Рефератна тему:
Авторадиография.
Введениерадиоактивнойметки в биологическиепрепараты
Авторадиография
Основноеназначениеавторадиографии- регистрацияполос радиоактивномеченых препаратов(белков и НК)после электрофореза.Для этой целииспользуютмедицинскую«неэкранированную»рентгеновскуюпленку (в пленкахс защитнымслоем на поверхностипоглощаетсячасть излучения).Почернениерентгеновскойпленки (послепроявления)происходиткак под действиемэлектронов, так и у-излучения.Препараты, меченые тритием,ввиду малойпроникающейспособностиего (3-электронов, лишь в случаеочень высокихинтенсивностейизлученияудается регистрироватьданным методом.Авторадиографияпрепаратов, меченых Sи С осуществляетсявполне успешно.Однако пластинкиПААГ в этихслучаях необходимоперед регистрациейрадиоактивностиполностьювысушивать.В противномслучае Р-электроны, испускаемыев глубине геля, не достигнутпленки. Сушатгель, уложивего на толстуюфильтровальнуюбумагу (он прилипаети при сушке несъеживается),1-2 часа в вакуумеи с нагреваниемили 36 часов навоздухе прикомнатнойтемпературе- до состояниятонкой, прочнойи прозрачнойпленки. Тем неменее, нежелательно, чтобы толщинавлажного геляпревышала 0,4мм.
Рентгеновскуюпленку накладываютэмульсией прямона гель. В такойпостановкеопыта Р-электроныуглерода и серыпроникают вслой эмульсиина глубинуоколо 0,25 мм. Дляхорошего прилеганияпленки к гелюпод крышкусоответствующейкассеты с пружиннымизажимами кладутпрокладку изгубчатой резины.Саму кассетузаворачиваютв черную бумагу.Экспозициядлится несколькодней. Затемследует, какобычно, проявлениеи фиксация.
ЭнергияР-излучениярадиоактивногофосфора достаточновелика, чтобыего авторадиографиюможно быловести прямос влажной пластиныгеля. Гель, покрытыйпленкой, оставляютна одной изстеклянныхпластин, заворачиваютв тонкий полиэтилени экспонируют, как было описановыше, в течениенесколькихчасов — лучшена холоде (-20°), с тем, чтобыпомешать расплываниюполос в гелево время экспозицииза счет диффузии.Р-электронырадиоактивногофосфора могутпроходить вматериалерентгеновскойпленки до глубиныв 6 мм. Это означает, что большаячасть их «прошивает»пленку, не передаввсю свою энергиюмолекуламбромистогосеребра и, следовательно, не самым лучшимобразом регистрируются.Иногда, еслиинтенсивностьР-излученияневелика (замалостью содержания), эти «пропадающиезря» электроныулавливаютс помощьюфосфоресцирующегоэкрана, которыйустанавливаютпо другую сторонупленки. Попавшиена экран Р-электронывызывают егосвечение ипленка регистрирует(не без некоторогоразмытия изображения)еще и светящуюсяполосу на экране.Зато яркостьпочерненияв этом случаеможет увеличитьсяв 5-8 раз.
Посколькупри использованиифлюоресценцииэкрана возможнарелаксациякристалловбромистогосеребра, распавшихсяпод действиемсвета, экспозициюпленки лучшепроводить вэтом случаепри — 70°.
Дляправильногосовмещенияпленки послепроявленияс исходнымгелем, на немдо авторадиографииделают двепометки поуглам радиоактивнымичернилами.
Сцинтилляционныесчетчики излучения
Методавторадиографииимеет два серьезныхнедостатка.Во-первых, нельзяколичественнооценить интенсивностьрадиоактивногоизлучения.Степень почерненияполос для этогокритерий слишкомгрубый. Во-вторых, практическиневозможново многих случаяхавторадиографиейзарегистрироватьизлучениетрития
Обаэти недостаткаснимаются прииспользованиижидкостныхсцинтилляционныхсчетчиков. Идеязаключаетсяв том, чтобырастворитьрадиоактивно-меченоевещество вжидкости, котораяна воздействиеР-электронов, обладающихдаже относительномалой энергией, отвечала бывспышкамисвета. Эти вспышкимогут бытьзарегистрированывысокочувствительнымифотоэлементами.Такая жидкостьименуетсясцинтиллятором,а сами вспышки- сцинтилляциями.Принцип действияздесь прост.Электрон, вылетевшийиз ядра радиоактивногоатома, входящегов состав некойбиологическоймолекулы, сразуже попадаетв жидкую среду, где он обреченстолкнутьсяна пути своегополета (пустьон будет измерятьсялишь долямимиллиметра)с молекуламисцитиллятора.Немалая частьтаких столкновенийприведет кпередаче частикинетическойэнергии электронакакому-либо«легко возбудимому»наружномуэлектронусцинтиллятора.Скорее всегоэлектрону, участвующемув реализациисопряженныхдвойных связейв ароматическоймолекуле, например,толуола илинафталина.Обычное «времяжизни» такогоэлектрона ввозбужденномсостоянии — порядка 10~8сек" после чегоон возвращаетсяк своему нормальномуположению, отдавая полученную«лишнюю» энергиюпосредствомиспусканиякванта света.
Электронылетят оченьбыстро. Поэтомуинтервалы междупоявлениемфотонов (напути пролетаэлектрона)будут стольмалы, что нетолько человеческийглаз (если быэтот свет оказалсяв видимой области), но и электронныерегистрирующиеприборы воспринимаютэту цепочкувспышек, какодин световойимпульс. Сколькорадиоактивныхраспадов впрепаратеслучится за1 минуту, т.е.сколько электроновза минуту прочертятсвои траекториив сцитилляторе, столько жеэлектрическихимпульсовзарегистрируетвысокочувствительныйсчетчик излучений.
В качестветакового используютне фотоэлементы(их чувствительностьслишком мала), а фотоумножители(ФЭУ). С этимиприборами васдолжны познакомитьв курсе физики.Идея их устройствасостоит в том, что в торце, внутри откаченногодо высокоговакуума цилиндраимеется фотокатод, который дажепри попаданиина него единичногофотона испускает, как минимум, один электрон.Под действиемсильногоэлектрическогополя этот электронразгоняетсяи ударяет впервый «динод»- металлическуюпластинку, покрытую особымсоставом, способным«ответить»на удар быстролетящего электронаиспусканиемпорядка 5-ти«вторичных»электронов.Все они, в своюочередь, разгоняютсяэлектрическимполем и ударяютво второй динод.Из котороговылетает ужеоколо 25-ти электронов.Такое умножениечисла электроновпроисходитна 8-10 «каскадах».Так, что на стоящийв конце цилиндраанод обрушиваетсяцелая «лавина»электронов, порожденнаялюбой оченьслабой и короткойвспышкой света.Лавина электроновлегко преобразуетсяво вполне ощутимыйи столь же короткий, как первоначальнаявспышка света, импульс напряжения.Далее следуетусилитель этогонапряженияи электронныйсчетчик импульсов, успевающийрегистрироватьмногие тысячиимпульсов всекунду. Поокончаниизаданноговремени счета(например, 1 минуты)счетчик останавливаетсяи показываетконечный результатсчета (в имп/мин).
Вышебыла сделанаоговорка: «еслибы этот светбыл видим глазом».Он не видимпотому, чтолежит в ультрафиолетовойобласти. Такойдалекой, чтоего не регистрируетобычный ФЭУ.Но коротковолновоеизлучение можнобез труда превратитьв более длинноволновоес помощью люминофоров- веществ, отвечающихна поглощениекоротких волнсвета испусканиемболее длинныхволн. В сцинтиллятордобавляют внебольшомколичестве(-0,5%) такие люминофоры, которые в дваэтапа, но мгновеннопереводятисходную вспышкусвета с длинойволны около310 тц во вспышкус длиной волны420 mi, хорошорегистрируемуюФЭУ.
Способрегистрацииэнергетическислабой радиоактивности(ЗH) и оценкиее удельнойактивности(числом имп/мин)кажется найден, но возникаютнекоторыетрудности, опреодолениикоторых следуетупомянуть. Яне случайноназвал вышев качествепервичныхсцинтилляторовтолуол и нафталин.Именно им поряду причинотдаетсяпредпочтение.Но нафталин- это твердоевещество. Ксчастью, егодо концентрации6-10% по весу можнорастворитьв диоксане. Адиоксан хорошосмешиваетсяс водой и нетеряет этойспособности, если в нем раствореннафталин. Это- существенно, так как большинствобиологическихпрепаратовисследуетсяв виде водныхрастворов.
То, чтово флаконе сосцинтилляторнойжидкостью лишь10% растворенноговещества является, собственноговоря, сцинтиллятором, не сказываетсяна эффективностисчета импульсов.«Результативных»столкновенийвсе-таки оказываетсядостаточномного, а онивсе равно сливаютсяв единую вспышкусвета. Ну а какбыть со сцинтилляторомна основе толуола? В этом случаевся жидкостьво флаконеявляется первичнымсцинтиллятором, но… она не смешиваетсяс водой. Проблемуудается решитьдобавлениемв толуол, всоотношении1: 3 или даже 1: 2, детергентаТритон Х-100. Есликоличествоводного растворарадиоактивногопрепарата непревышает 2,8мл на 20 мл сцинтиллятора, то получаетсяистинный раствор, и эффективностьсчета импульсовпрактическине снижается.
Задача, кажется, решена.Достаточнов стеклянныйфлакон, емкостьюв 25 мл залитьодин из двухсцинтилляторов, добавить вколичестве2-2,5 мл водныйраствор радиоактивномеченогобиологическогопрепарата, поставить этотфлакон в полнойтемноте (в глубинехорошо закрытогоот света прибора)перед фотокатодомФЭУ и можносчитать импульсы.Но не тут-тобыло. Посколькунадо считатьс большой точностьюпорой оченьмалые уровнирадиоактивности, то вмешиваетсяпостоянный«враг» всехвысокочувствительныхэлектронныхприборов — такназываемый«собственныйшум» элементов, образующихэти приборы.В том числе«шумит» и ФЭУ.Физическаяпричина этоголежит в том, что из фотокатода, без всякогоосвещения, атолько за счетсвоих тепловыхдвижений непрерывно, с большой частотойи совершеннохаотическивылетают электроны.Они тут жеподхватываютсясильным электрическимполем, умножаются, как описановыше, и даютложные, «темновые»импульсы напряжения, которые благополучнорегистрируютсясчетчикомимпульсов. Этот«темновой счет»может во многораз превышатьсчет регистрируемойрадиоактивности(он достигаетвеличины порядка105 имп/мин). Такова«плата» завысокую чувствительность!
Однакоэлектрониканашла выходи из этого, казалосьбы, безнадежногоположения.Флакон с препаратомставят междудвумя фотоумножителями.Импульсы напряженияс каждого изних подаютсяодновременнона электронноеустройство, именуемое«схемой совпадений».К сожалению, школьный курсфизики (боюсь, что и курсбиологическогофакультета)не позволяетздесь описатьэто очень простое, но замечательноеизобретение.Остается толькосообщить, чтооно осуществляет.Оно пропускает(в виде одиночногоимпульса) вследующую заним электроннуюцепь два импульсанапряжения, приходящиена два его «входа»строго одновременно- с точностьюдо 10~8 сек. Яупомянул, чтоФЭУ шумят хотяи с большойчастотой следованияшумовых импульсов, но хаотически.Поэтому вероятностьтого, что двашумовых импульсапридут на входысхемы совпаденийодновременно(с указаннойточностью)очень мала. Врезультатечисло регистрируемыхшумовых импульсовпадает катастрофически- до 3-5 имп/мин. Авспышку светав сцинтиллятореоба ФЭУ «видят»и регистрируютидеальноодновременно!
Впрочем, существуюти другие источникиложного счетаимпульсов.Например, космическиелучи. Они пролетаютчерез флаконсо сцинтиллятороми порождаютвспышку света.Для защиты отних флакон, опускающийсядля просчетав глубину прибора, защищен тамтолстой свинцовой«броней».
Электроникапозволяетдостигнутьеще одного, неменее замечательногорезультата.Если в сцинтилляторвносить одновременнодва препарата, из которыходин, к примеру, помечен, авторой — радиоактивнымуглеродом, тосовременный2-х канальныйсчетчик излученийможет зарегистрироватьв своих двухканалах однуи другую радиоактивностьпорознь. Здесьигра идет наразличии амплитудимпульсовтритиевогои углеродногопроисхождения.Оно проистекаетиз разницыэнергий Р-электронов, а значит и изразличия яркостисоответствующихвспышек света.Это различиепреобразуетсяв различиеамплитудпервоначальныхимпульсовнапряжения, снимаемых санодов обоихФЭУ. На входекаждого издвух каналовсчетчика (послеобщего предварительногоусилителянапряжений)стоят по два, так называемых,«пороговыхограничителя».Один из них(«верхний порог»)не пропускаетк счетчикуимпульсы напряжений, величина которыхбольше некоторогонаперед заданногозначения. Второй(«нижний порог»)«отрезает»все импульсы, которые меньшедругого, тоженаперед заданногозначения. Всеэти четыреограничителя(в 2-х каналах)устанавливаютсяэкспериментаторомв зависимостиот того, какаяпара изотоповпросчитывается.В результатетакой регулировкив один каналдля счета поступаютимпульсы толькоот более мощногоизлучателя, а в другой — толькоот слабого. Прирегулировкеучитываетсяи неизбежноечастичноеперекрытиераспределенийпо энергиямдля Р-электроновиз обоих источников.С этой цельюраспределениедля мощныхимпульсовчастично «отрезается»снизу — со стороныимпульсовменьшей амплитуды.А регистрацияслабых импульсовограничивается«сверху» — непроходит частьнаиболее «высоких»импульсов этойкатегории. Врезультатесчет числаимпульсов обеихкатегорийнесколькозанижается, но они оказываютсяразведеннымив разные каналы.Поправочныекоэффициентына такое занижениеприбор вноситавтоматически, просчитавпредварительно(при установленныхпорогах) эталонныеобразцы каждогоиз двух видовиспользуемойрадиоактивности.Результатыпечатаютсяна ленте в отдельныхстолбцах.
В автоматическийприбор можнос помощьюмногозвеннойцепи металлическихгнезд устанавливатьдо двух сотеннумерованныхфлаконов, которыепросчитываютсяпоследовательнобез участияоператора(например, ночью).
На рис.1 изображенапринципиальнаяэлектрическаясхема 2-х канальногосчетчика излучений.Обозначения:1 — флакон с препаратом,2 — ФЭУ, 3 — схемасовпадений,4 — усилительнапряжения,5 — нижние пороги,6 — верхние пороги,7 — счетчики числаимпульсов дляканалов А и В.
АВ
/>
Рис.1.
Счетрадиоактивностина фильтрах
Еслисинтез белкаили нуклеиновойкислоты ведутв полной ферментативнойсистеме invitro (в пробирке)с использованиемрадиоактивномеченых низкомолекулярныхпредшественников, то оценитьвключениерадиоактивностив биополимерможно с использованиемсчета радиоактивностиконечногопродукта нафильтре. Длязадержаниябелков илинуклеиновыхкислот послеосаждения ихиз реакционнойсмеси трихлоруксуснойкислотой (ТХУ)или этаноломможно использоватьфильтры изтолстой фильтровальнойбумаги илистекловолокнас размером пор0,45-1,2 ц. Второй вариантпредполагаетиспользованиеимеющихся впродаже мембранныхфильтров изнитроцеллюлозы(без осаждения).В этом случаезадержаниепродукта реакциина фильтреобусловленоего сорбцией.Нитроцеллюлозапрочно сорбируетщелочные белки, рибосомы иоднонитевые(денатурированные)молекулы ДНК.Следует отметить, что в случаеиспользованиябумажных илистекловолокнистыхфильтров частьрадиоактивногопродукта проникаетв глубь фильтра, а на мембранном- весь он тонкойпленкой распределяетсяпо поверхности.С точки зрениянадежногоконтакта сосцинтилляторомвторой вариантпредпочтительнее.Но мембранныефильтры намногодороже бумажныхили стекловолокнистых.
Дляданной целиудобны фильтрыдиаметром 24мм, что позволяетлегко вноситьих во флаконысцинтилляционногосчетчика.Фильтрованиеосуществляютс помощью простогоустройства, изображенногона рис.2.
/>
Рис.2.
В колбуБунзена (1) вставляютна резиновойпробке кольцевуюподложку дляфильтра (2) изнержавеющейстали в видерешетки с кольцевымшлифованнымфланцем. На неекладут фильтр(3), а на фильтрставят резервуар(4), выточенныйиз такой жестали и тожесо шлифованнымфланцем. Фланцысжимают пружиннымизажимами (непоказаны). Такаялегко разборнаяконструкцияудобна дляманипуляцийс фильтром.
В резервуарзаливают реакционнуюсмесь со взвешеннымв ней осадкомисследуемогопродукта (впервом варианте)или без осадка(во втором варианте)и при небольшомразреженииотсасываютжидкость.Радиоактивныепредшественникивымывают 5-6 разсменяя в резервуарепромывнуюжидкость, неспособнуюрастворитьосадок. (Например, ту же, в которойвелось осаждениеполимера)
Еслифильтров много, то, пронумеровавих предварительнопо краю карандашом, можно промывкувести «в объеме», большими партиями, сменяя промывнуюжидкость каждые15 минут и периодическивстряхиваяее. Последниепромывки влюбом случаеведут этанолом, затем эфиромдля полногоудаления водыво время последующейсушки фильтров.Это особенноважно для «объемных»: бумажных истекловолокнистыхфильтров, гдевода должнабыть полностьюудалена извнутреннихпор, так какпросчет радиоактивностиосадка на фильтреведут во флаконес чистым толуоловымсцинтиллятором.Остатки водыв порах могутпреградитьсцинтилляторудоступ к радиоактивномувеществу. Хорошовысушенныйфильтр в толуоловомсцинтилляторевыглядит однороднополупрозрачным.Сушку ведутна воздухе прикомнатнойтемпературе15-20 минут (доисчезновениязапаха эфира).
Положение«объемного»фильтра вофлаконе, — лежана дне или стояна ребре, — неиграет существеннойроли. Вспышкисвета при испускании(3-электроноввсе равно«засвечивают»всю жидкостьво флаконе ибудут замеченыобоими ФЭУ.Впрочем, мембранныйфильтр, все-таки, лучше положитьна дно пленкойвещества вверх.
В случаемалых объемовинкубационнойсмеси даже впервом вариантеиспользованияфильтров необязательнопроводитьреакцию и осаждениеполимера вобъеме дляпоследующегосбора осадкафильтрованием.До 50 мкл реакционнойсмеси можнопросто нанестина бумажныйфильтр и датьжидкости впитаться.Эту операциюможно провестиза один приемдля несколькихдесятковпронумерованныхфильтров, рядза рядом наколотыхбулавками наслой резины, так чтобы ониее не касались.Затем резинус фильтрамипомещают вовлажную камеру, термостатированнуюпри температуреферментативнойреакции. По ееокончаниифильтры вместес булавкамиснимают и помещаютв большой стакан, заполненный5%-ным растворомТХУ или этанолом.Осаждениеполимера будетпроисходитьвнутри фильтров.(С булавок фильтрыснимать неследует, таккак булавкипредохраняютих от слипания)Там же, в стаканепроизводяти все промывки.Затем фильтрыснова накалываютна резину, сушати помещают вофлаконы сосцинтилляторомв порядке ихномеров.
Разумеется, при использованиифильтровэффективностьсчета снижаетсяпо сравнениюс просчетомпрепарата, растворенногов сцинтилляторе.Некоторая частьэнергии (3-электроновтеряется насоударенияс материаломосадка и пространственнойсеткой фильтра.Однако Р-электрон, потерявшийчасть энергии, вовсе не обязательноуже неспособенвызвать световуювспышку всцинтилляторе.А для счетаважно толькочисло импульсовв минуту, а неих амплитуда(за исключениемсчета двойнойметки). Тем неменее, следуетконтролироватьтормозящиефакторы — толщинуи плотностьосадка, а такжеи самого фильтра, с тем, чтобы повозможностиуменьшить числоимпульсов, оказавшихсяне просчитаннымииз-за слишкомбольшой потериэнергии подороге к сцинтиллятору.
Введениерадиоактивнойметки в биологическиепрепараты
a)Inviuo.
Прощевсего предоставитьнепростую, аиногда и небезопаснуюоперацию введенияметки самойприроде. Дляэтого в питательнуюсреду вносятрадиоактивномеченый предшественниксинтеза интересующегонас веществав организме.Проще всегоэто сделатьдля бактерий.Меченый потимидин за 1час легко включаетсяв ее ДНК до уровня, составляющегооколо 10% внесеннойв среду радиоактивности.Точно так жеметят ДНК вживотных клетках, растущих вкультуре ткани.
Импульснуюметку в иРНКбактерий осуществляютпутем введенияв питательнуюсреду С-урацилаили того жеР-ортофосфата- после исчерпанияили отмывкинерадиоактивногофосфора. Ввидубыстроты протеканияпроцессовметаболизмау бактерийпродолжительностьтакого импульсадолжна бытьнебольшой(10-30 сек.). Послечего жизнедеятельностьбактерий надонемедленнопрекратить, например, вылитьих суспензиюна мелко раздробленныйлед, содержащийазид натрия.
Меткув бактериальныебелки, как и вбелки высшихорганизмовв культуреклеток, удобнеевсего вноситьс помощью меченогопо С или Sметионина.Напомню, чтометионин являетсянезаменимойаминокислотой(т.е. не синтезируетсяв самом организме)для клеток всехвысших животныхи некоторыхбактерий. Крометого, с негоначинаетсясинтез любогобелка, что позволяетследить заначалом этогопроцесса.
Введениеметки черездиету животныхпрактическине используется, так как радиоактивныеизотопы попутям метаболизмавключаютсяво многиебиологическиемолекулы. Крометого разбавлениерадиоактивнойметки происходитза счет собственныхзапасов организма, например, незаменимыхаминокислот, полученныхв результатекатаболизма(расщепления)собственныхбелков. Все этотребует большогорасхода дорогостоящихрадиоактивныхпрепаратови связано сповышеннойстепенью радиационнойопасности.
Здесьуместно заметить, что радиоактивнаяметка вводится, точнее сказать, создается ваминокислотах, нуклеотидахи других биологическихзначимых молекулахпутем специальногооблучения ватомных реакторах.Каталогиспециализированныхзарубежныхфирм содержатмногие сотнинаименованийрадиоактивномеченых молекул.Чего, к сожалению, нельзя сказатьоб отечественнойпродукции. б)Invitro.
Введениерадиоактивнойметки в ужеочищенные белкиили нуклеиновыекислоты можнопроизводитьи в лабораторныхусловиях спомощью химическихреакций замещенияили присоединениярадиоактивныхатомов, а иногдаи простыхрадиоактивномеченых молекул.Эти реакциидостаточносложны и рассматриватьих здесь неимеет смысла.Чаще введениеметки осуществляетсяв процессеидущих invitro ферментативныхреакций синтезабиополимеровс использованиемрадиоактивномеченых предшественников(Р-АТФ, аминокислот, нуклеозидтрифосфатови проч.) Некоторыеиз ферментовприсоединяюттолько одномеченое звенона конец цеписоответствующегополимера.
Другиеферменты, ведущиев пробиркекомплементарныйсинтез биополимеров(ДНК-полимеразы, РНК-полимеразы, рибосомальныекомплексы) приналичии радиоактивномеченых мономерныхпредшественников(рибо- идезоксирибонуклеозидтрифосфатов, аминоацил-тРНК)могут включатьрадиоактивнуюметку во всеили некоторыезвенья полимерныхцепей, придаваяим очень высокуюстепень радиоактивности.
В заключениеследует отметить, что по причинамбезопасностии удобствадетектированиярезультатовбиосинтезав последниегоды возниклатенденция кзамене радиоактивнойметки на флюоресцентную, что мы уже наблюдалина примереэволюции методасеквенированияДНК.
Литература
Авдонин П.В., Ткачук В. А, Рецепторы и внутриклеточный кальций. 1994. — Наука, Москва. — С.29-42.
Авцын А.П., Жаворонков А.А., Риш М.А., Строчкова Л.С. Микроэлементы человека, Медицина. М. — 1991.
Анестиади В.Х., Нагорнев В.А. О пато- и морфогенезе атеросклероза. Кишинев, Медицина. — 1985. — С.92.
Антонов В.Ф. Липиды и ионная проницаемость мембран. — М.: Медицина, 1982.
Аронов Д.М., Бубнова Н.Р., Перова Н.В. и др. Влияние ловастатина на динамику липидов и аполипротеидов сыворотки крови после максимальной физической нагрузки в период пищевой липемии у больных ИБС // Кардиология, — 1995. — Т.35. — N 31. — С.38-39.
Атаджанов М.А., Баширова Н.С., Усманходжаева А.И. Спектр фосфолипидов в органах-мишенях при хроническом стрессе // Патологич. физиология и эксперим. терапия. — 1995, — N 3: — С.46-48.