Молекулярно-генетическая характеристика заболеваний

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА НЕКОТОРЫХ МОНОГЕННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ. Раздел 1. Хромосомная локализация и принципы классификации генов наследственных болезней. К настоящему времени на хромосомах человека картировано около 800 генов, мутации которых приводят к различным наследственным заболеваниям. Количество моногенных заболеваний, для которых известна локализация контролирующего гена, еще больше и приближается к 950 за счет существования аллельных серий, то есть групп болезней, клинически сильно отличающихся друг от друга, но обусловленных мутациями в одном и том же гене (см.Глава IV). Для всех этих заболеваний принципиально возможна пренатальная диагностика с использованием косвенных методов молекулярного анализа (см.Главу VII).Более половины картированных генов клонировано и охарактеризовано методами молекулярного анализа. Для каждого из этих генов описаны мутантные варианты среди соответствующих групп больных, причем количество идентифицированных аллелей в разных генах может колебаться от одного до нескольких сотен (см.ниже). Молекулярное генотипирование мутации позволяет проводить прямую пренатальную диагностику соответствующего наследственного заболевания в семьях высокого риска.
Число генов наследственных болезней, локализованных на каждой хромосоме приведено на Рис. 10.1. В среднем, на каждой из них к 1995г. идентифицировано около 30 таких структурных генов. Обращает на себя внимание неравномерный харак-тер распределения этих генов. Так, хромосомы 1 и 2 имеют примерно одинаковые размеры (хромосома 2 даже несколько крупнее), однако, число уже картированных генов, связанных с наследственными заболеваниями, на хромосоме 1 в 3 раза меньше, чем на хромосоме 2. Наибольшее число таких генов (больше 100) картировано на Х-хромосоме. Это, по-видимому, можно объяснить гемизиготным проявлением мутаций генов Х-хромосомы в компаунде гоносом ХУ у мужчин. Вместе с тем, анализ приведенных данных (Рис. 10.1) свидетельствует и о феномене раз-личной насыщенности разных хромосом структурными генами. Наибольшая плотность структурных генов свойственна хромосомам 1, 3, 7, 9, 17, 22, Х. Значительно меньшая - хромосомам 2,13, 18, 21, У (Antonarakis, 1994). Неслучайно, дисбаланс некоторых из хромосом 2-й группы часто совместим с постнатальным развитием (синдром Дауна - трисомия 21; синдром Эдвардса- трисомия 18; синдром Патау - трисомия 13). По-видимому,это связано со сравнительно низкой плотностью структурных генов в этих хромосомах, а также с отсутствием в них генов,контролирующих ранние стадии развития. Напротив, сравнительно слабая насыщенность известными генами хромосом 2 и 15 в сочетании с редкостью их дисбаланса даже в абортном материале, может рассматриваться в пользу наличия в этих хромосомах "ранних генов", контролирующих начальные стадии онтогенеза человека: гаметогенез, ранний эмбриогенез. Мутации таких генов отметаются селекцией уже на этих ранних стадиях, а потому не обнаруживаются постнатально. Стремительный рост данных о генетической информации, заключенной в каждой хромосоме, распределении в ней структурных и регуляторных генов, их взаимодействии с надмолекулярными структурами хромосом (гетерохроматином), межхромосомных взаимодействиях и феномене геномного импринтинга открывает широкие возможности на новом методическом и концептуальном уровне подойти к проблеме хромосомного (геномного) контроля ранних стадий развития человека - основной проблемы цитогенетики развития млекопитающих (Баранов, 1984; 1990; 1992; Dyban, Baranov, 1987).Другое положение, которое следует напомнить в вводной части этой главы касается специфичности мутационных повреждений каждого структурного гена. Как указывалось ранее (см.Глава V), несмотря на наличие общих закономерностей в мутационных процессах, спектр мутаций для каждого гена, равно как и сами структурные гены - уникальны. Причины этой уникальности кроются в особенностях первичной структуры ДНК каждого гена, в частности, обогащенности CG нуклеотидами,его размерах, наличии прямых и обращенных повторов, присутствии внутри гена ДНК последовательностей, гомологичных внегенным участкам, что может приводть к нарушениям процессов рекомбинации в мейозе и.т.д. Для каждого идентифицированного гена, мутации которого приводят к наследственным заболеваниям, разработаны эффективные методы молекулярной диагностики,как правило, направленные на генотипирование наиболее частых мутаций этого гена. Реже для этих же целей используется непрямой метод диагностики с помощью молекулярных маркеров . Цитогенетические карты представляют собой один из способов однозначной и обьективной систематизации генов. Для практических целей медико-генетического консультирования и дифференциальной диагностики моногенных заболеваний подобная классификация не всегда удобна, так как при составлении карт генов никак не учитывается информация об особенностях кодируемых генами продуктов или о фенотипическом проявлении мутантных аллелей. В медицинскихх целях черезвычайно важно иметь представление о группах генов, кодирующих функциональ-но и структурно родственные белки, или контролирующие заболевания со сходной клинической картиной. Однако, далеко не всегда классификация по клиническим параметрам может быть проведена однозначно по ряду причин. Во-первых, большое число моногенных наследственных заболеваний носит синдромальный характер и, зачастую, не удается выделить группу ведущих клинических симптомов. Во-вторых, многие болезни отличаются высоким уровнем фенотипической гетерогенности, связанной либо со спецификой мутационных повреждений, либо с различиями в окружающих условиях и/или в генетическом фоне (см. Главу IV). Кроме того, многие болезни, вызванные мутациями в разных генах, могут протекать сходным образом и, основываясь только на клинических симптомах, трудно провести дифференциальную диагностику подобных заболеваний. Поэтому наиболее обьективная классификация моногенных наследственных болезней с известными первичными биохимическими дефектами проводится на основе классификации соответствующих генопродуктов с учетом их участия в определенных метаболических циклах. В данной заключительной главе мы попытаемся проиллюстрировать на ряде примеров теоретические положения, изложенные в предыдущих главах. В качестве примеров будут приведены краткие молекулярно-генетические характеристики некоторых классов хорошо изученных и достаточно распространенных моногенных наследственных болезней. Большинство из этих завболеваний в той или иной мере изучаются в соответствующих научных центрах России, а их диагностика в медико-генетических центрах страны проводится не только по клиническим параметрам, но и с обязательным учетом результатов молекулярного и/или биохимического обследования. Раздел 2. Метаболические дефекты лизосомных ферментов. Болезни накопления. В качестве примера наиболее полно и всесторонне изученных заболеваний мы выбрали группу болезней, обусловленных наследственными дефектами лизосомальных гидролаз. В Табл.10.1 представлены данные о наследовании и встречаемости ли-зосомных болезней, хромосомной локализации и структуре соответствующих генов, кодируемых ими продуктах и идентифицированных мутантных аллелях. Даны также ссылки на основные работы по картированию соответствующих генов, их клонированию и идентификации мажорных (то есть наиболее частых) мутаций.
Таблица составлена по материалам Каталога наследственных болезней В. МакКьюсика 1994 г.(McKusik, 1994) и дополнена необходимыми литературными данными. Таблица 10.1 Молекулярно-генетические основы лизосомных болезней( N) - примечания, представленные в конце таблицы). Синдромы 1), номер по¦Встречаемость,¦Типы и количество му- ¦Литература ¦
МакКьюсику; хромосом-¦белок, размеры¦таций 5), мажорные мута¦(локализация и структура¦ ная локализация; ген ¦в аминокисло- ¦ции -в скобках указаны ¦генов,клонирование кДНК,¦ 2);размеры 3); экзоны¦тах 4) ¦частоты аллелей у б-ных¦идентификация мутаций). ¦ ---------------------+--------------+-----------------------+------------------------+ N-ацетил-альфа-D-га- ¦Очень редко 6)¦Миссенс - 2: ¦Wang et al.,1990 ¦ лактозаминидазы деф.;¦ ¦E325K -Шиндлера болезнь¦Desnick, 1991 ¦ Шиндлера;Канзаки б-нь¦Ацетилгалактоз¦R329W - Канзаки болезнь¦ ¦ 104170; 22q11; ¦аминидаза,аль-¦ ¦ ¦ NAGA.2; кДНК-2.2 кб ¦фа-N-; 411¦ ¦ ¦ ---------------------+--------------+-----------------------+------------------------+ Ангиокератома Фабри; ¦1 : 40 000 ¦Миссенс -31;делеции (от¦ Bishop et al.,1988 ¦ дистопический липидоз¦ ¦1 н. до неск.экз.) -11;¦ Kornreich et al.,1990 ¦ 301500; Xq22; ¦Галактозидаза ¦сплайс.-5 (из них 3 с ¦ Davies et al., 1993 ¦ GLA.50; 12 кб, 7 экз.¦альфа; 429¦дел.экз); инс.,дупл.-3 ¦ Eng et al.,1993 ¦ ---------------------+--------------+-----------------------+------------------------+ Аспартилглюкозамину- ¦Более 100 случ¦Миссенс -5; делеции -4;¦Ikonen et al.,1991 ¦ рия, ¦в Финляндии ¦инсерции -2; ¦Ikonen et al.,1992 ¦ 208400; 4q23-q27; ¦Аспартилглюкоз¦C163S - мажорная мута- ¦ ¦ AGA.11; ¦аминидаза; 346¦ция в Финляндии (98%) ¦ ¦ ---------------------+--------------+-----------------------+------------------------+ Вольмана б-нь;гиперхо¦Более 70 случ.¦Делеция 72 н.,возникшая¦Anderson et al.,1991 ¦ лестерин-гипертригли-¦ ¦в результате сплайсинго¦Anderson et al.,1994 ¦ церидемия, ¦Лизосомальная ¦вой мутации -обнаружена¦Maslen et al,1993 ¦ 278000; 10q24-q25; ¦кислая липаза ¦в 2 случаях;миссенс -2;¦Klima et al.,1993 ¦ LIPA.4; 36 кб;10 экз.¦-A ¦инсерция 1 н. - 1. ¦ ¦ ---------------------+--------------+-----------------------+------------------------+ Галактосиалидоз, ¦Преим.в Японии¦Делеция экз.7 (сплайс.)¦Galjard et al.,1988 ¦ ¦Протективный ¦-мажорная у взрослsх в ¦Wiegant et al.,1991 ¦ 256540; 20q13.1; ¦белок бета га-¦Японии; миссенс -6; ¦Takano et al.,1991 ¦ PPGB.7; мРНК - 2 кб ¦лактозидазы452¦F412V - в 2 случаях ¦Zhou et al.,1991 ¦ ---------------------+--------------+-----------------------+------------------------+ Ганглиозидоз GMI; му-¦Неизвестно ¦Миссенс -10; дуплик.-2;¦Oshima et al.,1988 ¦ кополисахаридоз 1YB, ¦ ¦I51T и R201C-мажорные в¦Noshimoto et al.,1991 ¦ 230500; 3p21.33; ¦Галактозидаза ¦в Японии, R482H и W273L¦Suzuki et. al.,1993 ¦ GLB1.12; кДНК - 2кб ¦бета-1; 677¦мажорные в Европе ¦Mosna et al.,1992 ¦ ---------------------+--------------+-----------------------+------------------------+ Ганглиозидоз GM2-I, ¦1 : 300 000; у¦Миссенс-34;дел.-8;инс.-¦Proia et al.,1987 ¦ варианты B,B1 и псев-¦евреев 1:3 000¦2;сплайс.-8; Мажорные:у¦Myerowitz et al.,1988 ¦ до AB;Тея-Сакса б-знь¦Гексозаминида-¦евреев-инс.4 н.-70%,спл¦Arpaia et al.,1988 ¦ 272800; 15q23-q24; ¦за A, альфа ¦айс.-20%;G269S-взр.-20%¦Navon et al.,1989 ¦ HEXA.52; 35 кб, 14экз¦ 529¦не евреи - R247W - 32% ¦Triggs-Raine et al.,1992¦ ---------------------+--------------+-----------------------+------------------------+ Ганглиозидоз GM2, тип¦1 : 300 000 ¦Миссенс -5; делеции -2;¦Proia: 1988 ¦ II,Зандхоффа болезнь,¦ ¦инсерции - 2; Мажорные:¦Neote et al.,1990 ¦ 268800; 5q13; ¦Гексозаминида-¦16-кб делеция 1-5 экз.-¦Wakamatusi et al.,1992 ¦ HEXB.9; 40 кб, 14экз.¦за B,бета; 556¦27%;делеция 50кб; P417K¦McInnes et al.,1992 ¦ ---------------------+--------------+-----------------------+------------------------+ Ганглиозидоз-GM2, AB ¦Очень редко ¦Миссенс -3: C107R; ¦Heng et al.,1993 ¦ вариант, ¦ ¦R169P; C138R (1 пациент¦Schroder et al.,1993 ¦ 272750; q31.3-q33.1;¦GM2-активатор-¦гомозиготен) ¦ ¦ GM2A.3; ¦ный белок; 193¦ ¦ ¦ ---------------------+--------------+-----------------------+------------------------+ Гоше болезнь; глико- ¦1:600 у евреев¦Миссенс -30;инс.-1;деле¦Sorge et al.,1985 ¦ сфинголипидоз, ¦изол. в Швеции¦ции-3;сплайс.-1; Мажор-¦Sorge et al.,1987 ¦ 230800; 1q21; ¦Глюкоцеребро- ¦ные (98%):N370S, L444P,¦Beutler et al.,1992 ¦ GBA.36; ¦зидаза; 644¦R463C,84insG;IVS2+1 G-A¦Horowitz et al.,1994 ¦ ---------------------+--------------+-----------------------+------------------------+ Лейкодистрофия глобо-¦1 : 50 000 в ¦Нонсенс мутация:E369TER¦Zlotogora et al.,1990 ¦ ид-клеточная, Краббе,¦Швеции ¦ ¦Sakai et al.,1994 ¦ 245200; 14q21-q31; ¦Галактозилцера¦ ¦ ¦ GALC.1; кДНК -3.78 кб¦мидаза 669¦ ¦ ¦ ---------------------+--------------+-----------------------+------------------------+ Лейкодистрофия ¦1 : 100 000 ¦Миссенс -7; делеции -2;¦Stein et al.,1989 ¦ метахроматическая, ¦ ¦сплайс. -2; регулят. -1¦Polten et al.,1991 ¦ 250100; 22q13.31-qter¦Арилсульфатаза¦Мажорные:P426L и сплайс¦ ¦ ARSA.12; 8 экз¦A 507¦2 -70%, регулят. - 1-2%¦ ¦ ---------------------+--------------+-----------------------+------------------------+ Лейкодистрофия мета- ¦Редко ¦Миссенс -4: T23I,T216I,¦Rorman et al.,1992 ¦ хроматическая, SAP1 ¦ ¦C241S,F385C; ¦Wenger et al.,1989 ¦ деф.; Гоше б-нь, ¦ ¦инсерция 33 н. -1; ¦ ¦ 176801; 10q21-q22; ¦Просапозин ¦регуляторная мутация в ¦ ¦ PSAP.6; 20 кб, 13экз.¦ 511¦инициирующем кодоне -1 ¦ ¦ ---------------------+--------------+-----------------------+------------------------+ Лизосомальной кислой ¦ ¦ ¦Pohlmann et al.,1988 ¦ фосфатазы деф., ¦Кислая фосфата¦ ¦ ¦ 171650; 11p12-p11; ¦за 2, лизосом-¦ ¦ ¦ ACP2.; кДНК-2.1 кб ¦ная 423¦ ¦ ¦ ---------------------+--------------+-----------------------+------------------------+ Липидоз сфингомиелино¦Редко ¦Миссенс - 8; делеции -3¦Quintern et al.,1989 ¦ вый;Ниманна-Пика бо- ¦ ¦Мажорные:тип A евреи: ¦Levran et al.,1991 ¦ лезнь,тип A/B, ¦ ¦R496L,L302P,дел.1н.P330¦Schuchman et al.,1992 ¦ 257200; 11p15.4-p15.1¦Сфингомиелина-¦в комплексе 65%; тип B ¦Suchi et al.,1992 ¦ ¦ SMPD1.11; ¦за 629¦Сев.Африка R608del->80%¦Takahashi et al.,1992 ¦ ---------------------+--------------+-----------------------+------------------------+ Ниманна-Пика болезнь,¦Очень редко ¦ ¦Carstea et al.,1993 ¦ тип C, ¦ ¦ ¦Kurimasa et al,1993 ¦ 257220; 18p; ¦ ¦ ¦ ¦ NPC.; ¦ ¦ ¦ ¦ ---------------------+--------------+-----------------------+------------------------+ Ниманна-Пика болезнь,¦Очень редко ¦ ¦Winsor et al.,1978 ¦ тип D, ¦ ¦ ¦ ¦ 257250; ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ---------------------+--------------+-----------------------+------------------------+
Маннозидоз, альфа B, ¦50-100 случаев¦ ¦Kaneda et al.,1987 ¦ лизосомальный, ¦Лизосомальная ¦ ¦ ¦ 248500; 19p13.2-q12;¦альфа-D-манно-¦ ¦ ¦ MANB.; ¦зидаза B ¦ ¦ ¦ ---------------------+--------------+-----------------------+------------------------+
Маннозидоз, бета, ¦Очень редко ¦ ¦Lundin,1987 ¦ ¦Лизосомальная ¦ ¦ ¦ 248510; chr.4?; ¦бета маннози- ¦ ¦ ¦ MANB1.; ¦даза ¦ ¦ ¦ ---------------------+--------------+-----------------------+------------------------+ MASA синдром (сложная¦Редко ¦ ¦Schrander-Stumpel ¦ спастическая парапле-¦ ¦ ¦et al.,1990 ¦ ¦ гия), 303350; Xq28; ¦Маннозосвязыва¦ ¦Rosenthal et al.,1992 ¦ MASA.; ¦ющий лектин248¦ ¦ ¦ ---------------------+--------------+-----------------------+------------------------+ Мукополисахаридоз 1; ¦1:100 000, ¦Нонсенс -4; миссенс -3;¦Scott et al.,1991 ¦ Гурлера синдром;Шейе,¦1:600 000-Шейе¦сплайс. -1; дел. 1н. -1¦Scott et al.,1992 ¦ 252800; 4p16.3; ¦Альфа-L-идуро-¦Мажорные: W402X (31%), ¦Moskowitz et al.,1993 ¦ IDUA.9; 19 кб, 14экз.¦нидаза 653¦Q70X (15%), P533R (3%) ¦Scott et al.,1993 ¦ ---------------------+--------------+-----------------------+------------------------+ Мукополисахаридоз II;¦1:70 000 в Из-¦20% -крупные делеции,из¦Wilson et al.,1990 ¦ Хантера синдром, ¦раиле ¦них 4,5 % -всего гена; ¦Bunge et al.,1993 ¦ 309900; Xq28; ¦Идуронат-2- ¦делеции 1-3н-7;миссенс-¦Flomen et al.,1993 ¦ IDS.29; 24 кб, 9 экз.¦сульфатаза 550¦13;нонсенс -4;сплайс.-5¦Hopwood et al.,1993 ¦ ---------------------+--------------+-----------------------+------------------------+ Мукополисахаридоз ¦1 : 24 000 в ¦ ¦Kresse et al.,1971 ¦ IIIA,Санфилиппо синд-¦Нидерландах ¦ ¦ ¦ ром A, 252900; ¦(все типы A-D)¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ---------------------+--------------+-----------------------+------------------------+ Мукополисахаридоз ¦Наиболее часто¦ ¦Pande et al.,1992 ¦ IIIB,Санфилиппо синд-¦на юге Европы ¦ ¦ ¦ ром B, 252920;Chr.17?¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ---------------------+--------------+-----------------------+------------------------+ Мукополисахаридоз III¦Редко ¦ ¦Zaremba et al.,1992 ¦ C, Санфилиппо синдром¦ ¦ ¦ ¦ C, 252930;Chr.14 или ¦ ¦ ¦ ¦ 21?; ¦ ¦ ¦ ¦ ---------------------+--------------+-----------------------+------------------------+ Мукополисахаридоз III¦Редко ¦ ¦Robertson et al.,1988a ¦ Санфилиппо синдром D,¦N-ацитил-глюко¦ ¦Robertson et al.,1988b ¦ 252940; 12q14; ¦зоамин-6-суль ¦ ¦ ¦ GNS.; ¦фатаза 552¦ ¦ ¦ ---------------------+--------------+-----------------------+------------------------+ Мукополисахаридоз IYA¦1 : 300 000 ¦Миссенс - 3: N204K, ¦Tomatsu et al.,1991 ¦ Моркио синдром, ¦ ¦A138V, R386C; ¦Tomatsu et al.,1992 ¦ 253000; 16q24.3; ¦Галактозамин-6¦делеция 2 н. - 1 ¦Masuno et al.,1993 ¦ GALNS.4; ¦сульфатаза 522¦ ¦ ¦ ---------------------+--------------+-----------------------+------------------------+ Мукополисахаридоз YI;¦Редко ¦Миссенс - 4: C137V, ¦Litjens et al., 1989 ¦ Марото-Лами синдром, ¦ ¦C117R, L236P, C405Y; ¦Schuchman et al.,1990 ¦ 253200; 5q11-q13; ¦Арилсульфатаза¦делеция 1н. - 1 ¦Jin et al.,1992 ¦ ARSB.5; ¦B 533¦ ¦Litjens et al., 1992 ¦ ---------------------+--------------+-----------------------+------------------------+ Мукополисахаридоз YII¦Очень редко ¦Миссенс - 5: A619V, ¦Guise et al.,1985 ¦ Слая синдром, ¦ ¦R382C, R216W, R354W, ¦Oshima et al., 1987 ¦ 253220, 7q21.11; ¦Бета-глюкуро- ¦R611W ¦Miller et al.,1990 ¦ GUSB.5; 21 кб, 12экз.¦нидаза 651¦ ¦Tomatsu et al.,1991 ¦ ---------------------+--------------+-----------------------+------------------------+ Сиалидоз типы I и II;¦50-100 случаев¦ ¦Oohira et al.,1986 ¦ липомукополисахаридоз¦ ¦ ¦Klein et al.,1986 ¦ 256550; 6p21.3; ¦Нейраминида- ¦ ¦Sasagasako et al.,1993 ¦ NEU.; ¦за-1 ¦ ¦ ¦ ---------------------+--------------+-----------------------+------------------------+ Фукозидоз, ¦30-60 случаев ¦Нонсенс - 5:Q351X-мажор¦Fowler et al.,1986 ¦ ¦Фукозидаза аль¦ная (20%), E375X, Q77X,¦Kretz et al.,1992 ¦ 230000; 1p34; ¦фа-L-1,ткане- ¦W382X, Y211X;делеции -4¦Roychoudhuri et al.,1988¦ FUCA1.10; 23 кб, 8экз¦вая 461¦(экз2-1,1н-3);сплайс.-1¦Seo et al.,1993 ¦ ---------------------+--------------+-----------------------+------------------------- 1) - через ";" указаны различные наименования болезней либо аллельные варианты 2) - после наименования гена через "." указано количество идентифицированных мутантных аллелей к июлю 1994г. 3) - размеры генов указаны в килобазах (кб), иногда вместо размеров гена указаны размеры кДНК или мРНК 4) - размеры белка указаны в правом нижнем углу 5) - при количестве мутаций, меньшем 5, все они указываются после знака ":", при большем количестве перечисляются только типы мутаций 96) - частоты заимствованы из сводной таблицы Scriver et al., 189.Сокращения - взр.- взрослые; дел.- делеция; дупл.- дупликация; инс. - инсерция; н.- нуклеотиды; сплайс. замена нуклеотидов в донорном или акцепторном сайтах сплайсинга или мутации в интронных областях, создающие новый сайт сплайсинга; экз.экзон Из таблицы 10.1 следует, что для 29 из 31 лизосомных болезней определена хромосомная локализация гена, причем в 26 случаях - абсолютно однозначно. 23 лизосомных гена клонированы. Для 20 лизосомных заболеваний описаны различные мутантные аллели, что подтверждает правильность идентификация соответствующих генов . Для 12 заболеваний найены мажорные мутации в различных популяциях. Для 8 заболеваний общее количество идентифицированных мутаций пока не превысило шести и, возможно, мажорные мутации для них еще будут идентифицированы. Спектр мутаций в разных лизосомных генах очень разнообразен. Так, при болезни Фабри наряду с явным преобладанием миссенс мутаций обнаружено 14 внутригенных перестроек размерами от 0.4 до 8 кб, многие из которых имеют точки разрыва в экзоне 2 - области локализации большого числа Alu-повторов.Сам ген GLA содержит 12 различных Alu-элементов, составляющих около 30% его длины. В местах разрывов часто обнаруживаются короткие прямые и обращенные 2-6 нуклеотидные повторы.Одним из возможных механизмов возникновения структурных перестроек в данном гене может быть незаконная Alu-Alu рекомбинация или, что более вероятно, рекомбинация между короткими повторами. Участие Alu-элементов предполагается также при возникновении 16-кб делеции промоторной области и первых 5-и экзонов гена HEXB - мажорной мутации при болезни Зандхоффа. Нарушение процесса рекомбинации является, по-видимому, причиной возникновения очень большого числа крупных и мелких делеций в IDS-гене при синдроме Хантера. Высокая концентра-ция CpG динуклеотидов рассматривается как возможный эндогенный механизм возникновения мажорной среди евреев-ашкенази мутации P330FS в гене SPDM1 при болезни Ниманна-Пика типа B,так как эта делеция возникает в районе, где из 10 остатков 9 составляют цистеины.
Делеции целых экзонов или инсерции интронных областей возникают сравнительно часто в результате точковых мутаций в донорных или акцепторных сайтах сплайсинга. Примерами являются мажорная в Японии сплайсинговая мутация, сопровождающаяся делецией 7-го экзона гена- PPGB, приводящая к галактосиалидозу и сплайсинговая мутация IVS2+1, обусловливающая вырезание экзона 2 гена GBA при болезни Гоше. Появление в результате точковой мутации в интронной области нового сайта сплайсинга также может сопровождаться структурными перестройками. Такова, в частности, природа 33-нуклеотидной инсерции в гене PSAP при метахроматической лейкодистрофии, обусловленной дефицитом SAP1; 24-кб инсерции в гене HEXB при болезни Зандхоффа и 5-нуклеотидной инсерции в гене IDUA при синдроме Шейе. Важно отметить, что подобные мутации совместимы с образованием небольшого числа функционально активных мРНК, следствием чего является относительно более мягкое течение соответствующих форм заболеваний.
В некоторых случаях возникновению мутаций может способствовать наличие псевдогена. Молекулярный анализ псевдогена, тесно сцепленного с геном GBA, показал, что, по крайней мере, 4 мутации, обнаруженные у пациентов с болезнью Гоше, присутствуют в норме в псевдогене. Это 2 мажорные мутации - L444P и IVS2+1 и еще 2 миссенс мутации в 10-м экзоне (A456P и V460V). Подобное сходство несомненно указывает на фундаментальную роль псевдогена в образовании мутаций в GBA-гене. В то же время само по себе присутствие псевдогена не является мутагенным фактором, особенно если сам ген и его псевдоген локализованы в разных хромосомах, как, например, в случае генов GM2A и FUCA1, псевдогены которых находятся в хромосоме 3 и в области 2q31-q32, соответственно.Для двух лизосомных болезней - фукозидоза и синдрома Гурлера, мажорными являются нонсенс мутации. Более того, при фукосидозе все известные к настоящему времени мутации приводят к полному отсутствию продукта FUCA1-гена. Так, наряду с мажорной мутацией Q351X, представленной в 20% хромосом у больных фукосидозом, описаны еще 4 нонсенс мутации и 4 делеции со сдвигом рамки считывания. При синдроме Гурлера две мажорные нонсенс мутации - W402X и Q70X, составляют около 50% всех известных мутантных аллелей гена IDUA. Кроме того,при этом заболевании зарегистрированы еще 4 минорные по частоте нонсенс мутации и 1 делеция со сдвигом рамки считывания. 3 миссенс мутации и интронная мутация, создающая дополнителный сайт сплайсинга в гене IDUA, не приводят к полному блоку синтеза идуронидазы и реализуются в виде синдрома Шейе. Уместно заметить, что оба заболевания - синдром Гурлера и синдром Шейе, являются классическим примером фенотипического разнообразия, обусловленного существованием аллельных серий . Такой спектр крайне тяжелых мутаций нельзя объяснить только повышенной частотой их возникновения. Более вероятным представляется предположение о том, что кодируемые FUCA1- и IDUA-генами белки обнаруживают определенную устойчивость к небольшим повреждениям и сохраняют функциональную активность при определенных аминокислотных заменах, то есть миссенс аллели в этих генах проявляют себя как нейтральные мутации и не приводят к развитию заболеваний. Хорошо известно, что распространение мутаций в популяциях определяется не только, и не столько повышенной частотой их возникновения, но многими другими популяционно-генетическими факторами и, в первую очередь, связано с эффектом основателя . Типичным следствием эффекта основателя, как известно, является наличие различных мажорных по частоте мутаций одного и того же гена у пациентов разных изолятов и этнических групп. Подобная картина наблюдается, в частности, при ганглиозидозе GMI. Так, в Японии мажорными при этом заболевании являются миссенс мутации I51T и R201C,тогда как в Европе преобладают мутации R482H и W273L. Эффектом основателя можно объяснить высокую частоту аспартилглюкозаминурии в Финляндии, так как в 98% случаев у пациентов финского происхождения заболевание обусловлено присутствием одной и той же миссенс мутации C163S, резко уменьшающей активность аспартилглюкозаминидазы. Интересно отметить, что эта мутация у больных находится в сильном неравновесном сцеплении с другой миссенс мутацией в AGA-гене - R161Q, яв-ляющейся, в свою очередь, редкой формой полиморфизма. Невозможно, однако, исключить возможность комбинированного влияния этих двух мутаций на фенотип.Яркие примеры этнических различий по частоте и спектру мажорных мутаций выявляются при анализе таких лизосомных болезней накопления как болезнь Тея-Сакса, Ниманна-Пика и болезнь Гоше. Прежде всего, эти заболевания особенно распространены среди евреев-ашкенази, среди которых они встречаются в десятки раз чаще, чем в других популяциях европейского или азиатского происхождения. Наличие специфических мажорных мутаций для всех трех заболеваний у 70 - 95% всех пациентов еврейского происхождения скорее всего нельзя обьяснить только эффектом основателя. Генетический дрейф, селективное преимущество гетерозигот, характер миграции, социальные и религиозные особенности, обусловливающие ассортативность образования супружеских пар - вот те факторы, которые, по всей видимости, лежат в основе этих различий. В этой связи интересно отметить, что среди пациентов других национальностей мажорные мутации гомологичных генов, как правило, иные, чем у евреев-ашкенази. Так, болезнь Ниманна-Пика типа B часто встречается среди жителей стран, расположенных в западной части Северной Африки. Однако, в 80% случаев заболевание связано с делецией R608 в SMPD1-гене, которая не является мажорной среди евреев-ашкенази.На примере лизосомных болезней могут быть хорошо прослежены корреляции между типами мутаций и клиническими особенностями заболеваний. Выше уже упоминалось об аллельных вариантах гена IDUA, приводящих либо к синдрому Гурлера, либо к синдрому Шейе. Разные миссенс мутации в гене NAGA приводят к болезни Шиндлера или к болезни Канзаки (Табл.10.1.). Важное значение для анализа молекулярных основ патогенеза заболеваний имеют специфические мутации с поздней фенотипической манифестацией (так называемые взрослые формы).Такие мутации обнаружены в соответствующих генах при болезнях Тея-Сакса и галактосиалидозе. Очень интересен случай различного фенотипического проявления на разном расовом генетческом фоне одной и той же мутации - мажорной 16-кб делеции, обнаруживаемой у 27% пациентов с детской формой болезни Зандхоффа (McInnes et al.,1992; Sidransky et al.,1994). В частности, в одной франко-канадской семье эта мутация в компаунде с миссенс мутацией P417L, описанной впервые в Японии у пациента с подростковой формой заболевания, провлялась как взрослая форма с очень мягким течением заболевания.В ряде случаев удалось проанализировать молекулярную природу совместного влияния двух аллелей одного гена на фенотип. К примеру, при некоторых форм метахроматической лейкодистрофии трудность молекулярной диагностики заболевания связана с существованем, так называемого, псевдодефицитного аллеля ARSA-гена. Этот полиморфный аллель встречается в популяциях с достаточно высокой частотой, так что гомозиготы по нему состаляют 1 - 2% всего населения. Оказалось, что псевдодефицитный аллель представляет из себя сочетание двух мутаций в цис-положении. Одна из них - 3'-концевая ругуляторная мутация в первом сайте после стоп кодона, изменяет сигнал полиаденилирования. Другая - миссенс мутация в 6-м экзоне, приводит к потере сайта N-гликозилирования. Попутно отметим, что для гена ARSA (также как и для IDUA-гена) обнаружен альтернативный сплайсинг, в результате которого в фиб-робластах и печени образуются 2 различных типа мРНК, размером 2.1 кб и 3.9 кб, соответственно. У гомозигот по псевдодефицитному аллелю в фибробластах отсутствует 2.1 кб мРНК,при этом клинических проявлений заболеваний не наблюдается.Однако, при наличии S96F мутации в ARSA-гене на фоне псевдо-дефицитного аллеля развивается тяжелая форма лейкодистрофии.В заключении раздела кратко рассмотрим состояние проблемы генокоррекции лизосомных заболеваний. В литературе отсутствуют сообщения об успешных клинических испытаниях программ генотерапевтического лечения этих заболеваний, однако, по крайней мере, для некоторых лизосомных болезней такие программы уже разработаны и утверждены . Имеются сведения о положительных результатах таких исследований на культурах мутантных клеток и на модельных животных. Так, в опытах in vitro был осуществлен успешный ретровирусный перенос нормальной кДНК гена GBA в культурах мутантных фибробластов (Sorge et al.,1987) и в культурах клеток крови пациентов с болезнью Гоше (Fink et al., 1990),в результате чего была достигнута коррекция глюкоцереброзидазной активности. Такая же коррекция метаболическоих дефектов при болезни Ниманна-Пика и при синдроме Хантера была достигнута путем введения в соответствующие мутантные линии клеток нормальных кДНК генов SMPD1 и IDS соответственно. При этом активность идуронат-2-сульфатазы после ретровирусной трансдукции in vitro оказалась существенно выше нормальной и рекомбинантный фермент активно участвовал в метаболизме глюкозамногликанов. Генокоррекция первичного биохимического дефекта при мукополисахаридозе YII (синдром Слая) была получена как in vitro, путем ретровирусного переноса нормального гена GUSB в мутантные фибробласты человека, так и in vivo на собаках и мышах. При этом у больных собак нормальный белок (бета-глюкуронидаза) не только экспрессировался, но появлялся в лизосомах и восстанавливал процессинг специфических глюкозоаминогликанов (Wolf et al., 1990). Введение этого же гена (GUSB) в мутантные стволовые клетки мышей приводило к длительной экспрессии бета-глюкуронидазы, снижению лизосомального накопления в печени и мозге и частичной коррекции болезни у трансгенных животных (Wolf et al.,1992). В другом эксперименте GUBS-кДНК вводили в культивируемые мутантные фибробласты кожи мышей и затем трансдуцированные клетки имплантировали подкожно мутантным мышам. У всех животных наблюдали экспрессию введенного гена и полное исчезновение лизосомальных отложений в печени и в мозге (Sly, 1993). Полученные результаты подтверждают принципиальную возможность лечения, по крайней мере, некоторых лизосомных болезней с помощью методов генной терапии.
Раздел 3. Болезни экспансии, вызванные "динамическими" мутациями. Обнаруженный в 1991г. новый тип так называемых динамических мутаций и связанные с ними наследственные заболевания частично рассматривались нами в Главе IV. Однако их уникальность, необычный механизм экспрессии, особенности наследования, быстрый рост нозологий, обусловленных подобными нарушениями в последовательности ДНК, и, как оказалось, достаточно широкая распространенность делают целесообразным их более подробный анализ.Как упоминалось, этот тип мутаций пока найден только у человека и не зарегистрирован ни у одного вида млекопитающих или других хорошо изученных организмов (дрозофила, нематоды и пр.). Суть мутаций заключается в нарастании числа триплетных повторов, расположенных в регуляторной или в кодирующей,а значит и в транслируемой части генов. Впервые такой тип мутации был обнаружен при молекулярном анализе синдрома фрагильной (ломкой) Х-хромосомы, наследственная передача которой не подчинялась обычным менделевским законам. В дальнейшем аналогочные динамические мутации были описаны и при 7 других наследственных заболеваниях, контролируемых генами,расположенными на разных хромосомах - Таблица 10.2. Вместе с тем, все нижеперечисленные нозологии имеют ряд общих признаков, позволяющих объеденить их в одну самостоятельную группу. Прежде всего, для триплетных повторов, экспансия которых блокирует функцию гена, характерен выраженный популяционный полиморфизм, причем число аллелей может варьировать от единиц до нескольких десятков. Другой их особенностью является доминантный тип наследования, характерный как для Х-сцепленных генов, так и для генов, находящихся на аутосомах. Особенностью практически всех болезней "экспансии" является также эффект антиципации (ожидания), смысл которого заключается в нарастании тяжести симптомов заболевания в последующих поколениях, что, как оказалось, является результатом накопления ("экспансии") исходного числа триплетов после того как их количество возрстает больше нормального. Характерными для этих нозологий являются и особенности их передачи по-томству: для некоторых заболеваний типична передача по материнской (Fra-X, миотоническая дистрофия), а для других преимущественно по отцовской линии (хорея Гентингтона).Практически для всех "динамических" мутаций характерно поражение головного мозга и особенно подкорковых структур, причем тяжесть заболевания и его начало четко коррелируют с числом повторов. Молекулярный анализ этих генов позволяет предполагать определенное сходство механизма экспансии триплетов, которая, по всей вероятности, происходит в митозе,затрагивает чаще аллели с начально большим числом повторов,при этом нередко сигналом экспансии является утрата негомологичного триплета, в норме разделяюего цепочку монотонных повторов. Вместе с тем, патогенетические механизмы проявления мутаций экспансии принципиально различны. В случае раз-личных вариантов FRAX мутаций наблюдается блок экспрессии соответствующих генов вследствие стабильного метилирования области CpG островка в промоторной части генов. При миотонической дистрофии нарушение экспрессии, по-видимому связано с ошибками взаимодествия транскрибируемой нити ДНК с нуклеосомами. В случае остальных сугубо нейродегенеративных заболеваний (хорея Гентингтона, спинально-бульбарная мышечная атрофия и др.) экспрессия гена не нарушена, однако, образующийся белковый продукт с необычно длинной полиглутаминовой цепочкой каким-то образом нарушает процессы нормального метаболизма нервных клеток подкорковых отделов мозга.Таким образом, причиной повреждающего действия одних"динамических" мутаций является блок генной экспрессии, то есть потеря функции (loss-of-function mutation), тогда как другие мутации того же типа, связанные с нейродегенративными заболеваниями, ведут к появлению белковых продуктов с аномальными функциями ( мутации типа -gain-of-function). Интересно отметить, что помимо динамических мутаций для каждого названного гена обнаружены единичные точковые мутации, число которых крайне невелико. Для каждой болезни "экспансии" разработан свой вариант диагностики, основанный на ПЦР. Амплификация области триплетных повторов и дальнейший электрофоретический анализ синтезированных продуктов позволяет определить число повторов, то есть провести генотипирование аллелей. Вместе с тем, при числе повторов более 200, амплификация с помощью ПЦР обычно не достигается. В этих случаях размеры участка повторов определяются методом блот-гибридизации с соответствующими ДНК зондами. Например, используются зонды StB12.3, Ох1.9 или Ох 0.55 в случае синдрома FRAXA;зонд cDNA25 в случае миотонической дистрофии.
Подробней с этой интересной группой заболеваний можно ознакомиться в ряде обзоров (Willems, 1994; Баранов и др.,1993; Иллариошкин и др., 1995). Таблица 10.2. Болезни экспансии, вызванные динамическими мутациями. -----------------------T-----------T-------T-----T------T------T----------------------¬ Болезнь, номер по ¦ Ген, лока-¦Триплет¦Норма¦Прему-¦Мута- ¦Литература ¦ МакКьюсику (MIM) ¦ лизация ¦ ¦ ¦тация ¦ция ¦ ¦ -----------------------+-----------+-------+-----+------+------+----------------------+ Синдром ломкой X-хро- ¦FMR1, FRAXA¦(CGG)n ¦5-50 ¦50-90 ¦>90 ¦Rousseau et al.,1991 ¦ мосомы; 309550¦Xq27.3 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦Hirst et al.,1991 ¦ -----------------------+-----------+-------+-----+------+------+----------------------+ Синдром ломкой X-хро- ¦FMR2, FRAXE¦(CGG)n ¦6-25 ¦25-200¦>200 ¦Knight et al.,1994 ¦ мосомы тип 2; 309548¦Xq27.3 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ -----------------------+-----------+-------+-----+------+------+----------------------+ Миотоническая дистро- ¦DM, MP-1 ¦(CTG)n ¦5-10 ¦19-30 ¦>30 ¦Shelbourne et al.,1992¦ фия; 160900¦19q13.3 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦Wieringa,1994 ¦ -----------------------+-----------+-------+-----+------+------+----------------------+ Хорея Гентингтона; ¦HD, IT-15 ¦(CAG)n ¦6-37 ¦ ¦37-121¦Huntington's Dis. ¦ 143100¦4p16.3 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦Collab.Res.Group,1993 ¦ -----------------------+-----------+-------+-----+------+------+----------------------+ Спинально-мозжечковая ¦SCA1 ¦(CAG)n ¦6-39 ¦ ¦41-81 ¦Orr et al.,1993 ¦ атаксия тип 1; 164400¦6p21.3 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦Chung et al.,1993 ¦ -----------------------+-----------+-------+-----+------+------+----------------------+ Денто-рубральная-палли-¦DRPLA, B-37¦(CAG)n ¦7-34 ¦ ¦54-75 ¦ Koide et al.,1994 ¦ до-люисовая дегенерация¦12pter-p12 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ Nagafuchi et al.,1994¦ 125370¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ -----------------------+-----------+-------+-----+------+------+----------------------+ Спинально-бульбарная ¦AR ¦(CAG)n ¦12-33¦ ¦40-62 ¦La Spada et al.,1991 ¦ мышечная атрофия;313200¦Xq11-q12 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ -----------------------+-----------+-------+-----+------+------+----------------------+ Спинально-мозжечковая ¦MJD ¦(CAG)n ¦13-36¦ ¦68-79 ¦Kawaguchi et al.,1994 ¦ дегенерация Мачадо- ¦14q32.1 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ Джозефа ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
-----------------------+-----------+-------+-----+------+------+----------------------- Раздел 10.4. Моногенные наследственные болезни, диагностируемые молекулярными методами в России. Сводка, представленная в таблице 10.3, составлена на основании анализа работ основных отечественных лабораторий и публикаций, связанных с проблемой молекулярной диагностики наследственных болезней. Сводка не является исчерпывающей и включает преимущественно те заболевания для которых возможна или уже проводится диагностика на внутриутробных стадиях развития (Баранов, 1994).
Таблица 10.3. Моногенные наследственные болезни, диагностируемые молекулярными методами и доступные пренатальной диагностике в России. -----T-----------------------------------T------------------¬ ¦N пп¦ Болезни ¦Медицинские центры¦ +----+-----------------------------------+------------------+ ¦1 ¦ Муковисцидоз ¦ИАГ;ИЭМ РЦМГ; ТИМГ¦ ¦2 ¦ Миодистрофия Дюшенна/Беккера ¦ИАГ;РЦМГ; ТИМГ ¦ ¦3 ¦ Гемофилия А ¦ИАГ; ГНЦ; ¦ ¦4 ¦ Гемофилия В ¦ИАГ; ГНЦ ¦ ¦5 ¦ Фенилкетонурия ¦ИАГ; ГНЦ;ПМА;РЦМГ ¦ ¦6 ¦ Синдром ломкой Х-хромосомы ¦ИАГ; ¦ ¦7 ¦ Миотоническая дистрофия ¦ИАГ ¦ ¦8 ¦ Болезнь Виллебранда ¦ИАГ;ГНЦ ¦ ¦9 ¦ Хорея Гентингтона ¦ИАГ; РЦМГ; НИИН ¦ ¦10 ¦ Болезнь Леш-Нихана ¦ИАГ ¦ ¦11 ¦ Спинально-бульбарная мышечная ¦ИАГ; НИИН ¦ ¦ ¦ атрофия ¦ ¦ ¦12 ¦ Гепато-лентикулярная дегенерация ¦РЦМГ; ИАГ ¦ ¦13 ¦ Болезнь Хантера ¦ИАГ ¦ ¦14 ¦ Адрено-генитальный синдром ¦ЦОЗМиР; РЦМГ ¦ ¦15 ¦ Атаксия Фридрейха ¦ГНЦ ¦ ¦16 ¦ в- Талассемия ¦ГНЦ; ПМА ¦ ¦17 ¦ Болезнь Верднига-Гоффмана ¦РЦМГ ¦ ¦18 ¦ Дефицит альфа-1-антитрипсина ¦ИЭМ ¦ ¦19 ¦ Семейная гиперхолестеринемия ¦ИЭМ; ПМА ¦ ¦20 ¦ Предрасположенность к инсулин- ¦ПМА ¦ ¦ ¦ зависимому диабету ¦ ¦ ¦21 ¦ Дефицит ацил-СоА дегидрогеназы ¦ПМА ¦ L----+-----------------------------------+------------------- ИАГ - Институт Акушерства и Гинекологии РАМН, Санкт Петербург ИЭМ - Институт Экспериментальной Медицины РАМН, Санкт Петербург ПМА - Педиатрическая Медицинская Академия, Санкт Петербург РЦМГ- Российский Центр Медцинской Генетики РАМН, Москва ГНЦ - Гематалогический Научный Центр МЗ РФ, Москва ТИМГ- Томский Институт Медицинской Генетики, Томск НИИН- Научно-исследовательский Институт Неврологии РАМН, Москва ЦОЗМиР- Центр Охраны Здоровья Матери и Ребенка, Москва Молекулярные характеристики некоторых из приведенных в таблице заболеваний уже были рассмотрены в разделах 10.1 и 10.2. Отдельные аспекты, касающиеся идентификации соответстующих генов, их картирования, клонирования и сканирования мутаций уже упоминались в качестве примеров при изложении соответствующих вводных глав монографии (см.Главы II,III, IV, V). В этой части нам представляется целесообразным суммировать эти разрозненные сведения и охарактеризовать те наиболее частые, социально значимые моногенные заболевания,в отношении которых у нас накоплен достаточно большой собственный опыт молекулярных исследований. Список этих нозологий, их частоты и основные молекулярные характеристики приведены в Таблице 10.4. Таблица 10.4. Основные молекулярно-генетические характеристики моногенных болезней, диагностируемых в Лаборатории пренатальной диагностики ИАГ РАМН, Санкт-Петербург.(примечания в конце таблицы те же, что в Табл.10.1). Синдромы 1), номер по¦Встречаемость,¦Типы и количество му- ¦Литература ¦ МакКьюсику; хромосом-¦белок, ¦таций 4), мажорные мута¦(локализация и структура¦ ная локализация; ген ¦размеры в ами-¦ции -в скобках указаны ¦генов,клонирование кДНК,¦ 2),размеры 3), экзоны¦нокислотах ¦частоты аллелей у б-ных¦идентификация мутаций). ¦ -------------------------------------------------------------------------------------- Муковисцидоз; врожден¦1:2500- Европа¦Точковые-преобладающие;¦Rommens et al., 1989 ¦ ное отсутствие vas de¦1:3800 -Россия¦небольшие дел.и дупл.; ¦Kerem et al., 1989 ¦ ferens, ¦CF-трансмемб- ¦Мажорные:delF508-30-90%¦Riordan et al., 1989 ¦ 219700; 7q31.2 ¦ранный регуля-¦W1272X-2-33%,3732delA -¦Горбунова и др., 1991 ¦ CFTR.500; 260кб,27экз¦тор 1480¦4%,394delTT,G542X,R117H¦Баранов и др., 1995 ¦ ---------------------------------------------------------------------------------------------- Миопатия Дюшенна; Бек¦1:3500 мальчи-¦Делеции протяженные - ¦Kunkel et al.,1985 ¦ кера;кардиомиопатия ¦ков ¦60%; дупликации - 6-7%;¦Kunkel et al.,1986 ¦ делеционная, ¦ ¦делеции нескольких н. -¦Koenig et al.,1988 ¦ 310200; Xp21.2 ¦Дистрофин ¦7; нонсенс - 9; сплайс.¦Roberts et al.,1992a;b ¦ DMD.21; 2000кб,73экз ¦ 3685¦-3; миссенс -1; инс.-1 ¦Ahn et al.,1993 ¦ ------------------------------------------------------------------------------------- Гемофилия А, ¦1:6500 мальч. ¦Делеции экз. - 31; мис-¦Wood et al, 1984 ¦ фактора YIII деф.; ¦Фактор YIII ¦сенс - 21; нонсенс -8 ¦Toole et al., 1984 ¦ 306700; Xq28 ¦свертываемости¦Мажорные: инверсия 26 -¦Higuchi et al.,1991 ¦ F8C.66; 186 кб, 26экз¦крови 2351¦25 экзонов - 45% семей ¦Naylor et al., 1993 ¦ -------------------------------------------------------------------------------------- Гемофилия B, Кристма-¦1:20000 мальч.¦Миссенс и нонсенс более¦Kurachi et al., 1982 ¦ са, фактора IX деф.; ¦Фактор IX ¦60%; сплайс.-10%; регу-¦Jagadeeswaran et al,1984¦ 306900, Xq27.1-q27.2 ¦свертываемости¦лят.- 3.5%; делеции -до¦Green et al., 1991 ¦ F9.400; 34 кб, 8 экз ¦крови 461¦40% при тяжелых формах ¦Giannelli et al., 1993 ¦ -------------------------------------------------------------------------------------- фон Виллебранда бо- ¦1: 5 - 20 000 ¦Тип I и II-миссенс; Ма-¦Lynch et al., 1985 ¦ лезнь, ¦Фактор Y111R ¦жорные:R543W,R545C,V553¦Bonthorn et al., 1986 ¦ 193400; 12pter-p12 ¦свертываемости¦M,R578Q.Тип III-делеции¦Cooney et al., 1991 ¦ F8VWF.22; 178кб,52экз¦крови ¦1 н.в 28экз; нонсенс -4¦Randi et al., 1991 ¦ --------------------------------------------------------------------------------------- Фенилкетонурия; гипер¦1 : 10 -15 000¦Миссенс -62%; нонсенс -¦Guttler, Woo, 1986 ¦ фенилаланинемия, мяг-¦Фенилаланин- ¦13%;сплайс.-13%;делеций¦DiLella et al., 1986 ¦ кая, 261600; 12q24.1¦гидроксилаза ¦9%; Мажорные: IVS12+1, ¦Cotton, 1990 ¦ PAH.70; 90 кб, 13 экз¦ 452¦R408W,R261Q,R158Q,IVS10¦Барановская и др. 1995 ¦ -------------------------------------------------------------------------------------- Леш-Нихана синдром; ¦ ¦Миссенс -53%;небольшие ¦Jolly et al., 1983 ¦ HPRT-родств. подагра,¦Гипоксантин- ¦структ.перестройки -40%¦Edwards et al., 1990 ¦ 308000; Xq26-q27.2 ¦фосфорибозил ¦сплайс. -5%; нонсенс-2%¦Rossiter et al., 1991 ¦ HPRT.100; 44 кб,9 экз¦трансфераза217¦Мажорные: R170TER (15%)¦Sculley et al., 1992 ¦ - Гепато-лентикулярная ¦ ¦Миссенс -15; делеции/ ¦Bull et al., 1993 ¦ дегенерация Вильсона-¦ ¦инсерция -14;Мажорные -¦Petruchin et al., 1993 ¦ Коновалова, ¦Медь-транспор-¦H714Q - 31% в Америке, ¦Tanzi et al., 1993 ¦
277900; 13q14.3-q21.1¦тирующая АТФа ¦22% в России; 1 н. дел.¦Thomas et al., 1995 ¦ ATP7B.34; ¦за P типа 1434¦H1070Gl-28%;Gl1267L 10%¦ ¦ -------------------------------------------------------------------------------------- Многим из приведенных заболеваний посвящены обстоятельные обзоры, руководства и монографии, включающие наряду с клиническими данными специальные разделы, посвященные молекулярной природе патологического процесса, характе-ристике гена, его мутаций, их фенотипических проявлений, а так же последним достижениям и перспективам лечения, включая генную терапию. Некоторые из этих публикаций уже были упомянуты в предыдущих разделах книги, другие будут процитированы в соответствующих подразделах этой главы. Следует так же упомянуть, что все приведенные нозологии были первыми моногенными болезнями, которые были исследованы молекулярными методами в нашей стране и для которых, в итоге , были разработаны и оптимизированы с учетом этнических и национальных особенностей аллельного полиморфизма, частот и паттерна мутаций оптимальные схемы молекулярной обследования семей высокого риска с целью пренатальной диагностики и выявления гетерозиготного носительства. Практически все эти исследования проводились в рамках основных научных программ ГКНТ "Геном Человека" и "Приоритетные направления генетики". Обзор отечественных работ по молекулярной диагностике наследственных болезней представлен в ряде научных сводок (Баранов,1992; 1994; Baranov, 1993; Баранов и др., 1994; Евграфов,1993).
4.1 Муковисцидоз. Муковисцидоз (кистозный фиброз поджелудочной железы) -самое распространенное моногенное наследственное заболевание у представителей белой расы. Это первая "генная" болезнь,молекулярные основы которой определены методами позиционного клонирования без использования каких-либо данных о структурных перестройках в области локализации предполагаемого гена.Напомним, что обнаружение пациентов с транслокациями или крупными делециями, затрагивающими исследуемый ген, значительно облегчает его картирование и идентификацию, как это было при миопатии Дюшенна, ретинобластоме или хроническом грануломатозе. В области локализации гена муковисцидоза хромосомные перестройки, практически, отсутствуют. Подробно об истории открытия гена, его структуре, клонировании, анализе функций, идентификации мутаций можно ознакомиться в следующих отечественных работах (Гембицкая, Баранов, 1991; Баранов, Гинтер, 1994). Белковый продукт гена -трансмембранный регуляторный белок муковисцидоза -ТРБМ (cystic fibrosis transmembrane regulator -CFTR), как оказалось, является белком хлорных каналов, регулирующих обмен ионов хлора через апикальные мемб-раны всех эпителиальных клеток организма. В зависимости от типа мутаций, их локализации функция гена ТРБМ при муковисцидозе может быть полностью или частично нарушенной.К началу 1995г. в гене ТРБМ идентифицировано более 500 мутаций, несколько делеций и дупликаций. Наболее распространенной у жителей Западной Европы и Северной Америки является мутация delF508, приводящая к отстутсвию фенилаланина в 508 положении белка ЕРМБ. В этих странах частота delF508 находится в пределах 70-85%. В Европе частота мутации обнаруживает определенный градиент распространения с севера на юг и с запада на восток, достигая 85% в Дании она уменьшается до 50% в Италии и до 20-30% в Турции. В Европейской части России она составляет около 50% всех мутантных (CF) хро-мосом. У евреев-ашкенази доминируюшей по частоте является мутация W1282X (33%).Биохимический анализ клеток пациентов, больных муковисцидозом, позволил выяснить фенотипические особенности экспрессии мутантных аллелей гена ТРБМ, установить определенный градиент патологических нарушений на мембранном, клеточном и организменном уровнях в зависимости от типа мутации, её локализации и структуры аномального белкового продукта (Баранов, Гинтер,1994). Так, было установлено, что некоторые CFTR- мутации, в том числе и delF508, не препятствуя трансляции, нарушают процессинг белка так, что он не достигает апикальной мембраны и не создает хлорный поток. Этим объясняется тяжелая клиника муковисцидоза при подобных нарушениях (Sheppard et al.,1993). Другие мутации ( R117H, R334W и R347P), выявленные при более мягких формах заболевания, не затрагивают процессинга белка, хлорный канал формируется, но функционирует менее эффективно, чем в норме. Сопоставление процессинга, локализации и функционирования белка в 3-х линиях L-клеток, трансдуцированных нормальным CFTR-геном и двумя его аллельными вариантами, показало, что дефект одной из мажорных мутаций - G551D, связан с частичной инактивацией функции хлорного канала, в то время как delF508, как оказалось, обладает комбинированным эффектом - нарушает локализацию и стабильность белка и снижает эффективность его функционирования в качестве хлорого канала (Yang et al., 1993). Интересно, что мутация R117H в гомозиготном состоянии, чаще в компаунде с другими аллелями, в том числе с delF508, обнаруживается у пациентов с врожденным отсутствием семявыводящих канальцев (vas deferens). При этом клиника муковисцидоза у таких пациентов, как правило, отсутствует или очень стерта. Это еще один из примеров фенотипического разнообразия,обусловленного аллельными сериями.В настоящее время в России доступны идентификации по наличию известных мутаций около 65% больных муковисцидозом (Иващенко,1992; Потапова,1994). Диагностическая ценность основных мажорных мутаций в порядке убывания их частоты следующая delF508 (50%), 3732delA (4,3%), W1282X (2,4%),394delTT (2,1%); G542X (2,0%) (Иващенко, 1992). Cогласно нашим данным (Баранов, 1994) молекулярная диагностика муковисцидоза прямыми методами возможна примерно в 55 -60% семей. В случае непрямой диагностики используются полиморфные сайты локусов ДНК, расположенные в непосредственной близости(IRP, D7S8, D7S23, MET) или внутри самого гена CFTR - минисателлитные последовательности в интронах 6, 8, 17b гена СFTR (Zielenski et al., 1991; Morral et al., 1991; Chehab et al., 1991; Агбангла и др., 1992; Potapova et al., 1994). При отсутствии мажорных мутаций и информативности по полиморфным сайтам молекулярные исследования могут быть дополнены биохимическим анализом амниотической жидкости на содержание ферментов микроворсинок кишечника плода (Гобунова и др.,1989;Баранов и др.,1991). Методами направленного мутагенеза (gene targeting см. Главу VIII) в различных лаборатория США и Великобритании осуществлено успешное конструирование трансгенных моделей муковисцидоза на мышах (Clarke, et al., 1992; Colledge et al., 1992; Dorin et al., 1992; Snouwaert et al., 1992). Вы-яснены признаки сходства и некоторые межвидовые различия проявления мутации гена CFTR у мышей и человека. Показано,что различные мутации этого гена по-разному реализуются в фенотипе СFTR дефицитных мышей. Так, в одной из трансгенных линий отмечено преимущественное поржаение легких, у других -поджелудочной железы и кишечника. В одной мутантной линии наблюдается гибель большого числа зародышей от причин, сходных с мекониальным илеусом. Таким образом, эти линии представляют собой идеальные модели для исследования молекулярных основ патогенеза муковисцидоза, а также для разработки и испытания терапевтических мероприятий, включая генотерапию. Как уже отмечалось в предыдущей главе, программы генотерапии муковисцидоза реализуются по крайней мере в 7 центрах США и двух центрах Западной Европы (Великобритания и Франция). Уже успешно осуществлены не только апробации генноинженерных конструкций на мутантных культурах клеток и модельных животных, но начаты и успешно проводятся клинические испытания генотерапевтического лечения муковисцидоза на 70 пациентах. Исследования по генотерапии муковисцидоза, начатые в нашей стране пока проводятся на уровне клеточных культур.
4.2 Миодистрофия Дюшенна. Миодистрофия Дюшенна - сцепленная с полом мышечная дистрофия; выделяют две клинические формы: тяжелую - миодистрофию Дюшенна (МД) и гораздо более мягкую – миодистрофию Беккера (МБ). Ген миодистрофии Дюшенна (DMD) - один из самых крупных известных генов человека, кодирует белок дистрофин,входящий в состав сарколеммы мышечного волокна. При МД дистрофин либо полностью отсутствует, либо деградирует вскоре после синтеза. При форме Беккера, как правило, дистрофин присутствует, хотя и в измененном, чаще всего в укороченном состоянии.
В соответствии с современными представлениями (Ahn, Kunkel, 1993) огромный DMD-ген находится под контролем сложной системы регуляции транскрипции и сплайсинга. По крайней мере, 5 независимых промоторов осуществляют альтернативную специфическую транскрипцию первых экзонов в разных тканях и на разных стадиях эмбрионального развития. 3 промотора экспрессируют полноразмерную молекулу дистрофина, в то время как 2 осущесвляют экспрессию последних доменов взаимоисключающим способом. Высоко консервативные последовательности 6-и экзонов, кодирующих C-конец белка, альтернативно сплайсируются, образуя несколько структурно различающихся форм дистрофина, осуществляющих различные функции. Так, идентифицирована 6.5-кб мРНК, транскрибируемая с DMD-гена и являющееся, по-видимому, его основным продуктом в не-мышечных тканях, включая мозг (Bar et al.,.1990). Соответствующий белок значительно отличается от дистрофина и его уровень в некоторых не-мышечных тканях сопоставим с количеством дистрофина в мышцах. Описан также 4.8-кб транскрипт того же локуса, экспрессирующийся во многих типах тканей, но особенно в Шванновских клетках проводящей нервной системы, где сам дистрофин отсутствует (Blake et al., 1992). Этот белок получил название апо-дистрофин-1. Клонирован и секвенирован еще один 2.2-кб транскрипт DMD-гена, кодирующий аподистрофин-3, экспрессирующийся в позднем эмбриогенезе (Tinsley et al., 1993). В 60% случаев в гене DMD у больных мальчиков обнаруживаются протяженные делеции, захватывающие от одного до нескольких соседних экзонов и сосредоточеные, обычно, в двух "горячих" районах - в области 5'-конца гена (экзоны 6-19) и в 3'- конце (экзоны 40-53), при этом 30% делеций локализованы в проксимальной части гена и 70% - в дистальной. Проксимальные делеции возникают, по-видимому, в раннем эмбриогенезе и имеют больше шансов стать "семейными" мутациями.Дистальные делеции возникают позднее и чаще встречаются, как изолированные случаи. Считается, что в спорадических случаях повторный риск рождения больного ребенка при проксимальной делеции составляет 30%, тогда как при дистальной - только 4% (Passos-Bueno et al., 1992). Отмечены популяционные особенности паттерна делеций в разных европейских популяциях, а также в популяциях России и стран СНГ (Baranov et al., 1993). У некоторых пациентов делетирован не только весь ген, но достаточно протяженные соседние области. Очень часто концы делеций локализованы в центральной части дистрофинового гена. Так в интроне 44,протяженностью 160-180 кб, расположено около 30% точек разрыва всех делеций. Показано, что проксимальный конец одной из делеций в интроне 43 расположен внутри транспозон-подобного элемента, принадлежащего THE-1 семейству ретротранспозонов (Pizzuti et al.,1992). Описан еще один пациент, у которого делеция оканчивается в THE-1 элементе. Эти элементы,размером 2.3 кб, фланкированные 350-нуклеотидными LTR, повторены около 10 000 раз в геноме человека. Гипотеза нестабильности DMD-гена, вызванная присутствием транспозон-подобного элемента, привлекается также для обьяснения нескольких случаев обнаружения различий в молекулярном дефекте у пациентов, принадлежащих одной и той же родословной, то есть имеющих мутацию общего происхождения (Miciak et al.,1992). В 2-х случаях дупликаций из 8, для которых был проведен сиквенс концевых участков, показано присутствие Alu-элементов.В остальных 6 случаях рекомбинация осуществлялась между не-гомологичными последовательностями (Hu, Worton, 1992).Прямой корреляции между тяжестью течения заболевания и протяженностью делеции не отмечается, но различия между формами Дюшенна и Беккера, в общем случае, связаны с наличием или отсутствием сдвига рамки считывания. Ген дистрофина может быть вовлечен также в другие структурные перестройки -дупликации, транслокации. Так, примерно 5% мутаций гена дистрофина составляют дупликации и около 35%-точечные мутации, преимущественно, микроделеции (от 1 до нескольких нуклеотидов), а также нонсенс мутации. Относительно высокий процент нонсенс мутаций в гене дистрофина связывают с присутствием большого количества глютаминовых триплетов, мутации в котором часто приводят к образованию стоп-кодона.Крайне редки миссенс мутации. Считается, что в 30% семей с МД и МБ мутации спонтанного происхождения и возникают преимущественно в оогенезе, в остальных семьях это наследственные формы. Разработаны очень эффективные методы диагностики делеций в DMD-гене, основанные на мультиплексной ПЦР. Одновременное тестирование 18 экзонов + промоторной части гена позволяет выявить до 98% всех крупных делеций гена (Baranov et al., 1993). Для обнаружения гетерозиготного носительства делеций используется метод RT PCR, то есть изоляция эктопической DMD-мРНК из клеток крови, обратная транскрипция, амплификация кДНК, рестрикционный анализ и секвенирование (Roberts et al.,1991). Для этой же цели применяется метод иммунодетекции мутантного белка в белковом лизате мышц и на гистологических срезах биоптатов мышц (Arahata et al.,1989). При отсутствии идентифицируемой делеции применяют косвенный метод ДНК-диагностики с использованием внутриген-ных полиморфных сайтов: pERT87-8/Taq1; pERT87-15/BamH1;124/Pst1;16intron/ Taq1, и аллельных вариантов динуклеотидных СА повторов в интронах 49 и 50 - STR-49; STR-50 (Малышева и др., 1991; 1992; Евграфов, Макаров, 1987; Евграфов и др., 1990). Серьезную проблему для диагностики гетерозиготного носительства и, следовательно, для медико-генетического консультирования предствляют случаи, так называемого, гонадного мозаицизма - присутствие в соматических клетках гонад женщины-неносительницы мутаций гена дистрофина, что, в свою очередь, приводит к появлению нескольких генераций (клонов)половых клеток (ооцитов) с мутанынм и нормальным генами дистрофина. Предполагается, что такие мутации могут возникать еще на уровне первичных половых клеток, то есть на ранних стадиях внутриутробного развития будущей матери. По ориентировочным оценкам примерно 6-7% всех спорадических случаев являются следствием гонадного мозаицизма у матери. Оценить величину аберрантного клона ооцитов практически не представляется возможным. В связи с этим прогноз в отношении здоровья следующего ребенка в семьях, в которых у матери больного МД не удается определить гетерозиготное носительство, весьма затруднен. Эмпирически определено, что при наличии спорадического случая рождения ребенка с МД и при отсутствии прямых молекулярных доказательств гетерозиготного носительства мутации гена дистрофина у матери риск повторного рождения больного ребенка может достигать 14% (Essen et al.,1992).
У многих пациентов с миопатией Дюшенна при иммуногистохимическом окрашивании мышц обнаруживаются редкие дистрофин-положительные волокна. Однако, при использовании антител с антигенными детерминантами, кодируемыми делетированным участком гена, окрашивания не происходит и это позволяет от-вергнуть гипотезу соматического мозаицизма. Наиболее вероятный механизм такого явления - возникновение второй соматической делеции в мышечных клетках, устраняющей сдвиг рамки считывания, вызванный основной делецией. В результате мутантный ген может транскрибироваться с образованием стабильного, хотя и аномального дистрофина (Klein et al.,1992).Имеется модельная линия мышей с миодистрофией Дюшенна -mdx. Эта модель была получена в результате отбора мутации,спонтанно возникшей в C57BL/10 линии (Bulfield et al.,1984). В мышцах и в мозгу у мышей этой линии обнаруживается резко сниженное количество Dmd-мРНК, однако дистрофин полностью отсутствует. Несмотря на это, никаких видимых клинических аномалий у mdx-мышей не наблюдаются. Идентифицирована нонсенс мутация в mdx-гене, в результате которой у мышей транслируется лишь 27% дистрофинового полипептида. Обнаружена также сплайсинговая мутация, приводящая к вырезанию экзона 7 DMD-гена у собак (Sharp et al., 1992).В серии экспериментов на mdx-мышах доказана принципиальная возможность генокоррекции МД. Появление дистрофина человека в сарколемме мышечных волокон mdx-мышей наблюдали после введения ретровирусных или аденовирусных генноинженерных конструкций, содержащих полноразмерную кДНК гена дистрофина (14 кб) или его делетированную, но функционально активную форму, так называемый мини-ген (6.3 кб) (Wells et al.,1992; Cox et al., 1993; Aсsadi et al., 1995). После внутри-венного введения фрагментов Dmd-гена в составе рекомбинантного аденовируса наблюдали длительное присутствие экзогенной ДНК в скелетных и сердечных мышцах животных (Srataford-Perricaudet et al., 1992). Несмотря на эти очевидные успехи, проблема генноинженерной коррекции МД еще далека от своего решения. До сих пор ведутся оживленные дебаты исследователей о перспективности генной терапии МД по сравнению с клеточной терапией (пересадка здоровых эмбриональных миобластов). Пока не утверждена ни одна программы клинических испытаний генотерапевтического подхода МД (см.Главу IX). Основная сложность проблемы генокоррекции - необходимость обеспечения системы эффективной доставки гена дистрофина в миофибриллы не только скелетных мышц, но, что особенно важно - в мышцы сердца и диафрагмы. В 1995г. Исследования по генотерапии МД начаты в рамках программы Геном человека и в нашей стране.
4.3 Гемофилия А. Гемофилия А - сцепленное с полом заболевание, вызванное наследственным дефектом фактора VIII, важнейшего звена в системе свертывания крови (cм. Табл. 10.4). Комплекс фактора YIII с молекулярным весом более 1 миллиона состоит из 2-х компонентов. Главный компонент - YIIIC, кодируется геном F8C, локализованным в X-хромосоме. С YIIIC нековалентно связан фактор Виллебранда - YIIIR, кодирующийся аутосомным геном. Фактор Виллебранда стабилизирует фактор VIII и регулирует его активность. Ген F8C - одним из очень крупных генов человека; содержит 26 экзонов (размером от 69 до 3106 нуклеотидов). Общая длина интронов соствляет 177 кб; около 20% этой ДНК приходится на интрон 22 (32.4 кб). мРНК гена F8С размером 9 009 нуклеотидов включает 5'нетранслируемую последовательность (150 п.о.), 3'нетранслируемую последовательность (1 806 п.о.) и кодирующий фрагмент (7053 п.о.). Внутри гена F8 в интроне 22 локализовано еще два других структурных гена неизвестной природы - F8А и F8В, что было обнаружено методами молекулярный анализ. Ген F8A, целиком локализованный в интроне 22 гена F8C, не содержит интронов и транскрибируется в направлении, противоположном фактору VIII (3'-5'). Первый экзон гена F8B также расположен в интороне 22, а следующие его области распределены до экзонов 23-26; транскрибируется он в том же направлении, что и ген F8C (5'-3'). Оба гена экспрессируются во всех тканях (Levinson et al.,1990; Freije,Schlessinger, 1992; Lakich et al., 1993). Интрон 22 оказался необычным и в том отношении, что содержит CpG-ост-ровок на расстоянии около 10 кб от экзона 22 - предположительное место локализации бинаправленного промотора для генов F8A и F8B. Оказалось, что на расстоянии примерно 500 кб в 5-'направлении от гена F8 находятся еще 2 транскрибируемые копии гена F8A (Lakich et al.,1993).Во время процессинга первичного белкового продукта гена F8C от исходного пептида из 2 351 аминокислотных остатка отщепляется последовательность в 335 аминокислотных остатка. В плазме крови фактор VIII существует в виде металлозависимого гетеродимера, состоящего из С-концевой легкой цепи (80 кД) и N-концевой тяжелой цепи (200 кД). Половина всех больных с гемофилией A не имеют фактора VIII, 5%- имеют нормальное количество нефункционирующего белка и в остальных случаях ак-тивность белка сохранена, но его количество резко снижено(McGinnis et al.,1993). Изолированные случаи гемофилии A составляют 30%; 70% -семейные варианты. Показано, что мутации в гене F8 возникают в сперматогенезе в 3 - 5 раз чаще, чем в оогенезе (Rosendaal et al., 1990; Brocker-Vriends et al., 1991). Это означает,что в 80-86% спорадических случаев матери являются носителями мутации, возникшей в зародышевых клетках их отца. Кроме того, около 14% матерей, не являющихся носителями мутации,могут быть соматическими или гонадными мозаиками, так что вероятность повторного рождения больного ребенка у них также повышена.Около 10% всех идентифицированных мутаций в гене F8 являются делециями одного или нескольких смежных экзонов. Примерно 5% всех мутаций составляют короткие делеции и дупликации гена, остальные мутации - точковые замены (Antonarakis et al.,1995). Почти половина миссенс мутаций идентифицирована в домене A2. Показано, что 35% всех известных мутаций локализовано в CpG динуклеотидах, причем свыше 90% из них представляют собой C-T или G-A транзиции (Cooper,Youssoufian, 1988). Подобные мутации в кодирующих районах встречаются в 42 раза чаще, чем это можно было бы ожидать на основании случайного характера мутагенеза. Для подавляющего большинства мутаций гена F8C характерно практически полное отсутствие "горячих" точек: каждая семья высокого риска по гемофилии А имеет свою собственную мутацию. Исключение составляет группа обнаруженных сравнительно недавно протяженных инверсий интрона 22, захватывающих экзоны 1-22 и полностью блокирующих функцию гена. Такие инверсии, как оказалось, присутствуют в 45% семей с тяжелой формой гемофилии А (Lakich et a.,1993). Причиной инверсий в этой области гена является гомологичная рекомбинация между идентичными последовательностями гена F8А, расположенного в интроне 22 F8C-гена, и другими копиями этого же гена,находящимися на расстоянии 500 кб от 5'конца гена F8 (см.выше).Помимо инверсий и точечных мутаций в гене ФVIII зарегистрированы несколько случаев инсерционного мутагенеза,связанных с перемещением в геноме транспазонподобных элементов типа LINE ( см. Главу II). У двух пациентов неродственного происхождения был идентифицирован инсертированный в экзоне 14 F8C-гена длинный элемент LINE-1 (L1) (Kazazian et al.,1988). В обеих семьях это были мутации de novo. L1 последовательности представляют собой специфическое для генома человека семейство длинных, размером от 2 до 4 кб, повторяющихся элементов, распределенных по всем хромосомам и состоящее, примерно, из 100 000 копий. Было показано что оба L1 элемента, инсертированные в F8C-ген, родственны ретротранспозону, локализованному на хромосоме 22 (Dombroski et al., 1991). В третьей семье инсертированный в интроне 10 F8C-гена L1 элемент не был связан с болезнью. Все 3 L1 элемента имели открытые рамки считывания, а соответствующие реконструируемые аминокислотные последовательности были высоко идентичны друг другу с уровнем гомологии, превышающим 98%.Таким образом, были получены еще одни косвенные подтверждения существования ряда функциональных L1 элементов, кодирующих 1 или несколько белков, необходимых для их ретротранспо-зиции.Прямая диагностика протяженных инверсий в гене F8 осуществляется путем блот-гибридизации с ДНК зондом р482.6 c последующей рестрикцией эндонуклеазами Bcl1, Dra1, Nco1(Lakich et al.,1993). В остальных случаях, в силу отсутствия мажорных мутаций в гене F8C, чаще всего используют косвенные методы молекулярной диагностики. С помощью ПЦР анализируют полиморфные динуклеотидные СА-повторы экзона 13, HindIII полиморфизм в интроне 19; HbaI полиморфизм в интроне 22 и внегенный полиморфизм локуса DXS52 (St14/TaqI) (Асеев и др.,1989; Aseev et al., 1994; Сурин и др., 1990).Учитывая наличие функционально активной формы белка фактора VIII в плазме крови генноинженерые подходы в терапии этого заболевания направлены на получение в чистом виде пол-ноценного белкового продукта (заместительная терапия), либо на введение в организм больного соответствующей кДНК,обеспечивающей синтез ФVIII и его поступление в кровь. Осуществленное 10 лет назад выделение и клонирование кДНК этого гена сделало реальным оба эти подхода. Имеются сообщения о получении трансгенных животных (коз), в геном которых введен ген фактора VIII. Они могут быть использованы как продуценты полноценного белкового продукта. Генная терапия этого заболевания находится на стадии экспериментальных разработок . Успешно осуществлена трансдукция фибробластов человека in vitro с помощью ретровирусного вектора. Основная проблема в данном направлении заключается в выборе эффективного промотора и подборе клеток, в которых экспрессия гена могла быть достаточно длительной. В настоящее время найдены невирусные промоторы, обеспечивающие эффективную и длительную экспрессию гена фактора VIII in vivo. В качестве возможных клеток-мишеней используют мышечные клетки, фибробласты,гепатоциты и клетки эндотелия сосудов. В 1994г. методом направленного мутагенеза получены трансгенные модели гемофилии А на мышах. Есть все основания считать, что клинические испытания генокоррекции этого заболевания начнутся уже в ближайшем будущем.
4.4 Гемофилия B. Гемоофилия B - сцепленное с полом заболевание, вызванное наследственным дефектом фактора IX - важного компонента средней фазы внутреннего каскада свертывания крови. Белок (фактор IX) - гликопротеин, состоит из 415 аминокислотных остатков, объединенных в 8 доменов, синтезируется в виде мо-лекулы-предшественника клетками печени. В плазме крови фактор IX находится в виде гетеродимера, состоящего из 2-х полипептидных цепей - легкой (L) и тяжелой (H), ковалентно связанных между собой одним дисульфидным мостиком. Фактор IX циркулирует в виде неактивного зимогена до тех пор, пока не произойдет протеолитическое высвобождение его активирующего пептида, что позволяет ему принять конформацию активной сериновой протеазы. Его роль в свертывании крови связана с активацией фактора X посредством взаимодействий с ионами кальция, фосфолипидами мембраны и фактором VIII.Ген фактора IX транскрибируется в гепатоцитах с образованием мРНК размером 1 383 п.о. Для гена F9 характерна высокая частота возникновения мутаций - 4.1*10!6 за поколение.Также как и при гемофилии A мутации значительно чаще возникают в сперматогенезе, чем в оогенезе (Montandon et al.,1992). Считается, что вероятность получения мутации от отца в 11 раз выше, чем от матери. Это означает, что в изолированном случае вероятность гетерозиготного носительства мутации у матери составвляет более 80%. Обнаружена четкая корреляция между возрастом отца и вероятностью получения от него новой мутации в гене F9. Так, средний возраст отца в момент рождения дочери - носительницы новой мутации, составляет около 42 лет (King et al.,1992).
К 1994 г идентифицировано около 400 мутаций в гене гемофилии B. Подавляющее большинство из них замены нуклеотидов, приводящие к заменам аминокислот или к образованию стоп-кодонов. Характерно, практически, полное отсутствие вы-раженных мажорных мутаций и доминирующих областей повышенной частоты мутирования. Только одна мутация - I397T, встретилась в 7 самьях. Около 42% точечных мутаций возникает в CpG динуклеотидах (Bottema et al., 1993). Показано, что частота G-A или C-T транзиций в CpG cайтах в 24 раза выше, чем в других местах гена (Koeberl et al., 1990). Кроме того, в CpG динуклеотидах гена F9 в 7.7 раз чаще возникают трансверсии (A-T, A-C, G-T или G-C). Это обьясняется тем, что содержание (G+C) в кодирующих областях F9-гена составляет 40% (Bottema et al., 1991). В 40% случаев при тяжелых, ингибиторных формах гемофилии В у пациентов обнаруживаются делеции различной протяженности. Около 10% точковых мутаций локализовано в донорных или акцепторных сайтах сплайсинга или создают новые сайты сплайсинга внутри интронов. В одной семье разрушение гена произошло в результате инсерции Alu-элемента в экзон 5 (Vidaud et al., 1993). Описано 13 точковых мутаций в промоторной области гена F9. Именно с такими мутациями связана Лейденовская (Leyden) форма заболевания, при которой к возрасту половозрелости наступает улучшение многих клинических показателей и, в частности, исчезает кровоточащий диатез.Обьясняется это тем, что мутации в промоторной области могут приводить к переключению конститутивной экспрессии гена на стероид-гармон-зависимую, нарушая связывание гепатоцитарного ядерного фактора 4 (HNF-4), принадлежащего к суперсемейству транскрипционных факторов для рецепторов стероидных гормонов.Гемофилия B была использована как модель для выработки стратегии генетического консультирования при моногенных заболеваниях, обладающих выраженной мутационной гетерогенностью (Giannelli et al., 1992). Основой такой стратегии является составление национальных баз данных молекулярных дефектов и специфических методов их диагностики. В частности,основываясь на подобной информации, авторы провели характеристику мутаций в группе из 170 неродственных индивидуумов с гемофилией B шведского и английского происхождения и только в одном случае им не удалось идентифицировать мутацию.Молекулярная диагностика гемофилии В проводится как непрямыми так и прямыми методами. Непрямая диагностика основана на анализе методом ПЦР внутригенных полиморфных сайтов:Taq1 (в положении 11 109-11 113); инсерционного полиморфизма в интроне А (рестриктазы Hinf1 и Dde1) ; Taq1 в интроне F в положении 72. Метод ПДРФ анализа информативен только у 60-70% всех семей с гемофилией В (Aseev et al., 1994; Сурин и др., 1994). Прямая диагностика гемофилии В включает амплификацию геномных фрагментов гена фактора IX с последующей детекцией ошибок комплементации методом mismatch detection (см.Главу IV) и прямое секвенирование продуктов амплификации (Montadont et al.1990).Сравнительно небольшие размеры гена, присутствие белкового генопродукта в сыворотке крови и наличие естественных биологических моделей способствовали быстрому прогрессу исследований по генотерапия гемофилии В, которая в настоящее время уже включена в программы клинических испытаний. Успеш-ная трансдукция и коррекция генетического дефекта получена в опытах in vitro и in vivo на самых различных модельных системах (Culver, 1994; Gerrard et al., 1993). Так, при введении полноразмерной кДНК в составе ретровирусного вектора в первичные культуры кератиноцитов человека наблюдали экспрессию F9 и секрецию биологически активного фактора IX.После трансплантации этих трансдуцированных клеток nu/nu мышам человеческий фактор IX в небольшом количестве появлялся в кроветоке и сохранялся там в течение недели (Gerrard et al.,1993). На собаках, страдающих гемофилией B, осуществлена трансдукция гепатоцитов in vivo путем прямой инфузии рекомбинантного ретровирусного вектора в портальную вену. При этом наблюдали устойчивую экспрессию фактора IX в течение более 5 месяцев и улучшение биохимических показателей свертываемости крови (Kay et al.,1993). Имеется сообщение об успешной коррекции гемофилии В в Китае в 1992г. Двум больным мальчикам в кожу спины трансплантировали культуру аутологичных фибробластов, предварительно трансдуцированных ex vivo рекомбинантной кДНК гена FVIII. Несмотря на определенный скептицизм в оценке этого достижения со стороны специалистов, нет сомнения в том, что успешная генотерапия гемофилии В - событие самого ближайшего будущего. 4.5 Болезнь Виллебранда. Болезнь Виллебранда- аутосомно-доминантное (при некоторых формах рецессивное) заболевание, обусловленное наследственным дефицитом белка VIIIR, родственного фактору VIIIС свертывания крови (см.Гемофилия А) и известного, как фактор фон Виллебранда. Этот большой гликопротеин синтезиру-ется клетками эндотелия, в которых специфическая YIIIR-мРНК составляет 0.3%, и поступает в кровь в виде двух мультимеров с молекулярными весами от 850 кД до 20 миллионов дальтон.Фактор VIIIR осуществляет взаимодействие между стенкой сосудов и тромбоцитами, регулируя их адгезию в местах повреждения эндотелия. Фактор VIIIR участвует также в регуляции синтеза и секреции фактора YIIIC и стабилизирует комплекс фактора VIII. Различают 7 типов болезни Виллебранда - I, IIA-IIE и III (Zimmerman, Ruggeri, 1987). При типе I снижена концентрация всех мультимеров в плазме, но их качество не нарушено.Генетически эта форма заболевания подразделяется на рецессивные и доминантные варианты. Типы IIC и III - рецессивны. Тип II характеризуется качественными аномалиями фактора VIIIR, выражающимися в уменьшении способности формировать большие мультимеры, (типы IIA и IIC) или в увеличении скорости их выведения из плазмы (тип IIB).Ген F8VWF достаточно протяженный и состоит из 52 экзонов, размерами от 40 до 1379 п.о. (Mancuso et al., 1989). Величина интронов варьирует в огромных пределах (от 100 до 20 000пар нуклеотидов). Сигнальный пептид и пропептид кодируются первыми 17 экзонами, в то время как зрелая субьединица VIIIR- фактора и 3'нетранслируемая область - остальными 35 экзонами. Внутри гена идентифицированы повторяющиеся последовательности, включая 14 Alu-элементов и полиморфный TCTA,повтор размером около 670 п.о. в интроне 40. Районы гены, кодирующие гомологичные домены, имеют сходную структуру. На хромосоме 22q11-q13 обнаружен псевдоген длиной 21-29 кб,соответствующий экзонам 23-34 F8VWF-гена (Mancuso et al.,1991). Идентифицированные в нем сплайсинговые и нонсенс мутации препятствуют образованию функционального транскрипта.Наибольшее число мутаций идентифицировано при типе II болезни Виллебранда. Подавляющее большинство из них – замены аминокислот, чаще всего происходящие в результате транзиций в CpG динуклеотидах (Cooney et al., 1991; Randi et al.,1991; Donner et al., 1992). Мутации при болезни типа IIA кластерированы в A2 домене, где предположительно локализован сайт протеолетического отщепления, в то время, как при типе IIB - в домене, обеспечивающим взаимодействие с тромбоцитарным гликопротеиновым комплексом (Ib-IX рецептором). Большая группа мутаций при форме заболевания IIB локализована в сегменте из 11 аминокислот внутри единственного дисульфидного изгиба (loop), соединяющего цистеины в 509 и 695 положениях. При форме заболевания Нормандского типа, мимикриющей гемофилию A, фактор Виллебранда структурно и функционально нормален, за исключеним того, что нарушено его взаимодействие с фактором YIII. У таких пациентов действительно идентифицируются миссенс мутации, расположенные в области гена, кодирующей сайты связывания фактора VIIIR с фактором VIIIС (Mazurier, 1992).Тип III представляет собой наиболее тяжелую форму заболевания, при которй фактор VIIIR, как правило, отсутствует.Получены доказательства, что такие пациенты являются гомозиготами или компаундами по нонсенс мутациям, обнаруживаемым в одной дозе у больных типа I (Zhang et al., 1992). При этом же типе заболевания выявлен кластер мутаций со сдвигом рамки считывания, возникаюших в результате делеции одного из 6 цитозинов в положении 2679-2684 экзона 18. Именно такая мутация была обнаружена в семье, зарегистрированной впервые фон Виллебрандом в 1926 году. У некоторых членов этой родословной как было установлено недавно, она находилась в компаунде с мутацией P1266L, возникшей в результате рекомбинации между геном F8VWF и псевдогеном (см. выше) (Zhang et al., 1993).Выбор адекватного метода молекулярной диагностики болезни Виллебранда в значительной мере предопределяется правильностью предшествующей клинической и лабораторной диагностики и результатами медико-генетического консультирования, позволяющей достаточно четко определить характер наследования заболевания в семье высокого риска и установить его форму. К сожалению, достичь этого далеко не всегда возможно,а отсутствие характерных мажорных мутаций значительно снижает эффективность прямой молекулярной диагностики. Вместе с тем, по крайней мере, в некоторых популяций (Финляндия, Швеция) обнаружены "горячие" точки мутаций, которыми являются экзоны 18 и 42, при типе II болезни Виллебранда (Holmberg et al,1993). В популяциях России такие "горячие " точки пока не обнаружены, хотя исследования в этом направлении ведутся (Асеев, Шауи Абдельрхани, 1995). Значительно более перспективной на современном этапе представляется непрямая диагностика. В промоторной части гена, в интронах 15, 17, 23, 40, 41, 49, а также в экзонах 26, 35, 39 идентифицированы многочисленные полиморфные сайты рестрикции с достаточно высоким уровнем полиморфизма. Особенно перспективным для диагностики является полиморфизм интрона 40, представляющий собой две области варьирующих по числу тетрамерных повторов ТСТА на расстоянии 212 п.о. Амплификация этой части интрона 4О с помощью ПЦР, рестрикция AluI с последующим электрофоретическим разделением позволяет идентифицировать до 98 аллельных вариантов этого полиморфизма (Mercter et al.,1991). Столь выраженный полиморфизм позволяет с высокой эффективностью маркировать мутантную хромосому (ген) и проследить её передачу в потомстве.Сведения о генокоррекции болезни Виллебранда в доступной литературе не обнаружены.
4.6 Фенилкетонурия. Фенилкетонурия (ФКУ) - одно из наиболее частых аутосомно-рецессивных заболеваний, обусловленных наследственным дефектом фенилаланингидроксилазы, приводящим при отсутствии своевременной терапии к тяжелой умственной отсталости. В Европе один больной ребенок встречается в среднем среди 10 -17 000 новорожденных. В Ирландии и Шотландии частота ФКУ достигает 1 на 4500 новоржденных (DiLella et al., 1986).Распространена ФКУ также в Польше и в Белоруссии. В России частота заболевания колеблется в пределах 1 : 8 - 10 000.Очень важна ранняя диагностика ФКУ, так как при своевременном назначении пациенту диеты, не содержащей фенилаланин,умственная ограниченность, как правило, не развивается или имеет очень стертые формы. Разработаны биохимические скринирующие тесты диагностики ФКУ у новорожденных.Гидроксилирование фенилаланина является достаточно сложным процессом, в котором участвуют, по крайней мере, 3 фермента. Фенилаланингидроксилаза (РАН), гомополимерный фермент, состоящий из субъединиц с молекулярным весом 52 кД,продуцируется клетками печени и регулирует превращение L-фенилаланина в L-тирозин. Его дефицит приводит к накоплению фенилаланина в сыворотке крови. Гиперфенилаланинемия может возникать также при дефиците дигидроптеридинредуктазы и при дефектах синтеза биоптерина. Однако, эти заболевания, хотя и сопровождаются снижением активности РАН, значительно отличаются от классической ФКУ и не коррегируются диетой, лишенной фенилаланина.
PAH-ген транскрибируется в гепатоцитах с образованием мРНК размером 2.4 кб. Наиболее распространенный тип мутаций - однонуклеотдные замены (миссенс, нонсенс, мутации в сайтах сплайсинга), причем часто эти мутации являются результат омтранзиций в 22-х обнаруженных в PAH-гене CpG динуклеотидах.Крупных структурных перестроек не найдено, хотя имеется небольшой процент точечных делеций. Отмечается неравномерный характер внутригенной локализации мутаций (Scriver et al.,1989). Так, наибольшее число миссенс мутаций встречается в центральной части гена: в экзоне 7, кодирующем участок связывания белка с кофактором, где располжено 5 CpG дуплетов, а также в экзонах 9 и 12. Преимущественный район локализации делеций - экзоны 1, 2 и 3.Втури РАН-гена локализованоно более 10 полиморфных сайтов рестрикции, причем распределения гаплотипов по этим маркерам среди представителей разных рас и этнических групп значительно различаются. Обнаружено сильное неравновесие по сцеплению между определенными мутациями в PAH-гене и гаплотипами по внутригенным сайтам рестрикции. Так, каждая из 5-и наиболее частых в европейских популяциях мутаций ассоциирована только с одним из более, чем 70 гаплотипов по 8 рестрикционным полиморфизмам (Eisensmith et al., 1992). Мажорная в западно-европейских популяциях сплайсинговая мутация в донорном сайте 12-го интрона сцеплена с гаплотипом 3 (DiLella et al.,1986). В то же время другая мутация в экзоне 12 -R408W, наиболее распространенная на востоке Европы, в частности в Белоруссии и России, и не найденная в Японии и Китае, связана с гаплотипом 2 (DiLella et al.,1987). Мажорная в Европе мутация R158Q в 40% сцеплена с гаплотипом 4, наиболее частым среди жителей Японии и Китая. Распространенная в Турции сплайсинговая мутация в интроне 10, приводящая к 9-и-нуклеотидной инсерции, ассоциирована с "южными" гаплотипами 6, 10 и 36.Сопоставление частот различных гаплотипов по полиморфным сайтам рестрикции и мутаций в PAH-гене в разных популяциях, национальностях и этнических группах позволяет сделать вывод , что большинство из них, или даже все, произошли уже после дивергенции рас. Распространение мажорных мутаций гена РАН в различных популяциях и этнических группах связано с эффектом основателя. По некоторым оценкам эти мутации воз-никли однократно от нескольких сотен до нескольких тысяч лет тому назад. Однако, в ряде случаев распределение мутаций не может быть обьяснено в генетических терминах, сопоставимых с демографической историей. Несомненно доказанными являются примеры независимого и рекуррентного возникновения в разных популяциях таких мутаций, как R261Q или R158Q. Высокие популяционные частоты специфических мутаций в PAH-гене связаны,по-видимому, не только с эффектом основателя и/или с существованием эндогенных механизмов повышенного мутагенеза, но и с преимуществом гетерозигот. Высказано предположение, что носительство РАН - мутаций повышает устойчивость организма к токсическому эффекту охратоксина А, продуцируемого некоторыми видами грибковой плесени (Aspergillus, Penicillium), развивающимися при хранении зерна и других продуктов(Woolf,1986). Предполагается, что беременные женщины, гетерозиготные пл РАН -мутациям имеют меньшую вероятность аборта, индуцированного действием этих микотоксинов. Возможно,высокая частота ФКУ в Ирландии и Шотландии частично может быть обьяснена мягким и влажным климатом этих стран, способствующем росту таких грибов.В медицинской практике используется как прямая, так и косвенная диагностика мутаций в PAH-гене. Разработан очень быстрый и эффективный метод ПЦР/StyI-диагностики cамой частой в России (более 70%) мутации R408W (Ivaschenko,Baranov, 1993; Иващенко и др., 1993). Дигностика других мажорных мутаций в PAH-гене осуществляется методами ПЦР+АСО, аллель-специфической амплификации (ARMS), методом однонитевого конформационного полиморфизма (SSCP) (см. Главу IY).При первичном обследовании семьи черезвычайно удобно использовать три полиморфные нейтральные мутации в кодонах 232,245 и 385, сцепленные в Кавказских популяциях с определенными ПДРФ-гаплотипами, а значит и со специфическими мутантными аллелями. Каждая из этих мутаций создает новый сайт рестрикции и поэтому их аллельное состояние может быть легко протипировано с помощью амплификации и рестрикции (Kalaydjieva et al., 1991). При анализе семьи, в которой отсутствуют легко идентифицируемые прямыми методами мутации, молекулярная диагностика может быть проведена с помощью внутригенных полиморфных сайтов рестрикции. Удобен, в частности, Msp1-полиморфизм в 8-м экзоне, анализ которого может быть осуществлен методом ПЦР/рестрикции (Wedmeyer et al., 1993). В последнее время появились даные о наличии высокополиморфных сайтов внутри интронов гена РАН, которые оказались особенно удобными для молекулярного маркирования мутантных аллелей (Goltzov et al.1994).Генокоррекция ФКУ успешно осуществлена в опытах in vitro и в настоящее время находится на стадии экспериментальной разработки (Табл.9.2. Глава IX). 4.7 Синдром Леш-Нихана. Синдром Леш-Нихана - рецессивное сцепленное с полом заболевание, обусловленное наследственной недостаточностью гипоксантин-гуанин фосфорибозилтрансферазы (HPRT) и сопровождающееся тяжелыми поражениями центральной нервной системы.Фермент HPRT участвует в регуляции метаболизма пуринов,контролируя превращение гуанина и инозина в соответствующие рибонуклеотиды. Ген HPRT экспрессируется во всех типах клеток с образованием мРНК размером 654 п.о. Культивируемые линии клеток, дефектные по HPRT, устойчивы к 8-азагуанину и 6 тиогуанину, и таким образом, могут быть отобраны на соответствующих селективных средах. Гетерозиготные носители мутаций по HPRT-гену могут быть легко выявлены по наличию 2-х типов клеток - устойчивых и чувствительных к 8-азагуанину, в первичной культуре фибробластов или в клетках волосяных луковиц. В большинстве мутантных клеточных линий количество мРНК нормально, а белок отсутствует. У части пациентов хотя и транскрибируется достаточно много мРНК, но в этих молекулах обнаруживаются структурные и функциональные аномалии. В небольшом проценте случаев у больных не удается выявить ни белка, ни мРНК.
В 15% хромосом у больных с синдромом Леш Нихана ген HPRT вовлечен в крупные структурные перестройки, корторые могут быть выявлены методами Саузерн или Нозерн блот-гибридизации. Синдром Леш Нихана одно из первых моногенных наследственных заболеваний, для которых была проведена молекулярная идентификация точечных мутантных аллелей. Именно на этой моделе впервые был разработан и опробован метод анализа мутаций, основанный на расщеплении РНК-ДНК гибридов рибонуклеазой А в местах негомологичноно спаривания (метод расщеп-ления рибонуклеазой А - см.Главу VI, Gibbs, Caskey, 1987).Комбинация методов блот-гибридизации и расщепления рибонуклеазой А позволяет выявить до 50% мутаций. В настоящее время в гене HPRT найдено более 100 спорадических мутаций, половина которых - однонуклеотидные замены типа миссенс, нонсенс и в сайтах сплайсинга. Около 40% мутантных хромосом имеют структурные аномалии, в том числе крупные делеции, нехватки отдельных зкзонов и микроделеции одного или нескольких нуклеотидов. В HPRT-гене, практически, отсутствуют мутации, до-мининирующие по частоте в каких-либо популяциях. Исключение составляет нонсенс мутация R170TER, которая составляет около 15% всех нуклеотидных замен (Gibbs et al., 1989). Также как и при гемофилиях мутации гена HPRT чаще возникают в сперматогенезе, чем в оогенезе. Вероятность мутирования возрастает с возрастом отца. Идентифицировано 3 HPRT-псевдогена в хромосомах 3, 5 и 11 (Stout, Caskey, 1984). Описаны редкие случаи синдрома Леш Нихана у гетерозиготных девочек. При этом, как правило, болезнь развивается вследствие неслучайной инактивации X-хромосомы, не содержащей мутации (Ogasawara et al., 1989). Однако, у 3-х женщин -облигатных носительниц мутаций в HPRT-гене, селективный тест не выявил присутствия мутантных клеток в культивируемых фибробластах и волосяных луковицах. В связи с этим высказано предположение, что определенные мутации гена HPRT находятся в неравновесном сцеплении с неидентифицированной летальной мутацией в X-хромосоме, что и приводит к селекции клона клеток только с одной (мутантной или немутантной по гену HPRT) X-хромосомой (Marcus et al., 1992).Молекулярная диагностика болезни Леш-Нихана возможна прямыми и непрямыми методами. Прямой вариант основан на проведении обратной транскрипции мРНК, ее амплификации,SSCP-анализе одноцепочечных ДНК фрагментов с их последующим секвенированием (см.Глава VI). Косвенная диагностика предусматривает маркирование мутантной хромосомы при помощи по- лиморфных сайтов (в частности, локуса DXS52 - зонд St14/TaqI).
Как мы уже отмечали (Главы VII,VIII), первая трансгенная животная модель наследственного заболевания человека,сконструированная путем направленного переноса мутациий в культивируемые эмбриональные стволовые клетки, была получена для синдрома Леш-Нихана (Hooper et al., 1987; Kuehn et al.,1987). На этой моделе впервые была проведена генокоррекция наследственного дефекта in vivo. Эти успехи в значительной степени связаны с существованием селективных сред, позволяющих вести автоматический отбор мутантных клеток. Вообще,синдром Леш-Нихана представляет собой идеальную систему не только для изучения пуринового метаболизма, но и для решениямногих теоретических вопросов биологии и медицины(Seegmiller, 1989; Maraus et al., 1993; Boyel et al., 1993).Сложность генокоррекции заболевания, однако, заключается в необходимости обеспечения эффективной доставки гена HPRT (или его кДНК) непосредственно в мутантные нервные клетки. Эта проблема еще не решена. Поэтому реальные клинические программы генотерапии этого заболевания на сегоднешний день отсутствуют (см.Главу IX). 4.8 Болезнь Вильсона-Коновалова. Болезнь Вильсона-Коновалова (БВК) – гепатолентикулярная дегенерация - аутосомно-рецессивное заболевание, обусловленное наследственным дефектом одной из медь-транспортирующих АТФаз. У больных резко снижена концентрация основного медь-содержащего белка плазмы крови - церулоплазмина и в меньшей степени - цитохромоксидазы, еще одного белка, участвующего в метаболизме меди. Выделяют, по крайней мере, 3 формы БВК (Cox et al. , 1972). При редкой атипичной форме,предположительно Германского происхождения, у гетерозигот содержание церулоплазмина снижено, по крайней мере, в два раза. При двух других, типичных формах - славянской и ювенильной, содержание церулоплазмина у гетерозигот находится в пределах нормы. Славянский тип БВК характеризуется сравнительно поздним началом и преимущественно неврологической симптоматикой. Ювенильная форма чаще встречается в Западной Европе и ведущими в этиологии заболевания являются печеночные нарушения. Среди евреев-ашкенази встречается БВК с поздним началом и почти нормальным содержанием церулоплазмина в сыворотке крови больных. Ген БВК, идентифицированный в 1993г. независимо сразу в 2х лабораториях США, представляет собой медь-транспортирующую АТФазу P типа с 6-ю металл-связывающими районами. Ген имеет 60% гомологию по нуклеотидному составу с ранее идентифицированным геном АТФ-азы (АТР7А), мутантном при болезни Менкеса (Bull et al., 1993; Petruchin et al., 1993; Tanzi et al., 1993). По аналогии с геном болезни Менкеса, также обусловленной нарушением транспорта меди, ген БВК назван АТР7В. Два пациента с БВК оказались гомозиготными по 7-нуклеотидной делеции в кодирующей области гена ATP7B , что доказывало его идентичность гену БВК (Petruchin et al, 1993).Ген экспрессируется в клетках печени, мозга, почках, лимфоузлах. Типичным для экспрессии АТР7В оказался альтернативный сплайсинг двух и более экзонов центральной части гена (6, 7, 8, 12 и 13). Кодируемый ATP7B-геном белок содержит несколько мембранных доменов, АТФ-консенсусную последовательность, сайт фосфорилирования и, по крайней мере, 2 медь-связывающих сайта. В мозге, печени, почках и ломфоузлах обнаружены изоформы белка, соответствующие продуктам альтернативного сплайсинга гена АТР7В. Их назначение и функции пока неизвесты. В гене АТР7В идентифицированы полиморфные микросателлитные маркеры,а также около 10 полиморфных сайтов рестрикции. В настоящее время в гене АТР7В идентифицированы более 30 мутаций, в том числе 14 мелких делеций/инсерций, 2 - нонсенс мутации, 15 -миссенс мутаций, 3 - сплайсинговые мутации. Диагностическую ценность для европейцев представляют мутации His1070Gln и Gly1267Lys, зарегистрованные в 28% и 10% всех мутантных хромосом, соответственно (Thomas et al., 1995). В заключении данного раздела представляется целесообразным кратко рассмотреть другие достаточно частые моногенные заболевания, для которых показана и проводится молекулярная диагностика, в том числе и пренатальная, в других ме-дико-генетических центрах России и, прежде всего, в Лаборатории молекулярной диагностики Институтата клинической генетики РАМН (Москва). 4.9 Адрено-генитальный синдром. Адрено-генитальный синдром - (врожденный дефицит 21-гидроксилазы) - достаточно распространенное аутосомно-рецессивное заболевание. Частота "классических" форм 1:10 000 новоржденных, "неклассической" - около 1% в популяции. В зависимости от характера нарушения функции гена и, соот ветственно клинических проявлений "классическая форма" подразделляется на два варианта: 1. летальная сольтеряющая форма; 2. нелетальная - вирилизирующая форма, связанная c избытком андрогенов (Morel, Miller, 1991).В локусе 6р21.3, внутри сложного супергенетического комплекса HLA идентифицированы два тандемно расположенных 21-гидроксилазных гена - функционально активный CYP21B и псвдоген - CYP21А, неактивный вследствие делеции в 3-м экзоне, инсерции со сдвигом рамки считывания в 7-м экзоне и нонсенс мутаций - в 8-м экзоне. Ген и псевдоген разделены смысловой последовательностью гена С4В, кодирующей 4-й фактор комплемента. Оба гена состоят из 10 экзонов, имеют длину 3,4 кб и отличаются только по 87 нуклеотидам. Высокая степень гомологии и тандемное расположение указвают на общность эволюционного происхождения этих генов. Любопытно отметить,что такие же тандемно расположенные гены 21-гидроксилазы (называемые также Р450с21) обнаружены и у других млекопитающих, причем у мышей, в отличие от человека, активен только ген CYP21A, но не CYP21B, тогда как у крупного рогатого скота функционально активны оба гена.Белок- 21-гидроксилаза ( Р450с21- микросомальный цитохром 450) обеспечивает превращение 17-гидроксипрогестерона в 11-дезоксикортизол и прогестерона - в дезоксикортикостерон. В первом случае возникает дефицит глюкокортикоидов и, прежде всего, кортизола, что в свою очередь стимулирует синтез АКТГ, и ведет к гиперплазии коры надпочечников (вирилирующая форма). Нарушение превращения прогестерона в дезоксипрогестерон ведет к дефициту альдостерона, что в свою очередь нарушает способность почек удерживать ионы натрия и приводит к быстрой потере соли плазмой крови (соль теряющая форма). Как и в случае гемофилии А, наличие рядом с кодирующим геном гомологичной ДНК последовательности зачастую ведет к нарушениям спаривания в мейозе и, как следствие этого, к конверсии генов (перемещения фрагмента активного гена на псевдоген), либо к делеции части смыслового гена. В обоих случаях функция активного гена нарушается. На долю делеций приходится около 40% мутаций, на долю конверсий - 20% и примерно 25% составляют точечные мутации. Согласно отечественным данным в случае наиболее тяжелой сольтеряющей формы АГС,на долю конверсий приходится более 20% мутантных хромосом,на долю делеций - около 10% (Evgrafov et al., 1995).Непрямая диагностика АГС возможна с помощью типирования тесно сцепленных с геном CYP21B аллелей HLA A и HLA B генов,а также алелей гена HLA DQA1. Прямая ДНК диагностика АГС основана на амплификакции с помощью ПЦР отдельных фрагментов генов CYP21B и CYP21A, их рестрикции эндонуклеазами HaeIII или RsaI и анализе полученных фрагментов после электрофореза (Evgrafov et al., 1995).
4.10 Спинальная мышечная атрофия. Спинальная мышечная атрофия (СМА) - аутосомно-рецессивное заболевание, характеризуется поражением моторных нейронов передних рогов спинного мозга, в результате чего развиваются симметричные параличи конечностей и мышц туловища.Это - второе после муковисцидоза наиболее частое летальное моногенное заболевание (частота 1: 6 000 новорожденных).СМА подразделяется на три клинические формы. Тип I. Острая форма (болезнь Верднига-Гоффмана), проявляется в первые 6 месяцев жизни и приводит к смерти уже в первые два года; Тип II. Средняя (промежуточная) форма, пациенты не могут стоять,но обычно живут более 4-х лет; Тип III. Ювенильная форма(болезнь Кугельберга-Веландера) - прогрессирующая мышечная слабость после 2-х лет. Все три формы представляют собой аллельные варианты мутаций одного гена SMN (survival motor neurons), картированного в локусе D5S125 (5q13) и идентифицированного методом позиционного клонирования (см.Главу III) в 1995г (Lefebvre et al. 1995). В этой пока единственой рботе показано, что ген SMN размером всего 20 000 п.о.состоит из 8 экзонов. мРНК этого гена содержит 1 700 п.о. и кодирует ранее неизвестный белок из 294 аминокислотных остатков с молекулярным весом 32 КилоДальтона.
Ген дуплицирован. Его копия (возможно вариант псевдогена) располагается несколько ближе к центромере и отличается от гена SMN наличием 5-и точечных мутаций, позволяющих отличить оба гена путем амплификации экзонов 7 и 8 и их исследованием методом SSCP анализа (см.Главу IV). Ген назван сBCD541, по аналогии с первоначальным вариантом названия для теломерной копии, т 4о 0е 4сть 0гена SMN, tBCD541. Ген cBCD541 экспрессируется, но в отличие от гена SMN его сДНК подвергается альтернативному сплайсингу с утратой экзона 7. Отсутствие гена SMN (tBCD541) у 93% больных (213 из 229),его разорванная (interrupted) структура у 13 обследованных пациентов (5.6%) и наличие серьезных мутаций у оставшихся 3-х больных дали основание именно данную теломерную копию гена считать ответственной за заболевание. Существенно отметить, что центромерная копия гена обнаружена у 95 4. 05% больных, тогда как отсутствует она только у 4,4% пациентов .В непосредственной близости от теломерного конца гена SMN идентифицирован еще один ген - ген белка-ингибитора запрогаммированной гибели нейронов (neuronal apoptosis inhibitory protein -NAIP). При тяжелых клинических формах СМА (Тип I), обусловленных делециями, по-видимому, нередко происходит утрата гена NAIP.Согласно гипотезе авторов СМА возникает при гомозиготном состоянии мутаций (обычно-делеций) в гене SMN, при этом различия между формами СМА определяются двумя основными факторами: 1. числом копий гена cBCD541 (две - в случае Типа I и четыре (возникающих вследствие конверсии между SMN и cBCD541) - в случае Типа III), наличием или отсутствием гена 0NAIP. Среди всех обследованных СМА-больных необнаружены случаи одновременной делеции обоих гомологичных генов SMN (tBCD541) и сBCD541, что указывает, по мнению авторов, нато, что такая аберрация должна проявляться как доминантная леталь еще в эмбриогенезе.Некоторые положения этой, безусловно, основополагающей работы французских авторов, по-видимому, еще требуют уточнения, однако, уже сейчас она сделала возможной прямую молекулярную диагностику СМА у 98,6% больных. С этой целью проводится амплификация экона 7, который отсутствует у подавляющего большинства больных. Нормальный экзон 7 (ген SMN) дифференцируют от мутантного варианта (ген cBCD541) c помощью SSCP анализа. При необходимости возможна косвенная диагностика - ПЦР анализ динуклеотидных (CA) повторов ДНК локусов D5S125; D5S112; D5S127; ПДРФ-анализ с фланкирующими ДНК-зондами MU, 105-153RA; 153-6741 GT. 4.11 Атаксия Фридрейха. Атаксия Фридрейха (АФ) - сравнительно редкое (1 : 22-25 000) аутосомно-рецессивное заболевание, характеризующееся прогрессивной дегенерацией нервных клеток мозжечка. Ген АФ не идентифицирован, но достаточно точно картирован на хромосомных (9q13-q21) и физических картах ДНК-маркеров. Наиболее тесное сцепление гена АФ показано для локуса D9S5(зонд 26Р). Сконструированы космидные библиотеки и составлены подробные физические карты области геномной ДНК хромосомы 9, включающей локус D9S7 и, предположительно, ген АФ. Определено положение гена ФА по отношению к другим фланкирующим молекулярным маркерам (Fujita etal., 1991; Wilkes et al., 1991) 4. 0В настоящее время известно, по крайней мере,5 таких ДНК маркеров: GS4, MCT-112, GS2 -дистальные и микросателлитные маркеры FD1 (на расстоянии 80 кб 4) 0и MLS1 (на расстоянии 150 кб) - проксимальные. Изучены особенности аллельного полиморфизма этих систем для различных популяций Западной Европы. Для всех 5 молекулярных маркеров выяснены гаплотипы, сцепленные с заболеванием. Гаплотипы обоих мик-росателлитных маркеров оказались в абсолютном генетическом неравновесии с АФ, что доказывет их весьма близкое расположение на генетической карте по отношению к мутантному гену АФ (Pianese et al., 1994).Диагностика АФ пока возможна только непрямыми методами.ПДРФ анализ с помощью ДНК-зондов на дистальные полиморфные сайты, либо ПЦР анализ полиморфизма проксимальных по отношению к гену АФ микросателлитных маркеров MLS1 или FD1. Нами рассмотрены лишь некоторые моногенные наследственные болезни, условно разделенные на три подгруппы, исходя,главным образом, из того насколько они изучены с молекулярно-генетических позиций, их актуальности для пренатальной диагностики и в какой мере они важны для медико-генетической службы нашей страны. Более того, исторически сложилось так,что именно такие заболевания как муковисцидоз, миодистрофия Дюшенна, гемофилия А, фенилкетонурия, то есть социально наиболее значимые, раньше других генных болезней стали предметом детального молекулярного анализа в нашей лаборатории и в других медико-генетических центрах и научно-практических подразделениях России (см. Баранов, 1991, 1994;Baranov,1993; Евграфов, Макаров, 1987).Естественно, что рассмотренными нозологиями отнюдь не исчерпывается список тех болезней, которые являются объектами молекулярных исследований в нашей стране. Например, из обзора выпали такие моногенные 0болезни как гиперхолестеринемия, гемоглобинопатии, дефицит альфа-1 антитрипсина, митохондриальные болезни. Для многих из них разработаны и широко применяются эффективные методы молекулярной диагностики, ведутся исследования по генотерапии. Мы не касались также работ проводимых, главным образом, в возглавляемой профессором Е.И.Шварцем лаборатории молекулярной диагностики ПИЯФ РАН и посвященных молекулярному анализу мультифакториальных заболеваний, таких как диабет, гипертония, ишемия сердца. Результаты этих исследований будут, по-видимому, предметом следующих обзоров и монографий.