожжи, чтобыпрекратить брожение
Производствоперегнанного спирта моложе, чем неперегнанных спиртных напитков, но и его корнитеряются в веках. Для получения напитка, содержащего 40% (по объему) спирта,нужна перегонка. Её и сегодня осуществляют в перегонных аппаратах,представляющих собой модификации устройства, предложенного в 1830 г. Коффии носящего его имя. В спиртовом производстве используются пригодные для этойцели штаммы Saccharomyces.
Уксус – этопродукт, содержащий не менее 4% (вес/объем) уксусной кислоты; его получают спомощью двухстадийного процесса. Вначале осуществляют спиртовое брожение, в ходекоторого сахар сырья превращается в спирт при участии S. cerevisiae. После завершения этогоэтапа дрожжам дают осесть и собирают надосадочную жидкость. Содержание спиртадоводят до 10–13%. На следующем этапе этиловый спирт превращается в уксуснуюкислоту (промежуточным продуктом является ацетальдегид). Все процессы полученияуксуса идут при участии смешанных культур Acetobacter. Брожение происходит ааэробных условиях с потреблением больших количеств кислорода и выделениемтепла.
Производствокормового белка
Всоответствии с нормами питания человек должен ежедневно получать с пищей 60–120 г.полноценного белка. Если растения и большинство микроорганизмов способнысинтезировать все белковые аминокислоты из углекислоты, воды, аммиака иминеральных солей, то человек и животные не могут синтезировать некоторыеаминокислоты (валин, лейцин, изолейцин, лизин, метионин, треонин, триптофан ифенилаланин), которые называют незаменимыми. Эти аминокислоты должны поступатьв организм в готовом виде с пищей; их отсутствие вызывает тяжелые заболеваниячеловека и снижение продуктивности сельскохозяйственных животных. Незаменимыеаминокислоты наиболее сбалансированы в белках семян сои. Относительно высокуюбиологическую ценность имеют также белки зерна риса и гороха. В белках зернапшеницы и ячменя очень мало лизина, метионина и изолейцина, а в белках кукурузыещё и триптофана.
Особыйинтерес представляет использование микроорганизмов в качестве источника белка ивитаминов при производстве пищевых продуктов. Перспектива и экономическаяцелесообразность употребления микроорганизмов в технологии производства пищевыхпродуктов диктуется рядом факторов:
1) возможностьюиспользования самых разнообразных химических соединений, в том числе отходовпроизводства, для культивирования микроорганизмов;
2) высокойинтенсивностью синтеза белков;
3) относительнонесложной технологией культивирования микроорганизмов;
4) относительновысоким содержанием белка и витаминов;
5) повышеннымсодержанием незаменимых аминокислот по сравнению с растительными белками;
6) возможностьюнаправленного генетического влияния на химический состав микроорганизмов вцелях совершенствования белковой и витаминной ценности продукта (ГМО).
В настоящеевремя мировой дефицит белка составляет около 15 млн. т. Наиболее перспективенмикробиологический синтез, что следует из представленных ниже данных. Если длякрупного рогатого скота требуется 5 лет для удвоения белковой массы, для свиней– 4 мес., для цыплят – 1 мес., то для бактерий и дрожжей – 1–6 ч.Мировое производство пищевых белковых продуктов за счет микробного синтезасоставляет более 15 тыс. т в год. В качестве источников кормового белка чащеиспользуют различные виды дрожжей и бактерий, микроскопические грибы,одноклеточные водоросли, белковые коагулянты травянистых растений.
/>/>Дрожжевые клетки в качестве источникауглерода для роста способны использовать неразветвленные углеводороды с числомот 10 до 30 углеродных атомов в молекуле. В основном они представлены жидкимифракциями углеводородов нефти с температурой кипения 200–320ºС. В Россиипервый завод по производству кормовых дрожжей из жидких парафинов нефти вступилв действие в 1971 г. Альтернативная цепочка расщепления углеводородов: н-Алканы (С9– С30) Алифатические спирты
/>/>Алифатические кислоты Ацил-КоА Ацетил-КоА
Привыращивании дрожжей на н-парафинах нефти в приготовленную из нихпитательную среду добавляют макро- и микроэлементы, необходимые витамины иаминокислоты[13]. Высушенная дрожжевая масса гранулируется и используется какбелково-витаминный концентрат (БВК), содержащий до 50–60% белковых веществ, длякормления сельскохозяйственных животных.
Хорошимсубстратом для выращивания кормовых дрожжей является молочная сыворотка –производственный отход при переработке молока. В качестве источников углерода дрожжевыеклетки могут использовать и низшие спирты – метанол и этанол, получаемые вбиотехнологии из природного газа или растительных отходов. Дрожжевая масса,полученная после культивирования дрожжей на спиртах, содержит больше белков (56–62%от сухой массы) и меньше вредных примесей, чем кормовые дрожжи, выращенные на н-парафинахнефти, такие, как производные бензола, D-аминокислоты, аномальныелипиды, токсины и канцерогенные вещества. Вместе с тем белки дрожжей частичноне сбалансированы по метионину, в них мало цистеина и селенцистеина.
Наряду стехнологией использования дрожжевых белков в качестве кормовой добавки врационы сельскохозяйственных животных разработаны технологии получения из них пищевыхбелков. Важный резерв пищевого белка и витаминов – остаточные пивные дрожжиSaccharomycescarlsbergensis. Организм человекаусваивает свыше 90% всех питательных веществ, содержащихся в них. Пивные дрожжимогут с успехом применяться при производстве колбас в качестве заменителяказеина. Белки дрожжей применяют также при получении искусственного мяса. Дляэтого их нагревают с последующим быстрым охлаждением или продавливаниембелковой пасты через отверстия малого диаметра.
Известноболее 30 видов бактерий, которые могут быть применены в качестве источников полноценногокормового белка. Бактериальные белковые концентраты с содержанием сырого белка60–80% (от сухой массы) – ценные препараты в кормопроизводстве. Следуетотметить, что бактерии значительно быстрее, чем дрожжевые клетки, наращиваютбиомассу и, кроме того, белки бактерий содержат больше цистеина и метионина,что позволяет отнести их в разряд белков с высокой биологической ценностью.Источником углерода при культивировании бактерий могут служить природный ипопутный газы, водород, а также спирты – метанол, этанол, пропанол. К числубактерий с высокой интенсивностью синтеза белков следует отнести иводородокисляющие бактерии, способные накапливать в клетках до 80% сырогобелка. Для их культивирования в составе газовой среды обычно содержится 70–80%водорода, 20–30% кислорода и 3–5% СО2.
Для получениякормового белка используют одноклеточные водоросли Chlorella и Scenedesmus, сине-зеленые водорослииз рода Spirulina, способные синтезировать белки из диоксида углерода, воды иминеральных веществ за счет энергии солнечного света. Водоросли для своегоразвития нуждаются в определенных режимах освещения и температуры и в большихобъемах воды. Обычно их выращивают в естественных условиях южных регионов вбассейнах открытого типа. При выращивании водорослей в культиваторах открытоготипа с 1 га водной поверхности можно получать до 70 т сухой биомассы в год, чтопревышает выход биомассы при возделывании пшеницы, риса, сои, кукурузы. Белкиводорослей хорошо сбалансированы по содержанию незаменимых аминокислот, заисключением метионина. В клетках водорослей, кроме того, синтезируется довольномного полиненасыщенных жирных кислот и β-каротина.
В биомассемногих микроскопических грибов хорошо сбалансированы по аминокислотному составубелки; они включают также витамины и липиды. По своим питательным свойствамбелки грибов приближаются к белкам сои и мяса, что позволяет использовать из нетолько для приготовления кормовых концентратов, но и как добавку в пищучеловека. Источником углерода для промышленного выращивания микроскопическихгрибов служат растительные отходы, содержащие клетчатку, гемицеллюлозы, лигнин,а также торф и навоз. В Великобритании создан пищевой продукт, основнымкомпонентом которого является белок грибного происхождения – микопротеинна дешевом глюкозном сиропе, полученном путем гидролиза пшеничного иликукурузного крахмала.
1.3 Основыинженерной энзимологии
Применениеферментов
Ферментысохраняют свои уникальные свойства (эффективность, специфичность действия) ивне клеток, поэтому их традиционно широко применяют в практике. Биологическиекатализаторы нетоксичны, работают в мягких условиях, используют доступное сырье(в том числе и отходы), в связи с чем, их применение в промышленности выгодно сэкономической и экологической точек зрения. По объему производства ферментызанимают третье место после аминокислот и антибиотиков. Из более чем 2000известных в настоящее время ферментов в промышленности используется около 30.
Таблица 2. Применениеферментов
Название
фермента Источники фермента
Химический и биологический процессы.
Область использования. Амилазы
Bacillus sp., Aspergillus niger Гидролиз крахмала до декстринов, мальтозы и глюкозы. Спиртовая, пивоваренная промышленность, хлебопечение, получение патоки, глюкозы. Глюкоизомераза Более 80 видов микроорганизмов Изомеризация D-глюкозы в D-фруктозу. Кондитерская, ликероводочная, безалкогольная промышленность, хлебопечение. Глюкооксидаза
Penecillium chrysogenum, Aspergillus niger Удаление кислорода и глюкозы (из яичного порошка, мясных и других продуктов). Виноделие, пивоваренная, консервная, соковая и безалкогольная промышленность. Липазы Поджелудочные железы животных, семена растений, микроорганизмы Гидролиз жиров и масел. Пищевая, легкая, медицинская промышленность, сельское хозяйство, коммунальное хозяйство, бытовая химия. Пектиназа
Многие микроорганизмы (Aspergillusssp., Fusariumssp.) Гидролиз галактуронана, осветление вина и фруктовых соков. Пептидогидролазы Поджелудочные железы и слизистая желудка животных; плоды, побеги, отходы переработки некоторых растений (дынное дерево, инжир, ананас) Лизис белка. Получение аминокислот, производство и получение сыра, мягчение мясных и рыбных изделий, выделка кожи, активизация пищеварения. Пивоварение, виноделие, хлебопечение, пищевая промышленность, сельское хозяйство, медицина. Целлюлазы
Clostridium ssp., Aspergillus oryzae, Fusarium culmorum Гидролиз целлюлозы до глюкозы. Производство пищевых и кормовых белковых препаратов, этанола, глюкозо-фруктозных сиропов. Спиртовая, пивоваренная, пищеконцентратная промышленность, хлебопечение, кормопроизводство. Фруктофуранозидаза
Bacillus subtilis, E. coli, Streptococcus mutans Инверсия сахарозы. Кондитерская, ликероводочная, безалкогольная промышленность, сиропопроизводство.
Задачи инженернойэнзимологии заключаются в развитии прогрессивных методов выделения ферментов,их стабилизации и иммобилизации; конструировании катализаторов с нужнымисвойствами и разработке научных основ их применения. В частности, методамибелковой инженерии, сущность которых состоит в изменении первичной структурыприродной молекулы фермента посредством химической модификации самого энзимаили его гена, удается принципиально трансформировать структуру активного центраи его функцию, модулировать субстратную специфичность и физико-химическиесвойства фермента. Так, замена остатка глутамина-102 в молекулелактатдегидрогеназы на аргинин превратила фермент в высокоактивнуюмалатдегидрогеназу. Созданы гибридные формы ферментной системы, ценной виммуноферментном анализе, сочетающие в себе свойства β-галактозидазы и β-галактокиназы.Важным этапом развития инженерной энзимологии стала разработка способовполучения и использования иммобилизованных ферментов.
Иммобилизованныеферменты
Иммобилизованнымиферментами называют ферменты, искусственно связанные с нерастворимым носителем,но сохраняющие свои каталитические свойства[7].
Ещё в 1916 г.Дж. Нельсон и Е. Гриффин показали, что сахараза, сорбированная наугле, сохраняла свою каталитическую активность, но лишь в 1953 г. Н. Грубхофери Д. Шлейт впервые осуществили ковалентные связывания амилазы, пепсина,РНКазы и карбоксипептидазы с нерастворимым носителем. В 1971 г. на первойконференции по инженерной энзимологии был узаконен термин «иммобилизованныеферменты». Однако в понятие «иммобилизация» в настоящее время вкладывают болееширокий смысл, чем связывание на нерастворимом носителе, а именно – полное иличастичное ограничение движения белковых молекул.
Иммобилизованныеферменты имеют ряд преимуществ в сравнении со свободными молекулами. Прежде всего,такие ферменты, представляя собой гетерогенные катализаторы, легко отделяютсяот реакционной среды, могут использоваться многократно и обеспечиваютнепрерывность каталитического процесса. Иммобилизованные ферменты долговечны ив тысячи и десятки тысяч раз стабильнее свободных энзимов.
По Дж. Порату(1974), идеальные материалы, используемые для иммобилизации ферментов, должныобладать следующими основными свойствами: нерастворимостью; высокой химическойи биологической стойкостью; значительной гидрофильностью; достаточной проницаемостью,как для ферментов, так и для коферментов, субстратов и продуктов реакции;способностью носителя легко активироваться (переходить в реакционноспособнуюформу). В зависимости от природы носители делятся на органические инеорганические материалы.
Иммобилизациямногих ферментов осуществляется на полимерных носителях органической природы.Существующие органические полимерные носители можно разделить на два класса:природные и синтетические полимерные носители. Среди природных полимероввыделяют белковые, полисахаридные и липидные носители, а среди синтетических –полиметиленовые, полиамидные и полиэфирные.
Кпреимуществу природных носителей следует отнести их доступность,полифункциональность и гидрофильность, а к недостаткам – биодеградируемость идостаточно высокую стоимость. Из полисахаридов для иммобилизации наиболее частоиспользуют целлюлозу, декстран, агарозу и их производные. Для приданияхимической устойчивости линейные цепи целлюлозы и декстрана поперечно сшиваютэпихлоргидрином. Химической модификацией крахмала сшивающими агентами(формальдегид, глиоксаль, глутаровый альдегид) синтезирован новый носитель –губчатый крахмал, обладающий повышенной устойчивостью к гликозидазам. Изприродных аминосахаридов в качестве носителей для иммобилизации применяютхитин. Среди белков практическое применение в качестве носителей нашлиструктурные протеины, такие, как кератин, фиброин, коллаген и продуктпереработки коллагена – желатин.
К синтетическимполимерным носителям относятся полимеры на основе стирола, акриловойкислоты, поливинилового спирта; полиамидные и полиуретановые полимеры.Большинство синтетических полимерных носителей обладают механическойпрочностью, а при образовании обеспечивают возможность варьирования в широкихпределах величины пор, введения различных функциональных групп.
В качестве носителейнеорганической природы наиболее часто применяют материалы из стекла, глины,керамики, графитовой сажи, силикагеля, а также силохромы, оксиды металлов. Ихможно подвергать химической модификации, для чего носители покрывают пленкойоксидов алюминия, титана, гафния, циркония или обрабатывают органическимиполимерами. Основное преимущество неорганических носителей – легкостьрегенерации.
Существуютдва принципиально различных метода иммобилизации ферментов: без возникновенияковалентных связей между ферментом и носителем (физические методыиммобилизации) и с образованием ковалентной связи между ними (химические методыиммобилизации).
При адсорбционнойиммобилизации белковая молекула удерживается на поверхности носителя засчет электростатических, гидрофобных, дисперсионных взаимодействий и водородныхсвязей. Адсорбция была первым методом иммобилизации ферментов (Дж. Нельсон,Э. Гриффин, 1916), но и сейчас не потеряла своего значения и сталанаиболее широко распространенным способом получения иммобилизованных ферментовв промышленности. Процесс адсорбции ферментов достигается при контакте водногораствора фермента с носителем (статистическим способом, при перемешивании,динамическим способом с использованием колонок). К недостаткам адсорбционногометода следует отнести невысокую прочность связывания фермента с носителем. Приизменении условий иммобилизации могут происходить десорбция фермента, егопотеря и загрязнение продуктов реакции.
Способиммобилизации ферментов путем включения в трехмерную структуруполимерного геля широко распространен благодаря своей простоте иуникальности. Метод применим для иммобилизации не только индивидуальныхферментов, но и мультиэнзимных комплексов и даже интактных клеток.Иммобилизацию ферментов в геле осуществляют двумя способами. В первом случаефермент вводят в водный раствор мономера, а затем проводят полимеризацию, врезультате которой возникает пространственная структура полимерного геля свключенными в его ячейки молекулами фермента. Во втором случае фермент вносят враствор уже готового полимера, который впоследствии переводят в гелеобразноесостояние. Для первого варианта используют гели полиакриламида, поливинилового спирта,поливинилпирролидона, силикагеля, для второго – гели крахмала, агар-агара,каррагинана, агарозы, фосфата кальция. Метод непригоден для иммобилизацииферментов, действующих на водонерастворимые субстраты.
Сущностьспособа иммобилизации ферментов в полупроницаемые структуры заключается вотделении водного раствора фермента от водного раствора субстрата с помощьюполупроницаемой мембраны, пропускающей низкомолекулярные молекулы субстратов икофакторов, но задерживающей большие молекулы фермента. Разработано несколькомодификаций этого метода, из которых интерес представляет микрокапсулированиеи включение ферментов в липосомы. Первый способ предложен Т. Чангом в 1964 г.и состоит в том, что водный раствор фермента включается внутрь замкнутоймикрокапсулы, стенки которой образованы полупроницаемым полимером. Один измеханизмов возникновения мембраны на поверхности водных микрокапсул ферментазаключается в реакции межфазной поликонденсации двух соединений, одно изкоторых растворено в водной, а другое – в органической фазе. Примером можетслужить образование на поверхности раздела фаз микрокапсулы, получаемой путемполиконденсации гексаметилендиамина – 1,6 (водная фаза) и галогенангидридасебациновой кислоты (органическая фаза).
nН2N(CH2)6NH2+nClC(O) (CH2)8C(O) Cl = (-NH(CH2)6NHC(O) (CH2)8C(O)-)n+2nHCl
К недостаткамметода следует отнести невозможность инкапсулированных ферментов осуществлятьпревращения высокомолекулярных субстратов.
Близким кинкапсулированию методом иммобилизации можно считать включение водныхрастворов ферментов в липосомы, представляющие собой сферические илиламеллярные системы двойных липидных бислоев. Впервые данный способ былприменен для иммобилизации ферментов Дж. Вайсманом и Дж. Сессом в1970 г. Для получения липосом из растворов липида (чаще всего лецитина)упаривают органический растворитель. Оставшуюся тонкую пленку липидовдиспергируют в водном растворе, содержащем фермент. В процессе диспергированияпроисходит самосборка бислойных липидных структур липосомы, содержащих включенныйраствор фермента. Ферменты, иммобилизованные путем включения в структурулипосом, используют преимущественно в медицинских и научных целях, ибозначительная часть ферментов в клетке локализована в составе липидного матриксабиологических мембран.
Иммобилизацияферментов путем образования новых ковалентных связей междуферментом и носителем – наиболее массовый способ получения промышленныхбиокатализаторов. В отличие от физических методов этот способ иммобилизацииобеспечивает прочную и необратимую связь фермента с носителем и частосопровождается стабилизацией молекулы энзима. Однако расположение ферментаотносительно носителя на расстоянии одной ковалентной связи создает стерическиетрудности в осуществлении каталитического процесса. Фермент отделяют от носителяс помощью вставки (сшивка, спейсер), в роли которой чаще всего выступаютбифункциональные и полифункциональные агенты (бромциан, гидразин,сульфурилхлорид, глутаровый диальдегид и др.). Все методы химическойиммобилизации классифицируют в зависимости от природы реакционной группыносителя, вступающей во взаимодействие с молекулой фермента.
1)Иммобилизация ферментов на носителях, обладающих гидроксогруппами.
Наиболеераспространенным методом образования ковалентной связи между ферментом иполисахаридным носителем или синтетическим диольным соединением являетсябромциановый метод, который был предложен Р. Аксеном, Дж. Поратом и С. Эрнбакомв 1967 г. При обработке носителя бромцианом возникают реакционноспособныецианаты и имидокарбонаты, которые при взаимодействии с нуклеофильнымиаминогруппами фермента образуют производные изомочевины и уретанов.
Н-OH+BrCN = H-OCN+H2N-Ф=H-OC(NH) – NH-Ф
2)Иммобилизация ферментов на носителях, обладающих аминогруппами.
Первичныеаминогруппы носителя, связанные с ароматическим кольцом, предварительнопревращают в соли диазония, которые затем подвергают разнообразным реакциямсочетания. В реакции сочетания вступают фенольные, имидазольные, аминные,гуанидиновые, тиольные группы белков.                 Н-N2++H2N-Ф = H-N=N-NH-Ф+Н+
3) Иммобилизацияна носителях, обладающих активированными производными карбоксильной группы.
Наиболеечасто для соединения аминогрупп белка с ацильными группировками носителяиспользуют ангидриды, галогенангидриды, активированные эфиры и другиепроизводные карбоновых кислот.
Н-С(О) Cl+H2N-Ф = H-C(O) NH-Ф+НCl
4)Иммобилизация на носителях, обладающих сульфгидрильными группами.
Сульфгидрильныегруппы носителя и фермента легко окисляются с образованием дисульфидных связейпод действием кислорода воздуха.
H-SH+0,5О2+HS-Ф = Н-S-S-Ф+Н2О
Наряду симмобилизацией ферментов в последнее время все большее внимание уделяетсяиммобилизации клеток и субклеточных структур. Это объясняется тем, что прииспользовании иммобилизованных клеток отпадает необходимость выделения и очисткиферментных препаратов, применение кофакторов; создается возможность полученияполиферментных систем, осуществляющих многостадийные непрерывно действующиепроцессы.
Промышленныепроцессы с использованием иммобилизованных ферментов и клеток
Получениеглюкозофруктозных сиропов.
Перваяпромышленная установка для превращения глюкозы во фруктозу с помощьюиммобилизованной глюкоизомеразы была запущена лишь в 1973 г. Исходнымсырьем для этого процесса служит глюкоза, которую получают при гидролизекукурузного или картофельного крахмала в присутствии минеральных кислот. Дляконструирования промышленного биокатализатора глюкоизомеразу сорбируют напористых неорганических носителях или ионообменных смолах. Возникающий врезультате каталитического процесса глюкозофруктозный сироп содержит 42–45%фруктозы, около 51% глюкозы, небольшое количество олигосахаридов и по сладостисоответствует инвертному сахару, получаемому при гидролизе сахарозы.
Получение L-аминокислот из ихрацемических смесей.
Наряду смикробиологическими способами важное значение имеют химические методыпромышленного получения природных аминокислот, в том числе незаменимых. Однаков результате химических реакций, используемых для синтеза аминокислот,содержащих асимметрические атомы углерода, с одинаковой скоростью образуются какD-, так и L-стереоизомеры, т.е.всегда возникает рацемическая смесь. Разделение рацемических смесей насоставляющие их оптические изомеры (представляющее труднейшую задачу) явилосьпервым промышленным процессом с использованием иммобилизованных ферментов. Этотпроцесс был осуществлен в Японии в 1969 г.с помощью аминоацилазы,иммобилизованной на ДЕАЕ-целлюлозе. В качестве исходных соединений в данномпревращении используют N-ацилированные производные D-, L – аминокислот,получаемые с помощью химического синтеза. Аминоацилаза гидролизует лишь N-ацил-L-стереоизомер, отщепляяот него ацильный радикал, в результате чего растворимость образующейся L-аминокислоты резковозрастает и ее легко можно отделить от своего антипода физико-химическимиметодами. При нагревании оставшаяся N-ацил-D-аминокислота рацемизируется, т.е. превращается висходную смесь, которая вновь подвергается воздействию фермента.
Аминоацилазастрого специфична к структуре только ацильной части субстрата, поэтому одна ита же установка с иммобилизованным ферментом используется для полученияразличных аминокислот.
Получение L-аспарагиновой кислоты.
Аспарагиноваякислота широко употребляется в качестве пищевой добавки (подсластитель иподкислитель). Первая в мире промышленная установка для синтеза L-аспарагиновой кислоты изполучаемого химическим путем фумарата аммония была запущена в 1973 г. вЯпонии. В ней использованы иммобилизованные в полиакриламидном геле клеткикишечной палочки E.coli, содержащие аспартат-аммиак-лиазу.
H4NOOC-CH=CH-COOH= HOOC-CH2-CH(NH2) – COOH
Получение L-аланина.
В настоящеевремя основной промышленный способ получения L-аланина – ферментативноедекарбоксилирование L-аспарагиновой кислоты. Процесс превращения L-аспартата в L-аланин катализируетсяаспартат-β-декарбоксилазой ряда микроорганизмов (Pseudomonasdacunhae, Alcaligenesfaecalis, Achromobacterpestifier), иммобилизованных вполиакриламидном геле.
HOOC-CH2-CH(NH2) –COOH = CH3-CH(NH2) – COOH+CO2
Усовершенствованиепроцесса связано с использованием в качестве сырья фумарата аммония. В данномслучае процесс получения L-аланина становится двустадийным и реализуется в двухпоследовательно расположенных колонках. На первом этапе фумарат аммонияпревращается в L-аспарагиновую кислоту, которая без выделения из реакционной средына втором этапе претерпевает β-декарбоксилирование с образованием аланина.
Получение L-лизина
Процессполучения лизина основан на стереоспецефическом ферментативном гидролизе(конверсии) D-,L-α-амино-ε-капрлактама,который сначала получают химическим путём из циклогексена. Рацемат используют вкачестве субстрата, который под действием лактамазы превращается в L-лизин, анепрореагировавшая D-форма переводится в смесь антиподов рацемазой. Лактамаза найденау некоторых дрожжей (Candida laurentil). Рацемаза обнаружена у ряда бактерий (Alkaligenes obae).
Получениетриптофана
Химико-ферментативныйспособ получения триптофана состоит в прямой конденсации индола, аммиака и ПВК.Реакцию катализирует пиридоксальзависимая триптофаназа. Фермент найден у E.coli.
Получение L-яблочной кислоты.
Яблочнаякислота – заменитель лимонной в продуктах питания и лекарственных препаратах.Яблочную кислоту получают, используя иммобилизованные в полиакриламидном гелеклетки, содержащие фумаратгидратазу. В присутствии этого фермента происходитприсоединение воды по двойной связи в молекуле фумаровой кислоты.
HOOC-CH=CH-COOH+H2O= HOOC-CH(OH) – CH2-COOH
Перспективытехнологии иммобилизованных ферментов[4]
Сегодня впромышленности реализовано всего четыре крупномасштабные технологии на основеиммобилизованных ферментов (глюкоизомеразы, аминоацилазы, пенициллазы илактазы). В обозримом будущем иммобилизованные ферменты могут быть использованыдля следующих целей.
1. Холинэстеразаможет применяться для определения пестицидов. Степень ингибирования этогофермента в присутствии пестицидов оценивают электрохимическими иликолориметрическими методами.
2. Иммобилизованнаядиизопропилфторфосфатаза нервных клеток кальмара может найти применение дляобезвреживания фосфорорганических нервных газов.
3. Иммобилизованнаягепариназа может применяться для предотвращения тромбообразования в аппаратахискусственного кровообращения.
4. Предложенновый способ применения иммобилизованного гемоглобина. Включённый в полиуретановуюматрицу белок образует «гемогубку», способную поглощать кислород прямо из водыс эффективностью 80%. Далее кислород высвобождается из полимера под действиемслабого электрического разряда. Предполагается, что такая система можетснабжать кислородом водолазов либо работающие под водой двигатели.
5. Возможно,вскоре удастся создать системы из нескольких иммобилизованных ферментов. Так,если заключить в микрокапсулы уреазу, глутаматдегидрогеназу иглюкозодегидрогеназу, то их можно будет использовать для удаления мочевины изкрови больных с почечной недостаточностью.
6. Разнообразныеиммобилизованные ферменты находят применение в датчиках быстрого анализа.
7. Впоследнее время большое внимание уделяется использованию различных микробныхоксигеназных систем в стереоспецефическом эпоксиокислении олефинов.
1.5 Основыполучения метаболитов
Процессамибиотрансформации называют реакции превращения исходных органических соединений(предшественников) в целевой продукт с помощью клеток живых организмов илиферментов, выделенных из них.
По отношениюк процессу роста низкомолекулярные продукты метаболизма живых клеток делятся напервичные и вторичные метаболиты. Первичные метаболиты необходимы для ростаклеток. К ним относятся структурные единицы биополимеров – аминокислоты, нуклеотиды,моносахариды, а также витамины, коферменты, органические кислоты и другиесоединения. Вторичные метаболиты (антибиотики, пигменты, токсины) –низкомолекулярные соединения, не требующиеся для выживания клеток иобразующиеся по завершении фазы их роста.
Механизмыинтенсификации процессов получения продуктов клеточного метаболизма
В норме обменвеществ в клетке осуществляется по принципам строжайшей экономии, чтообеспечивается сложнейшей системой регуляции обмена веществ. Задачабиотехнолога состоит в обеспечении сверхсинтеза одного из продуктовметаболизма, что достигается как путем изменения генетической программыорганизма, так и посредством нарушения регуляторных систем метаболизма в нем[7].
Для выделенияиз природных популяций высокопродуктивных штаммов микроорганизмов используютметоды селекции, т.е. направленного отбора организмов со скачкообразнымизменением геномов. Для возникновения мутаций интересующий ген должен удвоиться106-108 раз. Более эффективен метод искусственногоповреждения генома. Таким методом является индуцированный мутагенез,основанный на использовании мутагенного действия ряда химических соединений,рентгеновских и ультрафиолетовых лучей.
Координацияхимических превращений, обеспечивающая экономность метаболизма, осуществляетсяу микроорганизмов тремя основными механизмами: регуляцией активности ферментов,в том числе путем ретроингибирования; регуляцией объема синтеза ферментов(индукция и репрессия биосинтеза ферментов); катаболитной репрессией.
В процессе ретроингибирования(ингибирование по принципу обратной связи) активность фермента, стоящего вначале многоступенчатого превращения субстрата, тормозится конечнымметаболитом, что детально разработано при изучении регуляции биосинтезапиримидиновых нуклеотидов и новообразования ряда аминокислот.
На обменвеществ, аналогичный конечным метаболитам, оказывают эффект их аналоги. Дляотбора объектов продуценты выращивают на селективной среде, содержащейподходящий аналог или антиметаболит, которые не включаются в обмен веществ (в частности,аналоги аминокислот не включаются в состав белков), что ведет к подавлениюроста организма. Выжившие мутанты обладают дефектами в механизме регуляцииактивности фермента по принципу обратной связи и поэтому служат важнымиобъектами в обеспечении сверхсинтеза целевого продукта.
Так, мутациипо участкам цистрона, детерминирующим структуру аллостерического центрафермента, могут привести к изменениям в конформации белка, которые делаютмолекулу энзима нечувствительной к концентрации конечного продукта. Этообеспечивает возможность образования в клетке избыточного количества целевогопродукта.
Мутации вгене-регуляторе проводят таким образом, чтобы его продукт – белок-репрессор –утрачивал способность связываться либо с индуктором, либо с оператором. Врезультате мутаций индуцибельные ферменты становятся конститутивными. Мутантныеорганизмы, у которых изменены нуклеотидные последовательности в зонегена-оператора, не могут связывать нормальный репрессор и также приобретаютспособность к конститутивной экспрессии структурных генов. Мутанты с дефектамирегуляторной области оперона называются регуляторными. Из-за отсутствияили выключения фермента, катализирующего промежуточную стадию процесса, в среденакапливается не конечный продукт, а промежуточный целевой метаболит. Мутанты сограниченной способностью к образованию конечных продуктов называются ауксотрофными.
Биотехнологияполучения первичных метаболитов
Производствоаминокислот
Средисоединений, получаемых биотехнологическими методами, аминокислоты занимаютпервое место по объему производства и второе место по стоимости, уступая попоследнему параметру лишь антибиотикам. Объем мирового производства аминокислотсоставляет более 500 тыс. т в год, из которых 300 тыс. т приходится на глутаматнатрия, 100 тыс. т на лизин и 140 тыс. т на метионин.
Впромышленных масштабах белковые аминокислоты получают:
1) гидролизомприродного белоксодержащего сырья;
2) химическимсинтезом;
3)микробиологическим синтезом;
4)биотрансформацией предшественников аминокислот с помощью микроорганизмов иливыделенных из них ферментов (химико-микробиологический метод).
В ходе кислотногогидролиза белков происходят рацемизация и разрушение некоторых составляющихих аминокислот. При кислотном гидролизе полностью разрушается триптофан идостаточно значительны потери цистеина, метионина и тирозина (10–30%).
Существенныйнедостаток методов химического синтеза аминокислот состоит в получениицелевых препаратов в виде рацемической смеси D- и L-стереоизомерных форм.Подавляющее большинство природных аминокислот относится к L-ряду. Исключением в этомотношении является лишь метионин, метаболизм которого нестереоизбирателен,благодаря чему данная аминокислота получается преимущественно путем химическогосинтеза.
Наиболееперспективен и экономически выгоден микробиологический синтезаминокислот. Более 60% всех производимых в настоящее время промышленностьювысокоочищенных препаратов белковых аминокислот получают именно этим способом,главное преимущество которого в сравнении с методами химического синтезасостоит в возможности получения L-аминокислот на основе возобновляемого сырья.
Промышленноепроизводство аминокислот стало возможным после открытия способности у некоторыхмикроорганизмов выделять в культуральную среду значительные количества какой-либоодной аминокислоты (С. Киносита, 1955). При этом было подмечено, чтобольшинство из нескольких тысяч проанализированных диких штаммовмикроорганизмов продуцировали аминокислоты во внешнюю среду, но в оченьнезначительных количествах. И лишь один из обследованных микроорганизмов – Corynebacteriumglutamicum был способен ксверхсинтезу глутамата. Этот штамм использовали при организации первого в мирекрупномасштабного производства глутаминовой кислоты микробиологическим способомв Токио (1956). Распространенные объекты селекции продуцентов – микроорганизмы,относящиеся к родам Brevibacterium, Microcjccus, Corynebacterium, Arthrobacter.
Производстволизина. Вклетках микроорганизмов лизин синтезируется из аспарагиновой кислоты и служитконечным продуктом разветвленного метаболического пути биосинтеза, общего длятрех аминокислот – лизина, метионина и треонина.
Эффектанакопления в среде всего одной целевой аминокислоты добиваются путемблокирования процессов, ведущих к синтезу побочных аминокислот, возникающих всвязи с разветвлением метаболического пути. У типичных продуцентов L-лизина – BrevibacteriumflavumиCorynebacteriumglutamicum– фермент аспартаткиназа,открывающий метаболический путь, является аллостерическим белком,чувствительным к ингибированию по принципу обратной связи при совместномдействии побочных продуктов L-треонина и L-лизина.
Чтобыдобиться образования лизина в больших количествах, получают мутанты двух типов.У мутантов первого типа не синтезируется или не функционирует гомосериндегидрогеназа,в результате чего блокируется синтез метионина и треонина. Мутанты второго типадефектны по структурному гену, детерминирующему конформацию аспартаткиназы. Витоге фермент теряет чувствительность к высоким концентрациям аллостерическогоингибитора – лизина.
Производствотриптофана. Подобно лизину триптофан образуется в ходе разветвленногометаболического пути, поэтому для его производства используют ауксотрофныхмутантов, у которых блокированы реакции, ведущие к синтезу фенилаланина итирозина. Однако при выращивании мутантных штаммов в среде с минимальнойконцентрацией этих аминокислот, не вызывающей регуляторных эффектов, избыточноенакопление триптофана в среде не наблюдается, что объясняется особенностьюпроцессов регуляции биосинтеза триптофана у микроорганизмов.
Триптофаноказывает ингибирующее действие на антранилатсинтетазу, поэтому для обходаметаболического контроля синтез фермента индуцируют ступенчатым введениемпредшественника – антраниловой кислоты:
В связи сэтой особенностью промышленное производство триптофана организованопреимущественно по двухступенчатой схеме. На первом этапе химическим способомсинтезируют антраниловую кислоту, которую с помощью энзиматической системымутантных штаммов дрожжей Candidautilis переводят в триптофан.
Крометриптофана микробиологическим способом с использованием предшественниковполучают гистидин, изолейцин, метионин, серин и треонин.
Для полученияаминокислот – конечных продуктов неразветвленных метаболических путей, напримераргинина, ауксотрофные мутанты не используют. В этом случае применяютмутанты с дефектами регуляции биосинтеза аминокислоты, т.е. регуляторныемутанты.
Производствовитаминов
Благодаряизучению физиологии и генетики микроорганизмов – продуцентов витаминов ивыяснению путей биосинтеза каждого из них создана теоретическая основа дляполучения микробиологическим способом практически всех известных в настоящеевремя витаминов. Однако с помощью энзимов целесообразнее производить лишь особосложные по строению витамины: В2, В12, β-каротин(провитамин А) и предшественники витамина D. Остальные витамины либовыделяют из природных источников, либо синтезируют химическим путем.
Получениевитамина В2 (рибофлавин). Вплоть до 30-х годов прошлого столетия рибофлавинвыделяли из природного сырья. В наибольшей концентрации он присутствует вморкови и печени трески. Из 1 т моркови можно изолировать лишь 1 г рибофлавина, а из 1 т печени – 6 г. В 1935 г. обнаружен активный продуцент рибофлавина –гриб Eremotheciumashbyii, способный при выращивании на 1 тпитательной смеси синтезировать 25 кг витамина В2. Сверхсинтезарибофлавина добиваются действием на дикие штаммы мутагенов, нарушающих механизмретроингибирования синтеза витамина В2, флавиновыми нуклеотидами.Отбор мутантов ведут по устойчивости к аналогу витамина В2 –розеофлавину.
В 1983 г.во ВНИИ генетики микроорганизмов сконструирован рекомбинантный штамм продуцентаBacillussubtilis, характеризующийсяувеличенной дозой оперонов, которые контролируют синтез рибофлавина.Клонированием генов рибофлавинового оперона в одной из созданных плазмид былполучен производственный штамм-продуцент витамина В2, способныйсинтезировать втрое большее по сравнению с E. ashbyii количество рибофлавинавсего за 40 ч ферментации.
Получениевитамина В12 (цианокобамид). Первоначально витамин В12 получалиисключительно из природного сырья, но из 1 т печени можно было выделить всеголишь 15 мг витамина. Единственный способ его получения в настоящее время –микробиологический синтез. Обнаружение витамина в качестве побочного продуктапри производстве антибиотиков в значительной степени стимулировало поискорганизмов-продуцентов витамина и изучение путей его образования. Однакомеханизмы регуляции биосинтеза витамина В12 до настоящего времениполностью не расшифрованы. Известно, что при высоких концентрациях витаминполностью репрессирует синтез ключевых ферментов своего новообразования.
Продуцентамивитамина В12 при его промышленном получении служат актиномицеты,метанобразующие и фотосинтезирующие бактерии, одноклеточные водоросли. В 70-хгодах ХХ в. интерес ученых привлекли пропионовокислые бактерии, известные ещё с1906 г. и широко использующиеся при приготовлении препаратов животноводства.Выделено 14 видов пропионовокислых бактерий, продуцирующих витамин В12.
Получение β-каротинаи витамина D2. β-Каротин можно выделить из рядарастительных объектов – моркови, тыквы, облепихи, люцерны. В начале 60-х годовХХ в. разработана схема микробиологического синтеза β-каротина, котораястала основой промышленного способа его получения. Установлено, что многиемикроорганизмы – фототрофные бактерии, актиномицеты, плесневые грибы, дрожжи –синтезируют каротин. Характерно, что содержание β-каротина у микроорганизмовво много раз превышает содержание этого провитамина у растений. Так, в 1 г моркови присутствует всего 60 мкг β-каротина, в то время как в 1 г биомассы гриба Blanesleatrispora – 3–8 тыс. мкг.
Микробиологическимспособом получают и витамин D2 (эргокальциферол), при производстве которогоосвоено дешевое сырье (углеводороды) и установлен стимулирующий эффектультрафиолетовых лучей на синтез эргостерина культурой дрожжей.
Производствоорганических кислот
Получениелимонной кислоты. Лимонную кислоту широко используют в пищевой, фармацевтической икосметической промышленности. Ею заменяют фосфаты в составе детергентов, таккак она полностью метаболизируется живыми организмами. Лимонная кислота образуетхелаты с металлами, поэтому её применяют для их очистки. Объем мировогопроизводства цитрата составляет 400 тыс. т/год. Производство лимонной кислотыпринадлежит к числу старейших промышленных микробиологических процессов: онобыло организовано в 1893 г.
Дляпромышленного производства лимонной кислоты используют главным образом культуругриба Aspergillusniger. Метаболическим источником лимоннойкислоты в организме служит цикл трикарбоновых кислот. Реакция образованиялимонной кислоты, катализируемая цитратсинтазой, открывает цикл Кребса. Цитратсинтазаопределяет скорость реакций, составляющих цикл Кребса. Активность ферментазависит от концентрации ЩУК, содержание которой может поддерживаться за счетфункционирования конститутивной пируваткарбоксилазы, обеспечивающейпереключение в аэробных условиях процессов гликолиза и глиоксилевого цикла.Скорость оборота цикла Кребса определяется поддержанием необходимого уровняокисленных форм коферментов дегидрогеназ, поэтому высокий выход цитратаполучается лишь при условии хорошей аэрации. Дефицит фосфата ведет ксверхпродукции цитрата.
Одновременнос лимонной было налажено производство молочной кислоты при участиимолочнокислых бактерий рода Lactobacillus.
С 20-х годовналажено промышленное производство D-глюконовой кислоты из глюкозы при участии A.niger. Глюконат натрия, в видекоторого обычно выделяют глюконовую кислоту, используют для извлеченияметаллов, борьбы со ржавчиной, как моющее средство и в качестве медицинскогопрепарата.
Производства,основанные на ацетон-бутанольном брожении и микробиологическая конверсияэтанола в ацетат в настоящее время не рентабельны по экономическимсоображениям.
Биотехнологияполучения вторичных метаболитов
Биосинтезвторичных метаболитов фазоспецифичен и происходит по завершении стадии роста, видиофазе, благодаря чему их ещё называют идиолитами. Среди вторичныхметаболитов ведущее место по объему производства занимают антибиотики.
Получениеантибиотиков
Организациякрупномасштабного производства антибиотиков сыграла решающую роль в становлениипромышленной биотехнологии. К антибиотикам относятся низкомолекулярныеэффекторы изначально природного происхождения, способные подавлять рост живыхклеток. Способность нитчатого гриба зеленой плесени Penicilliumnotatum вызывать гибельмикроорганизмов впервые была установлена в 1928 г. английскиммикробиологом А. Флеммингом. Однако лечебные свойства этой плесени былиописаны ещё в 1871 г. русским дерматологом А.Г. Полотебновым.Количество открываемых антибиотиков постоянно растет. В 1940 г. былоизвестно всего 6 антибиотиков, а в настоящее время описано более 12 000аналогичных соединений, из которых в клинике применяют около 200 препаратов. 97%известных антибиотиков токсичны, поэтому в практике не используются. Изысканиеновых антибиотиков обусловлено как потребностями практики, так и накоплениемрезистентных форм микроорганизмов по отношению ко многим антибиотикам.
Главноенаправление получения новых антибиотиков состоит в химической трансформацииприродных молекул для создания полусинтетических антибиотиков. Методы полученияантибиотиков путем химического синтеза чрезвычайно сложны и не могутконкурировать с их биосинтезом методами биотехнологии. Направленный биосинтезантибиотиков осуществляется путем прямой ферментации микроорганизма –продуцента с подходящим предшественником, что индуцирует синтез ферментоввторичного метаболизма в идиофазе. Вводимый предшественник должен лимитироватьскорость биосинтеза антибиотика. Например, производство бензилпенициллина взначительной степени стимулируется добавками его метаболическогопредшественника – фенилуксусной кислоты; пропионовая кислота и пропиловый спиртинициируют биосинтез макролидов через метилмалонилКоА; L-фенилаланин –предшественник фенилаланина – ускоряет образование грамицидина S. Аналогичный эффектвызывает использование ингибиторов метаболизма. Так, при подавлении процессавведения хлора микроорганизм S. aureofaciens образует тетрациклин, ане хлортетрациклин.
Другой способполучения антибиотиков состоит в использовании для их биосинтеза блокированныхмутантов, у которых отсутствует (блокировано) определенное звено в цепиреакций, ведущих к синтезу антибиотика. Блокированные мутанты не способныобразовывать нужный антибиотик. Используя низкую субстратную специфичностьферментов вторичного метаболизма и вводя аналоги предшественников антибиотика,последние переводят в аналоги самого антибиотика в ходе процесса, известногокак мутационный биосинтез или мутасинтез. Так, мутанты Nocardiamtditerranei, у которых нарушенаспособность к ацилированию, образуют аналог предшественника рифамицинаВ-рифамицин SV.
Особенноуспешны разработки в области биосинтеза полусинтетических пенициллинов ицефалоспоринов. Получение новых более эффективных аналогов пенициллина основанона изменении природы его ацильной группировки при сохранении в неизменном видеядра пенициллина – 6-аминопенициллановой кислоты (6-АПК). В промышленности 6-АПКполучают путем гидролиза природных пенициллинов с помощью специфическогофермента – пенициллинацилазы. Некоторые из ацилаз способны катализировать иобратные реакции – процессы ацилирования аминогруппы 6-АПК с образованиеммодифицированного пенициллина. Таким путем было получено более 4000полусинтетических пенициллинов.
Получениепромышленно важных стероидов
Способностьклеток микроорганизмов к сложнейшим процессам биотрансформации наиболее полнореализовалась при получении промышленно важных стероидов. Биотрансформациястероидов обычно заключается в селективном воздействии на одно из положенийстероидного скелета. Первый промышленный процесс (1937 г.) микробнойбиотрансформации стероидов основывался на технологии направленногогидроксилирования (11-α-гидроксилирование) прогестерона.
Важнейшийисточник стероидных гормонов (эндостраны и эстраны) – культура клеток растений.Так, культура клеток диоскореи дельтовидной (Dioscoreadeltoidea) корневого происхожденияпродуцирует фитостерин диосгенин и его гликозидные производные (сапонины). Дальнейшиеуспехи в производстве стероидных препаратов связывают с применением иммобилизованныхклеток.

1.6 Основыбиологической переработки отходов
Специфическоеприменение биотехнологических методов для решения проблем окружающей среды,таких, как переработка отходов, очистка воды, устранение загрязнений,составляет предмет экологической биотехнологии.
Получениебиогаза
Биогаз – этосмесь из 65% метана, 30% СО2, 1% сероводорода. Энергия, заключеннаяв 28м3 биогаза, эквивалентна энергии: 16,8м3 природногогаза; 20,8 л нефти. В основе получения биогаза лежит процесс метановогоброжения или биометаногенез.
Биометаногенез – сложныймикробиологический процесс, в котором органическое вещество разлагается додиоксида углерода и метана в анаэробных условиях[7]. Микробиологическомуанаэробному разложению поддаются практически все соединения природногопроисхождения. В анаэробном процессе биометаногенеза выделяют трипоследовательные стадии, в которых участвуют свыше 190 различныхмикроорганизмов. На первой стадии под влиянием экстрацеллюлярныхферментов ферментативному гидролизу подвергаются сложные многоуглеродныесоединения – белки, липиды и полисахариды. На второй стадии (ацидогенез)в процессе ферментации участвуют две группы микроорганизмов: ацетогенные игомоацетатные. Ацетогенные Н2-продуцирующие микроорганизмыферментируют моносахариды, спирты и органические кислоты с образованием Н2,СО2, низших жирных кислот, в основном ацетата, спиртов и некоторыхдругих низкомолекулярных соединений. Гомоацетатные микроорганизмы усваивают Н2и СО2, а также некоторые одноуглеродные соединения через стадию образованияацетил-КоА и превращают его в низкомолекулярные кислоты, в основном в ацетат.На заключительной третьей стадии анаэробного разложения отходовобразуется метан. Он может синтезироваться через стадию восстановления СО2молекулярным водородом, а также из метильной группы ацетата.
4Н2+ СО2 = СН4 + 2Н2О
3Н2+ СО = СН4 + Н2О
2Н2О+ 4СО = СН4 + 3СО2
4НСООН = СН4+ 3СО2+ 2Н2О
4 СН3ОН= 3СН4 + СО2+ 2Н2О
СН3СООН= СН4 + СО2
90–95%используемого углерода метанобразующие бактерии превращают в метан и лишь 5–10%углерода превращаются в биомассу. Процесс ведется при температуре 30–60ºСи рН 6–8. Этот способ получения биогаза широко применяют в Индии, Китае,Японии. В настоящее время для производства биогаза чаще используют вторичныеотходы (отходы животноводства и сточные воды городов), чем первичные (отходызерноводства, полеводства), обладающие сравнительно низкой реакционнойспособностью и нуждающиеся в предварительной обработке. Основное преимуществобиогаза состоит в том, что он является возобновляемым и экологически чистым источникомэнергии.
Очисткасточных вод
Методыочистки сточных вод [4]:
1. Механическиеметоды.Сущность этих методов состоит в том, что из сточных вод путем отстаивания ифильтрации удаляют механические примеси. Механическая очистка позволяетвыделять из бытовых сточных вод до 60–75% нерастворимых примесей, а изпромышленных – до 95%.
2. Химическийметод. Всточные воды добавляют различные реагенты (AL2(SO4)3), которыевступают в реакцию с загрязнителями и осаждают их в виде нерастворимых осадков.Химическая очистка уменьшает количество нерастворимых примесей до 95%, арастворимых – до 25%.
3. Физико-химическиеметодыиспользуют для удаления тонкодисперсных и растворенных неорганических примесей,а также разрушения органических и плохо окисляемых веществ. В арсенал этихметодов входят электролиз, окисление, сорбция, экстракция, ионообменнаяхроматография, ультразвук, высокое давление и др.
4. Биологическийметодоснован на использовании закономерностей биохимического и физиологического самоочищениярек и других водоемов. Для очистки сточных вод используют биофильтры, биологическиепруды и аэротенки.
В биофильтрах(перколяционные фильтры известны с1890г.) сточные воды пропускают через слойкрупнозернистого материала, покрытого тонкой бактериальной пленкой, благодарякоторой интенсивно протекают процессы биологического окисления. С 1970 г.на смену клинкеру и гравию, в качестве пористого материала, пришли пластмассы.
Аэротенки –огромные резервуары из железобетона, в которых очистка происходит с помощьюактивного ила (известен с 1914 г.) из бактерий и микроскопическихживотных, которые бурно развиваются в этих сооружениях, чему способствуюторганические вещества сточных вод и избыток кислорода, поступающего с потокомподаваемого воздуха. Процесс более эффективен, чем фильтрация, нохарактеризуется высокими эксплуатационными расходами (аэрация).
С 1980 г.и по сей день в технологии очистки сточных вод применяется принцип«псевдоожиженного слоя» – сочетание первых двух систем. Реализуется этот принципв уловителе Саймона-Хартли (периодическое наращивание биомассы проводят впустотах пористого полиэфира) и оксигенаторе Дорра – Оливера (подложкой служитпесок).
Послебиоочистки проводят хлорирование жидким хлором или хлорной известью. Длядезинфекции используют также ультразвук, озонирование, электролиз.
Микробноевыщелачивание
Методыизвлечения меди из пород, содержащих минералы, путем обработки их кислымирастворами используются уже много веков. Однако лишь в 50-е и 60-е годы ХХ векавыяснилось, что в получении металлов из минералов решающую роль играют бактерии[4].В 1947 г. Колмер и Хинкл выделили из шахтных дренажных вод бактерию Tiobacillusferrooxydans. Этот организм окислялдвухвалентное железо и восстанавливал серосодержащие соединения, а также,возможно, и некоторые металлы. Вскоре оказалось, что он участвует в переводемеди из рудных минералов в раствор.
Окислительнымпроцессом, катализируемым бактериями, является окисление железа,
4FeSO2+ O2 + 2H2SO4 = 2Fe2 (SO4)3+ 2H2O,                      (1)
и окисление серы,
S8+ 12O2 + 8H2O = 8H2SO4.                                       (2)
Ряд минераловнепосредственно окисляется некоторыми выщелачивающими организмами. Примерамитакого рода могут быть окисление пирита,
2FeS2 + 15O2 + 2H2O = 2Fe2 (SO4)3 + 2H2SO4,                     (3)
и сфалерита,
ZnS + 2O2 = ZnSO4.                                           (4)
Ионтрехвалентного железа служит сильным окисляющим агентом, переводящим в раствормногие минералы, например халькоцит,
Cu2S+ 2Fe2 (SO4)3 = 2CuSO4 + 2Fe2SO4+Sº,                      (5)

и уранинит,
UO2 + Fe2 (SO4)3 = UO2SO4 + 2FeSO4.                                 (6)
Выщелачивание,происходящее при участии иона трехвалентного железа, который образуется врезультате жизнедеятельности бактерий, называют «непрямой» экстракцией. Внастоящее время бактериальное выщелачивание, известное также какбиогидрометаллургия или биоэкстрактивная металлургия, применяется впромышленных масштабах для перевода в растворимую форму меди и урана.
Выщелачиваниемедных отвалов. Для начала процесса выщелачивания отвал смачивают водой,подкисленной серной кислотой до рН 1,5–3,0. Этот кислый раствор, или «выщелачиватель»,просачивается сквозь бедную руду или отвальные материалы. Он содержит кислороди углекислый газ и создает благоприятную среду для размножения ацидофильныхгиобацилл, широко распространенных в сульфидных рудах. В некоторых случаяхсодержание Tiobacillusferrooxydans превышает 106клеток на 1 кг породы и на 1 мл выщелачивающего раствора. Этот организм активноокисляет растворимые ионы двухвалентного железа (1) и воздействует на серу – ижелезосодержащие минералы (2) (3). При окислении медно-сульфидных минераловнередко образуется элементарная сера (5). Эта сера маскирует частицы минералов,ограничивая воздействие на них со стороны трехвалентного железа. T. Ferrooxydans, присутствующая вколичестве 103-105 клеток на 1 г породы и на 1 мл выщелачивающего раствора, окисляет некоторые растворимые соединения серы иэлементарную серу (2). Разрушение серы этим организмом приводит к удалениюмаскирующего слоя серы, окружающего некоторые частицы минералов, и усиливаетпроцесс выщелачивания. Из выщелачиваемых отвалов вытекают растворы, содержащие0,75–2,2 г меди в 1 л. Эти растворы направляют в отстойники; медь из нихполучают путем осаждения с использованием железа или экстракциейрастворителями. «Отработанные» выщелачивающие растворы вновь поступают в отвал.
Выщелачиваниеурана.Бактериальное выщелачивание урана применяли в восточных районах Канады дляизвлечения остаточного урана на уже выработанных площадях, а также из отвалов.Для роста бактерий достаточно 3–4 месяцев, за это время T. ferrooxydans окисляет железо дотрехвалентного состояния. Затем трехвалентное железо окисляет восстановленныйуран до растворимого окисленного состояния в соответствии с реакцией (6).Промывные воды, содержащие уран, собирают и извлекают из них уран с помощьюионного обмена либо экстрагируют растворителями. Бактериальное выщелачиваниеприменялось в Канаде и в качестве первичного средства для получения урана.Рудное тело разрушали взрывом и осуществляли выщелачивание in situ.
Практическоеприменение бактериального выщелачивания сдерживается по ряду причин. Главноепрепятствие заключается в том, что процесс еще плохо исследован как на опытныхустановках, так и в полевых условиях. Процессы бактериального выщелачивания нередкопротекают медленнее, чем химические процессы. Для бактерий, окисляющих железо исеру, требуется кислая среда. Поэтому для переработки непригодны руды и отходы,поглощающие кислоты в большом количестве. При подземном выщелачивании с помощьюрастворов следует принимать во внимание такие факторы, как влияние наактивность бактерий повышенного гидростатического давления и гипербарическойоксигенации.
Биотехнологиямноголика и по своим историческим корням, и по своей современной структуре,объединяющей элементы фундаментальных наук и прикладных исследований. Еёразвитие позволяет существенно повышать эффективность использования природныхресурсов, решать экологические проблемы, создавать новые источники энергии.Очевидно, что новые «скачки» биотехнологии глубоко скажутся на судьбечеловечества.
Именнопоэтому мы считаем необходимым более подробное изучение данного раздела вшкольном курсе химии и предлагаем разработку методических рекомендаций,позволяющих сделать данное изучение наиболее эффективным.

2. Содержаниевопросов биотехнологии в школьном курсе химии
 
2.1 Анализшкольных программ и учебников[15]
Основнымиидеями современной концепции школьного химического образования являются идеигуманизации и демократизации образования, согласно которым «следует преодолетьотчуждение науки и производства от человека. В процессе обучения химиинеобходимо раскрывать связь между химическими знаниями и повседневной жизньючеловека… [10]»
Программа В.В. Пасечникадля 11 класса в курсе общей биологии содержит тему «основы селекции ибиотехнологии». Затрагиваются следующие вопросы: микробиологическоепроизводство пищевых продуктов, витаминов, ферментов и лекарств, проблемы иперспективы биотехнологии, генная инженерия её достижения и перспективы.
В.Б. Захароввпрограмме, рекомендованной для 10–11 классов с углубленным изучениембиологических дисциплин в курсе общей биологии в теме «основы генетики иселекции» также затрагивает биотехнологию и генетическую инженерию.
Необходимоотметить, что если базовый стандарт по химии не предусматривает изучениевопросов биотехнологии, то таковой по биологии содержит наиболее общие еёаспекты: достижения генной инженерии и перспективы биотехнологии.
2.2Межпредметные связи по изучению аспектов биотехнологии в средней школе
По программе Р.Г. Ивановойи Л.А. Цветкова в 10 классе предусмотрено изучение темы «промышленноеполучение важнейших неорганических веществ» (15 часов), при этом затрагиваетсявопрос охраны окружающей среды от загрязнения. Считаю уместным затрагиваниетемы переработки отвалов металлургических предприятий биологическими методами(микробное выщелачивание).
О.С. Габриелянпредлагаетв 9 классе тему-модуль «химические вещества в сельском хозяйстве» (5 ч.).При рассмотрении проблемы защиты окружающей среды от пестицидов возможноакцентирование внимания учащихся на современных разработках в этой области (ГМрастения, резистентные к пестицидам и вредителям). В модуле «химия и экология»(9 кл. 5 ч.) рассматриваются основные источники загрязнений гидросферы исовременные способы очистки сточных вод.
В учебнике О.С. Габриеляна,Ф.Н. Маскаева, С.Ю. Пономарёва, В.Н. Терёнина для 10 классарассматривается тема «биологическиактивные соединения» затрагивающая применениеферментов в промышленности, а также гормональные препараты, витамины иантибиотики. Т.о. здесь уместно рассмотрение основных биотехнологическихприёмов получения данных БАВ.
В 11 классепрограммой предусматривается рассмотрение темы «химия и общество» (8 ч.).Необходимо отметить наличие в ней следующих вопросов: биотехнология и геннаяинженерия, а также химия и пища. В учебнике О.С. Габриеляна Г.Г. Лысовой,реализующих данную программу, тема содержит объёмный материал, но методамочистки сточных вод и биохимическим основам пищевой промышленности практическиничего не отводится.
Н.С. Ахметовв 9классе при изучении «металлургии» затрагивает проблемы безотходногопроизводства и охраны окружающей среды. При этом возможно включение основбиометаллургии. Также автор предлагает рассмотрение темы «химия и охранаокружающей среды», в частности вопросов охраны гидросферы.
В учебнике 10–11классов в разделе «химия и химическая технология» рассматривается производствоэтанола из древесины, а также «охрана гидросферы» и «биогеохимические процессы».
Г.И. Шелинскийпредусматриваеттему «роль химии в прогрессивном развитии человеческого общества» в 11 классе.
Программа Н.Е. Кузнецовой,И.П. Титовой, А.Ю. Жегина, Н.Н. Гара предназначена дляобщеобразовательных учреждений естественнонаучного профиля, поэтому в нейпрослеживается экологизация курса химии. Авторы раскрывают роль химии вобеспечении жизни и прогрессивном развитии общества. И в 10 классе предлагаютсятемы: «вещества живых клеток» – полипептиды в природе (гормоны,антибиотики), а также «особенности процессов биотехнологии» – микробиологическийсинтез, применение генной инженерии и белковой инженерии, бактериальноевыщелачивание, проблемы экологического и гуманитарного характера.
В 11 классеавторы рекомендуют темы «гидросфера», где рассматриваются биологические методыочистки воды и «биосфера», где затрагивается проблема микробиологическогобелка.
Л.С. Гузей,Р.П. Суровцева и Л.М. Кузнецова в своих программах не затрагивают, вявной форме, вопросы биотехнологии.
2.3 Вывод(оптимизация изучения основных направлений биотехнологии в средней школе)
Проанализировавшкольные учебники и программы относительно содержания в них материала повопросам биотехнологии, можно сделать вывод о том, что далеко не все программыпредусматривают рассмотрение последних, а если и рассматривают, то в неполномобъёме. Таким образом, помимо разработки единого комплекса уроков (элективногокурса) по теме «особенности процессов биотехнологии» мы предлагаем примерныйплан включения материала с биотехнологическим уклоном в «стандартные» темышкольного курса химии.
Функциявключения материала, в форме элективного курса – внутрипрофильная специализацияобучения, в форме комплекса фрагментов – расширение знаний учащихся,преодоление оторванности учебного материала от жизни[1].

3. Разработкаэлективного курса и педагогический эксперимент
 
3.1Тематическое планирование элективного курса «Основы биотехнологии»
1.  Биотехнология.Биотехнологические процессы в пищевой промышленности.
2.  Биотехнологическаяпереработка отходов.
3.  Бактериальноевыщелачивание.
4.  Основы получения БАВ.Производство кормового белка.
5.  Производство аминокислот,витаминов и антибиотиков.
6.  Применение ферментов.
7.  Практическая работа«Приготовление иммобилизованных ферментных препаратов.
8.  Основы генной инженерии.
9.  Применение генной инженерии.
10.Итоговая проверочнаяработа.
 
3.2Поурочное планирование элективного курса
УРОК №1 потеме «Биотехнология. Биотехнологические процессы в пищевой промышленности»
Задачи:
1. Образовательная:знакомство с биотехнологией как ярким примером интеграционных взаимодействийнаучных дисциплин. Хронология развития биотехнологии. Основныебиотехнологические процессы в пищевой промышленности допастеровской эры.
2. Развивающая     а) развитие познавательного интереса учащихся при знакомстве с даннымнаправлением человеческой деятельности;
б)формирование логического мышления в ходе изучения нового материала;
в)формирование умений и навыков умственного и практического труда.
3. Воспитательная: а)в целях формирования диалектического мировоззрения показать познаваемостьприроды, на примере влияния человека на биотехнологические процессы пищевойпромышленности;
б) воспитаниетакта и дисциплины на занятиях в общеобразовательном учреждении.
Ходурока:
1. Организациякласса
2. Актуализациязнаний
Биотехнология– что это такое? (мнения учащихся)
Биотехнология– использование в промышленности биологических систем или процессов (подзапись).
Важно то, чточеловек смог создать самолет по принципу птицы, многоотсечные подводные лодкипо принципу кольчатых червей (бионика – подражание природе), но даже не смогприблизиться к уникальности биологических систем в отношении узнавания икатализа (вспомните специфичность и активность ферментов).
Человекиспользовал биотехнологию многие тысячи лет: люди занимались пивоварением, пеклихлеб. Они придумали способы хранения и переработки продуктов путем ферментации(сыр, уксус), изготавливали простейшие лекарства и т.д. Однако толькоразработка методов генетической инженерии привела к «биотехнологическому буму»,свидетелями которого мы являемся.
3. Изучениенового материала
Но пойдем попорядку.
В своемсовременном варианте биотехнология, пожалуй, наука синтетическая:

/>

Но у вас недолжно быть мнение о ней как о прикладной дисциплине: «Нет и еще тысячу разнет: я не знаю такой науки, которую можно было бы назвать прикладной. Естьнаука и есть области её применения, и они связаны друг с другом, как плод свзрастившим его деревом» (Луи Пастер, 1871 г.)
Съездевропейской ассоциации биотехнологов разделил развитие биотехнологии на пятьэтапов: (под запись) [16]
1) допастеровскаяэра (до 1865 года) – самобытные производства пива, вина, хлеба, сыра;
2) послепастеровская(1866–1940) – производство органических кислот, растворителей, кормовыхдрожжей, вакцин, очистка сточных вод.
В конце 19века Луи Пастер установил, что микробы играют ключевую роль в процессахброжения, и показал, что в образовании отдельных продуктов участвуют разные ихвиды;
3) эра антибиотиков(1941–1960) – началом которой послужило открытие Александром Флемингомспособности Penicillium вызывать гибель микроорганизмов;
4) эрауправляемого биосинтеза (1961–1975) – производство аминокислот, витаминов,ферментов. Достижения, главным образом, селекции и биохимии микроорганизмов;
5) эрагенетической инженерии (70-е годы) – технология гибридных ДНК.
Сегодня мыразберем основные процессы допастеровской эры – производство некоторыхпродуктов питания (таблица выполняется на доске).
Пищевой продукт
Сбраживающие организмы
Основной процесс Молочнокислые продукты Стрептококки, молочнокислые бактерии
Молочнокислое брожение:
/>C6H12O6 2CH3CH(OH) COOH
глюкоза молочная кислота Сыр
Молочнокислые бактерии,
Ренин из сычуга
Маслянокислое брожение:
/>C6H12O6 CH3CH2CH2COOH +
глюкоза масляная кислота
+ 2CO2 + 2H2 + образование сгустка казеина Сметана, сливочное масло Особые молочнокислые бактерии
Лимоннокислое брожение:
C6H12O6 + H2O = C6H8O7 + 3Н2
лимонная
кислота Хлебопродукты Дрожжи Saccharomyces
/>Анаэробное сбраживание глюкозы:
C6H12O6 = 2C2H5OН + 2СО2 Изоглюкоза («кукурузный сироп») Гидролазы и изомеразы различных микроорганизмов
Гидролиз крахмала:
(C6H10O5)n + n H2O = n C6H12O6
глюкоза
Изомеризация глюкозы:
2n C6H12O6 = n C6H12O6 + n C6H12O6
глюкоза глюкоза фруктоза Пиво, вино Дрожжи Saccharomyces
/>Анаэробное сбраживание глюкозы:
C6H12O6 = 2C2H5OН + 2СО2 Уксус (≥ 4º) Acetobacter
Аэробное окисление спирта:
(1) C2H5OН + 1/2О2 = [CH3C(O) H] + Н2О
ацетальдегид
(2) CH3C(O) H + 1/2О2 = CH3CОOH
уксусная кислота

4. Вывод
Итак,изменилось ли ваше представление о биотехнологии, производстве продуктовпитания?
УРОК №2 потеме «Биологическая переработка отходов»
Задачи:
1. Образовательная:изучение основ получения биогаза и очистки сточных вод. Знакомство с экологическойбиотехнологией.
2. Развивающая:     а)развитие познавательного интереса при знакомстве с новым направлениембиотехнологии;
б)формирование логического мышления в ходе систематизации материала;
в)формирование умений и навыков умственного и практического труда.
3. Воспитательная: а)в целях формирования диалектического мировоззрения показать использованиечеловеком процессов и объектов живой природы для нужд общества;
б) воспитаниемотивации к обучению в связи актуальности экологических проблем в современноммире.
Ходурока:
1. Организациякласса
Вспомните,какой этап развития биотехнологии мы разобрали на предыдущем уроке?
Какойхимический процесс лежит в основе всех бродильных(спиртовых) производств?
2. Актуализациязнаний
Ни для когоиз вас не секрет, что человек в ходе своей деятельности создает большуюэкологическую нагрузку окружающей среде (примеры учащихся). И здесьбиотехнология внесла и вносит свой вклад. Под запись: специфическое применениебиотехнологических методов для решения проблем окружающей среды, таких какпереработка отходов, очистка воды, устранение загрязнений, составляет предметэкологической биотехнологии.
3. Изучениенового материала
(Основнаячасть урока проходит в форме лекции, позволяющей компактно передать учащимсяукрупненную дидактическую единицу)
отходы/>/>
бытовые
(сточные воды городов, с/х отходы мелких хозяйств и т.д.)
промышленные
(отвалы металлургических предприятий, стоки химических комбинатов и т.д.)
Насегодняшнем уроке мы «займемся» бытовыми отходами.
Необходимоотметить, что проблемой очистки сточных вод занялись только в 1890 году, когдабыл предложен первый биофильтр. Вообще, все биологические методы очисткисточных вод основаны на использовании закономерностей самоочищения водоемов.
Для очисткииспользуют:
а) биофильтры– сточные воды пропускают через слой крупнозернистого материала, покрытоготонкой бактериальной пленкой, благодаря которой интенсивно протекают процессыбиологического окисления. С 1970 года на смену клинкеру и гравию в качествепористого материала пришли пластмассы. Таким образом, видим сочетаниемеханической (пористый носитель) и биологической (биодеградация органическихостатков) очистки сточных вод. Недостаток – избыточный рост микроорганизмов и,как следствие, засорение фильтра.
б) биологическиепруды – отстойные цветущие водоемы. Характеризуются малой эффективностью ибольшим временем самоочистки.
в) аэротенки– известны с 1914 года. Именно 1914 год считается годом рождения биоочисткисточных вод. Аэротенки – это огромные резервуары из железобетона, в которыхочистка происходит с помощью активного ила из бактерий (Zoogloea) и микроскопическихживотных. Процесс очистки непрерывный, аэробный, т.е. нуждается в активнойаэрации воздухом (отсюда высокие эксплуатационные расходы) и высоко эффективный.
г)«псевдоожиженный слой» – применяется с 1980 года по сей день. «Псевдоожиженныйслой» – это сочетание биофильтра и активного ила. Подложка – полимерныйноситель или песок. Процесс периодический и не требует аэрации. Послебиоочистки проводят дезинфекцию жидким хлором, хлорной известью, УЗ, озоном илиэлектролизом.
Каким быспособом не проводилась биоочистка сточных вод, в конце имеем избыточнуюбиомассу. Наиболее эффективный способ утилизации – анаэробное брожение сполучением биогаза.
Биогаз –смесь 65% СН4; 30% СО2; 1% Н2S … NH3 …
Энергия 1,7м3биогаза эквивалентна энергии 1м3 природного газа. В основе получениябиогаза лежит процесс метанового брожения или биометаногенез. Биометаногенез –сложный микробиологический процесс разложения органического вещества до СО2и СН4 в анаэробных условиях (под запись).
Участвуютсвыше 190 микроорганизмов.
Стадии:
/>/>I. Белки аминокислоты
/>/>/>Липиды ВЖК и глицерин
/>Полисахариды моносахара
II.
 
H2 + СО2 + НЖК(СН3СООН) + низшие спирты
(в основном)
III. Образование метана: (1) 4H2 + СО2 = СН4 + 2Н2О…
(2) 4СН3ОН = 3СН4 + СО2 + 2Н2О
(3) СН3СООН = СН4 + СО2
90–95%используемого углерода превращается в метан, остальное в биомассу. Температурапроцесса 30–60ºС; рН ~ 7. Основное преимущество биогаза – возобновляемый иэкологически чистый источник энергии.
4. Вывод
Итак, что жемы сегодня изучили? Какую роль, по вашему мнению, может сыграть технологиябиометаногенеза в ближайшем будущем в свете дефицита энергоносителей?
УРОК №3 потеме «Бактериальное выщелачивание»
Задачи:
1. Образовательная:расширить сведения учащихся о переработке отходов на примере использованияпромышленных отвалов. Рассмотрение основных процессов микробного выщелачивания.Промышленное использование на примере переработки медных отвалов.
2. Развивающая:     а)развитие познавательного интереса в процессе знакомства с материалом;
б)формирование логического мышления в ходе дедуктивного изложения материала;
в)формирование умений и навыков умственного и практического труда.
3. Воспитательная: а)в целях формирования диалектического мировоззрения показать, что, при всейнеобычности процессов микробного выщелачивания, они закономерно вписываются вовсеобщую биотрансформацию неорганических веществ;
б)«прививание» экологического мировоззрения.
Ходурока:
1. Организациякласса
Какие видыочистки сточных вод вы можете назвать? Как вы понимаете понятие биометаногенез?
2. Актуализациязнаний
Еще за 1000лет до н.э. финикийцы извлекали медь из рудничных вод. Валлийцы (Британскиеострова) в 17 веке описали аналогичный процесс. Сегодня мы попытаемсяразобраться в секрете древних металлургов. Тема урока: «Бактериальноевыщелачивание».
3. Изучениенового материала
1947 г.– Колмер и Хинкл выделили из шахтных вод бактерию Thiobacillus ferrooxydans. Попытайтесь перевестиназвание на русский язык («Серобацилла железоокислительная»).
Идействительно этот вид осуществляет процесс:
/>Fe2+ Fe3+, что соответствуетокислению железа.
Данный видбактерий относиться к группе хемосинтезирующих автотрофов (вспомните, что этотакое), открытых Виноградским в 1920-е годы. Позже были обнаружены Thiobacillus thiooxydans – организмы, живущие всреде при рН = 0,65, и Sulfolobus, «терпящие» до 85ºС. Эти бактериисуществуют за счет окисления серы.
T.ferrooxydans
/>4Fe2+ + O2+ 4H+ 4Fe3+ + 2H2O
Sulfolobus
/>S8 + 12O2= 8 H2O 8H2SO4
T.thiooxydans
/>ZuS + 2O2 ZuSO4
T. ferro-/thiooxydans
/>4FeS2 + 15O2 + 2H2O 2Fe2 (SO4)3 + 2H2SO4
Обратите напоследние два процесса особое внимание, так как данные процессы «растворения»минералов сфалерита (ZuS) и пирита (FeS2) идут в земной коре имогут быть использованы человеком как альтернатива
t
2ZuS + 3O2 = 2ZuO +2SO4, дающего многозагрязнителей атмосферы.
Особыйинтерес для промышленности представляет перевод в раствор полудрагоценной меди:
Cu2S + 4Fe3+= 2Cu2+ + 4Fe2+ + S/> /> /> /> /> /> /> /> /> /> />

/>/>T.ferrooxydans             Sulfolobus H2SO4
Данныйпроцесс позволяет перерабатывать бедные руды и отвалы с содержанием меди 0,4% (w).

Возможныесхемы проведения
I. р-р H2SO4
/>/>(рН=2)
/>

сбор продукта
II. р-р H2SO4 откачка
/>/>О2 продукта III. Чановое выщелачивание (меньше потерь)
Продукт: р-р,содержащий 0,75 – 2,2 г/л меди:
/>Cu2+ + Fe = Cu + Fe2+ (можно показать меднениегвоздя в растворе медного купороса)
Образующийсяраствор Fe2+ снова направляют в отвал.
· Проблемы:
1) Бактерииживут только в кислой среде. Что будет происходить при контакте выщелачивающегораствора с известковыми породами?
2) Потерираствора и возможное смешивание с грунтовыми водами.
3) Разогреваниепороды при «работе» бактерий (зафиксировано до 80ºС) и как следствиестерилизация.
4) Инженерныепроблемы введения кислоты и воздуха в породу.
· Перспективы:
1) Удалениесеры из каменного угля. Подумайте, как это можно сделать.
2) Извлечениеметаллов из морской воды (Au) – привлечение ГМО.
4. Вывод
Итак, прижелании человек может применять природосберегающие технологии даже приразработке медных, и не только, руд.
УРОК №4 потеме «Основы получения БАВ. Производство кормового белка»
Задачи:
1.      Образовательная:изучение основных механизмов интенсификации процессов получения продуктовклеточного метаболизма. Производство кормового белка как предшественникуправляемого биосинтеза БАВ.
2. Развивающая:     а)развитие познавательного интереса учащихся;
б)формирование логического мышления в ходе изучения механизмов интенсификациипроцессов получения продуктов клеточного метаболизма;
в)формирование умений и навыков умственного и практического труда.
3. Воспитательная: а)в целях формирования диалектического мировоззрения показать возможностьвоздействия человека на процессы клеточного метаболизма;
б) воспитаниемотивации к обучению.
Ходурока:
1.Организация класса
Напишитеуравнения химических процессов лежащих в основе микробиологическоговыщелачивания медных отвалов, руд, содержащих пирит.
2. Актуализациязнаний
Всем вамхорошо известны витаминные препараты, продающиеся повсеместно в аптеках.Антибиотики как средство от многих возбудителей заболеваний прочно вошли в нашужизнь. Встает вопрос, какими методами получают в промышленности все этисоединения. Прежде, чем говорить о получении, вспомним, что из себяпредставляет предмет нашего разговора.
3. Изучениенового материала
Витамины –группа низкомолекулярных природных органических соединений, абсолютнонеобходимых для гетеротрофных организмов (что это за организмы?).Автотрофные организмы обладают способностью к синтезу витаминов. (под запись)
Антибиотики –низкомолекулярные регуляторы обычно природного происхождения, способныеподавлять рост живых клеток.
Итак, впроцессе роста организмы вырабатывают различные низкомолекулярные (какие ещё вызнаете?) продукты (метаболиты). Они подразделяются на первичные (абсолютнонеобходимы) и вторичные (не требующиеся для выживания).
низкомолекулярные метаболиты/>/>
первичные
(структурные единицы биополимеров, витамины, органические кислоты)
вторичные
(антибиотики, пигменты, токсины)
Такимобразом, вторичные метаболиты повышают адаптационные возможности организмов.
/>

массаорганизма                                                I – первичные метаболиты
 
II – вторичные(синтезируются
назавершающей стадии роста)
/>

времяроста
К какимметаболитам вы отнесете аминокислоты, углеводы? Почему?
В норме обменвеществ в клетке осуществляется по принципу строжайшей экономии. Задачабиотехнолога состоит в обеспечении сверхсинтеза одного из продуктовметаболизма, что обеспечивается следующими методами:
1) Изменениегенетической программы организма:
а) селекция –направленный отбор организмов со скачкообразным изменением генома. Но длявозникновения мутации интересующий нас ген должен удвоиться ~107раз.
б)искусственный мутагенез – химический, УФ, радиационный.
2) Нарушениерегуляторных систем организма: (на доске)

/>Ф Ф'
/>/>А Б С
/>

/>блокировка фермента конечным метаболитом Если Д (тоже блокирует Ф) – антиметаболит С, т.е. Д не включается в обмен, то на среде с Д выживают организмы с дефектами регуляции.
Сегодня мырассмотрим также производство кормового белка как прообраз современногоуправляемого биосинтеза аминокислот, витаминов и антибиотиков.
Всоответствии с нормами питания человек должен ежедневно получать с пищей 60–120 г.полноценного белка (содержащего все незаменимые аминокислоты). Незаменимыеаминокислоты наиболее сбалансированы в белках семян сои, также риса и гороха. Вбелках зерна пшеницы мало лизина, метионина и изолейцина.
Особыйинтерес представляет использование микроорганизмов в качестве источника белка ивитаминов:
1) использованиеразнообразных сред для культивации (вплоть до отходов производства);
2) высокаяинтенсивность роста
удвоениебелковой массы:    крупный рогатый скот – 5 лет,
свиньи – 4месяца,
дрожжи – 1–6часов;
3) повышенноесодержание незаменимых аминокислот;
4) относительнаяпростота влияния на процессы синтеза.
Дрожжевыеклетки способны использовать жидкие фракции углеводородов нефти (10–30ºС).В России первый завод по производству кормовых дрожжей из жидких парафиновнефти вступил в действие в 1971 году. При выращивании в среду добавляют такжеминеральные соли, витамины и воду. Полученная высушенная дрожжевая массагранулируется и используется как белково-витаминный концентрат (БВК),содержащий до 60% белковых веществ.
Хорошимсубстратом для выращивания кормовых дрожжей является молочная сыворотка – отходпри переработке молока, а также низшие спирты. Хороший резерв пищевого белка ивитаминов – остаточные пивные дрожжи. Организм человека усваивает свыше 90%питательных веществ, содержащихся в них.
Известнотакже более 30 видов бактерий, которые могут быть применены в качествеисточника полноценного белка. Например, водородоокисляющие бактерии способнынакапливать в клетках до 80% сырого протеина (среда 75% Н2, 20% О2,5% СО2).
Используютсятакже одноклеточные водоросли (Chlorella, Seenedesmus). Обычно их выращивают в естественных условияхюжных регионов в бассейнах открытого типа (70 т/га в год).
Микопротеин –белок грибного происхождения. Среда культивации – глюкозный сироп (гидролизаткукурузного крахмала).
4. Заключение
Итак, остротапроблемы глобального перенаселения, сокращение с/х площадей в результате ростагородов и деградации земель выводит нас на новый виток развития биотехнологии,а именно, крупномасштабное использование микроорганизмов для наработкибелково-витаминной продукции.
УРОК №5 потеме «Производство аминокислот, витаминов и антибиотиков»
Задачи:
1.      Образовательная:изучить примеры некоторых производств аминокислот, витаминов и антибиотиков.Другие промышленно важные процессы эры управляемого биосинтеза: производстволимонной и молочной кислот.
2. Развивающая:     а)развитие познавательного интереса учащихся в процессе ознакомления сматериалом;
б)формирование логического мышления;
в)формирование умений и навыков умственного и практического труда.
3. Воспитательная: а)в целях формирования диалектического мировоззрения показать использованиечеловеком природных систем для получения некоторых БАВ;
б) воспитаниемотивации к обучению в связи с важностью биотехнологических методов всовременной химической промышленности.
Ходурока:
1.Организация класса
Какиекомпоненты используются при получении БВК?
2.Актуализация знаний
На предыдущемуроке мы познакомились с возможными путями обеспечения сверхсинтеза одного ихпродуктов метаболизма (какими?), а сегодня попытаемся рассмотреть конкретныепроизводства.
3. Изучениенового материала
I. Производствоаминокислот
Средисоединений, полученных биотехнологическими методами, аминокислоты занимаютпервое место по объему производства (500 тыс. т/год).
Белковыеаминокислоты можно получить:
1) гидролизомприродного белоксодержащего сырья, но кислотное воздействие разрушает некоторыеаминокислоты;
2) химическимсинтезом, в ходе которого получается трудноразделимая смесь целевого продукта иего аналогов;
3) микробиологическимсинтезом, который обеспечивается возобновляемым сырьем и характеризуетсястрогостью чистоты получаемого продукта. Более 60% производимых аминокислотполучают именно этим методом.
Промышленноепроизводство аминокислот стало возможным после открытия способности некоторыхмикроорганизмов выделять в культурную среду значительные количества какой-либоаминокислоты (1955). Corynebacterium glutamicum был способен, крометого, к сверхсинтезу глутамина, и в 1956 году этот микроорганизм былиспользован при организации первого в мире производства глутаминовой кислоты(НООС-СН2-СН2-СН(NH2) COOH). Сейчас на глутаматнатрия приходится 300 тыс. т/год, т.е. 60% производства аминокислот. Японцыназывают глутамат натрия «солью вкуса», т.е. он значительно продлевает вкусовыеощущения.
Лизинапроизводится 100 тыс. т/год. Данная аминокислота H2N(CH2)4CH(NH2) COOH – незаменимый компонентпитания с/х животных. В клетках микроорганизмов лизин служит конечным продуктомразветвлённого метаболического пути, и эффекта накопления в среде целевойаминокислоты добиваются путем блокирования процессов, ведущих к синтезупобочных продуктов. Получаемые мутанты дефектны по ферменту разветвленияметаболического пути, в результате чего накапливается только лизин. В качествепитательной среды используют молочную сыворотку или гидролизаты крахмала.
Некоторыеаминокислоты синтезируют из предшественников, полученных химически имодифицированных ферментной системой организма (триптофан получают изантраниловой кислоты).
II. Производствовитаминов
В настоящеевремя микробиологически синтезируют лишь особо сложные по строению витамины (В2,В12, β-каротин, D). Остальные либо синтезируют химическим путем, либо выделяютиз природных источников.
Витамин В2(рибофлавин) вплоть до 30-х годов 20 века выделяли из природного сырья (1г из1т моркови и 6г из 1т печени трески). В 1935 году был обнаружен активныйпродуцент рибофлавина – гриб Eremothecium, способный давать с 1т питательной среды 25 кгвитамина. Отбор мутантов ведут по устойчивости к аналогу витамина В2.
Витамина В12из 1т печени трески можно было выделить лишь 15 мг. В настоящее время витамин В12синтезируется только микробиологическим путем с использованиемактиномицетов и одноклеточных водорослей.
β-каротинможно выделить из ряда растительных объектов: 1т моркови содержит 0,06 мгвитамина, в то время как биомасса гриба Blaneslea накапливает β-каротинв количестве 8 мг/г.
III. Получениеорганических кислот
Объеммирового производства лимонной кислоты НООССН2С(ОН) (СООН) СН2СООН– 400 тыс. т/год. Данное производство относится к старейшим микробиологическимпроцессам: 1893 г. – год основания. Используют культуру гриба Aspergillus niger. Условиями высокоговыхода лимонной кислоты является хорошая аэрация и дефицит фосфата в среде.
Одновременнос лимонной было налажено аналогичное производство молочной кислоты при участиимолочнокислых бактерий Lactobacillus.
IV. Получениеантибиотиков
Вспомните,что такое антибиотики? Думаю, важность получения соединений данной группы нетнеобходимости доказывать.
В 1940 годубыло известно всего 6 антибиотиков, а в настоящее время описано свыше12 000 соединений, из которых в клинике используется около 200 (остальныетоксичны).
Биосинтезантибиотиков осуществляется:
1) добавлениемв питательную среду подходящего предшественника (фенилуксусная кислотастимулирует биосинтез бензилпенициллина);
2) использованиемблокированных мутантов, у которых отсутствует определенное звено в цепиреакций, ведущих к синтезу антибиотика. Следовательно, можно получить аналогиантибиотиков и модифицировать их химически (бензилпенициллин, ампицилин).
4. Вывод
Пока человеклишь приближается к моделированию природных биохимических процессов, а покаизыскивает новые пути использования существующих.
УРОК №6 по теме«Применение ферментов»
Задачи:
1.      Образовательная:знакомство с иммобилизованными ферментами. Промышленное применениеиммобилизованных ферментов.
2.Развивающая: а) развитие познавательного интереса;
б)формирование логического мышления в ходе знакомства с методами иммобилизацииферментов;
в)формирование умений и навыков умственного и практического труда.
3.Воспитательная:      а) в целях формирования диалектического мировоззренияпоказать использование катализаторов белковой природы;
б) воспитаниемотивации к обучению при акцентировании на современности и важности даннойметодики работы с ферментными препаратами.
Ходурока:
1.Организация класса
Какимиспособами можно получить белковые аминокислоты? Попытайтесь написать реакциюгидролиза белка в общем виде.
2. Актуализациязнаний
Всем хорошоизвестно, что в морской воде много растворенного кислорода, но, тем не менее,его использование затруднено, и при погружении приходится использоватьдополнительные источники кислорода. А что, если гемоглобин, выделенный изкрови, использовать в качестве посредника между морской водой и газовой средойдыхательного аппарата?! Более того, модель «гемогубки» уже предложена и,возможно, в ближайшем будущем будут сконструированы эффективные искусственныежабры. Сегодня на уроке мы попытаемся разобраться, каким образом можно«направить в нужное русло» тот или иной фермент.
3. Изучениенового материала
Ферментысохраняют свои уникальные свойства (какие?) и вне клеток, поэтому ихтрадиционно широко применяют в практике.
Применениеферментов
Фермент
Химико-биологический процесс
Область применения Амилазы Гидролиз крахмала до мальтозы и глюкозы Спиртовая промышленность, хлебопечение, получение глюкозы Глюкоизомераза
/>Глюкоза фруктоза Кондитерская промышленность Липазы Гидролиз жиров и масел Пищевая и медицинская промышленность Пептидогидролазы Гидролиз белка Получение аминокислот, производство сыра, выделка кожи, медицина Целлюлазы Гидролиз целлюлозы до глюкозы Производство этанола, глюкозо-фруктозных сиропов Сахараза Гидролиз сахарозы Сиропопроизводство
Но еслисмешать фермент с реагентами, то после окончания реакции его будет очень трудноотделить от продуктов. Еще в 1916 году Дж. Нельсон и Е. Гриффинпоказали, что сахараза, сорбированная на угле, сохраняла свою каталитическуюактивность, а уголь можно отделить от раствора продуктов без особыхзатруднений, и, следовательно, фермент можно применять многократно.
В настоящеевремя (с 1971 года) применяется термин «иммобилизация» – полное или частичноеограничение движения белковых молекул. Иммобилизованными ферментами называютферменты, искусственно связанные с нерастворимым носителем, но сохраняющие своикаталитические свойства (под запись). Иммобилизованный ферментный препаратвключает в себя непосредственно фермент и носитель (природные полимеры –целлюлоза, хитин, желатин; синтетические – полистирол, поливиниловый спирт;неорганические – керамика, силикагель, графит).
Примерыхимической иммобилизации:
1) образованиеамидной связи:
H – C(O) Cl + H2N – Ф = H – C(O) NHФ + HCl
2) образованиедисульфидного мостика:
H – SH + 0,5O2+HS – Ф = H –S – S – Ф +Н2О
3) образованиеоснований Шиффа:
H – C(O) H + H2N – Ф = H – CH = N – Ф + Н2О
Промышленноеприменение иммобилизованных ферментов:
1. Иммобилизованнаясахараза работает до 10 лет, при этом активность фермента теряетсянезначительно:
С12Н22О11+ Н2О = С6Н12О6 + С6Н12О6
глюкоза фруктоза
инвертныйсахар
2. Глюкоизомеразапревращает глюкозу во фруктозу и таким образом получают глюкозо-фруктозныйсироп (50 х 50).
3. Осуществленпромышленный синтез аминокислот из их аналогов на иммобилизованных ферментах:
/>НООС – СН = СН – СООNH4 HOOC – CH2 – CH(NH2) – COOH
фумаратаммония                                    аспарагиновая кислота
/>HOOC – CH2 – CH(NH2) – COOH H3C – CH(NH2) – COOH + CO2
аспарагиноваякислота                                     аланин
4. Яблочнуюкислоту – заменитель лимонной в продуктах питания – получают из химическисинтезируемой фумаровой:
/>НООС – СН = CH – СООН + Н2О НООС– СН(ОН) – СН2СООН
фумароваякислота                        яблочная кислота
4. Заключение
Итак, намстало ясно, какое значение играют ферменты в современной химическойпромышленности. На следующем уроке мы попробуем сами получить иммобилизованныйферментный препарат.
УРОК №7Практическая работа «Приготовление иммобилизованных ферментных препаратов»
Задачи:
1.      Образовательная:освоение простейших методов получения ферментных препаратов в растворенном ииммобилизованном виде.
2.Развивающая: а) развитие познавательного интереса учащихся;
б)формирование логического мышления в ходе выполнения практической работы;
в)формирование умений и навыков умственного и практического труда.
3.Воспитательная:      а) в целях формирования диалектического мировоззренияпроведением качественных проб на ферменты показать реальность процессаиммобилизации;
б) воспитаниемотивации к обучению.
Ходурока:
1. Организациякласса
Какие способыиммобилизации ферментов вы знаете?
2. Постановкаучебных задач
Насегодняшнем занятии вы попробуете самостоятельно выделить фермент из природногообъекта и иммобилизовать его на полимерном носителе.
Класс делитсяна 3 группы, и каждая работает со своим ферментом.
3. Проведениеработы (более подробно см. [13].
I. Получениеферментных препаратов:
10 г. природного объекта(пекарские дрожжи – сахараза; бобы фасоли без кожуры – уреаза; проросткипшеницы – комплекс амилаз) тщательно растирается в ступке с кварцевым песком изаливается 20–30 мл воды; перемешивание – 10 мин. Фильтрование черезскладчатый фильтр.
II. Иммобилизация:
Послепояснения термина «катионит» берут 1 г его и в химическом стакане перемешиваютс полученным ранее фильтратом 40–60 мин. После фильтрования (обычныйфильтр) массу промывают 2 раза водой.
III. Проведениекачественных проб:
(Заранее надоске приготовлена таблица)Фермент Субстрат Реагент обнаружения Признаки реакции Сахараза 3 мл 5% сахарозы Фелингова жидкость (2 мл)
Образование красного Cu2O при нагревании Уреаза 5 мл 1% мочевины 2 капли спиртового фенолфталеина Малиновая окраска Амилазы 5 мл 1% крахмала Фелингова жидкость (2 мл)
Образование красного Cu2O при нагревании
Контрольвыполняют 3 человека из класса со смоченным водой катионитом.
4. Выводы
Итак, что выможете сказать после проведения качественных реакций? Почему катионит не далположительных результатов в контрольных опытах? Оформите дома работу,попробуйте написать химический процесс, катализируемый «вашим» ферментом, иответьте на вопрос: какой вид иммобилизации мы использовали в ходе работы?
УРОК №8 потеме «Основы генной инженерии»
Задачи:
1.      Образовательная:знакомство с современной биотехнологией – генетической инженерией, основныенаправления и задачи. Принципиальные методы создания искусственных генетическихструктур.
2.Развивающая: а) развитие познавательного интереса учащихся;
б)формирование логического мышления в процессе освоения теоретических приемовконструирования генетических структур;
в)формирование умений и навыков умственного и практического труда.
3.Воспитательная:      а) в целях формирования диалектического мировоззренияпоказать познаваемость тонких механизмов реализации генетической программыорганизма и возможности воздействия человека на геномы различных живыхобъектов;
б) воспитаниемотивации к обучению.
Ходурока:
1. Организациякласса
Обсуждениевопросов, возникнувших при оформлении практической работы.
2. Актуализациязнаний
«…там, гдеприрода кончает производить свои виды, там человек начинает из природных вещейсоздавать, с помощью этой же самой природы, бесчисленные виды новых вещей». (Л. ДаВинчи: расшифрованные записные книжки)
С глубокойдревности человек мечтал создавать новые виды животных … людей. Достаточновспомнить множество мифов о русалках, кентаврах, сиренах и других сказочных(?!) персонажах. Кто знает, может в недалеком будущем они станут реальностью.
Насегодняшнем уроке мы попытаемся разобраться, что служит основанием для такихсуждений.
3. Изучениенового материала
Если вывспомните первое занятие, то сами скажете, в какой «биотехнологической эре» мысейчас живем (эра генетической инженерии).
Попробуемразобраться в этом термине:
генетическая(генная) – затрагивающая генетические структуры (какие это структуры?);
инженерияподразумевает конструирование, модификацию в механическом смысле.
Итак,запишите определение:
Геннаяинженерия – система экспериментальных приемов, позволяющих конструировать лабораторнымпутем искусственные генетические структуры, вводить их в клетку и позволяющих вней совершать работу.
Возможно, увас вызвало недоумение словосочетание «совершать работу». Вспомним простейшуюсхему реализации генетической информации:
/>/>участок ДНК (ген) РНК белок (на доске)
и именнобелок реализует генетическую информацию сам по себе или, если он фермент,запускает превращение каких-то веществ. Например, собаки не нуждаются впоступлении извне витамина С, а синтезируют его из компонентов углеводистойпищи. Следовательно, если гены, кодирующие нужные ферменты такого превращения,«пересадить» от собаки организму, испытывающему недостаток витамина С (морскойсвинке, человеку!?!), то проблема будет решена. Правда, данный перенос генов насовременном этапе утопичен, но я привел его как наглядный примербиотехнологического использования.
Успехи вгенной инженерии стали возможны благодаря изучению простейших живых существ(вирусов и бактерий) на генетическом уровне. Прежде, чем извлечь нужный ген измикроорганизма, надо знать его местоположение. Составлены так называемыегенетические карты многих штаммов бактерий и вирусов методами классическойгенетики. Нужен «почтальон» – носитель генов, предназначенных для переноса («вектор»).Такие имеются в природе с незапамятных времен: плазмиды и бактериофаги.Плазмиды – кольцевые молекулы ДНК, относительно небольших размеров,самостоятельно существующие независимо от хромосомы бактерии. Они обусловливаютвне хромосомную наследственность (кстати, у человека её обусловливаютмитохондрии). И конечно нужны «хирургические скальпели» молекулярных размеров,позволяющие резать ДНК в нужных местах. И такие инструменты всегда были рядом снами и даже в нас: ферменты специфического расщепления ДНК – рестриктазы. Рольих в клетке – разрушение вирусных ДНК. Каждая рестриктаза специфична по-своему,но все они имеют одну общую особенность – действуют на последовательности,читаемые в одной цепи ДНК, идентично другой, но в противоположную сторону:
/>                   5´ГААТТЦ 3´
/>                   5´ ЦТТААГ 3´
«перевертыши»:«А роза упала на лапу Азора».
Обратитевнимание, что образовались однотяжевые последовательности, комплементарные другдругу, «липкие концы». Уже известно более 500 рестриктаз, позволяющихрасщеплять ДНК в 120 последовательностях. Впервые их применили в 1972 году вСША.
Естьферменты, сшивающие разрывы ДНК (на доске):
/>/>ААТТ ААТТ
______________________
____________________________________________
/>/>ТТАА ТТАА
рестриктаза =
/>

/>ААТТ
ТТАА
(плазмида)
ААТТ
___________________
___________________
ТТАА
(нужный ген) =
ААТТ
___________________
___________________
ТТАА
(раскрытая плазмида)
ААТТ
ТТАА
ТТАА
ААТТ
гибридная ДНК
(после сшивки)

Теперьобновленные плазмиды, поглощенные бактериями из раствора, можно размножить вмиллионы раз – клонировать. А встроенный ген будет работать инарабатывать нужный белок, витамин, аминокислоту… Это мы рассмотрим наследующем уроке.
УРОК №9 потеме «Применение генной инженерии»
Задачи:
1.      Образовательная:знакомство учащихся с применением достижений генной инженерии в биотехнологии:клонирование генов в различных организмах. Проблемы и перспективы данногонаправления.
2.Развивающая: а) развитие познавательного интереса учащихся в связи сзанимательностью материала;
б)формирование логического мышления в ходе познания путей получения современныхлекарственных препаратов и новых сортов растений;
в)формирование умений и навыков умственного и практического труда.
3.Воспитательная:      а) в целях формирования диалектического мировоззренияпоказать хрупкость состояния природного равновесия и все возрастающую рольчеловека в поддержании этого равновесия;
б) воспитаниемотивации к обучению.
Ходурока:
1. Организациякласса
Объясните,как можно пересадить ген от одного микроорганизма другому?
2. Актуализациязнаний
Итак, мыразобрались, как можно пересадить ген от одного организма другому. Сегодняпосмотрим, к чему это приводит или может привести.
3. Изучениенового материала
В настоящеевремя основные работы по генной модификации организмов ведутся с бактериями,так как они наиболее изучены и просты. Многие штаммы микроорганизмов такжеявляются сверхпродуцентами различных биологически активных веществ.
Материал куроку смотри клонирование в клетках различных организмов(главаI).
«Мыпочувствовали себя ничтожными существами, богохульно дерзнувшими затронутьсилы, бывшие до сих пор в неприкосновенности». (Генерал Фарелл, очевидец взрывапервой экспериментальной атомной бомбы 16.07.1945)
УРОК №10Итоговая проверочная работа
Iвариант
1. Определениебиотехнологии
2. Принципработы биофильтра, аэротенка
3. Напишитеуравнения реакций микробиологического окисления пирита, выщелачивания медныхотвалов
4. Определениеиммобилизованного фермента. Методы иммобилизации.
5. Чтотакое генная инженерия?
II вариант
1. Этапыразвития биотехнологии
2. Уравненияпроцессов молочнокислого и спиртового брожения, получения уксуса
3. Определениебиометаногенеза, этапы
4. Принципотбора мутантов с нарушениями регуляторных систем
5. Каквы понимаете понятия: вектор, рестриктазы

3.3Примерный план включения материала элективного курса в темынеспециализированной программы по химии
Занятия элективного курса
Материал «стандартных» уроков Биотехнологические процессы в пищевой промышленности.
Углеводы, процессы брожения;
Получение этилового спирта Биотехнологическая переработка отходов Охрана гидросферы; получение низших УВ(биометаногенез) Бактериальное выщелачивание Получение металлов; экологические аспекты химии – переработка промышленных отходов
Основы получения БАВ.
Производство кормового белка.
Производство аминокислот, витаминов и антибиотиков Химия и жизнь; биологически активные вещества Применение ферментов Белки, ферменты
Основы генной инженерии.
Применение генной инженерии Нуклеиновые кислоты, перспективы изучения
3.4Педагогический эксперимент
Приведённаяпрактическая работа была выполнена на занятиях школы №18 со школьниками 10 «А»и 10 «Б» и со студентами 5 курса биолого-химического факультета КГПУ им. К.Э. Циолковского.
Занятие потеме «Микробиологическое выщелачивание» было также проведено со студентами (БХ-51)за невозможностью использования резервов школы.
Кроме того,был изучен и переработан опыт учителей средней школы №18 г. Калуги впреподавании темы «Биотехнология». Данная тема затрагивается ими в 11 классе вмодуле «Химия в жизни общества» (по программе О.С. Габриеляна).
Вывод
Педагогическийэксперимент выявил некоторые технические и временные недостатки предлагаемойпрактической работы. По нашему мнению целесообразнее её проводить во внеурочноевремя: на факультативных занятиях и кружках.
В ходе беседыбыла выявлена заинтересованность студентов в предложенном материале.Несомненно, данное занятие расширило их кругозор и мотивировало к дальнейшемуобучению.
Учитель химиисредней школы №5 г. Калуги также считает нужным расширение предложенного О.С. Габриеляноммодуля за границы лекарственных препаратов.

Заключение
В процессеработы для достижения цели нами были выполнены следующие задачи:
1. Проанализированаметодическая литература и обоснована актуальность темы.
2. Проанализированалитература, дающая обзор основных вопросов биотехнологии.
3. Подобранматериал к проведению уроков по данной теме и разработаны методическиерекомендации по его использованию.
4. Подобраналабораторная работа, которую следует включить в изучение данной темы.
5. Проведёнпедагогический эксперимент и освоен опыт учителей.
Такимобразом, разработанная нами методика применима для обучения, так как повышаетпознавательный интерес у учащихся, что является важным условием формированиявысокого качества знаний и эффективности их усвоения. Кроме того, предложеныопыты, не требующие применения сложного оборудования.

Списоклитературы
 
1.  Андреева Н.В., Левченко А.Л. Профильноеобучение: вчера, сегодня, завтра // Биология в школе, №5, 2004-с. 21
2.  Баранов В.С. Геннаятерапия – медицина XXI века // Соросовский образовательный журнал, №3, 1999-с. 63
3.  Белозёрский А.Н. Молекулярнаябиология – новая ступень познания природы – М., «Советская Россия», 1970
4.  Биотехнология. Принципы иприменение: Пер. с англ. // Под ред. И. Хиггинса, Д. Беста и Дж. Джонса.– М.: Мир, 1988. – 480 с.
5.  Браун А.Д. Фаддеева М.Д. Молекулярныеосновы жизни – М.: «Просвещение», 1976 – 206 с.
6.  Геном, клонирование,происхождение человека // общ. ред. Корочкина Л.И. – Фрязино, 2004
7.  Егорова Т.А., Клунова С.М.,Живухина Е.А. Основы биотехнологии – М.: «Академия», 2003 – 208 с.
8.  Ингрем В. Биосинтезмакромолекул Пер. с англ. – М.: Мир 1966 –273 с.
9.  Коничев А.С., Севастьянова Г.А. Молекулярнаябиология – М.: «Академия», 2003. – 400 с.
10. Концепциямодернизации российского образования на период до 2010 года
11. ЛенинджерА. Основы биохимии: в 3-х томах Т.3. Пер. с англ.-М.: Мир, 1985. – 320 с.
12. Лутова Л.А.«Генетическая инженерия растений: свершения и надежды» // Соросовскийобразовательный журнал, том 6, №10, 2000 – с. 10
13. Николаев А.А. Основыбиотехнологии часть I Калуга, КГПИ им. Циолковского. 1989. – 43 с.
14. Овчинников Ю.А. Биоорганическаяхимия. – М.: Просвещение, 1987. – 815 с.
15. Программыдля общеобразовательных учреждений: химия 8–11 кл. // сост. Габрусева Н.И.,Суматохин С.В. – М.: Дрофа, 2001 – 288 с.
16. Садовникова Е.А.,Шакир И.В. «Биотехнология – что это такое?» // Химия в школе №2 1994
17. Филиппович Ю.Б. Основыбиохимии Высш. шк., 1985. – 503 с.
18. Франк-Каменецкий М.Д. Самаяглавная молекула – М.: Наука 1988. – 176 с.
19. Чирков Ю.Г.«Время химер. Большие генные игры». – М.: ИКЦ «Академкнига» 2002.
20. http://www.pravda.ru/science/technologies/209660-egg-0
21. http://www.vz.ru/society/2006/10/17/53162.html