Структура и методы анализа ДНК

СТРУКТУРА И МЕТОДЫ АНАЛИЗА ДНК. ВВЕДЕНИЕ Если век Х1Х по-праву вошел в историю мировой цивилизации, как Век Физики, то стремительно завершающемуся веку ХХ,в котором нам посчастливилось жить, по всей вероятности, уготовано место Века Биологии, а может быть и Века Генетики.
Действительно, за неполных 100 лет после вторичного открытия законов Г.Менделя генетика прошла триумфальный путь от натурфилософского понимания законов наследствености и изменчивости, через экспериментальное накопление фактов формальной генетики к молекулярно-биологическому пониманию сущности ге-на, его структуры и функции. От теоретических построений о гене как абстрактной единице наследственности к пониманию его материальной природы как фрагмента молекулы ДНК, кодирующей аминокислотную структуру белка, до клонирования индивидуальных генов, создания подробных генетических карт человека и животных, идентификации генов, мутации которых сопряжены с тя-желыми наследственными недугами, разработки методов биотехнологии и генной инженерии, позволяющих направленно получать организмы с заданными наследстве-нными признаками, а также проводить направленную коррекцию мутантных генов человека, тоесть генотерапию наследственных заболеваний. Молекулярная генетика значительно углубила наши представления о сущности жизни, эволюции живой природы, структурно-функциональных механизмах регуляции индивидуального развития. Благодаря её успехам начато решение глобальных проблем человечества, связанных с охраной его генофонда. Естественно, что возможность манипуляции с индивидуальными генами человека и животных еще недостаточна для понимания функции всего генома, его организации вцелом, взаимодействия его частей в обеспечении всего многообразия механизмов онтогенеза, то есть развития одной клетки до целого организма. Если добавить к этому, что в геноме любого вида записана не только программа индии-видуального развития, но закодирована и вся эволюция вида, то есть его фило-генез, становится понятным насколько логичной и методически своевременной Явилась Международная научная программа "Геном человека". Наряду с аналогичными программами для других видов (лабораторные мыши, нематоды) программа Геном человека, начатая около 10 лет назад, уже к 2 000 году позволит полностью расшифровать первичную структуру ДНК, то есть идентифицировать все гены человека, их регуляторные элементы. Захватыающая Одиссея о наследственности, которой и является эта программа, безмерно расширит наши представления о структуре и функции генома,его эволюции, откроет горизонты столь увлекательного, а, возможно, и не менее опасного направленного воздействия человека на геном растений, животных и, что особенно рискованно, на свой собственный геном. Важно осознать, что это не завтрешний день фундаментальной науки, не отдаленные абстракции, но день сегоднешний. Он уже наступил и стал реальным независимо от нас, и, если не быть к нему готовым концептуально и методически, то пройдет помимо нас. Предлгаемая вашему вниманию книга, действительно,представляет собой введение в молекулярную генетику наследственных болезней и рассчитана на достаточно широкую аудиторию медиков и биологов. Для большинства из уже состоявшихся специалистов в этих областях - это реальная возможность для самообразования, которой, увы, с годами мы так часто пренебрегаем, запутавшись в повседневных заботах. Для студентов биофаков и особенно для студентов-медиков- эта книга вполне может рассматриваться в качестве учебного пособия по молеку-лярным основам медицинской генетики. Однако, и для первых и для вторых, по глубокому убеждению авторов, много лет отдавших внедрению достижений молекулярной биологии в медицинскуюя практику, книга может служить в качестве справочного руководства по молекулярной генетике человека. Действительно, ни одна клиническая дисциплина (за исключением, может быть,службы организации здравоохранения) не мыслима сегодня без знаний и определенных навыков по молекулярной генетике. Ни один биолог, занятый вопросами наследственности, изменчивости, онтогенеза или эволюции независимо от конкретного биологического объекта, не может игнорировать человека, как одного из пока немногих биологических видов с полностью расшифрованной структурой генома. Быстро набирающая силы молекулярная медицина, преподование азов которой все еще явно недостаточно для будущих врачей, на самом деле представляет собой принципиально новый качественный уровень в понимании вопросов этиологии, патогенеза, а, следовательно, и лечения многих болезней, как наследственной моногенной, так и мультифакториальной природы.По нашему мнению, не только современный врач и специалист-биолог, но и каждый образованный человек сегодня должен знать о триумфе Международного Научного Сообщества в выполнении программы Геном человека, в результате которой успешно расшифровываются все гены человека, каждый из которых, будучи выделенным из организма и проклонированным может выступать в качестве лечебного препарата для генотерапии. О том, что уже сегодня идентифицировано на генетических картах более 5 000 структурных генов и свыше 60 000 пока неизвестных смысловых и анонимных ДНК последовательностей. О том, что всего за 5 лет после первых успешных попыток введения чужеродных маркерных генов в клетки человека in vivo, число уже одобренных для клинических испытаний программ по генной терапии наследственных заболеваний достигло более 100! Эти итоги представляются особенно впечетляющими если учесть, что согласно данным Всемирной Организации Здравоохранения около 2,4% всех новорожденных на земном шаре страдает теми или иными наследственными нарушениями; около 40% ранней младенческой смертности и инвалидности с детства обусловлены наследственной патологией. Нельзя не упомянуть о реальных достижениях молекулярной генетики в расшифровке наследственных факторов таких бичей человечества как ишемия сердца, атеросклероз, диабет, онколо- гические и инфекционные заболевания. Адекватно воспринимать происходящую на наших глазах революцию в биологии и в медицине, уметь воспользоваться её заманчивыми плодами и избежать опасных для человечества соблазнов - вот что необходимо сегодня и врачам, и биологам, и представителям других смежных специальностей, и просто образованному человеку. Именно эта цель, эта сверхзадача, поставлена перед данной монографией, восполняющей, по мнению авторов, наметившийся в отечественной научной литературе пробел в области молекулярных аспектов медицинской генетики и генетики человека.Отдельные обзоры, монографии (Шишкин, Калинин, 1993), пере-водная литература по молекулярной биологии и даже обстоятельные сводки, подводящие ежегодные итоги работ по программе "Геном человека" достаточно фрагментарны и касаются лишь отдельных аспектов проблем генодиагностики и генотерапии. Рассчитаны преимущественно на специалистов по молекулярной биологии. Задача данной монографии не только осветить современное положение дел в молекулярной диагностике и лечении наследственных болезней методами генной терапии, но,главным образом, подготовить читателей, прежде всего врачей и биологов, к пониманию и восприятию этой методически и концептуально достаточно сложной обасти генетики.Для достижения поставленной цели нам представлялось ло-гичным начать изложение материала с описания структуры и современных методов анализа ДНК, с общих представлений о её клонировании, секвенировании, геномных библитеках (Глава I).Глава II полностью посвящена структуре генома человека, новой трактовке понятия "ген", генным семействам, вариабильным структурам генома. Генетические карты, принципы их построения, функциональное и позиционное картирование, молекулярные маркеры, современные достижения в разработке физических и хромосомных карт человека и в картировании генов, ответственных за наследственные заболевания рассмотрены в Главе III.Глава IV целиком посвящена описанию молекулярных методов детекции как уже известных мутационных изменений в структурных генах, так и методов сканирования предполагаемых мутаций определенных генов. Описание прямых методов идентификации мутаций дополнены косвенными методами, основанными на молеку-лярном маркировании мутантных генов. Все эти методы, как прямые, так и косвенные, составляют основу молекулярной диагностики моногенных наследственных болезней, широко используются в генетике человека при построении генетических карт,исследовании проблем филогенеза, в популяционной гентике и в геномной дактилоскопии, то есть для идентификации личности.Подробному анализу внутренних (эндогенных) факторов мутагенеза, а также принципам популяционного анализа мутаций посвящена Главе Y. Основные подходы, используемые при изучении экспрессии генов в модельных бесклеточных системах, на уровне отдельных клеток и целых организмов приведены в Главе VI. Принципы молекулярной диагностики наследственных болезней и, в частности, пренатальной диагностики, а также особенности выявления гетерозиготного носительства в семьях выского риска, изложены в Главе VII. Небольшая по размеру,но важная также и для понимания принципов генной терапии Глава VIII касается искусственного создания генетических моделей наследственных заболеваний, в частности на базе трансгенных живоных. Описаны используемые при этом методы направленного переноса чужеродных генов в эукариотические системы. В Главе IX изложены основы генотерапии наследственных заболеваний, рассмотрены методы доставки чужеродной ДНК в клетки человека in vitro и in vivo, преимущества и недостатки существующих векторных систем (физических, хими-ческих и биологических), их конструирование, преспективы создания "идеальных" векторных систем. Кратко рассмотрены итоги уже проведенных испытаний по генотерапии тех заболеваний, для которых Программы клинических испытаний уже одобрены или находятся на стадии эксперимента. В заключительнойглаве (Глава X) мы посчитали целесообразным подвести некоторые итоги и более подробно рассмотреть молекулярную диагностику трех групп наследственных заболеваний:
(1) достаточно полно изученную группу лизосомных болезней накопления; (2) болезни экспансии (преимущественно нейродегенеративные заболевания), вызываемые совершенно новым ранее неизвестным типом так называемых "динамических" мутаций и (3) наиболее частые, социально значимые наследственные заболевания, по пренатальной диагностике которых молекулярными методами уже накоплен достаточно большой опыт в нашей лаборатории и в других медико-генетических центрах России.
Итак, предлагаемая монография рассчитана на достаточно широкий круг читателей, но, прежде всего, на медиков и биологов, а также специалистов смежных профессий. Нам хотелось бы думать, что книга будет особенно полезной для студентов меди-цинских институтов и академий, врачей курсов повышения квалификации, сотрудников медико-генетических консультаций и центров, а также для студетнов-биологов, многие из которых, как показывает наш опыт, пополняют ряды специализированных диагностических лабораторий, медико-генетических центров и институтов. Раздел 1. Общие представления, центральная догма, генетический код. Универсальная генетическая субстанция или "энциклопедия жизни", ДНК, содержит информацию, необходимую для синтеза белков и нуклеиновых кислот, присутствующих во всех типах клеток как про- так и эукариот. Дезоксирибонуклеиновые кислоты (ДНК) - это нитевидные молекулы, состоящие из четырех расположенных в варьирующем порядке нуклеотидов: пуринов -аденина и гуанина, и пиримидинов - цитозина и тимина, соединенных в полинуклеотидную цепь с остовом из чередующихся остатков сахара - дезоксирибозы, и фосфата. Последовательность нуклеотидов ДНК или пар оснований составляет информационную емкость молекулы, определяя порядок синтеза и аминокислотную последовательность белков в соответствии с универсальным для всех живых существ трехбуквенным - триплетным, генетическим кодом . Дезоксирибонуклеиновые кислоты представляют собой единственный тип молекул, способных к самовоспроизводству или репликации, что и обеспечивает преемственность генетической информации в ряду поколений. Записывается последовательность ДНК слева направо (5' - 3') первыми заглавными буквами соответствующих нуклеотидов, являющихся од-новременно единицами измерения молекулы. Размеры ДНК могут меняться в гигантских пределах от нескольких нуклеотидов до миллиардов пар оснований (п.о.). В качестве единиц измерения размеров ДНК используются также килобазы (kb) и мегабазы(mb) - последовательности, соответствующие тысячи и миллиону пар оснований, соответственно.ДНК могут существовать как в виде однонитевых, так и в виде двухнитевых молекул. Двухнитевые или двухцепочечные молекулы образуются за счет химического комплементарного спаривания между аденином и тимином (А - Т) и между гуанином и цитозином (Г - Ц). Эти водородные связи между парами нуклеотидов достаточно непрочные, так что цепи ДНК могут легко диссоциировать - разделяться, и ассоциировать - соединяться,при изменении температуры или солевых концентраций. При каждом цикле ассоциаци - диссоциации или, как еще говорят, отжиге - плавлении, будет точно воспроизводиться двухнитевая структура - дуплекс, устойчивость которого определяется со-ответствием нуклеотидных пар. Наиболее устойчивы структуры,представленные полностью комплементарными нитями ДНК. Процесс образования дуплексов носит название гибридизации. Способность к комплементарному спариванию оснований - одно из самых замечательных свойств ДНК, определяющих возможность ее саморепликации и точного выбора специфических участков активации молекулы в процессе считывания генетической информации. Это свойтво широко используется в молекулярной биологии для поиска и идентификации нужных последовательностей в огромных молекулах ДНК при использовании в качестве зондов ее сравнительно небольших меченых фрагментов.У человека большая часть ДНК- 3.2 миллиарда пар оснований, находится в ядрах клеток в виде 46 плотно упакованных, суперскрученных за счет взаимодействий с ядерными белками структур, называемых хромосомами. Сравнительно небольшая часть ДНК - около 5%, пристствует в митохондриях - органеллах цитоплазмы, обеспечивающих процессы дыхания и энерегетического обмена клеток эукариот. В большинстве соматических клеток ДНК представлена в двух копиях - по одной в каждой хромосоме. Таким образом, в клетках присутствуют 23 пары хромосом, 22 из которых гомологичны друг другу - аутосомы, и одна пара (X и Y) - половые хромосомы. Наличие Y хромосомы определяет мужской пол особи. При записи нормального кариотипа индивидуума указывается общее число хромосом и тип половых хромосом. Таким образом, нормальный кариотип мужчины -46,XY, а женщины -46,XX. В процессе гаметогенеза происходит случайное расхождение гомологичных хромосом в мейозе и в каждой зрелой половой клетке - гамете, остается только 23 хромосомы, то есть гаплоидный набор хромосом. При этом в каждой гамете сохраняется лишь одна половая хромосома - гоносома. В яйцеклетках это X хромосома, тогда как сперматозоиды с равной вероятностью несут как X, так и Y хромосому, то есть пол будущей особи детерминируется геномом сперматозоида. При оплодотворении диплоидный набор хромосом восстанавливается. В соответствии с современными представлениями геном человека состоит из 25 хромосом, 22 из которых аутосомы,2 половые хромосомы и одна митохондриальная . В каждой клетках присутствует порядка 1000 митохондрий, а в каждом митохондрионе содержится около 10 кольцевых митохондриальных хромосом, сходнах с хромосомами бактерий. Таким образом, в клетках присутствует около 1000 копий митохондриальных хромосом. В хромосомах эукариот ДНК находится в двухнитевой форме,что обеспечивает возможность ее точной репликации при каждом цикле деления клетки. Одна нить кодирующая или смысловая,комплементарная ей нить - антисмысловая. Декодирование информации, заключенной в молекуле ДНК, или процесс транскрипции, осуществляется за счет избирательного синтеза молекул РНК, комплементарных определенным участкам ДНК, так называемых первичных РНК транскриптов. Транскрибируемые участки ДНК носят название генов. Рибонуклеиновые кислоты (РНК) по своей структуре очень сходны с молекулами ДНК. Они также состоят из четырех нуклеотидов, только одно из пиримидиновых оснований - тимин, заменено на урацил и в сахарозном остове вместо дезоксирибозы представлена рибоза. Молекулы РНК существуют только в однонитевой форме, но могут образовывать дуплексы с молекулами ДНК. После синтеза молекулы РНК претерпевают достаточно сложную модификацию - процессинг. При этом происходят изменения в концевых участках молекул и вырезаются области, гомологичные интронам - некодирующим частям гена.Этот процесс называется сплайсингом. В результате из первичных РНК транскриптов образуются молекулы информационной или матричной РНК (мРНК), представляющие собой непрерывную последовательность нуклеотидов, гомологичную только экзонам- смысловым участкам гена. Молекулы мРНК в виде рибонуклео-протеиновых гранул выходят из ядра в цитоплазму и соединяются с рибосомами, где происходит процесс трансляции – синтез полипептидной цепи. Трансляция мРНК происходит в точном соответствии с генетическим кодом, согласно которому последовательность из трех нуклеотидов РНК - кодон, соответствует определенной аминокислоте или сигналу терминации синтеза полипептидной цепи . Реализация генетического кода осуществляется с участием 20-ти типов транспортных РНК (тРНК), единственных нуклеиновых кислот, содержащих в своем составе наряду с нуклеотидами одну из аминокислот. тРНК имеют кленовообразную форму, в хвостовой части молекулы расположена определенная аминокислота, в точном соответствии с последовательности из трех нуклеотидов в области, называемой антикодоном. Прохождение мРНК по рибосоме является сигналом приближения к рибонуклеопротеидному комплексу той тРНК, у которой последовательность нуклеотидов в антикодоне комплементарна кодирующему триплету мРНК. Таким образом транспортируется соответствующая аминокислота и осуществляется последовательный синтез полипептидной цепи. Митохондрии имеют свою автономную систему белкового синтеза: рибосомальные РНК, мРНК и транспортные РНК.Генетический код универсален для всех живых существ -это одно из его главных свойств. Небольшие отличия в структуре кода найдены только для митохондриальной ДНК. Так в митохондриальном генетическом коде стоп кодонами являются триплеты АГА и АГЦ, кодирующие аргинин в ядерной ДНК (Табл.1.1). Универсальность генетического кода служит наиболее веским аргументом в пользу гипотезы об едином источнике возникновения жизни на земле и о филогенетическом родстве всех видов живых существ. Кроме того, именно это свойство обеспечивает возможность прочтения в любых модельных клеточных системах искусственно введенной генетической информации,сконструированной из фрагментов ДНК разного видового происхожденеия. Таким образом, вся генная инженерия основана на универсальности генетического кода. Другим свойством генетического кода является его вырожденность, заключающаяся в том, что все аминокислоты кроме двух кодируются несколькими вариантами триплетов. Действительно, из 64 возможных комбинаций нуклеотидных триплетов РНК три соответствуют терминирующим кодонам - ochre, amber и opal, остальные варианты(61) кодируют 20 аминокислот, причем триплеты, кодирующие одну и ту же аминокислоту, как правило, различаются по ретьему нуклеотиду в кодоне. Таким образом, зная нуклеотидную последовательность кодирующего участка ДНК, можно однозначно прогнозировать аминокислотную последовательность соответствующего полипептидного фрагмента, тогда как одна и та е аминокислотная последовательность может кодироваться различным образом. При этом, число возможных вариантов кодирующих ДНК резко возрастает с увеличением длины полипептида.На следующем этапе полипептидные цепи транспортируются специфическим органеллам клетки и модифицируются с образованием зрелого функционально активного белка. В некоторых лучаях информация с молекул РНК может обратно транскрибироваться в молекулы ДНК. В частности, при обратной транскрипции мРНК образуются молекулы комплементарной ДНК - кДНК, в которой в зависимости от полноты процесса представлены частично или полностью все смысловые кодирующие последова-тельности гена. Рассмотренная схема реализации однонаправленного потока информации ДНК-РНК-Белок составляет основу центральной молекулярно-биологической догмы .Более детально с процессами репликации, транскрипции,процессинга и трансляции можно ознакомиться в многочисленных руководствах по молекулярной биологии, цитологии и генетике(Стент, Кэлиндер, 1981; Зенгер, 1987; Льюин, 1987).
2. Выделение ДНК, ее синтез и рестрикция. ДНК может быть изолирована из любого типа тканей и клеток, содержащих ядра. Этапы выделения ДНК включают быстрый лизис клеток, удаление с помощью центрифугирования фрагментов клеточных органелл и мембран, ферментативное разрушение белков и их экстрагирование из раствора с помощью фенола и хлороформа, концентрирование молекул ДНК путем преципитации в этаноле. Из 1 грамма сырой ткани или из 10!9 клеток обычно получают 2 миллиграмма ДНК. У человека ДНК, чаще всего, выделяют из лейкоцитов крови, для чего собирают от 5 до 20 мл венозной крови в стерильную пробирку с раствором, препятствующим коагуляции (например, с глюгециром или гепарином). Затем отделяют лейкоциты и разрушают клеточные и ядерные мембраны добавлением буферных растворов, содержащих денатурирующие агенты. Наилучшие результаты при выделении ДНК дает применение протеиназы-К с последующей фенол - хлороформной экстракцией разрушенных белков. ДНК осаждают в этаноле и растворяют в буферном растворе. Оценку качества экстрагированной ДНК проводят на основании измерения оптической плотности раствора ДНК в области белкового и нуклеинового спектров поглощения. В чистых образцах ДНК соотношение А(260)/A(280) > 1.8. В противном случае процедуру очистки необходимо повторять, так как для успешного использования и хранения ДНK белки должны быть полностью удалены. Более подробно с методами выделения и очистки ДНК из различных тканей можно ознакомиться в работах и руководствах, приведенных в конце книги (Маниатис и др., 1984; Дейвис, 1990; Горбунова и др., 1991).В процессе сложного и многообразного функционирования различные участки хромосом и ДНК претерпевают разнообразные регулируемые и, в основе своей, обратимые изменения. Эти мо-дификации осуществляются с помощью специальных белков - ферментов. Описание ферментативного аппарата репликации, транскрипции, репарации - системы защиты и восстановления поврежденных участков ДНК, рекомбинации, то есть обмена участками гомологичных хромосом и ДНК, далеко выходит за рамки нашего изложения. Мы кратко ознакомимся только с двумя классами ферментов ДНК - полимеразами и рестриктазами, особенно важными для понимания основ современной молекулярной диагностики.Ферменты, осуществляющие синтез ДНК, называются ДНК-полимеразами. И в бактериальных клетках, и в клетках эукариот содержатся три различные формы ДНК-полимераз, все они обладают синтезирующей активностью и способны удлинять цепи ДНК в направлении 5' - 3', последовательно наращивая по одному нуклеотиду к 3'-OH концу, причем точность синтеза определяется специфичностью спаривания оснований. Таким образом, для работы ДНК-полимеразы необходима однонитевая матричная ДНК с двухнитевым участком на 3'- конце молекулы. Кроме того, в среде должны присутствовать четыре типа трифосфатов (dATP,dCTP, dGTP и dTTP) - молекул, состоящих из основания -A,C,G или T, сахара - дезоксирибозы (d) и трех фосфатных остатков (P). В клетках эукариот репликацию осуществляет ДНК-полимераза альфа, а в клетках E. coli - ДНК-полимераза 111.ДНК-полимеразы обладают различными активностями, в том числе и экзонуклеазной в направлении 3' - 5', что позволяет им исправлять - репарировать, дефекты, допущенные при подборе комплементарных оснований. ДНК-полимераза 1 E. coli способна инициировать репликацию в месте разрыва ДНК и замещать гомологичный участок в двойной цепи ДНК. Это свойство используется для введения в ДНК меченых нуклеотидов методом ник-трансляции.
Открытие бактериальных ферментов, обладающих эндонуклеазной активностью - рестрикционных эндонуклеаз или рестриктаз, значительно продвинуло исследование структуры ДНК и возможности генноинженерного манипулирования с молекулами ДНК. In vivo эти ферменты участвуют в системе распознования и защиты "своих" и уничтожении чужеродных ДНК. Рестриктазы узнают специфические последовательности из 4 - 6, реже 8 - 12 нуклеотидов в двухцепочечной молекуле ДНК и разрезают ее на фрагменты в местах локализации этих последовательностей, называемых сайтами рестрикции. Количество образующихся рестрикционных фрагментов ДНК определяется частотой встречаемости сайтов рестрикции, а их размер - характером распределения этих сайтов по длине исходной молекулы ДНК. Чем чаще расположены сайты рестрикции, тем короче фрагменты ДНК после рестрикции. В настоящее время известно более 500 различных типов рестриктаз бактериального происхождения, причем каждый из этих ферметов узнает свою специфическую последовательность. Рестриктазы выделяют путем биохимической очистки из различных видов бактерий и обозначают тремя буквами, соответствующими первым трем буквам латинского названия вида бактерий, и римской цифрой, соответствующей хронологии открытия этого фермента у данного вида бактерий. В зависимости от частоты встречаемости сайтов рестрикции в молекуле ДНК различают три класса рестриктаз часто-, средне- и редкощепящие. Естественно, что рестриктазы, узнающие длинные специфические последовательности (8-12 п.о.), как правило, являются редкощепящими (например Nor1), а узнающие короткие (4-5 п.о.) - частощепящими (Taq1, EcoR1).Сайты рестрикции могут быть использованы в качестве генетических маркеров ДНК. Действительно, образующиеся в результатае рестрикции фрагменты ДНК могут быть упорядочены по длине путем электрофореза в агарозном или полиакриломидном геле, и тем самым может быть определена их молекулярная масса, а, значит, и физическое расстояние между сайтами. Напомним, что обычным методом выявления ДНК в геле, также как и РНК, является ее специфическое окрашивание, чаще всего этидиумом бромидом, и просмотр геля в проходящем ультрофиолете. При этих условиях места локализации ДНК имеют красную окраску. При использовании для рестрикции нескольких эндонуклеаз с последующим электрофоретическим анализом перекрывающихся аддитивных по длине фрагментов ДНК можно добиться полного упорядочивания сайтов узнавания для каждого из ферментов относительно друг друга и каких-то иных маркеров, присутствующих в исследуемой молекуле ДНК. Процесс этот называется физическим картированием и является обязательным элементом анализа плазмидных, вирусных, бактериальных ДНК и относительно небольших фрагментов ДНК эукариот. На рис.1.2. представлен простейший пример такого картирования в том случае,когда в исследуемой молекуле ДНК присутствует по одному сайту рестрикции для двух эндонуклеаз. После обработки исходной ДНК отдельно каждой из рестриктаз образуется два фрагмента, соответствующих по длине расстоянию от концов молекулы ДНК до сайтов рестрикции. При совместной обработке обеими эндонуклеазами на электрофореграмме появляется новый фрагмент,размер которого соответствует расстоянию между сайтами рестрикции. Очевидно, что эти данные еще не позволяют однозначно определить положение сайтов рестрикции по отношению к концам молекулы ДНК. Однако, достаточно знать расположение хотя бы одного маркера для того, чтобы произвести точное физическое картирование исходной молекулы ДНК независимо от количества локализованных в ней сайтов рестрикции.При обработке тотальной геномной эукариотической ДНК, в частности ДНК человека, часто- или среднещепящими эндонуклеазами образуется так много фрагментов различной длины (в среднем, порядка 1 миллиона), что их не удается разделить с помощью электрофореза, то есть не удается визуально идентифицировать отдельные фрагменты ДНК на электрофореграмме. После электрофореза рестрцированной геномной ДНК получается равномерное окрашивание по всей длине геля - так называемый шмер. Идентификация нужных фрагментов ДНК в таком геле возможна только путем гибридизации с мечеными ДНК-зондами. Это достигается при помощи метода блот-гибридизации по Саузерну.
3. Блот-гибридизация по Саузерну, гибридизация in situ. Одним из наиболее эффективных методов идентификации определенных молекул ДНК среди электрофоретически разделенных фрагментов является ставший уже классическим метод блот-гибридизации по Саузерну, по фамилии автора Edцuard So-uthern, предложившего данный метод в 1975г . Суть метода заключается в том, что геномная ДНК подвергается рестрикции одной или несколькими рестриктазами, после чего образую-щиеся фрагменты разделяются по молекулярному весу в агарозном или акриламидном гелях. Затем ДНК подвергается денатурации in situ и переносится с геля на плотный носитель (обычно нитроцеллюлозный фильтр или нейлоновую мембрану). Сам перенос (блоттинг) осуществляется за счет действия капиллярных сил, электрического поля или вакуума. Фиксированную на фильтре ДНК гибридизуют с радиоактивномеченым ДНК или РНК зондом. Методом авторадиографии определяют положение искомого фрагмента геномной ДНК на электрофореграмме. Блот-гибридиза-ция - высоко чувствительный метод идентификации специфических последовательностей ДНК. При достаточно длительной экспозиции (в течение несколько дней) и при высокой удельной радиоактивности ДНК-зонда (более 10!9 расп/ мин/микроГ) этот метод позволяет выявлять менее, чем 0,1 пикоГ ДНК. Так при использовании зонда размерами в несколько сот оснований уникальная последовательность в 1 000 п.о. может быть выявлена в 10 микроГ геномной рестрицированной ДНК в виде отдельной полосы на радиоавтографе после его экспозиции в течение 12 часов. Метод позволяет работать и с очень короткими олигонуклеотидными зондами (20 п.о.), однако требует особенно хорошего мечения и длительной экспозиции фильтра. Необходимость работы с чистыми препаратами ДНК, применение высокомеченых радиоактивных зондов, длительность и трудоемкость всей процедуры делают её весьма дорогостоящей. Тем не менее, в ряде случаев и сегодня метод не потерял своего значения в том числе и для диагностики генных болезней. В последнее время для этих целей нередко используют различные варианты нерадиоактивного мечения или окраску ДНК азотно-кислым серебром. Гибридизация с меченым ДНК-зондом препаратов ДНК или РНК, нанесенных капельно на твердый матрикс без предварительной рестрикции и электрофореза носит название дот- или слот-гибридизации в зависимости от конфигурации пятна ДНК на фильтре, округлой или продолговатой, соответственно. На рис.1.3 также изображены последовательные этапы этих методов. Попутно отметим, что метод гибридизации ДНК-зондов с электрофоретически разделенными молекулами РНК носит название Нозерн блот, тогда как Вестерн блот или иммуноблот – это связывание электрофоретически разделенных белков, фиксированных на фильтрах, с мечеными антителами. Название этих методов - дань уважения молекулярных генетиков профессору Саузерну, внесшему неоценимый вклад в разработку эксперимен-тальных подходов, используемых для анализа ДНК.В ряде случаев для проведения гибридизации с ДНК зондами не требуется предварительного выделения и очистки ДНК.Процедуру гибридизации можно проводить не только на геле, на фильтрах или в растворе, но и на гистологических или хромосомных препаратах. Этот метод носит название гибридизации in situ. Вариант метода, при котором в качестве зондов используются препараты ДНК или РНК, меченые флюорохромами, называется FISH (flurescein in situ hybridization). Меченый ДНК-зонд наносят на препараты дифференциально окрашенных и подготовленных для гибридизации (денатурированных) метафазных хромосом. Предварительная обработка хромосом направлена на облегчение доступа зонда к геномной ДНК. Важное значение имеет также подбор условий, максимально способствующих процедуре гибридизации. После отмывки несвязавшихся молекул ДНК и нанесения светочувствительной эмульсии (при использовании радиоактивной метки), либо проведения соответствующей обработки (при использовании биотин- или флюоресцеин-меченых ДНК зондов) места локализации последовательностей ДНК, комплементарных использованному ДНК-зонду, можно непосредственно наблюдать в микроскоп в виде характерных точек над соответствующими участками определенных хромосом . Гибридизация in situ, является одним из наиболее эффективных методов картирования комплементарных ДНК-зонду последовательностей ДНК на хромосомах. Эта методика особенно эффективна при исследовании распределения по геному повторяющихся последовательностей ДНК, клонированных последовательностей ДНК анонимного происхождения, при определении не только хромосомной принадлежности, но и внутри-хромосомной локализациии уникальных генов в тех случаях, когда имеются соответствующие ДНК-зонды. При этом разрешающая способность метода может достигать нескольких хромосомных бэндов. Согласно последним данным, в экспериментах на специально приготовленных и растянутых интерфазных хромосомах человека разрешающая способность метода FISH может достигать 50 kb, что составляет всего около 1/20 величины среднего хромосомного бэнда. Проблемы взаиморасположения клонированных фрагментов ДНК даже в пределах одного хромосомного локуса также с успехом решаются методом FISH.Гибридизация in situ между молекулами РНК и кДНК-овыми зондами, проводимая на гистологических препаратах, является одним из наиболее эффективных методов анализа тканеспецифического распределения и внутриклеточной локализации мРНК(Манк, 1990). Подробно с этим и другими современными методом молекулярного и цитогенетического анализа, а также с их многочисленными модификациями и вариантами можно ознакомиться в серии работ, руководств и обзоров (Маниатис и др.,1984; Дейвис, 1990; Sambrook et al., 1989).
4. ДНК-зонды, клонирование, векторные системы. ДНК-зондом может служить любая однонитевая ДНК ограниченного размера, используемая для поиска комплементарных последовательностей в молекуле большего размера или среди пула разнообразных молекул ДНК. В ряде случаев в качестве зондов используют искусственным образом синтезированные оли-гонуклеотидные последовательности ДНК, размер которых обычно не превышает 30 нуклеотидов. Зондом также могут служить выделенные из генома последовательности ДНК. Однако значительно чаще такие последовательности предварительно клонируют,чтобы иметь возможность получать их в любое время и в неограниченном количестве. Клонирование предполагает встраивание (инсерцию) чужеродной экзогенной ДНК в векторную молекулу ДНК, обеспечивающую проникновение этой конструкции в бактериальные клетки хозяина . Химерные молекулы ДНК, составленные из фрагментов разного происхождения, носят название рекомбинантных ДНК. В качестве клонирующих векторов используют модифицированные плазмиды, фаги, космиды, ретрои аденовирусы, а также некоторые другие генетические конс-трукции. Размеры клонированных ДНК-зондов составляют от сотен до нескольких тысяч нуклеотидов, что определяется, главным образом, способностью вектора удерживать чужеродный фрагмент ДНК. Особенно широко применяют в качестве векторов плазмидную ДНК. Плазмиды - это небольшие кольцевые двухцепочечные молекулы ДНК, которые могут присутствовать в различном числе копий в бактериальных клетках. Открытие плазмид связано с изучением генетической природы антибиотикоустойчивости. Ока-залось, что именно плазмиды могут нести гены, сообщающие клеткам устойчивость к различным антибиотикам, и потеря чувствительности инфекционных бактерий к их действию как раз и происходит за счет отбора тех штаммов, в которых имеются плазмиды с соответствующей генетической информацией. Заметим, что присутствие плазмиды в бактериальной клетке вовсе не обязательно для обеспечения ее жизнедеятельности, так как при отсутствии антибиотиков в среде обитания бактерий штаммы, не содержащие плазмид, вполне жизнеспособны. Плазмиды имеют автономную систему контроля репликации, обеспечивающую поддержание их количества в клетке на определенном уровне -от одного до нескольких сотен плазмидных геномов на клетку.Обычно для клонирования выбирают плазмиды с ослабленным контролем репликации, что позволяет им накапливаться в клетке в большом числе копий. Конструирование плазмидных клонирующих векторов заключается во внесении изменений в систему контроля репликации и в добавлении или вырезании генов антибиотикоустойчивости или удобных для клонирования иных генетических элементов: специфических сайтов рестрикции, инициации и регуляции транскрипции и т.п. Чаще всего для клониро-вания используют плазмиды pBR322, ColE1 или их производные.Кольцевую молекулу плазмидной ДНК можно легко перевести в линейную форму путем единичного разрыва в месте локализации уникального сайта рестрикции. Присоединение (встраивание, инсерция) фрагмента чужеродной ДНК к концам линейной молекулы осуществляется с помощью специфических ферментов-лигаз, после чего гибридная плазмида вновь принимает кольцевую форму. Разработаны достаточно простые и эффективные методы трансформации бактерий, то есть искусственного введения плазмид в бактериальные клетки. При этом, присутствующие в плазмидах гены антибиотикоустойчивости используют в качестве маркеров трансформированных бактерий для их отбора на соответствующих селективных средах. При размножении трансформированных бактерий происходит увеличение числа копий инсертированного фрагмента ДНК. Таким образом, этот чужеродный для бактерий генетический материал может быть получен, практически, в любых количествах. Выделенная из бактерий плазмидная ДНК или изолированный из плазмиды инсертиро-ванный фрагмент могут быть в дальнейшем использованы в качестве ДНК-зондов.Для некоторых целей в качестве клонирующих векторов оказалось удобнее использовать фаги - бактериальные вирусы.Фаговая ДНК существует только в линейной форме, поэтому при ее рестрикции образуются два фрагмента, которые сшивают с чужеродной ДНК с образованием химерного фага. Чисто технически эта операция проще, чем инсерция в плазмиду. Однако,размеры встраимовой ДНК ограничены пакующей способностью головки фага. Поэтому при конструировании вектора вырезают последовательности фаговой ДНК, не имеющие критического зна- чения для жизнеобеспечения фага. Такой бактериофаг может существовать только в том случае, если в него встроена чужеродная ДНК, по размерам сопоставимая с вырезанной фаговой ДНК. Наиболее удачные конструкции векторов были получены на основе фага лямбда - лямбда gt10, лямбда gt11, лямбда Zap.Многие проблемы молекулярной генетики успешно решаются с использованием экспрессионных векторов, содержащих в своем составе регуляторные последовательности, обеспечивающие син-тез чужеродных белков в клетках хозяина. Так в случае лямбда gt11 фаги могут быть выращены в, так называемых, репликативных условиях, обеспечивающих экспрессию инсертированной ДНК. Так как обычно ДНК встраивают в район локализации маркерного гена, позволяющего вести селекцию химерных фагов, то экспрессироваться будет слитый белок, в котором часть полипептидной цепи будет соответствовать маркерному белку, а часть цепи будет транслироваться в соответствии с информацией, заключенной во встроенном фрагменте ДНК. Этот белок может быть идентифицирован путем детекции фрагмента маркерного белка либо с помощью антител к специфическим участкам, кодируемым чужеродной ДНК.В последнее время большое распространение получило клонирование в космидах - конструкциях, обьединяющих в себе преимущества плазмид и фагов. Космиды получены на основе плазмид, но в них введены генетические элементы фага лямбда,отвечающие за упаковку ДНК в фаговой частице. Такие векторы могут существовать не только в виде плазмид, но и в виде фаговых частиц in vitro. Космиды обладают большей клонирующей способностью по сравнению с плазмидными и фаговыми векторами и могут нести до 40-45 тысяч пар оснований инсертированной ДНК. Все вышеперечисленные векторы используются для клонирования в прокариотических системах.Векторы, пригодные для направленного переноса в эука- риотические клетки, конструируют на основе прокариотических или дрожжевых плазмид - единственных плазмид, найденных в клетках эукариот, а также используют различные эукариотические вирусы, чаще всего ретровирусы, аденовирусы или аденоассоциированные вирусы. При использовании плазмид в ка-честве клонирующих векторов в них вводят вирусные последовательности, ответственные за начало репликации. Введение векторов в эукариотические клетки часто осуществляют путем котрансформации, то-есть одновременно вводят плазмиду и сегмент чужеродной ДНК. Векторные последовательности, введенные в клетки эукариот, могут сохраняться там в течение нескольких дней в виде суперскрученных кольцевых молекул эписом. В редких случаях возможна интеграция экзогенной ДНК в хромосомную ДНК. В этих случаях введенные последовательности устойчиво сохраняются в геноме клеток хозяина и наследуются по менделевскому типу (см. Глава VIII).Для клонирования субхромосомальных фрагментов ДНК, со-держащих целые гены, разработана система дрожжевых минихромосом. Искусственные дрожжевые хромосомы (YAC - artificial yeast chromosomes) конструирют на основе плазмидных векторов, содержащих в своем составе известные центромерные и теломерные последовательности хромосом дрожжей, необходимые для поддержания и репликации векторов в клетках хозяина. Такие системы способны удерживать фрагменты чужеродной ДНК размером в несколько сотен тысяч и даже миллионов пар оснований.
Остановимся коротко на методах введения векторов в клетки хозяина. Но прежде всего, определим основные термины. Как уже упоминалось, введение плазмидной ДНК в бактериальные клетки назвается трансформацией. Если перенос генов осуществляется с помощью фага, то говорят о трансдукциии. Процесс введения экзогенной ДНК в эукариотические клетки называется трансфекцией. Все эти методы основаны на подборе условий,облегчающих прохождение плазмидной или фаговой ДНК через клеточные и ядерные мембраны. Для повышения проницаемости мембран используют два разных подхода. В первом случае проводят обработку векторной ДНК и клеток хозяина буферными растворами, повышающими проницаемость клеточных и ядерных мембран (метод кальций-фосфатной преципитации,DEAE-декстран-опосредованная трансфекция). Во втором случае используют краткосрочное физическое воздействие на клетки для создания в мембранах микропор, проходимых для макромолекул ДНК (метод электропорации - воздействие высоковольтным электрическим полем, "бомбардировка" частицами золота и т.п.). Более подробно проблемы векторов и методы генетической трансфрмации (трансдукции) рассмотрены в Главе IX. Вопросам молекулярного клонирования также посвящена обширная литература (Гловер, 1988; 1989; Шишкин, Калинин, 1992; Маниатис и др., 1984; Дейвис, 1990; Sambrook et al., 1989).
5. Геномные и к-ДНК-овые библиотеки генов, их скрининг. Рассмотрим более подробно методы выделения и идентификации фрагментов ДНК, необходимых для анализа или для использования в качестве ДНК-зондов. Основным источником этих фрагментов являются искусственным образом сконструированные библиотеки генов, в которых осуществляют поиск или скрининг нужных последовательностей ДНК разными методами в зависимости от специфических особенностей этих последовательностей. Библиотека генов это полный набор клонированных перекрывающихся фрагментов ДНК, полученных в результате рестрикции или механического разрезания тотальной ДНК, выделенной из какого-либо специфического источника. В зависимости от происхождения ДНК различают геномные и кДНК-овые библиотеки генов. Для конструирования геномных библиотек используют ДНК, выделенную из тканей, культур клеток, из отдельных хромосом или из их фрагментов. При создании кДНК-овых библиотек выделяют тотальную мРНК из тканей или культивируемых клеток, в которых заведомо экспрессируются инте-ресующие исследователя гены. На следующем этапе методом обратной транскрипции (РНК-ДНК) синтезируют кДНК. Затем её разрезают и упаковывают в выбранный для клонирования вектор.Схема конструирования геномных и кДНК-овых библиотек предс-тавлена на рис.1.6. Как видно на схеме в геномных библиотеках присутствуют не только кодирующие последовательности генов, но также несмысловые внутригенные последовательности -интроны и межгенные участки ДНК, причем удельный вес некоди-рующих фрагментов ДНК значительно выше. кДНК-овые библиотеки состоят только из кодирующих - экзонных, областей генов. Наиболее удобный размер инсертируемой ДНК сопоставим со средним размером гена млекопитающих и составляет 15 - 25 тысяч пар оснований (kb). Оптимальный по размеру набор перекрывающихся последовательностей геномной ДНК человека получается после ее переваривания частощепящими рестриктазами Sau3a или Mbo1. Информационная емкость каждой библиотеки, то есть количество клонов с различными инсертированными фрагментами ДНК, определяется размерами исходного генома и необходимостью присутствия каждой его последовательности хотя бы в одном клоне. Поэтому достаточно представительные геномные библиотеки млекопитающих обычно содержат не менее 8*10!5 - 10!6 различных клонов.Чаще библиотеки конструируют на основе фаговых или космидных клонирующих векторов, так как в таком виде легче хранить большие количества химерных ДНК. Для создания библиотек генов человека особенно удобны векторы, полученные на основе фага лямбда, такие как EMBL3 или EMBL4. Пакующая способность этих векторов от 9 до 23 кб, они содержат много удобных клонирующих сайтов, так что для инсерции ДНК могут быть использованы разные рестриктазы. Кроме того, эти векторы не содержат последовательностей плазмид, наиболее часто используемых для клонирования : pBR322 и ColE1. Это позволяет проводить отбор нужных клонов с помощью фаговой ДНК, не вырезая предварительно инсертированный в нее фрагмент. Для создания библиотек клонов, содержащих большие районы ДНК,используется технология искусственных дрожжевых хромосом-YAC. Последние представляют собой крупные (до 1 млн п.о.)фрагмены геномной ДНК человека, сшитые с центромерными районами хромосом дрожжей. После идентификации в таких библиотеках нужных клонов с инсертированными фрагментами чужеродных ДНК последние могут быть субклонированы в фаговых или космидных библиотеках. Скрининг библиотек проводят путем гибридизации на фильтрах с олигонуклеотидными, кДНК-овыми или любыми иными ДНК-зондами, а также с помощью антител, если библиотека сконструирована на основе экспрессионного вектор.Для этого химерные фаги, составляющие библиотеку, высевают на плотно растущий в чашках Петри газон бактерий таким образом, чтобы образовались отдельные литические бляшки в результате инфецирования клеток одним рекомбинантным фагом.Все культуры дублируют путем отпечатка - реплики, на другие чашки Петри. Затем на исходные культуры накладывают фильтры и переносят на них растущие и лизированные колонии, проводят их разрушение, фиксацию белков и ДНК на фильтре и блот гибридизацию с меченым ДНК-зондом или иммуноблот с мечеными антителами (для экспрессионных библиотек). После отмывки фильтров от несвязавшихся меченых зондов и радиоавтографии на рентгеновской пленке проявятся темные пятна в местах локали-зации колоний, содержащих в инсертированном фрагменте ДНК последовательности, комплементарные зонду, или специфические антигены. Отбор положительных колоний фагов на дублированных культурах производят именно в тех местах, где произошло потемнение пленки. Чтобы избежать возможного загрязнения,отобранные колонии размножают и вновь подвергают скринированию. Обычно, инсертированную ДНК изолируют из бактериофага и субклонируют в плазмидном векторе, позволяющем наращивать большие количества этой ДНК. 6. Секвенирование последовательностей ДНК. Следующими этапами анализа отобранного и клонированного ДНК фрагмента являются его физическое картирование и определение нуклеотидной последовательности, то есть секвенирование. Методология секвенирования достаточна проста и заключается в том, чтобы получить серию комплементарных молекул ДНК, различающихся по длине на одно основание. На практике,однако, определение нуклеотидной последовательности протяженных молекул ДНК представляет собой весьма трудоемкую задачу. Существует два основных метода секвенирования: химическое - метод Максама-Гильберта и дидезоксисеквенирование -метод Сэнджера. В первом случае используют химическое расщепление ДНК по одному основанию, во втором – синтезируют нужную цепь ДНК in vitro, специфически останавливая синтез на заданном основании.Чаще при секвенировании используют метод Сэнджера, так как он более надежный и простой в исполнении. На первом этапе ДНК денатурируют, чтобы получить однонитевые молекулы. Затем добавляют секвенирующий праймер - искусственно синтезированную олигонуклеотидную последовательность, комплементарную определенному участку исходной молекулы ДНК. Создают условия для гибридизации праймера, то есть для образования двухцепочечного участка, и инициируют синтез ДНК, добавляя в реакционную смесь ДНК-полимеразу и трифосфаты - dATP, dCTP, dGTP и dTTP,один из которых является радиоактивным. Синтез ведут в четырех параллельных пробирках, в каждую из которых добавляют один из специфических дидезоксинуклеотидов или терминаторов- ddATP, ddCTP, ddGTP или ddTTP. При встраивании ddNTP на место соответствующего нуклеотида синтез ДНК прекращается.Таким образом, в каждой из пробирок получают набор различающихся по длине радиоактивномеченых фрагментов ДНК с одним и тем же специфическим для данной пробирки дидезокситерминатором на конце молекулы. После одновременного электрофоретического разделения этих фрагментов на четырех соседних дорожках и радиоавтографии, размер синтезированных фрагментов может быть определен, а значит и определена локализация дидезоксинуклеотидов и порядок соответствующих им нуклеотидов в исходной молекуле ДНК . На каждом секвенирующем геле может быть определена первичная последовательность всего около 500 пар оснований. В своем первоначальном варианте этот метод является достаточно трудоемким и дорогостоящим.Достаточно заметить, что цена одного звена (шага) в цепи ДНК в Международной Программе "Геном человека" еще несколько лет назад оценивалась в 1$.В качестве модификаций метода Сэнджера используют предварительное клонирование ДНК в векторах, сконструированных на основе фага M13, для получения протяженных однонитевых участков ДНК, которые могут быть непосредственно секвенированы без денатурации и праймирования. Очень эффективной оказалась система векторов mp8 и mp9, позволяющих вести сиквенс одовременно в обоих направлениях и прочитывать участки большей протяженности. Интенсивно разрабатывается методология автоматического ДНК секвенирования. Особенно перспективным для массового секвенирования в автоматическом режиме оказалось применение меченых различными флюорохромами дидеоксинуклеотидов. В этом варианте каждому из нуклеотидов соответствует свой цвет полосы в геле, который легко учитывается автоматически. Этот метод нашел особенно широкое применение в реализации программы Геном человека. По последним данным,разработка автоматических секвенаторов позволила снизить стоимость одного звена до 0,5$ и резко повысить эффективность этого процесса. Так, на 30 автоматических секвенаторах фирмы Applied Biosystems за одну неделю работы в 1994г.можно было просеквенировать до 1 млн пар оснований.В последние годы активно разрабатываются принципиально новые, более эффективные и экономичные методы секвенирования. Особенно перспективным на сегоднешний день представляется метод секвенирования путем гибридизации исследуемой последовательности ДНК с набором олигонуклеотидов, так называемой олигонуклеотидной матрицей (Мирзабеков, 1990; Барский и др.,1994; Southern, et al, 1992). Наиболее удобными для этой цели являются наборы матриц - чипы, в ячейках которых пришиты (иммобилизованы) октануклеотиды. Суть данного подхода в том, что пришивается набор всех возможных вариантов перестановок из 4-х стандартных нуклеотидов (А,Г,Ц,Т) определенной длины, при этом в случае октануклеотидов количество возможных вариантов нуклеотидов составляет 65536. Секвенируемый фрагмент ДНК метят радиоактивным фосфором и гибридизуют с октануклеотидной матрицей. Фрагмент ДНК гибридизуется только с теми октануклеотидами, последовательности которых комплементарны его участкам. Таким образом, определяется набор всех возможных октануклеотидов, присутствующих в исследуемом фрагменте ДНК. После этого, при помощи специальной компьютерной обработки упорядочивается расположение этих октамеров в изучаемом фрагменте ДНК. Этот перспективный метод позволяет значительно ускорить время секвенирования за счет автоматизации процесса.
7. Полимеразная цепная реакция. До недавнего времени гибридизация с ДНК-зондами и клонирование являлись единственными способами поиска и выделения специфических геномных или к-ДНК-овых последовательностей ДНК с целью их дальнейшего исследования. Не говоря уже о большой трудоемкости этих методов, они имеют ряд принципиальных недостатков и ограничений. Во-первых, исследуемые фрагменты значительно превосходят по длине ДНК-зонды и слишком велики для прямого молекулярного анализа. Концы этих последовательностей не могут быть выбраны произвольно, так как определяются наличием соответствующих рестрикционных сайтов в исследуеммой молекуле ДНК. Во-вторых, для проведения успешной рестрикции и гибридизации необходимо большое количество хорошо очищенной высокомолекулярной геномной ДНК (не менее 10 микроГ на одну реакцию). Такое количество ДНК обычно получают из 3- 5 мл крови. Часто это количество оказывается слишком большим, если учесть, что речь идет о детях и о тяжело больных людях. Кроме того, необходимость немедленного использования собранной крови для выделения ДНК или хранения ее до использования при -20 С затрудняет исследование нетранспортабильных пациентов или родственников, проживающих на отдаленном расстоянии от исследовательских центров. В-третьих, для геномной гибридизации, как правило, необходимы радиоактивные ДНК-зонды с высокой удельной активностью, не менее 10!8-10!9 имп./мин/мкГ., причем они должны быть использованы в течение очень короткого периода после их приготовления. Кроме того, работа с радиоактивным материалом требует соблюдения необходимой техники безопасности и наличия специально оборудованного изотопного блока, что возможно лишь для некоторых диагностических центров. В-четвертых, необходимость длительной экспозиции автографов значительно удлиняет время получения результатов, что также ограничивает использование методов блот-гибридизации для пренатальной диагностики плода, специфика которой во многом определяется сроком беременности.
Предложенный в 1983г. американским исследователем Карри Муллисом, удостоенным за это изобретение Нобелевской премии в 1993г., альтернативный метод анализа геномной ДНК -метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), явился эпохальным открытием молекулярной биологии нашего века. Метод ПЦР или специфической амплификации ДНК позволяет избирательно синтезировать in vitro относительно небольшие участки ДНК, длиной от нескольких десятков до нескольких сотен пар нуклеотидов,реже до 1000 - 2000 п.о., используя в качестве матрицы любые образцы ДНК, содержащие амплифицируемую последовательность.Необходимым условием для проведения ПЦР является знание нуклеотидной последовательности амплифицируемой области ДНК,так как специфический выбор этого участка осуществляют путем гибридизации матричной ДНК с двумя искусственно синтезиро-ванными праймерами - олигонуклеотдными последовательностями ДНК, длиной, обычно, от 15 до 30 п.о., комплементарными 3'-концам амплифицируемого участка на смысловой и антисмысловой нитях ДНК, соответственно. Таким образом, расстояние между праймерами определяяет длину синтезируемых молекул. В качестве матрицы для синтеза может быть использован любой тип ДНК - геномная ДНК отдельных индивидуумов различных видов про- и эукариот; ДНК, выделенная из культур клеток, бактериальных клонов, библиотек генов или из других источников. Для проведения специфической амплификации не требуется больших количеств матричной ДНК и, в принципе, достаточно даже одной молекулы ( Li et al., 1988). Успех в разработке метода ПЦР в значительной мере связан с использованием в качестве фермента, обеспечивающего синтез ДНК, термофильной ДНК полимеразы,выделенной из бактерий, живущих в горячих источниках, и потому устойчивой к действию высоких температур (Kogan et al.,1987). Принципиальная схема полимеразной цепной реакции показана на Рис.1.10. На первом этапе исследуемая двухнитевая матричная ДНК переводится в однонитевую форму путем ее нагревания в течение нескольких минут до температуры, превышающей +95 - +98 С. Дальнейшая схема проведения ПЦР достаточно проста и заключается в чередовании циклов (1) гибридизации или отжига ДНК с праймерами, (2) синтеза последовательности,комплементарной матричной ДНК, и (3) денатурации образовав-шихся двухнитевых структур. При гибридизации, достигаемой за счет понижения температуры реакционной смеси до +30 - + 50 С, происходит образование двухнитевого участка ДНК в строго специфичных областях, комплементарных праймерам. При температуре, оптимальной для работы ДНК-полимеразы - +60 - +70 С, начинается синтез ДНК в направлении 5' - 3' с двухнитевого участка, образованного праймерами. Затем при нагревании раствора примерно до +80 - +90 С синтез прекращается и двухнитевой участок между матричными и вновь синтезированными молекулами ДНК расплавляется (денатурирует). В первом цикле олигопраймеры гибридизуются с исходной матричной ДНК, а затем в последующих циклах и с вновь синтезированными молекулами ДНК по мере их накопления в растворе. В последнем случае синтез ДНК заканчивается не при изменении температурного режима, а по достижении ДНК-полимеразой границы амплифициро- ванного участка, что и определяет, в кончном счете, размер вновь синтезированного участка ДНК с точностью до одного нуклеотида. Таким образом, при каждом цикле происходит двухкратное увеличение числа синтезированных копий выбранного для амплификации участка ДНК и содержание продуктов амплификации в растворе нарастает в геометрической прогрессии. Каждая из процедур цикла определяется двумя параметрами – температурой реакции и ее длительностью, меняющейся в диапозоне от десятков секунд до 1 - 3 минут, так что полный цикл длится от одной до несколько минут. За 25 - 30 циклов число синтезированных копий ДНК достигает нескольких миллионов. ПЦР обычно проводят в автоматическом режиме, используя для этого специальные приборы - термоциклеры или амплификаторы ДНК.Такой прибор позволяет задавать нужное количество циклов и выбирать оптимальные временные и температурные параметры для каждой процедуры цикла из большой и часто непрерывной шкалы возможных вариантов. В техническом исполнении ПЦР очень проста. Все компоненты реакции - матричную ДНК, олигопраймеры, смесь трифосфатов и термофильную ДНК полимеразу добавляют в специфический буфер (часто одномоментно), наслаивают небольшой обьем вазелинового масла для предотвращения раствора от высыхания, затем помещают пробирку с реакционной смесью в автоматический термоциклер и выбирают необходимую программу циклической смены температуры и длительности каждого шага реакции. Общий обьем реакционной смеси, обычно,составляет от 10 до 50 - 100 микролитров. Выбор оптимального режима работы определяется длиной и специфичностью амплифицируемого участка. Следует подчеркнуть, что, реально, для каждой полимеразной реакции в звисимости от типа праймеров,длины амплифицированного фрагмента, особенностей его первичной нуклеотидной структуры, а также от типа используемой термофильной ДНК-полимеразы оптимальные режимы температуры и состав амплификационной смеси могут существенно варьировать и зачастую подбираются эмпирически.С помощью ПЦР можно непосредственно исследовать места локализации предполагаемых мутаций или полиморфных сайтов, а также изучать наличие любых других специфических особенностей ДНК. Подбор системы олигопраймеров производят на основании анализа нуклеотидной последовательности амплифицируемого участка. Разработаны различные варианты автоматического поиска последовательностей ДНК, использование которых в качестве праймеров оптимизирует процедуру амплификации специфического участка геномной ДНК. Для того, чтобы гибридизация проходила строго специфично, праймеры не должны содержать повторяющихся последовательностей ДНК. Мы уже отмечали, что для проведения ПЦР достаточно минимального количества ДНК, вплоть до одной молекулы. Кроме того, различные органические компоненты клеток, такие как белки, липиды, углеводы, фрагменты клеточных органелл или мембран заметно не препятствуют процессу амплификации. Поэтому в качестве источника матричной ДНК может быть использован любой, даже деструктурированный биологический материал, сохранивший в своем составе достаточно полный набор фрагментов исходных молекул ДНК. Для специфической амплификации наряду с очищенной ДНК используют высушенные на фильтровальной бумаге пятна крови, небольшие кусочки тканей, например, такие как ворсины хориона, смывы из полости рта, луковицы корней волос, культуры клеток и сливы среды с клеточных культур, содержащие не прикрепившиеся и не давшие роста клетки, соскребы с цитогенетических препаратов и, что особенно удивительно, полученные при паталогоанатомическом анализе и длительно хранившиеся фиксированные ткани (Higuchi, R. et al., 1988). Более подробные сведения о постановке ПЦР можно получить в ряде специальных руководств и инструкций.Существуют различные модификации ПЦР, которые используются в зависимости от конкретных целей проведения реакции или от характера последующего молекулярного анализа амплификатов. Так, для трудноамплифицируемых участков ДНК (содержащих различные повторяющиеся последовательности или необычные структурные элементы), а также в тех случаях, когда матричная ДНК присутствует в следовых количествах, ПЦР проводят в два раунда, используя в качестве матричной ДНК на втором этапе амплификации, или как еще говарят при доамплификации,продукты ПЦР, синтезированные в первом раунде. Часто в этих случаях для повышения специфичности праймирования используют систему, так называемых вмонтированных (nested) праймеров,то есть при доамплификации в качестве праймеров выбирают последовательности, локализованные внутри амплифицируемого в первом раунде участка ДНК.В ряде случаев удобно проводить мультиплексную ПЦР,то есть одновременную амплификацию нескольких участков мат-ричной ДНК. Можно получать меченые продукты ПЦР, добавляя в реакционную смесь меченые трифосфаты. Особого внимания заслуживает возможность проведения ПЦР с молекулами кДНК. На основе этой реакции разработаны методы анализа экспрессии генов и получения больших количеств кДНК. Уместно заметить,что реакцию амплификации можно проводить не только в растворах, но и непосредственно на хромосомных препаратах, при этом в случае использования меченых нуклеотидов продукты амплификации будут гибридизоваться и выявлять комплементарные им участки ДНК на хромосомах (метод PRINS – polymerase reaction in situ). До настоящего времени доступными амплификации были участки ДНК, не превышающие по длине 5 kb. В последнее время, благодаря внесению ряда кардинальных усовершенствований (особый подбор праймеров, использование сразу двух различных ДНК полимераз, трицинового буфера, специального температурного режима полимеразных циклов), возможно проведение амплификации фрагментов ДНК, достигающих 35 kb. В частности, таким образом удалось амплифицировать плазмиду со вставкой 8.5 kb, равной целому геному вируса HIV 1 (Cheng et al., 1994). И это еще не предел. В дальнейшем мы неоднократно будем возвращаться к описанию различных модификаций ПЦР,так как этот метод по праву стал один из основных в молекулярной диагностике наследственных болезней ( Erlich, 1993;Rolfs et al., 1993; RT-PCR, Methods and Applications, 1991).Возможность очень точного и специфичного выбора участка ДНК для амплификации, небольшие размеры синтезируемых молекул, их огромное количество черезвычайно облегчают молеку-лярный анализ продуктов ПЦР. Как правило, амплифицированную ДНК можно непосредственно наблюдать в проходящем ултрофиолете в виде красной полосы после электрофоретического концентрирования и обычного окрашивания геля этидиумом бромидом.Кроме того, возможна идентификация этих молекул путем блот гибридизации со специфическими олигонуклеотидными зондами.При наличии сайтов рестрикции в амплифицированных участках ДНК после их обработки эндонуклеазами и электрофореза количество и положение окрашенных полос на геле изменяется в соответствии с положением этих сайтов. Путем электрофореза могут быть выявлены небольшие отклонения в размерах синтезированных молекул, которые возникают за счет делеций или инсерций нескольких нуклеотидов в исходной матричной молекуле ДНК; конформационные изменения в однонитевых молекулах ДНК, возникающие при замене оснований; а также структурные изменения в дуплексах между нормальными и мутантными вариантами амплифицированных фрагментов ДНК. И, наконец, возможно определение полной нуклеотидной последовательности синтезированных молекул с идентификацией всех мутаций в исследуемом районе матричной ДНК.Разработаны варианты ПЦР, при которых синтезируются преимущественно однонитевые фрагменты ДНК, что в последуюшем зна-чительно облегчает их секвенирование. В дальнейшем мы более подробно рассмотрим методы генотипирования мутаций с помощью ПЦР, позволяющие производить полный молекулярный анализ определенных участков ДНК у отдельных индивидуумов. При этом отпадает необходимость визуализации малых количеств ДНК путем их гибридизации с мечеными геномными или кДНК-зондами.Это не означает, конечно, что методы блот гибридизации и клонирования потеряли свою актуальность. Без их использования невозможна молекулярная идентификация генов, предшествующая разработке методов молекулярной диагностики с использованием ПЦР.