Состояние естественной резистентности и иммунологической реактивности у новорожденных телят при колибактериозе

Государственный Аграрный Университет Молдовы
На правах рукописи
ЖOCAH Николай Степанович
УДК 619:619. 98-092:636.2-053.2
СОСТОЯНИЕ ЕСТЕСТВЕННОЙ РЕЗИСТЕНТНОСТИ И ИММУНОЛОГИЧЕСКОЙ РЕАКТИВНОСТИ У
НОВОРОЖДЕННЫХ ТЕЛЯТ ПРИ КОЛИБАКТЕРИОЗЕ
16.00.03 – ветеринарная микробиология и вирусология
Диссертация
на соискание ученной степени доктора ветеринарных наук
Научный консультант – Скутару Иван Гаврилович, доктор-хабилитат ветеринарных наук, профессор
Кишинев 1998
Содержание:
Список условных сокращений……………………………6
ВВЕДЕНИЕ 7
РАЗДЕЛ I ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 17
1.1. Краткие сведения о колибактериозе телят 17
1.2. Специфическая иммунологическая реактивность телят в постнатальный период 43
1.3. Неспецифическая иммунологическая реактивность новорожденных телят
53
1.4. Получение и применение лактоглобулинов 57
заключение 64
РАЗДЕЛ 2 РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 66
2.1. Материалы и методы исследований. 66
2.2. Изучение специфической иммунологической реактивности телят в постнатальный период. 89
2.2.1. Уровень иммуноглобулинов в сыворотке крови телят до приема молозива и через 24ч после рождения и взаимосвязь между концентрацией иммуноглобулинов и проявлением синдрома нарушения пищеварения. 90
2.2.2. Количественная характеристика абсорбции колостральных иммуноглобулинов новорожденными телятами. 94
2.2.3. Уровень колостральных иммуноглобулинов в сыворотке крови новорожденных телят через 6, 24 и 48 ч после рождения.
100
2.2.4. Количественное определение колостральных иммуноглобулинов в сыворотке крови и в фецес неонатальных телят.. 102
2.2.5. Концентрация иммуноглобулинов в сыворотке крови и секрете молочной железы коров. 103
2.2.6. Содержание иммуноглобулинов в сыворотке крови коров и новорожденных телят. 105
2.2.7. Уровень антител против О-антигенов Е. coli в нормальном коровьем молозиве, молоке и сыворотке крови новорожденных телят.. 110
2.2.8. Уровень антител против К-антигенов Е. coli в нормальном коровьем молозиве, молоке и в сыворотке крови новорожденных телят. 120
2.2.9. Протективный механизм молозива при колибактериозе новорожденных телят. 131
2.2.10. Факторы, влияющие на выживание новорожденных телят. 134
2.2.11. Клиническая оценка эффективности вакцинации коров для профилактики колибактериоза телят. 137
ВЫВОДЫ 145
РАЗДЕЛ 3 ИЗУЧЕНИЕ НЕСПЕЦИФИЧЕСКОЙ ИММУНОЛОГИЧЕСКОЙ РЕАКТИВНОСТИ НОВОРОЖДЕННЫХ ТЕЛяТ 147
3.1. Биохимический анализ крови новорожденных телят. 147
3.2. Коррекция кислотно-основного баланса при диареи неонатальных телят. 154
3.3. Изменение фагоцитарныхных показателей у новорожденных телят в зависимости от клинического статуса. 158
3.4. Бактерицидная активность сыворотки крови новорожденных телят.
171
3.5. Комплементарная активность сыворотки крови новорожденных телят
178
3.6. Лизоцимная активность сыворотки крови. 184
3.7. Пропердиновая активность сыворотки крови. 189
ВЫВОДЫ 193
РАЗДЕЛ 4 ЭФФЕКТИВНОСТЬ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ ПРИ КОЛИБАКТЕРИОЗЕ НОВОРОЖДЕННЫХ ТЕЛЯТ 194
4.1. Эффективность применения колостральной сыворотки и лактоглобулина для коррекции иммунодефицита неонатальных телят. 194
4.2. Эффективность лактоглобулина и ретинола применяемых с целью коррекции иммунодефицита новорожденных телят. 198
4.3. Применение хлорпромазина и Т-активина для лечения телят, больных колибактериозом. 203
ВЫВОДЫ 209
5. Обсуждение результатов исследований. 210
6. ВЫВОДЫ. 222
7. РЕКОМЕНДАЦИИ ПРОИЗВОДСТВУ. 228
СПИСОК условных сокращений
агт – агглютинационный тест ант – антиглобулиновый тест атф – аденозинтрифосфат днк – дезоксирибонуклеиновая кислота мпа – мясо-пептонный агар мпб – мясо-пептонный бульон мппб – мясо-пептонный печоночный бульон ра – реакция аглютинации рнк – рибонуклеиновая кислота рн – отрицательный логарифм концентрации водородных ионов сда – синдром дефицита антител tl – термолабильная фракция E. coli ts – термостабильная фракция E. coli фэк-м – фотоэлектрокаллориметр цамф – циклический 3’5’ - аденозинмонофосфат
ВВЕДЕНИЕ
Успешное развитие животноводства во многом зависит от направленного выращивания молодняка, сочетающего высокую продуктивность с устойчивостью организма к заболеваниям.
Результаты многочисленных исследований состояния естественной резистентности организма сельскохозяйственных животных свидетельствует о том, что защитные силы являются динамичным показателем, и определяется как генетическими особенностями организма, так и воздействием различных факторов окружающей среды. Это обстоятельство позволяет направленно влиять на формирование и проявление защитных сил организма. Обеспечение животным благоприятных условий содержания, максимально отвечающих биологическим особенностям организма, сложившимся в процессе эволюционного развития, способствует более быстрому формированию и лучшему проявлению его защитных сил. Вместе с тем, неблагоприятное воздействие окружающей среды приводит к ослаблению устойчивости организма, защитные силы его проявляются недостаточно, что усиливает опасность возникновения и распространения инфекционных заболеваний. Следовательно, инфекционные болезни могут возникнуть только в результате нарушения нормальной реактивности, ослабления защитных свойств организма.
На фоне нарушения нормальной реактивности и ослабления защитных свойств организма возникают массовые желудочно-кишечные заболевания новорожденных животных, особенно телят. Среди них, колибактериоз телят относится к числу наиболее широко распространенных инфекционных болезней молодняка и регистрируется во всех развитых странах мира, в том числе в хозяйствах Республики Молдова.
Вследствие этого, актуальность изучения данного заболевания стала не меньшей, а наоборот возросла. Это связано с резистентностью энтеротоксических штаммов Е. coli к большинству доступных химиотерапевтических средств. Данная резистентность имеет внехромосомальный характер, она детерминируется плазмидами (R) и в связи с этим постепенно охватывает все большее число штаммов энтеротоксических и определяется, как «заразная комплексная резистентность к антибиотикам». Кроме того, продуцируемые эшерихиями экзо- эндо- и энтеротоксин способны воздействовать самостоятельно, что затрудняет использование средств специфической защиты и профилактики. Очень сложное многогранное и далеко не изученное воздействие возбудителя на иммунную систему организма хозяина приводящее к крайне низкой его сопротивляемости.
Биологическая активность энтеротоксинов проявляется в виде нарушения равновесия между процессами секреции электролитов в кишечнике. Колонизация энтеротоксических штаммов Е. coli посредством специфических фимбрий в энтероциты, дает возможность проникновения в них молекул энтеротоксинов, которые нарушают состояние равновесия между объемами электролитов, перемещаемых из кровеносных сосудов в кишечник и в обратном направлении, это же равновесие является результатом роста секреции жидкостей эпителием кишечных крипт и торможения их резорбции клетками эпителия кишечных ворсинок.
Таким образом, вследствие продуцирования кишечной палочкой (Е. coli) энтеротоксина происходит стимуляция аденилаткиназы энтероцитов, что вызывает трансформацию АТФ в циклический 3’,5’-аденозинмонофосфат (АМФ). Одновременно изменяется функция энтероцитов, которые вместо абсорбции питательных веществ, элиминируют свободную воду и минеральные вещества из клетки в кишечник, что приводит к резкому обезвоживанию и деструктивным изменениям ворсинок эпителия [E. Salajka, 1980]. Следовательно, колонизация слизистой кишечника патогенными Е. coli имеет основное значение для развития болезни. Смертельные исходы в ходе острой формы колибактериоза у новорожденных телят являются следствием существенных нарушений электролитного равновесия и дегидратации.
Актуальность темы. Снижение заболеваемости и предупреждение гибели народившегося молодняка является одной из главных задач, стоящих перед ветеринарной наукой и практикой.
Одной из главных причин, тормозящих полное сохранение нарождающегося молодняка — массовые желудочно-кишечные заболевания новорожденных животных, особенно телят. Эти заболевания имеют широкое распространение, наносят значительный экономический ущерб и вызывают большой отход телят, который составляет в странах мира от 3,1 до 31,0 %, а в бывшем СССР средний отход среди заболевших телят за ряд лет составил 18-21 % [Г. В. Гнатенко, 1968; Л. К. Волынец, 1975; А. В. Драгомир, Е. А. Драгомир, A.Ф. Карышева, Ф. В. Спатарь, 1985; А. А. Гутковский, 1989; Ю. С. Кабанков, С. Ф. Армашу, 1991].
Среди заболеваний новорожденных телят колибактериоз занимает одно из ведущих мест. Он относится к числу острых заболеваний, чаще всего протекающее с признаками диареи, интоксикации, септицемии, расстройства сердечно-сосудистой и центральной нервной системы. В возникновении, развитии и исходе заболевания реактивность организма играет первостепенную роль [С. Н. Преображенский, Н. И. Блинов, Н. В. Ершова, Г. В. Вышинский, 1974; И. М. Архангельский, 1976; В. С. Бузлама, С. М. Сулейманов, В. Н. Долгополов, Н. Н. Коновалов, М. Н. Рецкий, И. С. Толкачев, 1978; П. А. Емельяненко, 1979; Э. С. Коган, 1981; В. Я. Мозгис, 1982; В. М. Асламов, 1983; М. А. Костына, 1984; R. Morar, 1985; А. Н. Голиков, 1989; И. М. Карпуть, А. Г. Ульянов, 1990; Е. А. Маринин, Т. Т. Ворошилова, 1993; П. П. Игнатьев, Г. Ч. Бондаренко, 1994; T. E. Besser, C. C. Gay, 1994; A. S. Sheikh, P. S. Bradford, S. C. James, B. Patricia, B. F. Thomas, H. Richard, D. Gregore, D. R. Lin, W. Bert, 1995; Д. Н. Масюк, 1997].
Защитные силы животных являются основными показателями, обеспечивающими устойчивость организма новорожденных телят к факторам внешней среды и их тестирование позволяет определять иммунный статус.
Неблагоприятное воздействие окружающей среды приводит к ослаблению устойчивости организма и усиливает опасность возникновения и распространения различных заболеваний, в том числе инфекционных. В связи с этим академик А. А. Богомолов отмечал, что инфекционные болезни могут возникнуть только в результате нарушений нормальной реактивности, ослабления защитных свойств организма [С. И. Плященко, В. Т. Сидоров, А. Ф. Трофимов, 1990].
Несмотря на то, что в профилактике колибактериоза телят достигнуты определенные успехи, однако эта проблема еще далеко от своего полного решения. Лекарственные препараты, используемые с этой целью, не вызывают коррекцию иммунного статуса. Кроме того, реализация существующих способов профилактики колибактериоза телят затруднена из-за отсутствия экспресс- индикации К-антител в колостральной сыворотке коров.
Изучение иммунологической реактивности организма новорожденных телят, таким образом, приобретает актуальное значение для понимания патогенеза заболевания, для рациональной патогенетической терапии.
Связь работы с научными программами. Тема диссертационной работы была частью проблемы ветеринарной медицины Республики Молдова «Разработка методов и средств профилактики и борьбы с болезнями животных».
Цель работы. Цель работы состоит в экспериментальном и теоретическом обосновании неспецифической и специфической реактивности новорожденных телят при колибактериозе, разработке иммунологически обоснованных рациональных способов коррекции иммунного статуса и ингибирования циклического аденозинмонофосфата (сАМР) посредством «анти-секреторного фактора».
Для реализации данной цели мы поставили следующие задачи:
1. Определить уровень антител против О- и К-антигенов Е. coli в нормальном коровьем молозиве, молоке и в сыворотке крови новорожденных телят.
2. Изучить количественную характеристику абсорбции колостральных иммуноглобулинов классов G, М и А новорожденными телятами.
3. Выявить роль кислотно-основного баланса в течение инфекционного процесса при колибактериоза телят.
4. Установить величину взаимосвязи между показателями неспецифической реактивности; (фагоцитарная реакция, бактерицидная, лизоцимная, комплементарная и пропердиновая активность) у здоровых, больных и павших новорожденных телят.
5. Разработать способы коррекции иммунного статуса новорожденных телят и ингибирования циклического аденозинмонофосфата (сАМР) посредством
«антисекреторного фактора».
Научная новизна полученных результатов. Новизна работы заключается в том, что впервые к изучению заболевания колибактериоза телят проявлен новый, комплексный подход. В результате комплексно проведенных исследований изучена специфическая и неспецифическая реактивность организма новорожденных телят.
Впервые изучен уровень антител против К-антигенов в нормальном коровьем молозиве, молоке и в сыворотке крови новорожденных телят.
Доказано, что клинический статус новорожденных телят находится в прямой зависимости от сывороточной концентрации иммунных глобулинов и их катаболической эффективности, увеличение уровня иммуноглобулинов М и А в сыворотке крови клинически здоровых животных в среднем в 5,7 и 3,4 раза, по сравнению с павшими указывает на их защитную функцию. Выявлено нарушение кислотно-щелочного равновесия при диареи неонатальных телят. Доказано, что сопутствующими ацидозу были отклонения в уровнях сывороточных хлоридов натрия, кальция и калия. Применение электролитного раствора корректировало указанные аномалии.
Установлена взаимосвязь между фагоцитарными показателями и бактерицидной активностью сыворотки крови, между фагоцитарной активностью и уровнем пропердина, между уровнем пропердина и лизоцимной активностью, между уровнем комплемента и фагоцитарной активностью у здоровых, больных и павших телят.
Обоснованы и испытаны лекарственные препараты, корректирующие иммунный статус новорожденных телят и ингибирующие циклический аденозинмонофосфат (сАМР) посредством «анти-секреторного фактора».
Практическая значимость полученных результатов. На основании результатов исследований определен уровень антител против О- и К-антигенов Е. coli. Изучена количественная характеристика абсорбции колостральных иммуноглобулинов новорожденными телятами.
Материалы дают информацию о содержании иммуноглобулинов G, M и А в сыворотке крови и в фекалиях телят больных колибактериозом, а также об экспресс методах для определения иммунного статуса новорожденных телят.
Для коррекции иммунного статуса испытан лактоглобулин совместно с ретинолом. Испытан хлорпромазин совместно с Т-активином для ингибирования циклического аденозинмонофосфата.
Результаты исследований позволяют дать теоретически обоснованные рекомендации по коррекции специфической реактивности организма новорожденных телят, для понимания патогенеза заболевания и для рациональной патогенетической терапии, так как в возникновении, развитии и исходе заболевания реактивность организма играет первостепенную роль.
Основные результаты исследований используются в учебной и научно- исследовательской работе и в практической деятельности ветеринарных специалистов хозяйств Республики Молдова.
Для ветеринарной наук и практики предложены:
I. Методические рекомендации по применению колостральной сыворотки и лактоглобулина для коррекции иммунодефицита неонатальных телят.
Одобрены научно-техническим советом Министерства сельского хозяйства и продовольствия Республики Молдова. Изданы:
Молдагроинформреклама, Кишинев, 1992.
II. Методические рекомендации – Экспресс-метод индикации антиген- агглютининов против К-антигена Е. coli в колостральной сыворотке коров и в сыворотке крови новорожденных телят. Одобрены Научно- техническим советом Министерства сельского хозяйства и продовольствия республики Молдова, Кишинев, 1994.
Разработаны способы:
I. Коррекция иммунодефицита неонатальных телят. (Brevet de inven?ie, n 345), Republica Moldova.
II. Лечение телят больных колибактериозом (Brevet de inven?ie, nr.
409), Republica Moldova.
III. Результаты исследований включены в тексты лекций и реализуются на лабораторно-практических занятиях со студентами ветеринарного и зооинженерного факультетов Государственного аграрного университета Республики Молдова.
Личный вклад соискателя. Автором самостоятельно выполнен весь объем экспериментальных исследований. Биохимический анализ крови проводили на венгерской лабораторной установке «Контифло».
Апробация результатов диссертации. Результаты научных исследований доложены и одобрены на состоявшемся в октябре 1972 г. в г. Москве Пленуме отделения ветеринарии ВАСХНИЛ по проблеме лечения и профилактики болезней молодняка сельскохозяйственных животных; на научной конференции профессорско-преподавательского состава Одесского сельскохозяйственного института (Одесса, 1974); на научной конференции по вопросам повышения продуктивности сельскохозяйственных животных в условиях Северного Казахстана (Целиноград, 1976), на Республиканской научной конференций профессорско-преподавательского состава и аспирантов Кишиневского сельскохозяйственного института им. М. В. Фрунзе (Кишинев 1977); на 3-х конференциях профессорско-преподавательского состава научно- исследовательской конференции Кишиневского сельскохозяйственного института (Кишинев, 1979, 1980, 1982); на Республиканской научно-производственной конференции (Кишинев, 1981); на Республиканской научно-практической конференции «Технические проблемы продовольственной программы» (Кишинев, 1984); на Всесоюзной научно-производственной конференции «Вопросы интенсификации и научно-обоснованного ветеринарного обслуживания промышленного животноводства» (Кишинев, 1987); на заседаниях Ученого совета ветеринарного факультета Государственного аграрного университета Республики Молдова. (1988-1998 гг.).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 37 работ в трудах ВАСХНИЛ, межвузовских сборниках и республиканских изданиях, в том числе 2 учебника (учебные пособия), 1 монография, 29 научных статей, 2 патента, 1 рацпредложение, 2 методические рекомендации.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 229 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, рекомендаций производству, списка литературы и приложения. Работа содержит 88 таблиц и 11 рисунков. Список литературы включает 410 источников, в том числе 212 иностранных.
РАЗДЕЛ I
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Краткие сведения о колибактериозе телят
1.1.1. Историческая справка. Учение о роли в патологии новорожденных телят кишечных палочек (Bact. сoli, позже названной Eschеrichia coli, 1939), обнаруженных Обихом [C. О. Jensen, 1897], а позже Эшерихом [Th. Escherich, 1885] прошло длительную историю становления.
Морские свинки и кролики после заражения кишечной палочкой погибали через несколько часов, а иногда через 2 дня, при наличии сильного поноса и повышенной температуры [Th. Escherich, 1885]. Болезнетворное действие микроба проявлялось как при интраперитонеальном, так и при подкожном заражении.
Датский ученый C. O. Jensen, 1897 первый обратил внимание на кишечную палочку как на возбудителя поносов у новорожденных животных. Его исследования позволили предположить об аналогичной причине диспепсических расстройств у детей.
По данным многочисленных исследователей среди массовых желудочно- кишечных заболеваний новорожденных телят значительный удельный вес занимают инфекционные заболевания, из которых наибольшее распространение имеет коли- инфекция [П. Алтухов, 1904; М. К. Апалев, 1908; Th. Smith, M. L. Orcutt, 1925; Ф. Гутира, И. Марек, Р. Маннингер, И. Мочи, 1961; Т. П. Руденко, 1963; О. С. Андреева, 1966; Д. Келмен, 1967; Е. П. Чиркова, 1968; Я. Е. Коляков, С. С. Гительсон, Л. С. Каврук, 1970; Л. Н. Головнев, 1970; S. Craven, 1970; C. C. Gaу, 1971; H. Feу, 1972; T. Gossling, K. A. Mckaу, 1974; H. W. Moon, 1974; S. D. Acres, C. J. Laing, O. M. Radostis, 1975; А. В. Голиков, А. С. Вовк, А. Т. Марчук, В. Т. Ширяева, 1976; J. Tyler, 1976; Л. К. Волынец, 1978; Г. Пашкявичус, 1978; Я. Е. Коляков, 1978; Ю. В. Алексеев, 1979; J. E. C. Bellamу, S. D. Acres, 1979; J. Hutchinoson, 1979; H. W. Smith, M. B. Huggins, 1979; E. Salajka, 1980; М. А. Сидоров, 1981; H. Feу, 1981; Дж. Х. Б. Рой, 1982; C. C. Gaу, S. M. Parish, T. C. McGuire, 1982; В. А. Аликаев, В. В. Матюшин, 1983; Г. В. Гнатенко, Л. Т. Тупица, 1984; М. А. Сидоров, 1984; В. А. Гушул, Л. А. Афанасьев, Т. П. Мантрова, 1984; M. E. Amstutz, 1985; J. A. Morris, W. J. Sojka, 1985; В. Г. Зароза, 1985; И. И. Фельдман, 1985; Я. Антал, Р. Благо, Я. Булла, 1986; В. И. Девликамов, М. А. Сидоров, 1986; L. Okerman, 1987; M. M. Levine, 1987; К. С. Ливанов, 1988; Г. Л. Дворкин, 1989; З. М. Бедоева, 1990; В. Г. Зароза, 1991; В. А. Ушкалов, 1992; Г. К. Волков, В. Д. Баранников, 1997; ].
1.1.2. Возбудитель болезни. Изучение энтеропатогенной роли кишечной палочки для человека и животных начинается сразу же после открытия ее Обихом Цит. по Jensen C. O., (1897), позже Эшерихом [Th. Escherich, 1885] и, особенно Иенсеном [C. O. Jensen, 1897].
В 1897 году C. O. Jensen, 1897 отметил, что в органах и кишечнике телят, павших от кровавого поноса, находится большое количество микробов подобных тем, которые были открыты Эшерихом. Иенсен установил, что достаточно новорожденному теленку дать вместе с молоком 5-6 мл бульонной культуры Е. coli, выделенной из трупов телят, павших от поноса, чтобы вызвать смертельную болезнь.
Возможность эндогенного возникновения колибациллеза у телят путем скармливания им креолина, пиоктанина и формалина, вызывавших у телят острый энтерит и последующее проникновение Е. coli в общий кроваток экспериментально подтвердил C. O. Jensen, 1905. Из органов павших в этих случаях животных выделяли бактерии кишечной палочки, способные вызвать заболевание при пероральной даче их здоровым телятам без введения раздражающих веществ. На этом основании Иенсен считал, что дизентерию, «белый понос», может вызвать любая кишечная палочка, если по каким либо причинам резко снижается резистентность организма новорожденного. Иенсен первый приготовил вначале моно валентную сыворотку а затем поливалентную гипериммунную колисыворотку и с успехом ее применил для профилактики «белого поноса».
Мнение Иенсена разделяли и русские исследователи [П. Алтухов, 1904; М. К. Апалев, 1908].
Иенсен указывал, что гибель новорожденных телят, может быть как в результате септической формы колибациллеза, так и в результате тяжелого гастроэнтерита с явлениями интоксикации, без проникновения возбудителя в кровяное русло. Автор не обнаружил различия в культурально-биохимических свойствах у штаммов, выделенных от поносящих телят, и штаммов, выделанных от здоровых животных того же возраста.
Количественные и качественные соотношение разных серогрупп Е. coli в содержимом кишечника мало чем различаются у больных и здоровых телят [W. J. Sojka, 1971].
В настоящее время для дифференциации энтеропатогенных штаммов и непатогенных используют классический тест на изолированных петлях кишечника кролика, поросенка, теленка [E. Salajka, 1980].
В последнее время опубликовано значительное количество работ, в которых подробно дается характеристика купьтурально-морфологических и биохимических свойств Е. coli выделенных от новорожденных телят, как больных, так и здоровых [C. O. Jensen, 1897; О. С. Андреева, 1966; Е. П. Чиркова, 1968; А. Ф. Пилуй, В. А. Ленькова, В. В. Медведьев, 1974; L. L. Myers, P. A. Guinee, 1976; Я. Е. Коляков, 1978; Л. К. Волынец, 1978; J. Hutchinson, 1979; М. А. Сидоров, 1980; S. Tzipori, 1981; H. Brade, C. Galanos, 1983; И. И. Тарасов, 1984; Б. М. Анохин, 1985; А. В. Драгомир., Е. А. Драгомир., А. Ф. Карышева, Ф. В. Спатарь,1985; И. И. Фельдман, 1985; В. Тилга, Н. Кампус, 1986; У. Риихикоски, 1986; H. W. Ewing, 1986; М. А. Сидоров, 1987; Н. А. Соколова, О. А. Полякова, Н. И. Евглевская, 1987; К. С. Ливанов, 1988; I. Blanco, E. A. Gonzalez, S. Garcia, 1988; Н. Н. Жосан, 1989; А. А. Гутковский, 1989; B. H. Janke, D. H. Francis, J. E. Collins, 1990; В. Г. Зароза, 1991; Ю. С. Кабанков, С. Ф. Армашу, 1991; G. Galiero, M. Palladino, O. Lai, C. G. Goffredi, 1995; А. В. Куликовский, А. Н. Панин, В. В. Соснина, 1997].
Согласно последним международным классификациям кишечных бактерий (9-ое издание определителя бактерий Берги) род Escherichia представлен одним видом Escherichia coli, который в свою очередь делится на серо- ферментативные типы.
Е. coli представляет собой бактерию или кокобактерию размером 1-4 мкм/0,4-0,6 мкм. Под влиянием внешних факторов эшерихии трансформируются в нитевидные формы длиной до 8-10 мкм. Спор не образуют. Перитрихи, но некоторые штаммы не имеют жгутиков (атрихи). Под воздействием антибиотиков и других факторов образуются гранулярные формы (L-форма), представленные сферическими элементами различной величины (5-20 мкм). Большинство серотипов, изолированных от здоровых животных не образуют капсулу. Изолированные серотипы от больных животных могут быть как капсулообразующими (серотипы 08, 09 и 0101), так и не образующими капсулу.
Красятся всеми анилиновыми красками. Грам-негативные.
Е. coli обладают ресничками (пили), которые представляют рецепторы, посредством которых происходит абсорбция на бактериальной клетке РНК- содержащих фагов, а также осуществляется проникновение РНК фага в микробную клетку. В процессе конъюгации через реснички (пили), выполняющие роль коньюгационного мостика (канала) происходит передача ДНК от клетки донора к клетке реципиенту. Фимбрии (реснички, пили) обладают адгезивными свойствами с помощью которых эшерихии прикрепляются на эпителиальных клетках пищеварительного тракта.
Способность Е. coli образовывать фимбриальные адгезины определяют в капельной РА с моноспецифическими антиадгезивными сыворотками К99, F41, Аtt25, 987Р, К88ав, К88ас, К88аd [О.А. Полякова, Н. И. Евглевская, Н. А. Соколова, 1986; Ю. А. Маллахов, О. А. Тугаринов, М. К. Пирожков, Т. И. Исхакова, 1993].
Е. coli - аэроб или факультативный анаэроб. Оптимальная температура роста 37,5° С, рост и размножение бактерий может происходить в пределах 15- 45° С, оптимум рН 7,0, но культивировать возможно и при значительных изменениях рН среды.
Культивируют, как на обычных (МПБ, МПА), так и на дифференцнально- днагностических средах (Эндо, Левина). В МПБ рост эшерихий характеризуется равномерным помутнением среды без осадка или с образованием незначительного осадка легко разбивающегося при встряхивании. В старых культурах образуется иногда пристеночное кольцо и очень редко пленка. Форму «R» бактерий продуцируют культуры образующие, осадок, а МПБ остается почти прозрачным.
На МПА форма «S» бактерий образуют округлые колонии, слегка выпуклые, непрозрачные с ровными краями. Форма «R» представлена сухими колониями, сплющенными, плотно прилегающими к среде с неровными краями. Размер колоний варьирует в пределах 2-10 мм.
На среде Эндо кишечная палочка растет в виде малиново-красных колоний с металлическим блеском или без него, а на среде Левина (агар с эозином и метиленовой синькой) в виде темно-фиолетовых или черных колоний.
Кишечная палочка не требовательна к питательной среде и способна размножаться даже в изотоническом растворе хлорида натрия [Я. Е. Коляков, С. С. Гительсон, Л. С. Каврук, 1990].
1.1.3. Биохимические свойства. Одним из ведущих дифференциальных признаков кишечной палочки, отличающих ее от бактерий других родов семейства Enterobacteracea является сбраживание лактозы с образованием кислота и газа [И. В. Голубева, 1985].
Кишечная палочка способна ферментировать многие сахара и многоатомные спирты, глюкозу, маннит, дульцит, сахарозу, арабинозу и др., но, как правило, не изменяет адонита и инозита. При сбраживании углеводов образуется пируват, превращающийся в молочную, уксусную и муравьиную кислоты. Глюкоза, лактоза, маннит сбраживаются с образованием кислоты и газа. Сахароза и дульцит ферментируются непостоянно.
Кишечная палочка не усваивает цитраты, не разжижает желатину, выделяет индол и не образует сероводород, дает положительную реакцию с метилротом и отрицательную Фогес-Проскауэра (не образует ацетилметилкарбинол), редуцирует нитраты в нитриты, непостоянно декарбоксилирует лизин и орнитин. Она не обладает фенилаланиндезаминазой и цитохромоксидазой, являющейся окислительным ферментом. Не растет на средах с цианистым калием [H. Fey, 1972; А. А. Гутковский, Г. Л. Дворкин, 1989; В. Г. Зароза, 1991; Ю. С. Кабанков, С. Ф. Армашу, 1991].
1.1.4. Антигенная структура. Дифференциация патогенных Е. coli от непатогенных стало возможным благодаря детальному изучению антигенной структуры бактерий рода Escherihia [Th. Smith, M. L. Orcutt, 1925; H. Knipschildt, 1945; F. Kaufman, 1966; H. Fey, 1972; G. Orskov, F. Orskov, 1984; А. А. Гутковский, Г. Л. Дворкин, 1989; Ю. С. Кабанков, С. Ф. Армашу, 1991].
В 1948 году была опубликована первая классификация Кауфмана-Книпшильдта- Вэлна, которая послужила основанием к международной классификации. [H. Fey, 1972].
Е. coli имеет сложную антигенную структуру. Различают соматический О- антиген, поверхностный (оболочечный) К-антиген и жгутиковый Н-антиген [H. Knipschildt, 1945; F. Kaufman, 1966; H. Fey, 1972; G. Orskov, F. Orskov, 1984].
В настоящее время по О-антигену эшерихии подразделяются на 180 серогрупп, по К-антигену на 104 и по Н-антигену на 56 серогрупп. Установлено 18 фимбриальных адгезинов (пили-антигены) [В.Г.Зароза, 1988, 1991].
Соматический О-антиген Е. coli термостабильный, резистентный к нагреванию при 100° С в течении 2,5 ч. Он представляет собой полисахариднопротеинолипидный комплекс.
К-антиген имеет полисахаридную природу и состоит из трех компонентов, обозначенных буквами L, В, А. Для типизации культуры по О-антигену ее прогревают при температуре от 100 до 121°С. L- и В-антигены обладают сходной термостабильностью. Антигенная способность штамма, обладающего В- антигеном не полностью разрушается при нагревании при 100° С в течение 2,5 ч. Более строгая дифференцнация между L- и В-антигенами происходит, когда культуру нагревают при 121°С. А-антиген сохраняет агглютинабильные и антигенные свойства после нагревания культуры при 100° С, но эти свойства утрачиваются при 121° С, через 2,5 ч. [Я. Е. Коляков, С. С. Гительсон, Л. С. Каврук, 1970; H. Fey, 1972; А. А. Гутковский, Г. Л. Дворкин, 1989; В. Г. Зароза, 1991]
Штамм Е. coli может обладать более чем одним типом К-антигена [G. Orskov, F. Orskov, 1984].
Жгутиковый Н-антиген термолабильный, обладает антигенными и агглютиногенными свойствами при нагревании до 60°С, эти свойства утрачиваются при 100° С. Химический состав антигена-Н белковой природы [Th. Smith, M. L. Orcutt, 1925].
Адгезивные антигены Е. coli имеют первостепенное, значение, поскольку они позволяют микроорганизмам конкурировать с бактериями коменсалами при паразитировании в организме животных.
Известно 7 типов специфических адгезивных антигенов: К99, К88, 987Р, СFА1, СFА2 и F7, Аtt25 [В. Г. Зароза, 1988; А. Н. Головко, 1997].
Адгезивный антиген К99 впервые описан в 1975 г. он характерен для кишечных палочек, энтеропатогенных для телят и ягнят, по некоторым сообщениям и для поросят, жеребят, козлят [F. Orskov, G. Orskov, H. W. Smith, W. J. Sojka, 1975; S. Tzipori, 1981].
В адгезивном антигене К99 в зависимости от иммунофоретической активности его фракций различают анионный и катионный компоненты. Первый содержится только в серотипах Е. coli О9, О101, а второй в серотипах Е. coli О8, О9, О20, О64, О101. Серотипы Е. coli с анионным компонентом вызывает агглютинацию эритроцитов овец, морских свинок и лошадей, а с катионным компонентом только эритроцитов лошадей.
При заболевании телят диареей Е. coli К99 обычно заселяют медиальный и каудальный сегменты тонкого кишечника. Энтеротоксигенные Е. coli с этим антигеном обычно вызывают диарею у 1-2-дневных телят и 1-4-дневных ягнят [H. W. Moon, S. C. Whipp, S. M. Skartvedt, 1976].
Адгезивный антиген К88 впервые описан в 1961г. По иммунофоретической подвижности адгезивный антиген К88 имеет три варианта: К88ав, К88ас и К88ад. [C. J. Murray, 1987].
Е. coli с адгезивным антигеном К88 вызывает в 71% случаев диарею у новорожденных поросят. [J. A. Morris, W. J. Sojka, 1985].
Адгезивные антигены 987Р и F41 впервые описаны в 1977г. и в настоящее время признаны энтеротоксигенными для поросят [B. Nagy, Gy. Nagy, 1982]. Характерная особенность культур Е. coli с адгезивпым антигеном 987Р - отсутствие способности агглютинировать эритроциты. Этот антиген не сочетается с К88, обладает более выраженными, чем К88 колонизирующими и адгезивными свойствами и встречается иногда у телят. Адгезивный антиген F41 в отдельных случаях у Е. coli может сочетаться с адгезивным антигеном К99 [J. A. Morris, W. J. Sojka, 1985].
Адгезивные антигены СFА1, СFА2, и F7 впервые описаны в 1975 (СFА1, СFА2) и в 1980 - F7 .Все эти антигены характерны для кишечных палочек, энтеротоксигенных для человека. Данные типы адгезивных антигенов термолабильны, обладают выраженной специфичностью, агглютинируют у человека эритроциты крови группы А [S. Tzipori, 1981].
Адгезивные антигены Е. coli закодированы в плазмидах, которые относятся к молекулам ДНК (независимо от хромосомы бактериальной клетки) и обладают способностью к репликации. При скрещивании бактерий-доноров с другими реципиентами плазмиды легко им передаются т.е. обладают трансмиссивностью [М. А. Сидоров, М. А. Соколова, 1982; J. A. Morris, W. J. Sojka, 1985].
Взаимосвязь адгезивных и соматических антигенов. При диареи телят энтеротоксигенные Е. coli с адгезивным антигеном К99 в 47 % случаев относятся к О-группе 101, а в остальных случаях к О-группам 64, 8, 9, 20. При холероподобных заболеваниях детей у энтеротоксигенных Е. coli адгезивный антиген СFА1 коррелирует с соматическим антигеном 78, а антиген СFА2 с О-группами 6 и 8 [B. Nagy, Gy. Nagy, 1982]. При диареи поросят энтеротоксигенные Е. coli с адгезивным антигенами К88, 987Р, К99 присутствуют у Е. coli О-групп 9, 20, 141, 101, 149, причем Е. coli О101 чаще всего синтезируют антиген К99 [M. Awad-Masalmeh, H. W. Moon, P. L. Runnels, R. A. Schneider, 1982].
1.1.5. Токсины. Несмотря на многочисленные исследования в области изучения биологии кишечной палочки, все еще недостаточно ясно, за счет каких именно свойств патогенных серотипов Е. coli обусловливается их энтеропатогенность и способность, в отличие от непатогенных кишечных палочек, вызывать заболевания у новорожденных телят [Ю. П. Вертиев, 1987].
Поэтому изучение токсических компонентов Е. coli имеет большое значение в расшифровке патогенности кишечной палочки.
Уже вскоре после открытия кишечной палочки отдельные исследователи отличали у данного микроба наличие токсических свойств [P. H. Romer, H. Much, 1906].
На основании наблюдений при заражении культурой кишечной палочки, установлено наличие у данного микроба двух типов токсических веществ: 1) вызывающих токсикоз и 2) обусловливающих энтерит [А. И. Улендеев, В. И. Оленин, О. Г. Тихонова, 1971; И. В. Голубева, 1985; Ю. В. Езепчук, 1985].
Впервые присутствие токсина в фильтратах бульонных культур кишечной палочки было отмечено А. Г. Радзинским [Д. Э. Беленький, 1932]; Его наблюдения в дальнейшем подтвердил Д. М. L. Barber, 1978, который установил, что кишечная палочка продуцирует два токсина - экзотоксин, появляющиеся в бульонной культуре уже в течение первых суток роста и эндотоксин, накапливающийся в тех же культурах позднее, в результате аутолиза микробных тел.
Токсичность суточных фильтратов бульонных культур исчезла после прогревания их при 56°С в течение 30 мин [Д. Э. Беленький, 1932]. Прогревание же «старых» фильтратов (из 20-40 суточных культур) при 56°С не приводило к потере их токсичности.
Более детальное изучение экзотоксинов Е. coli проводилось И. В. Голубевой, 1985. Автор исследовала экзотоксины в фильтратах бульонных культур 130 штаммов Е. coli. Ею были установлены различия в антигенных и иммуногенных свойствах экзо- и эндотоксинов. Величина смертельной дозы термолабильного колитоксина зависела от силы токсина каждого штамма, индивидуальной чувствительности животных и способа введения токсина. Наиболее характерные патологоанатомические изменения, вызываемые экзотоксином, автор обнаружила в нервных клетках спинного мозга.
Наличие у Е. coli экзо- и эндотоксинов было подтверждено многочисленными учеными: [В. Л. Елин, 1957; Т. П. Руденко, 1963; О. С. Андреева, 1966; K. Garson, E. Bull, 1970; А. И. Улендеев, 1971; H. Fey, 1971b; C. Wray, J. R. Thomlinson, 1972; H. Fey, 1972; J. W. Boyd, J. R. Baker, A. Leyland, 1974;Л. К. Волынец, 1975; E. T. Anderson, L. S. Young, W. L. Hewitt, 1978; Дж. Х. Б. Рой, 1982; J. Blanu, J. H. Parvu, O. Ivanciu, 1983; W. H. Ewing, 1986; А. А. Гутковский, Г. Л. Дворкин, 1989; Л. Сланина, 1989; В. А. Ушкалов, 1992].
Эндотоксины Е. coli представлены полисахаридо-липидо-протеиновым комплексом, ассоциирующимся с О-антигеном, который интегрирован в кишечную стенку и сому. Это основной токсин общий для патогенных и апатогенных грам- негативных микроорганизмов. Эндотоксиновый комплекс может быть экстрагирован из бактерий в количестве 5-10 % в который входят: полисахариды 45-60 %, липид А 5-15 %, протеин 15-20 % и липиды 10% [Д. Э. Беленький, 1932; C. Wray, J. R. Thomlinson, 1972].
Эндотоксины обладает важным биологическим эффектом в течение инфекционного процесса, вызванного грам-негативными микроорганизмами, иммунотерапия и иммунопрофилактика в данном случае являются чрезвычайно необходимы [C. Wray, J. R. Thomlinson, 1972; I. Kim, D. W. Watson, 1978; D. C. Morrison, R. J. Ulevitch, 1978; E. Neter, 1983]. Но защита против эндотоксина не возможна О-антителами, что достигается защитой против экзотоксинов, продуцируемых грам-позитивными микроорганизмами [H. Fey, 1972].
Антисыворотка против эндотоксинов, полученная при О-антигенной стимуляции обладает нейтрализующим антитоксическим эффектом по отношению к данному штамму [S. Lariviere, R. Lallier, M. Morin, 1979]. Несмотря на этот обнадеживающий факт, эндотоксины грам-негативных бактерий не могут быть нейтрализованы сходным образом как токсины клостридий. В связи с этим антиэндотоксическая сыворотка не обладает терапевтическим и профилактическим действием по сравнению с дифтерийным токсином [H. Fey, 1971а; H. Fey, 1971b;].
Энтеротоксин Е. coli представляет собой токсический комплекс, продуцируемый внеклеточно бактериальной клеткой. Энтеротокоин стимулирует возникновение диареи, вследствие чего нарушает водно-минеральный статус. Основным методом, позволяющим идентифицировать штаммы продуцирующие энтеротоксин является метод «кишечной лигатуры» [И. В. Голубева, 1985; M. Decun, 1986; А. А. Гутковский, Г. Л. Дворкин, 1989]. Энтеротоксигенные эшерихии пролиферируют в кишечник ворсинки и вызывают большое накопление полостной жидкости и диарею.
Энтеротоксины Е. coli состоят из двух фракций:
1. Фракция термостабильная (ТS) резистентная к нагреванию при 100° С в течение 30 мин.
2. Фракция термолабильная (TL) резистентная к нагреванию при 60° С в течение 10 мин.
Установлено тесное антигенное сходство между термолабильным энтеротоксином Е. coli и энтеротоксином Vibrio cholerae [W. J. Sojka, 1971; E. Salajka, 1980].
Термостабильный энтеротоксин Е. coli способен диализироваться, резистентный к воздействию кислот, трипсина, не обладает антигенными (иммунными) свойствами. Энтеротоксин Е. coli вызывающий диарею, часто изолируют при энтеритах у телят, и, исключительно, редко при септицемийном колибактериозе [G. Sivaswamy, C. L. Gyles, 1976]. В очаге колибактериоза при энтеритной форме выделяют энтеротоксигенные типы Е. coli из фекалий телят и здоровых коров-матерей в достаточно высокой пропорции [H. W. Smith, 1971; G. Sivaswamy, C. L. Gyles, 1976; M. Decun, 1986].
Энтеротоксины имеют плазмидную природу. Ent+ плазмида контролирует синтез энтеротоксина у патогенных эшерихий. Передача фактора Ent+ при конъюгации происходит независимо или одновременно с факторами Hly+, K88+, соl+ и R [H. W. Smith, 1976; М. А. Сидоров, Т. К. Курашвили, 1978; H. W. Smith, 1978; В. А. Ушкалов, 1994].
Повышение секреторных процессов в кишечнике новорожденных после введения термолабильного энтеротоксина Е. coli происходит вследствие активизации гуанилциклазы в слизистой кишечника, которая вызывает образование внутриклеточного циклического гуанозин 3,5-монофосфата [W. Gaastra, F. K. de Graaf, 1982; H. de Jonge, 1984; C. L. Gules and K. K. Baxi, 1987].
Термолабильный энтеротоксин Е. coli обладает антигенными свойствами и в отличие от термостабильного энтеротоксина имеет специфические рецепторпые зоны на слизистой кишечника новорожденных. Этот знтеротоксин подобно холерному вибриону (Vibrio сholerae) стимулирует активность аденилциклазы, которая вызывает накопление внутриклеточного циклического аденозин 3,5- монофосфата, что приводит к нарушению секреции воды и электролитов и развитию диареи в первые 10-18 ч его действия.
В качестве тестов для выявления термостабильного энтеротоксина могут быть использованы проба на инфантильных мышатах и проба с расширением перевязанного сегмента тонкого кишечника поросят и телят [Н. И. Романенкова, В. Е. Ефремов, В. Е. Клеганов, 1963; H. Fey, 1972; S. C. Whipp, H. W. Moon and N. C. Lyon, 1975; P. M. Newsome, M. N. Burgess, R. J. Bywater, C. M. Cowley, N. A. Mullan, 1978; C. M. Wise, A. P. Knight, M. J. Lucas, 1983; J. P. Dube, 1990].
Для обнаружения термолабильного энтеротоксина использует пробу с перевязанным сегментом тонкого кишечника кролика или морской свинки [H. W. Moon and S. C. Whipp, 1971; M. M. Levine, D. R. Nalin, R. B. Hornick, 1978; J. S. Seriwatana, P. Echeverria, D. N. Taylor, 1988].
1.1.6. Клинические симптомы колибактериоза. Большинство авторов характеризует колибактериоз, как инфекционное заболевание протекающее в трех формах: септицемической, энтеритной и энтеротоксемической [Ф. Гутира, И. Марек, Р. Маннингер, И. Мочи, 1961; Г. В. Гнатенко, 1968; Л. Н. Головнев, 1970; Я. Е. Коляков, С. С. Гительсон, Л. С. Каврук, 1970; W. J. Sojka, 1970; H. Fey, 1972; T. Gossling, K. A. McKay and D. A. Barnum, 1974; Л. К. Волынец, 1975; К. Эльце, Х. Мейер, Г. Штейнбах, 1977; J. N. Roy, 1980; E. Salajka, 1980; M. E. Amstutz, 1985; M. Decun, 1986; В. С. Шипилов, В. П. Шишков, В. Г. Зароза, В. П. Карев, Г. Д. Смоленская, 1987; A. K. Gupta and K. K. Baxi, 1987; Ю. Н. Федоров, 1988; D. H. Zeman, J. U. Thomson, D. H. Francis, 1989; А. А. Гутковский, Г. Л. Дворкин, 1989; В. Г. Зароза, 1989; А. С. Ковалев, 1989; B. H. Janke, D. H. Francis, J. E. Collins, 1990; Г. П. Задорожняя, В. Д. Уманец, 1990; Ю. С. Кабанков, С. Ф. Армашу, 1991; В. Г. Зароза, 1991; М. А. Сидоров, 1996].
Колисептицемийная (септическая) форма протекает очень остро и, обычно телята погибают через 3-6 дней после рождения. Новорожденные телята внезапно отказываются от молозива (молока), находятся в состоянии прострации, не способны стоять, глаза запавшие, дыхание и сердцебиение учащенные, возможна диарея, но чаще отсутствует, животные подвергаются быстрой дегидратации, вызывающая гибель животного после коматозного состояния через один два дня после начала заболевания. У отдельных животных развиваются артриты и менингоэнцефалит. Из других признаков отмечают сонливость, парез, опистотонус, атаксию, судороги [T. K. Korhonen, M. V. Valtonen, J. Parkkinen, 1985].
Энтеритная форма характеризуется диареей и основным симптомом дегидратацией варьирующей от слабой до тяжелой. Фецес жидкий, желтого или серо-белого цвета. Телята не погибают быстро, они могут болеть в течение недели без прироста массы или могут даже выздоравливать. Эта форма наиболее часто встречается в Англии [W. J. Sojka, 1971], Ирландии [M. Morrin, S. Lariviere, R. Lallier, 1976], Канаде и США [J. Hadad, C. L. Gyles, 1982], тогда как в Швейцарии преобладает септицемическая форма колибациллеза [H. J. Greene, 1984].
Энтеротоксемическая форма колибациллеза характеризуется коллапсом и чрезмерной прострацией. Течение очень быстрое, не наблюдается диарея, смерть наступает обычно в пределах 6-16ч от начала заболевания, животное теряет мышечный тонус и становится параличным. При данной форме бактериемия не развивается, но массивная пролиферация Е. coli наблюдается в нижней и задней части тонкого кишечника. Штаммы Е. coli мукоидного типа, принадлежащие к О группам 9 и 10 и обладающие капсулярным антигеном А внедряются в мезентериальные лимфатические узлы [С. С. Gay, 1971; С. С. Gay, S. M. Parish, T. C. McGuire 1982].
1.1.7. Патогенез. Основным путем инфицирования телят большинство исследователей считают алиментарный. Не исключается также заражение через носоглотку, внутриутробно и другими путями [Я. Е. Коляков, С. С. Гительсон, Л. С. Каврук, 1970; H. Fey, 1972; B. Tennant, D. Harold and Reina- M. Guerra, 1972; B. Tennant, D. Harold, Reina- M. Guerra, 1975; Дж. Х. Б. Рой, 1982; R. D. Linnabary, D. F. Dean, 1983; У. Риихикоски, 1986; I. Castrucii, F. Frigeri, M. Ferrari, 1987; А. А. Гутковский, Г. Л. Дворкин, 1989; В. Г. 3ароза, 1991].
В результате быстрого размножения бактерий и значительного увеличения их количества в кишечнике происходит быстрый распад микробов, при котором высвобождаются токсические продукты - эндотоксины, вызывающие воспаление желудка и кишечника, вследствие чего резко усиливается перистальтика, что также следует рассматривать как рефлекторную защиту организма, стремящегося быстрее вывести из кишечника раздражающий агент [M. Morrin, S. Lariviere, R. Lallier, 1976].
При недостаточной активности защитных механизмов кишечной стенки и, прежде всего фагоцитоза, эшерихии проникают в лимфатическую и кровеносную системы и вызывают септический процесс, который приводит к летальному исходу.
Начавшийся понос вызывает резкое обезвоживание тканей организма. Размножение в крови бактерий и наводнение организма токсическими продуктами их жизнедеятельности и тканевого распада угнетают деятельность центральной нервной системы, что дает к концу заболевания картину теплого коматозного состояния.
Новорожденный теленок является полностью неспособным противостоять инфекционным заболеваниям, и кишечник его стерилен. Поэтому теленку необходимо в течение первых четырех часов жизни выпоить не менее двух литров молозива. С молозивом теленок получает антитела, которые препятствуют размножению бактерий и вирусов, у него формируется пассивный иммунитет. Приобретенная таким образом способность к сопротивлению продолжается в течение 3-4 недель, после чего у теленка в 4-5 недельном возрасте развивается активный иммунитет [Th. Smith, and M.L. Orcutt, 1925; E. F. Logan, and W. J. Penhale, 1971; W. J. Penhale, E. F. Logan, A. Stenhouse, 1971; I. E. Selman, G. H. de la Fuente , E. W. Fisher and A. D. MсEwan, 1971; E. F. Logan, 1974; J. N. Roy, 1980; G. H. Stott A. Pellah, 1982; Т.Е. Besser, 1991; L. J. Perino, 1995].
Синдром дефицита антител (СДА) появляется у подсосных телят, если они получают недостаточное количество молозива или в молозиве отсутствуют гаммаглобулины. Содержание гаммаглобулинов в сыворотке крови в количестве более 500 мг обеспечивает невосприимчивость к колибактериозу. С другой стороны установлено, что 82,4% телят, болевших колибактериозом имели выраженный СДА [R. Kruedener, 1970].
Колибактериоз вызывается небольшим количеством энтеропатогенных штаммов, продуцирующих энтеротоксины, к которым новорожденные животные обладают повышенной чувствительностью [E. M. Kohler, 1971; A. Kircher, 1981].
Энтеротоксины Е. coli стимулируют аденилциклазу в эпителиальных клетках кишечника. Этот энзим действует каталитически при образовании циклического 3’,5’-аденозинмонофосфата (сАМР) из аденозинтрифосфата (АТР). Увеличение количества 3,5 аденозинмонофосфата с (АМР) вызывает изменение транспортировки ионов, ингибируя активную абсорбцию натрия и стимулируя выделение ионов хлора и бикарбоната, вследствие чего происходит накопление жидкости в просвете кишечника и в результате наблюдается сильный понос [E. Salajka, 1980].
Многие исследователи полагает, что дефицит витамина А является главным условием для возникновения колибациллеза у телят [Н. И. Старикова, 1994; Н. И. Старикова, 1994].
Телята, родившиеся от коров с низким содержанием витамина А в молозиве были более подвержены заболеваниям, таким как белый понос, пупочная инфекция, заболевание суставов, по сравнение с телятами, родившимися от коров с относительно высоким содержанием витамина А [F. Blakemore, A. Davies, E. Eylenburg, Т. Moore, K. C. Sellers and A. N. Worden, 1948]. Взаимосвязь между дефицитом витамина А и колибациллезом также установили и другие ученые: [R. A. Willoughby, D. G. Buttler and J. K. Thorton, 1970; H. Fey, 1972; R. G. Hansen, P. H. Phillips, G. W. Rupel, 1976; J. N. Roy, 1980; H. Fey und S. Lindt, 1982; G. J. Pearson, E. F. Logan, 1986]
По некоторым данным [W. J. Sojka, 1970; H. Fey und G. Hunyady, 1972; В. М. Чекишев, В. М. Васильев, А. И. Кабанцев, 1983; R.K. Braun, B.C. Tennant, 1983; A. S. Sheikh P. S. Bradford, S. C. James, B. Patricia, B. F. Thomas, H. Richard, D. George, D. R. Lin, W. Bert, 1995], решающая роль иммуноглобулинового дефицита в патогенезе колисеятицемии у неонатальных телят, принадлежит грам-негативным бактериям.
1.1.8. Специфическая профилактика и терапия. Неуклонное выполнение комплекса зоотехнических, зоогигиенических и организационных мероприятий является незыблемой основой в деле получения, сохранения и выращивания молодняка. Исходя из этого для предупреждения колибактериоза, прежде всего, необходимо создать хорошие условия кормления и содержания стельных коров и новорожденных телят. Изоляция новорожденных телят в специальном изолированном приёмном отделении является важнейшим звеном в цепи эффективных профилактических и противоэпизоотических мероприятий против колибактериоза телят. Необходимость и эффективность таких мероприятий признаны давно, и проведение их рекомендуется многими учеными [H. Fey, 1972; Л. К. Волынец, 1978; А. В. Драгомир, 1982; В. Т. Самохин, М. А. Сидоров, Г. К. Волков, 1983; П. А. Рыдак, 1984;С. И. Джупина, И. И. Фельдман, В. М. Чекишев, 1986; P. Г. Иксамов, М. П. Неустроев, 1987; Г. Ф. Коромыслов, Н. Н. Михайлов, 1987; А. А. Гутковский, Г. Л. Дворкин, 1989; Т. Otoi, Т. Toujou, H. Toujou, M. Hasimoto, 1990; В. Г. 3ароза, 1991; С. И. Плященко, 1991; Г. К. Волков, В. Н. Гущин, В. Д. Баранников, 1996; E. С. Воронин, Д. А. Девришов, Р. В. Петров, В. П. Шишков, 1996; А. Н. Куриленко, 1996].
Раннему выпаиванию молозива придают большое значение [Я. Е. Коляков, С. С. Гительсон, Л. С. Каврук, 1970; A. D. MсEwan, E. W. Fisher, I. E. Selman, 1970; T. C. Guire, N. E. Pfeiffer, J. M. Weikel and R. C. Bartsch, 1976; Я. Е. Коляков, 1978; М. И. Немченко, Т. Д. Гришина, 1983; М. И. Немченко, 1984; В. Г. 3ароза, 1985; R. Morar, 1985; Г. В. Полушин, 1987; E. С. Воронин, Д. А. Девришов, Л. Я. Ставцева, 1989; М. И. Немченко, 1989; E. С. Воронин, Л. Я. Ставцева, Т. Н. Грязнева, 1990; P.E. Howe, 1991; К. Ф. Думбур, В. В. Левенец, О. Н. Ткаченко, А. К. Думбур, 1996]. При хранении молозива химический состав его быстро приближается к составу обычного молока, причем кислотность молозива у одних коров понижается быстро, в то же время как у других постепенно. Снижение кислотности молозива неблагоприятно влияет на организм теленка, в таких случаях отмечается большой процент заболевания и отхода.
Специфическая профилактика основана на пассивной иммунизации новорожденных сывороткой. О положительном применении антиколибактериозной сыворотки сообщали многие исследователями [P. Ehrlich, 1892; C. O. Jensen, 1905; Ф. Гутира, И. Марек, Р. Маннингер, И. Мочи, 1961; С. И. Губкин, А. И. Коган, 1971; A. Dam, 1971; E. F. Logan, and W. J. Penhale, 1971; Я. Е. Коляков, 1978; Y. Danieli, I. Kornitzer, R. Tamarin, 1979; А. Т. Флюстиков, 1982; В. А. Аликаев, В. В. Матюшин, 1983; Е. В. Андреев, М. Д. Бакуменко, А. К. Панасенко, В. И. Тертышник, Л. Т. Лещенко, Р. И. Бессараб, 1983; Г. В. Гнатенко, Л. Т. Тупица, 1984; В. М. Чекишев, Т. В. Бондарь, О. А. Колганова, 1985; Г. В. Полушин, 1987; C. M. Scanlan, 1988; Е. С. Сухарев, 1994; М. Х. Шайхаманов, В. П. Грамолин, Б. М. Авакаяц, 1994; Г. К. Волков, В. Н. Гущин, В. Д. Баранников, 1996; B. C. Солодков, Е. Э. Школьников, Г. Ф. Коломнина, Е. М. Лукьянова, В. Н. Алейников, 1996; С. В. Вальциферова, 1997] .
Противоколибактериозную сыворотку особенно важно вводить телятам, которые были лишены молозива и молодняку, матери которых были переведены из другого хозяйства и поэтому содержат в молозиве антитела, несоответствующие микрофлоре нового помещения [B. C. Шипилов, В. К. Копытин, 1984; C. Staak, 1992].
Исследования [M. M. EI-Nageh, 1967; H. Fey, 1971a; H. Fey und G. Hunyady, 1972; B. Tennant, B.H. Baldwin, 1979; H. Fey und A. Margadant, 1981; М. И. Немченко, Т. Д. Гришина, 1983; Ю. Н. Федоров, И. Д. Фесенко, М. Ю. Горбунова, С. О. Кодыров, И. Ю. Пичкова, 1983; В. М. Чекишев, В. М. Васильев, А. И. Кабанцев, 1983; М. И. Немченко, 1984; В. Т. Сидоров, 1984; B. C. Шипилов, В. П. Шишков, В. Г. Зароза, В. П. Карев, Г. Д. Смоленская, 1987; A. Badiu, T. Nedelcu, 1989; Ю. Н. Федоров, 1996; Ю. Н. Федоров, О. А. Верховский, 1996], показали большое значение гипогаммаглобулинемии, как одного из важных предрасполагающих факторов в возникновении колибактериоза у новорожденных телят. Авторы установили, что у всех телят павших от колисептицемии, наблюдалась гипо- или агамаглобулинемия [A. K. Lascelles, G. H. Me Dowell, 1974; T.C. McGuire, D.S. Adams, 1982].
Наличие К агглютининов в сыворотке молозива, защищающих телят от колисептицемии и других форм колибациллеза обнаружил С. С. Gay, 1971. Им установлено, что 45 телят из 59 кормившихся молозивом погибли вследствие отсутствия К агглютининов в скармливаемом молозиве.
Аналогичные исследования о дефиците К агглютининов в молозиве коров и, следовательно, о развитии колисептицемии у новорожденных телят провели многие ученые [C. Briggs, 1951; H. W. Smith and M. A. Linggood, 1972; F. Orskov, G. Orskov, H. W. Smith and W. J Sojka, 1975; B. Kaijser, S. Ahlstedt, 1977; В. Б. Федотов, 1982; J. Hadad, C.L. Gyles, 1982].
Успехи, достигнутые в изучения антигенной структуры возбудителя колибактериоза телят, позволили ученым предложить активные средства специфической профилактики этого заболевания иммунные сыворотки и лактоглобулины [Ф.Н.Щепетов, 1951; R. Aschaffenburg, S. Bartlett, S. K. Kon, J.M. Roy and D. M. Walker, 1951a; P. Lepine, 1963; К. Геров, П.Чушков, Р. Георгиева, 1965; В. К. Чернуха, 1968; С.И.Губкин, А. И. Коган, 1971; Н. С. Жосан, 1974; Н. С. Жосан, 1976; Е.В.Гублер, А. А. Генкин, 1978; L. S. Young, 1984; В. Б. Билоштан, 1985; В. П. Павлов, Т. Н. Грязнева, Е. В. Чичикова, 1988; Н. С. Жосан, 1992; В. В. Бурсуков, 1993; W. Zaremba, 1993; С. В. Вальциферова, 1997].
О положительных результатах фаготерапии в ранних случаях заболевания телят колибактериозом сообщали многие исследователи [К. Н. Шерстобаев, 1944; С. Н. Муромцев, 1947; Я. Е. Коляков, С. С. Гительсон, Л. С. Каврук, 1970; H. Fey, 1972; Л. Б. Борисов, 1976; Я. Е. Коляков, 1978; А. С. Овод, А. Г. Морозов, 1986; M. Decun, 1986; А. А. Гутковский, Г. Л. Дворкин, 1989].
Для лечения диареи у новорожденных телят У. Риихикоски (1986) рекомендует следующую программу: a) голодная диета; b) лечение с применением минеральных солей; c) лечение антибиотиками; d) лечение путем повышения кислотности внутри кишечника; e) профилактика всасывания в кровь бактерий и их токсинов; f) создание животным хороших условий содержания и обеспечение их качественными кормами.
В качестве неспецифических профилактических и лечебных средств при колибактериозе рекомендуются и используются различные антибиотики [И. Е. Мозгов,1968; W. J. Sojka, 1971; H. Fey, 1972; B.J. Buntain and I.E. Selman, 1980; E. С. Фортинская, А. М. Наумова, Е. А. Маркова, 1983; H. J. Greene, 1983; М. А. Сидоров, В. Н. Гущин, 1984; H. Balbierz, L. Kuchar, 1984; С. И. Джупина, И. И. Фельдман, В. М. Чекишев, 1986; G. Rademacher, G. Dirksen, 1986; А. А. Гутковский, Г. Л. Дворкин, 1989; Г. П. 3адорожняя, В. Д. Уманец, 1990; В. А. Антипов, 1991; Ю. Юнисова, Т. П. Жарова, 1996; П. А. Паршин, С. В. Шабунин, 1997].
В связи с очень широким применением антибиотиков, приобрела особо важное значение проблема антибиотикоустойчивости микробов. Увеличение антибиотикоустойчивых штаммов микробов может изменить микробиологический, клинический, возможно эпизоотологический фон ряда инфекционных болезней и, в первую очередь, массовых заболеваний молодняка. Антибиотикоустойчивые штаммы кишечной палочки, выделяясь в большом количестве с фекалиями во внешнюю среду инфицируют помещения, предметы ухода за телятами, посуду и др., что приводит к попаданию и заселению кишечника новорожденных клинически здоровых телят. Поэтому в настоящее время антибиотики применяются предварительным определением чувствительности изолированных микробов к антибиотикам [Г. В. Гнатенко, 1968; Я. Е. Коляков, 1978; R. J. Bywater, 1983; Л. А. Таранова, 1984; E. С. Фортинская, А. М. Наумова, Е. А. Маркова, 1983; В. А. Антипов, 1991].
Исследованиями ряда авторов [J. W. Boyd, J.R. Baker, A. Leyland, 1974; К. Эльце, X. Мейер, Г. Штейнбах, 1977; O. M. Radostis, S. D. Acres, 1983; Ю. А. Ширванян, А. А. Акопов, 1985; M. Decun, 1986; А. А. Гутковский, Г. Л. Дворкин, 1989] была установлена высокая чувствительность преобладающего числа штаммов Е. coli к cульфаниламидным препаратам, тогда как, их устойчивость к некоторым антибиотикам значительно повышалась.
Для профилактики колибактериоза новорожденных телят М. А. Сидоров с соавт. (1978, 1980, 1996) рекомендует применять колипротектан сразу после рождения в дозе 10-15 мл per os и затем в течение двух дней в той же дозе (всего 6 раз). Колипротектан способствует резкому снижению заболеваемости (до 10-20%) и повышению сохранности телят (до 95-98 %). Применению материнской и гетерогенной крови при острых желудочно-кишечных заболеваниях новорожденных животных посвящено немало работ отечественных и зарубежных авторов [H. Fey, 1972; Е. В. Андреев, М. Д. Бакуменко, А. К. Панасенко, В. И. Тертышник, Л. Т. Лещенко, Р. И. Бессараб, 1983; Дж. Х. Б. Рой, 1982; У. Риихикоски, 1986; А. А. Гутковский, Г. Л. Дворкин, 1989]. Опыты [В. П. Урбан, 1966; В. К. Чернуха, 1968; В. П. Урбан, И. Л. Найманов, 1985; В. П. Павлов, Т. Н. Грязнева, Е. В. Чичикова, 1988] показали, что использование сывороточных поли- и гаммаглобулинов бывает более результативным, чем применение цельной крови.
Из симптоматических средств E. W. Fisher and de la G. H. Fuente, 1972; H. Rascova, 1974; Е. Рашкова, Т. Сехер, К. Рашка, В. Матейовска, Л. Палак, 1976; J. Blanu, J. H. Parvu, O. Lvanciu, 1983; R. J. Bywater, 1983; В. В. Митюшин, 1984; H. J. Greene, 1984; I. M. Naylor, 1986; Г. Ангелов, Б. Абделмалек, 1987; I. M. Naylor, 1987; А. И. Теш, 1990; Н. Т. Винников, 1993; А. Г. Шитый, Н. С. Дудникова, Л. М. Тихомирова, 1993; М. Х. Шайхаманов, В. П. Грамолин, Б. М. Авакаяц, 1994, рекомендуют при колибактериозе телят, сопровождающимся профузным поносом и сильным обезвоживанием организма, применение водно-электролитных растворов. В связи с тем, что объем плазмы крови уменьшается и она становится гипоосмотической по отношению к кишечной жидкости, так как не только вода, но н ионы Na+, K+, Cl- и HCO3- выходят из плазмы в просвет кишечника, а слизистая кишечника превращается в секреторный орган, всасывание воды и электролитов прекращается. Авторы рекомендуют в начале болезни, при легком течении, изотонические растворы а при тяжелом течении — парентерально — гипертонические, с обязательным включением ионов натрия, хлора и бикарбоната.
Некоторые авторы рекомендуют витаминотерапию, например гексавит (А1, В1, В2, В6, С, Е, Р). Рутин увеличивает продолжительность циркуляции солевых кристалловидных растворов в кровяном русле и тем самым уменьшает проницаемость капилляров. Витамин С устраняет гипоксию и метаболический ацидоз, содействует нормализации окислительно-восстановительных процессов [F. Blakemore, A. Davies, E. Eylenburg, Т. Moore, K. C. Sellers and A. N. Worden, 1948; R. G. Hansen, P. H. Phillips, G. W. Rupel, 1976; В. А. Аликаев, В. В. Матюшин, 1983; В. И. Федюк, 1983; У. Риихикоски, 1986; А. А. Гутковский, Г. Л. Дворкин, 1989; Я. Я. Самуйленко, 1996].
Антисекреторные факторы (хлорпромазин и другие производные фенотиазина, никотиновая кислота, опий, аспирин, соматостатин, гликокортикоиды, амфотерицин В, производные барбариса и др.) приводят к нормальной абсорбции электролитов и воды в кишечнике, ингибируя чрезмерную секрецию. Хлорпромазин обладает сильным антисекреторным действием, ингибируя диарею, вызванную энтеротоксином TL — Е. coli. Этот препарат ограничивает чрезмерную активность циклического аденозинмонофосфата (сАМР). Он действует анти-секреторно при лечении диареи, вызванной энтеротоксином TS — Е. coli.
Кроме анти-секреторной деятельности фенотиазиновые препараты обладают довольно сильным бактерицидным действием, по отношению к некоторым штаммам Е. coli. Кроме того данные препараты воздействуют на плазмиды, ответственные за синтез адгезивных фимбрий, энтеротоксинов, а также препятствуют комплексной резистентности эшерихий к антибиотикам и тормозят синтез компонентов адгезивных антигенов, ограничивающие колонизирующее действие [A. I. Furowicz, W. Zyska, 1988].
1.2. Специфическая иммунологическая реактивность телят в постнатальный период
Молозиво является для новорожденного исключительно полноценной и легко усвояемой пищей. Обеспечивая потребности новорожденного в необходимых питательных веществах, оно, кроме того, является носителем иммунных тел и антибактериальных веществ, передающихся от матери потомству, служащих для защиты молодого организма от инфекции на первом этапе жизни.
Природа защитных свойств молозива была предметом длительного изучения. Впервые исследования по выяснению роли молозива в создании иммунитета телят начались после опубликования работ P. Ehrlich [1892], который установил, что у детенышей, рожденных от мышей, иммунизированных рицином и абрином невосприимчивость к этим ядам не передается плацентарным путем, а появляется только после сосания молозива иммунизированных мышей.
Оценивая эксперименты Эрлиха И. И., М. Мечников [1951] писал: «В своих этюдах об унаследованном иммунитете Эрлих указал еще на другой важный фактор, именно на прямую передачу материнских антител в молоко при сосании. Он прямо показал своими опытами над мышами, происходившими не от иммунных матерей, а вскормленных иммунными самками, что благодаря этому, молодые мыши были иммунизированы к рицину, абрину и столбнячному токсину. Это интересное поле исследований дало много важных результатов, а в будущем, наверное, будет еще многое достигнуто в этом направлении».
У различных видов животных, у которых эпителиохориальная плацента (лошади, крупный рогатый скот, свиньи, козы) антитела не проникают из материнского организма в плод плацентарным путем. У этих видов животных передача антител от матери новорожденному возможна колостральным путем (через молозиво). С молозивом новорожденные жвачные получает необходимый запас иммунных тел. [П. П. Емельяненко, 1987; Ю. Н. Федоров, 1988; И. М. Карпуть, 1993]
Иммунологическое исследование молозива показало, что концентрация антител в молозиве превосходит таковую в сыворотке крови. Больше того, молозиво содержит антитела, отсутствующие в сыворотке [В. А. Фортушний, 1984].
Результаты исследований Th. Smith and R.B. Little, 1922b; R. S. Comline H. E. Roberts, D. A. Fitchen, 1951; R. S. Comline, H. E. Roberts, D.A. Fitchen. 1951; H. Fey, 1968; A. Kaeckenbeeck, G. Colinet, F. Schoenaers, 1971; P. D Porter, 1972; W. J. Penhale, E. F. Logan, I. E. Selman, E. W Fisher, 1973; У. Дж. Герберт, 1974; G. H. Stott and B. E. Menefel, 1977; J. A. Patt, 1977; И. И. Головистиков, 1979; G. H. Stott, D. B. Marx, B. E. Menefel and G. T. Nightengale, 1979; G. H. Stott, D. B. Marx, B. E. Menefel and G. T. Nightengale, 1979; G. H. Stott, D. B. Marx, B. E. Menefel and G. T. Nightengale, 1979; Т. Brignole, J. Stott, 1980; L. J. Buch, Т. Е. Staley, 1980; И. М. Карпуть, В. М. Холод, 1982; G. H. Stott A. Pellah, 1982; Ю. Н. Федоров, И. Д. Фесенко, М. Ю. Горбунова, С. О. Кодыров, И. Ю. Пичкова, 1983; Э. Купер, 1985; В. М. Чекишев, Т. В. Бондарь, О. А. Колганова, 1985; B. C. Шипилов, В. П. Шишков, В. Г. Зароза, В. П. Карев, Г. Д. Смоленская, 1987; Н. С. Жосан, 1988; В. Г. 3ароза, 1989; С. И. Плященко, В. Т. Сидоров, А. Ф. Трофимов, 1990; Т. Е. Besser, O. Szenci, C. C. Gay, 1990; Ю. Н. Федоров, О. А. Верховский, 1996; F. В. Carry, 1996, также свидетельствуют о том, что абсорбция иммуноглобулинов молозива происходит обычно в течение первых 24—36ч жизни животного, постепенно замедляясь к 10- 12 ч возраста вплоть до полного прекращения. Всасывание иммуноглобулинов происходит в кишечнике, и через лимфатические пути они попадают в кровь. Иммуноглобулины появляются в лимфе уже через 1-2 ч после поступления их в двенадцатиперстную кашку животного.
Большое значение молозива в создании иммунитета у новорожденных телят впервые отметили P. H. Romer, H. Much [1906]. В дальнейшем их данные были подтверждены исследованиями многочисленных авторов [R. Aschaffenburg, S. Bartlett, S. K. Kon, P. Terry, S. Y. Thompson and D. M. Walker, 1949a; R. Aschaffenburg, S. Bartlett, S. K. Kon, D. M. Walker, C. Briggs, E. Cotchin and R. Lovell, 1949b; R. Aschaffenburg, S. Bartlett, S. K. Kon, J. M. Roy and D. M. Walker, 1951a; R. Aschaffenburg, S. Bartlett, S. K. Kon, S. Y. Roy, D. M. Walker C. Briggs and R. Lovell, 1951b; C. Briggs, 1951; E. Selman, A. D. McEwan and E. W. 1970; P. Blackmer, 1973; V.C.R. Irvin, 1974; С. В. Вальциферова, 1997; L. Hirszfeld et J Lille-Azyszkowierz, 1979; J. N. Roy, 1980; И. М. Карпуть, В. М. Холод, 1982; С. С. Gay, 1984; J. J. Geene, 1984; R. Morar, 1985; Г. Н. Печникова, Т. В. Окунева, О. Н. Грызлова, 1988; И. М. Карпуть, А. Г. Ульянов, В. И. Бабин, 1990; P.E. Howe, 1991; C. Staak, 1992; W. Zaremba, 1993; Т. Е. Besser, C. C. Gay, 1994; P. P. Игнатьев, Г. Ч. Бондаренко, 1994; F. В. Carry, 1996; Д. Н. Масюк, 1997; L. J. Perino, 1997].
В сыворотке крови новорожденных телят не обнаруживали агглютинины [Th. Smith and R. B. Little, 1922; Th. Smith and R.B. Little, 1922b; S. C. Whipp and S. T. Donta, 1976; A. N. Thepfilopoulos, F.J. Dixon, 1979; J. M. Tyler, J. S. Cullor, M. C. Thurmond, 1989; K. Walser und H. Brumer, 1987] к кишечной палочке, хотя в сыворотке крови матерей и в молозиве они имелись в значительном количестве. После поения теленка молозивом в сыворотке его крови указанные агглютинины появлялись. Более того, молозиво, полученное в первые часы после отела, в дозе 0,2 мл предохраняло морских свинок от заражения 1-1,5 минимальными смертельными дозами культуры кишечной палочки. Авторы пришли к заключению, что кормление телят молозивом имеет огромное значение в создании невосприимчивости к колиинфекции.
В молозиве коров обнаружен иммунный глобулин, имеющий огромное значение, как носитель антител, в создании устойчивости новорожденных телят к инфекционным заболеваниям [H. W. Smith, 1971; H. W. Smith, 1976; H.W. Smith, 1978] .
Исследования механизмов транспорта и катаболизма иммуноглобулинов in vitro показало, что в начале всасывания образуется комплекс между иммуноглобулинами и специфическими рецепторами энтероцитов. Во взаимодействии с рецепторами клеток кишечника участвует Fc-фрагмент иммуноглобулинов. Вероятно, связывание иммуноглобулинов с клетками предохраняет их от катаболизма и способствует транспорту в кровь [D. Eddie, M. Sohulkind, I. Robbins, 1971; И. И. Головистиков, 1979]. Процесс переноса наиболее активно идет при рН 6,0-6,5, что соответствует кислотности жидкости в тонком отделе кишечника новорожденных.
Иммуноглобулины крупного рогатого скота были идентифицированы как аналоги по физико-химической и антигенной характеристике к человеческим IgG, IgA и IgM. Два класса IgG: IgG1 и IgG2 иммунологически и биологически различались. Секреторный IgA был идентифицирован в эпителии слизистой оболочки кишечника в секреторных компонентах. IgG1 является доминирующим в молочной секреции, IgM превышает IgA в секреции пищеварительного тракта преруминантных телят [P. D. Porter, 1973; J. A. Roth, J. W. Sexton, 1975; R. Sakulramrung, G. L. Domingae, 1985; G. Riedel-Caspari, 1993;] .
IgM и IgA играют важную роль в местной (локальной) реакции вымени при заражения бактериальными антигенами, а также, вероятно, эти два иммуноглобулина взаимодействуют в защитном механизме новорожденных телят [R. A. Wilson and I. W. Jutila, 1976; P. Pivont, R. Gregoire and H. Antoine, 1984; L. S. Young, 1985; M. L. Wickstrom, 1987].
У новорожденных интестинальная адсорбция колостральных антител не селективная, таким образом иммуноглобулиновый профиль сыворотки постколостральных телят имеет сходство с молозивом и это обеспечивает необыкновенно высокий уровень секреторного IgA в циркуляции крови. Секреторные IgA и IgM существенно содействуют пассивному иммунитету, хотя их продолжительность в сыворотке крови телят составляет соответственно только 2 и 4 дня [G. G. B. Klaus, A. Bennett and E.W. Jones, 1979; R.K. Braun, B.C. Tennant, 1983; J. Brenner, 1991].
Концентрация иммуноглобулинов в молоке коров снижается быстро в течение первых 3 дней лактации и, маловероятно, что содействует локальной защите алиментарного тракта телят после первой недели. Тем не менее, локальный синтез иммуноглобулинов является доказуемым в иммуноцитах, находящихся на конце эпителиальных клеток пищеварительного тракта и секреция иммуноглобулинов начинается на 2-ой неделе жизни [H. Fey, 1967; E. F. Logan, and W. J. Penhale, 1971; J. E. Butler, C. A. Kiddy, C. Maxwele, M. B. Hylton, A. Asofsky, 1971; J.W. Boyd, 1972; P. D. Porter, D. E. Noakes, and W. D. Allen, 1972; E. F. Logan, 1974; В. М. Чекишев, 1977; Ю. Н. Федоров, И. Д. Фесенко, М. Ю. Горбунова, С. О. Кодыров, И. Ю. Пичкова, 1983; В. М. Чекишев, Т. В. Бондарь, О. А. Колганова, 1985; Т. Е. Besser, 1988].
Эффективность абсорбции лактоглобулинов связана с количеством проглоченного молозива [I. E. Selman, A. D. McEwan, E. W. Fisher, 1971; Т. Brignole, J. Stott, 1980; С. С. Gay, Т. McGuire, S. M. Parish 1983;] и влиянием присутствия коров матерей в течение первых 24 ч жизни [E. Selman, A. D. McEwan and E. W. 1970; D. F. Wolfe, 1985; Ю. Н. Федоров, О. А. Верховский, 1996].
В течение двух часов после приема молозива иммуноглобулины появляются в сыворотке и, через четыре-восемь часов — в синовии. Иммуноглобулиновый профиль синовии имеет сходство с сывороткой крови телят и коров-матерей [H. Fey, 1972]. Это объясняет, почему телята, получившие молозиво более резистентные к септицемии и полиартритам, чем телята, которые недостаточно получают молозиво.
Молозиво превосходный источник энергии, протеина, витаминов А, Д и комплекса витаминов В, а также кальция, фосфора, магния и хлоридов. При дефиците указанных компонентов молозива и, особенно, витамина А резистентность к Е. coli инфекции резко снижается. [Th. Smith and R. B. Little, 1922; H. Fey und S. Lindt, 1982; С. С. Gay, 1984; J. J. Geene, 1984; R. Morar, 1985; P.E. Howe, 1991]
Молозиво коров содержит высокий уровень иммуноглобулинов, среди которых 75 % IgG, IgA и IgM вместе составляют около 20 % от иммуноглобулинов молозива [J. A. Roth, J. W. Sexton, 1975].
По данным исследователей [E. W. Fisher, 1971; J. W. Boyd, 1972; E. W. Fisher, A. A. Martinez, Z. Trainin, 1975], риск заболеваемости и летальности можно предсказать у телят 48 ч возраста при определении уровня сывороточных иммуноглобулинов. Новорожденные телята с уровнем IgG и IgM меньше чем 0,8 и 0,2 мг/мл соответственно, погибали от неонатальной септицемии, тогда как у телят с уровнем IgG и IgM 5,0 и 0,6 мг/мл соответственно, развивалась энтеральная инфекция. Телята с постколостральным сывороточным уровнем 7,5 и 0,8 мг/мл IgG и IgM соответственно, были нормальными (клинически здоровы). Следовательно, телята с умеренно низким уровнем иммуноглобулинов имели достаточный иммунитет, предупреждающий септицемию, но не профилактировали энтерит.
Многочисленные исследования показывают, что имеется корреляция между пассивно приобретенными сывороточными иммуноглобулинами и выживанием неонатальных телят [H. Fey, 1967; H. Fey, 1968; E. F. Logan, A. Stenhouse, D. J. Ormorod and W. J. Penhale, 1974; T. A. Ferris, J. W. Thomas,1975; R. K. Braun, B.C. Tennant, 1983; P. Dobbelaar, I. P. T. M. Noordhuizen and K. Van A. S. Keulen, 1987; A. Lacheretz, J. Chontol, P. Desmettre, 1987].
Определение уровня сывороточного иммуноглобулина у новорожденных является клинически важным, так как их количество оказывает влияние на восприимчивость телят к заболеванию. Иммуноглобулиновые фракции составляют примерно одну третью значения общего сывороточного протеина. Иммуноглобулин дефицитные телята имеют низкое значение общего протеина, на это указывают показания рефрактометра. Рефрактометр не дает прямое измерение сывороточного иммуноглобулина подобно цинк-сульфатному, натрий-сульфитному и глутаральдегидному тестам, но предусматривает быстрый подсчет уровня сывороточного иммуноглобулина и может легко применяться в практической ветеринарии [D. G. McBeath, W. J. Penhale, E. F. Logan,1971; A. D. Me Ewan, E. W. Fisher, I. E. Selman and W. J. Penhale, 1970; N. E. Pfeiffer, T. C. McGuire, 1977; N. E. Pfeiffer, T. C. McGuire, R. E. Bendel and J. M Weikel, 1977; B. Tennant, B.H. Baldwin, 1979; H. Frerking, von E. Henkel and E. Schwartz, 1980; H. Balbierz, M. Nicolaijczuk, J. Zeilinski, 1983]
Объем сыворотки необходимый для рефрактометрического теста очень незначительный (примерно 0,2-0,3 мл) и если доступно центрифугирование, оценку концентрации иммуноглобулина, соответствующую требованиям, можно получить в пределах 30 мин из исследуемых проб. Рефрактометрический тест, как а другие (цинк-сульфатный, натрий-сульфитный, глутаральдегидный) зависят от гемоконцентрации и имеет незначительное значение при определении иммуноглобулинового статуса дегидратированных (обезвоженных) телят [D. G. McBeath, W. J. Penhale, E. F. Logan,1971; Ю. Н. Федоров, 1988].
Рефрактометр позволяет определить иммуноглобулиновый статус неонатальных телят с различной степенью риска. Норма этой оценки для телят голштинской породы крупного рогатого скота (молочного направления) следующая:
1. Высокий риск заболеваемости и летальности отмечают при уровне общего сывороточного протеина 4,9 г/100 мл;
2. Средний риск — при уровне общего сывороточного протеина 5,0-5,4 г/100 мл.
3. Низкий риск — при уровне общего сывороточного протеина 5,5-6,9 г/100 мл. [D. G. McBeath, W. J. Penhale, E. F. Logan,1971; R.K. Braun,
B.C. Tennant, 1983]
Для изучения корреляции у крупного рогатого скота между пассивно приобретенными антителами и инфекционными заболеваниями были проведены многочисленные исследования, применяя метод количественного определения иммуноглобулинов [A. D. Me Ewan, E. W. Fisher, I. E. Selman, 1970; J. W. Boyd, 1972; W. J. Penhale, E. F. Logan, I. E. Selman, E. W Fisher, 1973; E. F. Logan, A. Stenhouse, D. J. Ormorod and W. J. Penhale, 1974; G. H. Stott and E. J. Reinhard, 1978; G. G. B. Klaus, A. Bennett and E. W. Jones, 1979; G. H. Stott, D. В. Marx, В. E. Menefel, and G. T. Nightengale, 1979; N. H. Teng, H. S. Kaplan, J. M. Herbert, 1985].
Наиболее широко применяются метод прямой радиальной иммунодиффузии [N. E. Pfeiffer, T. C. McGuire, 1977; В. М. Чекишев, 1977; N. E. Pfeiffer, T. C. McGuire, R. E. Bendel and J. M Weikel, 1977; А. А. Тихомиров, 1997] и цинк-сульфатный тест помутнения [A. D. Mс Ewan, E. W. Fisher, I. E. Selman and W. J. Penhale, 1970; Н. С. Жосан, 1989].
Наиболее точный и простой метод для тестирования уровня иммуноглобулинов, применяемый на ферме или в научной лаборатории является натрий-сульфитный преципитационный тест. Натрий сульфит в соответствующей концентрации (14, 16, 18 %) вызывает преципитацию иммуноглобулинов, подобно тому как и цинк-сульфатный тест. Значение помутнения, вызываемого взаимодействием натрия сульфита и иммуноглобулинов пропорционально степени защиты телят [N. E. Pfeiffer, T. C. McGuire, 1977; N. E. Pfeiffer, T. C. McGuire, R. E. Bendel and J. M Weikel, 1977; T.C. McGuire, D.S. Adams, 1982; Ю. Н. Федоров, 1988].
Для выявления гипогаммаглобулинемии у неонатальных телят применяют также быстрый скрининг тест. Тест основан на коагуляции иммуноглобулинов глутаральдегидом в 10 % концентрации. Иммуноглобулиновая концентрация у исследуемых телят, данным методом, была классифицирована как высокая 6 мг/мл, промежуточная 4,1-6 мг/мл и низкая 4 мг/мл [B. Tennant, B.H. Baldwin, 1979].
1.3. Неспецифическая иммунологическая реактивность новорожденных телят
Результаты многолетних исследований состояния неспецифической иммунологической реактивности организма сельскохозяйственных животных свидетельствует о том, что защитные силы их являются динамичным показателем и определяются как генетическими особенностями организма, так и воздействием различных факторов окружающей среды. Неблагоприятное воздействие окружающей среды приводит к ослаблению устойчивости организма и, как правило, к возникновению и распространению различных заболеваний, в том числе и инфекционных. Организм животных в процессе внутриутробного развития продуцирует клетки, осуществляющие фагоцитоз и молекулы с выраженным противомикробным действием — лизоцим, комплемент, пропердин, иммунные глобулины и другие факторы естественной резистентности. С возрастом животных они динамически изменяются [С. J. Howard, A. A. Glynn, 1971; В. В. Никольский, В. П. Литвин, 1974; П. А. Емельяненко, 1979; В. Т. Сидоров, 1984; B. C. Шипилов, В. К. Копытин, 1984; R.M. Miller, A.J. Guidry, M.J. Poape, 1988; G. Mulcahy, P.J. Gunn, 1988; С. И. Плященко, 1991].
Иммунологическая реактивность у новорожденных телят формируется постепенно и достигает полноценной выраженности только на определенном уровне их индивидуального физиологического развития [B. C. Бузлама, С. М. Сулейманов, В. Н. Долгополов, Н. Н. Коновалов, М. Н. Рецкий, И. С. Толкачев, Т. И. Агеева, 1978].
В качестве критериев степени реактивности животного организма используют [В. В. Никольский, В. П. Литвин, 1974]: динамику накопления антител, колебание бактерицидной активности крови, опсоно-фагоцитарную реакцию, специальную внутрикожную пробу и картину крови. В течение первых 10-15 дней жизни у телят более выражена клеточная защитная функция организма, характеризующаяся активным фагоцитозом микроорганизмов. Так, опсоно- фагоцитарный показатель по отношению к кишечной палочке в первые 10-15 дней жизни равнялся 8, в 30-40 дней — 3,7 а в 60-70 дней — 1,4. Сходные результаты получены при изучении гуморальных защитных факторов организма. Фагоцитарная способность лейкоцитов в крови играет большую роль в противомикробной защите новорожденного теленка. По данным исследователей, фагоцитарная активность гранулоцитов крови новорожденных телят до выпойки молозива летом (июнь-июль) достигает 98-100 % (у матерей 90-95 %). Фагоцитарное число (8-16) несколько ниже, чем в крови коров-матерей (16- 19). Активность лизоцима по лизису тест-микроба в агаровом геле определяли в сыворотке крови телят и молозиве коров-матерей. Количество лизоцима в 5 первых порциях молозива равно 13±0,26 мкг/мл, в сыворотке крови новорожденных телят до выпойки молозива — 12±0,69, на 10-й день — 13,4±0,61 и в 3 месяца — 12,5±0,017. Таким образом, авторы не установили различий в содержании лизоцима в сыворотке крови телят в разных возрастных периодах [С. Н. Преображенский, Н. И. Блинов, Н. В. Ершова, Г. В. Вышинский, 1974].
В университете штата Оклахома, национальной лаборатории по изучению болезней животных в США и Гуэлфском университете Канада [O. Barta, V. Barta, 1972] на плодах и новорожденных телятах определяли бактерицидную активность крови. Двукратно разведенную сыворотку крови, в объеме 0,2 мл смешивали с равным объемом взвеси культуры содержащей 104 мл клеток бактерий кишечной палочки. Смесь выдерживали час при температуре 37° С и 0,1 мл ее высевали на плотную среду. Посевы выдерживали 16-18 ч при 37° С, подсчитывали число колоний и определяли дозу сыворотки, задерживающую рост 50 % бактерий. Антитела определяли по реакции агглютинации и пассивной гемагглютинации. Бактерицидная активность сыворотки крови составляла соответственно (в 1 мл сыворотки, задерживающей рост 50 %) бактерий у новорожденных телят 0,0036 и 0,0068.
При изучении иммунологической неспецифической реактивности организма новорожденных телят, [П. А. Емельяненко, 1979] определял фагоцитарную активность нейтрофилов и моноцитов крови, а также содержание в ее сыворотке лизоцима, комплемента и пропердина. Он установил, что у погибших телят от острых желудочно-кишечных болезней достоверно снижался процент фагоцитоза нейтрофилов, незначительно снижался уровень комплемента, пропердина и лизоцима.
При иммунобиологическом исследовании крови и сыворотки крови определяют [Д. Келмен, 1967; В. Я. Мозгис, 1982]: a) фагоцитоз лейкоцитов по отношению к золотистому стафилококку 209р; b) бактерицидную активность (БАСК); c) активность бета-лизинов (БЛСК) сыворотки крови методом фотонефелометрии. Сущность метода заключается в том, что микробы (в данном случае, изолированный от телят штамм кишечной палочки — штамм 83) в течение 5 и 14 ч соответственно подвергаются воздействию исследуемой сыворотки. Чем слабее бактерицидная и бетализиновая активность сыворотки, тем интенсивнее размножаются микробы и тем более мутной становится взвесь; d) лизоцимную активность сыворотки крови.
При круглогодовом стойловом содержании коров наступает угнетение иммунологической реактивности, а родившиеся от них телята имеют пониженный уровень гуморальных и клеточных факторов защиты организма (бактерицидная и лизоцимная активность сыворотки крови, фагоцитоз, уровень иммуноглобулинов, по сравнению с телятами, родившихся от коров, пользовавшихся выгулами и пастбищами [С. И. Плященко, В. Т. Сидоров, А. Ф. Трофимов, 1990].
Все новорожденные до приема молозива обладали достаточно выраженной фагоцитарной защитной реакцией. Показатели гуморальных факторов защиты формировались в более позднем возрасте и были выражены значительно слабее. До приема молозива сыворотка крови телят не обладала лизоцимной активностью и не содержала гаммаглобулинов [М. А. Сидоров, В. Н. Гущин, 1984].
На скорость роста телят положительное влияние оказывает 5-дневный период подсоса. Так, у таких телят были выше показатели естественной резистентности (лизоцимная активность, общий белок, глобулины, фагоцитарное число и фагоцитарный индекс) по сравнению с телятами, которых содержали с матерями только 12 ч [В. П. Павличенко, О. В. Милованов, Н. Н. Берникова, 1985].
Реактивность и адаптация сельскохозяйственных животных две взаимосвязанные проблемы; их надо изучать на организменном и иммуноцитологическом уровнях в комплексе со многими причинными факторами воздействующими на организм. Надо учитывать, что в каждом из указанных процессов лежат конкретные механизмы поддержания гомеостаза и адаптации, во многом еще не выясненные и требующие всестороннего изучения [А. Н. Голиков, 1989].
1.4. Получение и применение лактоглобулинов
В 1892 году P. Ehrlih впервые установил, что невосприимчивость к различным токсинам передается через молоко.
Исходя из того, что молозиво и молоко иммунизированных коров обладают выраженными превентивными свойствами, его использовали с профилактической и лечебной целью при соответствующих заболеваниях [C. Briggs, 1951; С. И. Губкин, А. И. Коган, 1971; J.E. Butler, C. Maxwele, 1972; P. Blackmer, 1973; D. M. Barber, 1978; D. M. Barber, 1979; J. J. Geene, 1984 В. Б. Билоштан, 1985; С. В. Вальциферова, 1997].
Из молока были получены иммунные лактоглобулины против сальмонелл, бруцелл, вируса ящура и полиомиелита [P. Lepine, 1963]. Эти препараты оказались пригодными для применения с лечебной и профилактической целью не только для телят, а и для обезьян. Автор приводит данные, подтверждающие преимущества применения лактоглобулинов по сравнению с цельными иммунными сыворотками молозива и крови.
Болгарские исследователи [К. Геров, П. Чушков, Р. Георгиева, 1965] изготовили из молозива препарат, который назвали лактоплазмин. По мнению авторов лактоплазмин содержит лактоглобулины, иммунные тела, витамины, микроэлементы и, являясь биологически ценным продуктом, может быть использован самостоятельно или в комбинации с другими средствами при заразных и незаразных болезнях молодняка, при которых понижается общая резистентность организма. Этот препарат является эффективным средством профилактики и лечения различных видов расстройств пищеварения у телят.
В ветеринарно-бактериологическом институте Бернского университета (директор профессор H. Fey) и научно-исследовательской лаборатории Бернской ветеринарной школы (заведующий Graub) из иммунного молозива изготовлен гамма-глобулиновый препарат (ГГП) или гамалин по Граубу [H. Fey, 1972].
Давая обзор работам, проведенным в этих учреждениях и анализируя литературу по методам получения и результатам изучения свойств ГГП, [K. Walser und H. Brumer, 1987] отмечают высокую терапевтическую и профилактическую эффективность применения этого препарата при инфекционных заболеваниях сельскохозяйственных животных. Они полагают, что наиболее результативным будет применение препарата при колиинфекциях и энтеротоксемиях.
Из молозива коров, иммунизированных внутривыменно против паратифа А. Ф. Барабаш, 1966, выделил путем осаждения сернокислым аммонием специфический противопаратифозный лактоглобулин. Полученный препарат применялся парентерально и показал выраженные профилактические и лечебные свойства на лабораторных животных и телятах.
Из молока коров, вакцинированных внутривыменно ящурным антигеном изготовили иммунолактон против вируса типа А, а затем изготовили бивалентный иммунолактон против вируса типа А и О [В. П. Онуфриев, В. К. Журавлёв, К. В. Чунаев, А. И. Дудников, Ю. Ф. Швецов, Б. П. Мартьянов, 1967]. Введение иммунолактона лабораторным животным, поросятам и телятам в дозе 0,5-1,5 мг на кг массы тела предохраняло животных от заболевания ящуром. Авторы указывают, что от одной коровы со средней продуктивностью 10 л молока в сутки в течение месяца можно изготовить иммунолактон в количестве, которое предохранит от ящура 300 телят или 800 поросят.
Иммунизируя стельных коров вначале подкожно концентрированным адсорбированным столбнячным анатоксином, а затем и внутривыменно нативным столбнячным анатоксином, получили сыворотку молозива с наличием противостолбнячных антитоксинов 850-2000 АЕ/мл, из которой выделили лактоглобулин, обладающий выраженными профилактическими и лечебными свойствами в опытах на белых мышах, крысах, ягнятах, поросятах и жеребятах [B. C. Барабаш, 1968].
Из сыворотки молозива коров, иммунизированных внутривыменно пуллорным антигеном, путем осаждения сернокислым аммонием получен специфический лактоглобулин, обладающий профилактическими свойствами в опытах на белых мышах и на цыплятах 10-30-дневного возраста [М. Г. Кондратюк, 1970].
Из сывороток молозива коров, гипериммунизированных паратифозной вакциной и бруцеллезным антигеном для РА, путем высаливания сернокислым аммонием при 20 % насыщении, выделен специфический паратифозный и бруцеллезный лактоглобулин, из которого изготовили люминисцируюшие лактоглобулины для диагностики паратифа телят и экспресс-индикации бруцелл [В. А. Атамась, 1968; В. А. Атамась, 1969].
Из сыворотки молозива коров, иммунизированных внутривыменно против диплококковой септицемии, получен специфический лактоглобулин и испытан с профилактической и лечебной целью в опытах на телятах. Противодиплококковый лактоглобулин обладал довольно выраженными профилактическими и лечебными свойствами [В. В. Май, 1970].
В ФРГ широко применяют гамма-глобулиновые препараты для профилактики и лечения колибактериоза и налажено промышленное производство гамма- глобулиновых препаратов из сыворотки убойных животных, сыворотки иммунизированных животных и молозива [R. Kruedener, 1970].
Из молока коров, гипериммунизированных внутривыменно модифицированным штаммом БУК вируса болезни Ауески получен иммунолактон против болезни Ауески [Д. Ф. Осидзе, В. К. Муравьев, В. Т. Ночевный, В. П. Онуфриев, В. М. Кравченко, 1972]. Авторы на основании проведенных исследований, установили принципиальную возможность диателической иммунизации коров штаммом БУК вируса болезни Ауески с целью получения специфической лактосыворотки и иммунолактона. Препарат в дозе 0,5-2,0 г/кг массы тела животного обладал выраженным профилактическим действием. Пассивный иммунитет у животных сохранялся 21 день. Лечебный эффект отмечали только после применения иммунолактона в первые двое суток после инфицирования животных.
Путем осаждения сернокислым аммонием молозивной сыворотки, был получен специфический лактоглобулин который обладал профилактическими и лечебными свойствами при экспериментальном и спонтанном заражении телят колибактериозом [Н. С. Жосан, 1974; Н. С. Жосан, 1976].
Для получения лактоглобулина [Е. В. Гублер, А. А. Генкин, 1978] использовали молозиво первого и второго удоев после отела коров. Молозиво подогревали до температуры 38-40° С, затем к нему добавляли свежеприготовленный раствор пепсина из расчета 100 мл на 900 мл молозива. После отделения молозивной сыворотки ее фильтровали через 4-5 слоев марли, затем через бумажный фильтр и консервировали 5 %-ным раствором фенола в 0,5 %-ном отношении к ее объему. Добавляли его при постоянном помешивании из расчета 11,1 мл на 100 мл препарата. Выпаивали лактоглобулин телятам в подогретом виде (38° С) в дозе 100-120 мл, первый раз за 30 мин до кормления молозивом, второй к концу первых суток. Больным животным после голодной диеты (8-9 ч) его давали утром до кормления один раз в сутки 2-3 дня в такой же дозе.
Из сыворотки крови отелившихся коров, находившихся в родильном отделении не менее 10 дней В. П. Павлов, Т. Н. Грязнева, Е. В. Чичикова, 1988, изготовили гаммаглобулин. Кровь брали у клинически здоровых животных (до 2 л от каждого). Из сыворотки крови готовили гаммаглобулин, используя 3 %-ный раствор этакридина лактата. Новорожденным телятам через каждые 3 дня инъецировали специфический гаммаглобулин внутримышечно в дозе 1 мл/кг массы тела, декстрофан и тривит в дозах соответственно 5 мл и 2 мл внутримышечно, а также в течение трех суток 2 раза в день внутримышечно вводили гентамицин в дозе 1,5 мг/кг массы, что позволило профилактировать желудочно-кишечные болезни у 100 % животных.
Для коррекции иммунодефицита неонатальных телят использовали колостральную сыворотку и лактоглобулин. [Н. С. Жосан, 1992]. Препараты вводили внутримышечно или подкожно, в дозе по 0,5 мл на кг живой массы дважды с интервалом 24 ч. Данные препараты повышали естественную резистентность организма, содержали неспецифические антитела против энтеропатогенов циркулирующих, в каждом конкретном хозяйстве при условии изготовления колостральной сыворотки и лактоглобулина, из молозива, полученного от коров данного хозяйства.
Применение молозива и его производных (молозивный иммуногормональный препарат, молозивная сыворотка, гидролизат казеина) снижает заболеваемость телят диареей на 50-60%, при этом болезнь протекает в легкой форме со 100% выздоровлением. Парентеральное введение этих препаратов новорожденным телятам способствует повышению уровня белка в сыворотке крови в 1,5 раза, иммуноглобулинов в 2 раза, уровень лейкоцивот у этих животных не превышал 8000, бактериальная загрязненность фекалий была в 2-3 раза ниже, чем у телят, которым молозиво давали только внутрь. Максимальный лечебно- профилактический эффект молозивная терапия дает в том хозяйстве, где молозиво было получено [В. В. Бурсуков, 1993; С. В. Вальциферова, 1997].
Исходя из литературных данных, следует отметить, что иммунное молозиво, молоко и полученные из них препараты обладают выраженными профилактическими лечебными свойствами.
Сравнительная дешевизна сырья, используемого для получения препаратов из молозива (практически оно не используется в хозяйствах) [М. Х. Шайхаманов, В. П. Грамолин, Б. М. Авакаянц, 1993], простота изготовления, высокая эффективность послужит основанием для получения указанных препаратов в производственных условиях.
заключение
Анализируя данные литературы, касающиеся состояния естественной резистентности и иммунологической реактивности у новорожденных телят при колибактериозе, необходимо выделить следующие основные моменты:
. колибактериоз занимает среди заболеваний новорожденных животных одно из ведущих мест и наносит значительный экономический ущерб;
. высокий уровень резистентности обеспечивает широкий диапазон ответных реакций организма на влияние различных факторов внешней среды в том числе и микроорганизмов, позволяющих ему адаптироваться на уровне физиологической реактивности;
. животные с низким уровнем неспецифической резистентности не способны адаптироваться к изменившимся условиям внешней среды, что часто вызывает истощение резервной защитно-приспособительной реактивности и, как следствие этого, приводит к гибели животных;
. сущность защитных факторов против колибактериоза телят ассоциируется с лактоглобулиновой фракцией и уровнем К-антител- агглютининов в сыворотке молозива коров и в сыворотке крови новорожденных телят;
. фагоцитирующие лейкоциты, лизоцим, комплемент, пропердин и иммуноглобулины обладают функцией антител, противомикробное действие которых в совокупности выражается бактерицидной активностью сыворотки крови;
. уровень иммуноглобулинов является одним из важных показателей резистентности организма новорожденного. При этом следует определять и учитывать иммунный статус до первой выпойки молозива и после его скармливания;
. абсорбция колостральных иммуноглобулинов находится в прямой зависимости от ряда факторов важнейшими из которых являются: способность новорожденных телят усваивать их из молозива, условия внешней среды, качество молозива и своевременная выпойка первого молозива в адекватном количестве;
. лактоглобулин совместно с ретинолом отличаются высоким иммуно- корректирующим эффектом и широтой профилактического действия;
. аминазин совместно с Т-активином обладают иммуно-корректирующим действием и антисекреторной активностью ингибирующей трансформацию аденозинтрифосфата (АТФ) в циклический 3,5- аденозинмонофосфат (АМФ).
РАЗДЕЛ 2
РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.1. Материалы и методы исследований.
2.1.1.Общая методика. Экспериментальная часть работы выполнялась на ферме крупного рогатого скота учебно-опытного хозяйства «Кетросу», района Анений Ной, ОПХ «Колоница» района Криулень и в лаборатории микробиологии кафедры эпизоотологии Государственного aграрного университета Молдовы с 1973 по 1998 год.
Опыты проводились на коровах черно-пестрой породы 5-8 лактации и на родившихся от них телят, с целью изучения состояния неспецифической и специфической иммунологической реактивности новорожденных телят при колибактериозе, а также выявления роли кислотно-основного баланса в течение инфекционного процесса, коррекции иммунодефицитного состояния новорожденных телят. Для лечения применяли антисекреторные препараты, ингибирующие циклический аденозинмонофосфат.
Пробы молозива отбирались в первый день (из первого, второго и третьего доения), на второй, пятый день после отела, а на десятый, двадцатый день и через месяц исследовалось молоко.
В сыворотке крови, молозиве и молоке изучались: динамика накопления агглютининов, иммуноглобулиновый уровень, в т. ч. в динамике.
Сыворотку крови получали путем отстаивания, а из молозива — методом пепсинизации. Из сывороток молозива первого и второго дня после отела выделяли колостральную сыворотку и лактоглобулин. У родившихся телят от опытных и контрольных групп коров в сыворотке крови изучали: динамику накопления О- и К- антител-агглютининов, уровень иммуноглобулинов в зависимости от клинического статуса, показатели фагоцитоза, пропердина, комплиментарной и бактерицидной активности (до поения молозивом, на 2, 5, 10, 20 и 30 день жизни).
Бактерицидные свойства колостральной сыворотки и сыворотки крови новорожденных телят изучали нефелометрическим методом. Профилактические и лечебные свойства молозивных сывороток и лактоглобулина изучались на лабораторных животных и телятах.
Коррекцию иммунодефицита неонатальных телят, проводили с применением лактоглобулина и витамина А.
В качестве анти-секреторных факторов, ингибирующих циклический аденозинмонофосфат (сАМР) применяли хлорпромазин и Т-активин.
Опыты проводились на 562 телятах, 468 коровах, 247 белых мышах и 30 кроликах.
Полученный цифровой материал подвергался биометрической обработке по различным биометрическим методикам: [Дж. У. Снедекор, 1961; И. П. Ашмарин, А. А. Воробьев, 1962; В. Ю. Урбах, 1964; Е. В. Гублер, А. А. Генкин А. А., 1969].
2.1.2. Приготовление колибактериозного антигена. Для приготовления антигена использовали три серотипа колибактерий: О78:К80, О119:К69 и О137:К79.
Использованные серотипы Е. coli по морфологическим и биохимическим свойствам были типичными, отвечающими требуемым иммуногенным, антигенным н вирулентным свойствам.
Е. coli О78:К80, О119:К69 и О137:К79 раздельно высевали в пробирки с мясопептонным бульоном на 12 ч и проверяли на чистоту (микроскопия мазков, окрашенных по Граму). В последующем бульонную культуру высевали на стерильный мясопептонный агар в матрацах. Посевы выращивали в термостате в течение 18 ч при температуре 37° С, проверяли на чистоту и смывали стерильным изотоническим раствором хлорида натрия. Для выделения О-антигена бактериальную суспензию автоклавировали при 120°С в течение 2 ч дня разрушения К-антигена. Густую отмытую суспензию Е. coli содержащую 10 млрд. микробных тел в 1 мл по оптическому стандарту, смешивали с ацетоном в отношении 1:5 до появления коагуляции (свертывания). Плотную часть материала отбирали на воронке Бюхнера, промытой один раз ацетоном и затем высушенной эфиром. Препарат высушивали на воздухе и хранили при 4°С.
Сухой порошок применяли для приготовления суспензии антигена, добавляя 1 мг высушенных ацетоном бактерий на 1 мл барбиталового буфера.
Для выделения К-антигена бактериальную суспензию получали путем смыва из агаровых культур изотоническим раствором хлорида натрия, содержащего 0,5 % формальдегида. Бактерии были экстрагированы при добавлении ацетона непосредственно после их смыва с агаровой культуры и промыты. [E. Neter, E. A. Gorzynski, R. M. Gino, O. Westphal and O. Luderwitz. 1956; E. Neter, 1957].
Полученные О- и К-антигены проверяли на стерильность и на безвредность. Стерильность устанавливали путем высева на МПБ, МППБ и МПА. Посевы выдерживали 10 дней в термостате (+37°С). Безвредность антигенов была проверена на лабораторных животных. Для этого каждый из антигенов вводили 10 белым мышам под кожу в области спины по 0,5 мл и 5 морским свинкам в области внутренней поверхности задней конечности по 1,0 мл. Клинические наблюдения за опытными животными вели в течение 15 дней.
Отсутствие роста в посевах на МПБ, МППБ и МПА и гибели привитых животных позвонило считать антигены стерильными и безвредными. Хранились антигены при температуре +4 +5°С в холодильнике.
2.1.3. Изучение агглютиногенных свойств серотипов О78:К80, О119:К69 и О137:К79 Е. coli. Для определения агглютиногенности изучаемых серотипов использовали 30 кроликов, по 5 на каждый серотип (определение О- и К- антигенов). Антигены вводили кроликам в краевую вену уха в нарастающих дозах (от 0,5 до 2,0 мл) с интервалом в три дня, четырехкратно.
Для определения О-антигена смешивали одну каплю антигена с одной каплей соответствующей О-сыворотки на зеркальном стекле, размещали над водяной баней при 60°С. Результаты учитывали через 10 мин после смешивания.
Позитивную реакцию подтверждали пробирочной агглютинацией, применяя формалинизировавную шестичасовую культуру в МПБ. Основное разведение сыворотки 1:10.
Для определения К-антигена культуру вначале тестировали пластинчатой реакцией агглютинации на предметном стекле. Одну каплю живой суспензии культуры смешивали с одной каплей различных антисывороток. Результаты учитывали в течение 30с после смешивания. Позитивную реакцию подтверждали пробирочной агглютинацией до титра тест сыворотки, применяя как антиген живую пятичасовую культуру в МПБ. Пробирки инкубировали при 37°С два часа, в последующем агглютинационные пробирки центрифугировали при 2000 об/мин в течение трех минут. Одинаковый писк агглютинации учитывали как позитивную реакцию. [E. Neter, E. A. Gorzynski, R. M. Gino, O. Westphal and O. Luderwitz. 1956; E. Neter, 1957].
2.1.4. Получение сыворотки крови, молозива и молока. Кровь от животных (коров, телят) брали из яремной вены в стерильные пробирки и помещали в термостат (+37°С) на 3 ч, после чего выдерживали 12-16 ч при комнатной температуре до полного отделения сыворотки. Затем сыворотку отсасывали в стерильные пробирки и помещали в холодильник (+4 +5°С).
Молозиво от коров брали при первом, втором и третьем доении после отела, а затем на второй, пятый, десятый, двадцатый дни и через месяц.
Сыворотку из молозива и молока получали путем добавления пепсина. На каждые 1000 мл молозива или молока добавляли 100 мл 0,5% раствора пепсина и после тщательного перемешивания смесь помещали в водяную баню при температуре 38° С на четыре часа. Образовавшийся сгусток, отделяли от сыворотки фильтрацией через три слоя марли. Полученную сыворотку пропускам через воронку Бюхнера с двойным слоем бедой фильтровальной бумаги, а затем через бактериальный фильтр Зейтца.
2.1.5. Реакция атглютинации с молозивной и молочной сыворотками. В центрифужные пробирки наливали 5-6 капель 5 % раствора пепсина, приготовленного на изотоническом растворе хлорида натрия и 10 мл исследуемого молозива или молока, тщательно перемешивали и для свертывания ставили в термостат при температуре 38°С на 30 мин. Свернувшееся молозиво отделяли от стенок пробирки стеклянной палочкой и центрифугировали при 3000 об/мин в течение 30 мин.
С полученной сывороткой ставили реакцию агглютинации в объеме 1 мл в разведениях с физиологическим раствором от 1:10 до предельного титра сыворотки. Контроли обычные.
Антиген добавляли по 0,05 мл в каждую пробирку, пробы встряхивали и помешали в термостат при температуре 37°С на 4 ч, после чего производили предварительный учет реакции, а окончательный учет реакции определяли через 24 ч. Молозиво исследовали в день его получения.
2.1.6. Определение титра агглютининов. Для изучения динамики накопления агглютининов в сыворотках крови и молозива использовали реакцию агглютинации, которую ставили в объеме 1 мл (классическим методом) в пробирках с ровным округлым дном с убитыми и живыми О- и К-антигенами (серотипы О78:К80; О119:К69; О137:К79 Е. coli ).
Для определения агглютинационных титров, в наших исследованиях применяли двукратное разведение сывороток. Разведение сывороток крови и молозива производили в агглютинационных пробирках начиная с разведения 1:10.
После добавления антигена (по 0,05 мл) содержимое пробирок встряхивали, затем помещали в термостат на 4 ч при температуре 37°С. После этого производили предварительный учет результатов реакции. В дальнейшем пробирки выдерживали 24 ч при комнатной температуре и определяли окончательный результат.
Для учета результатов реакции агглютинации пользовались четырех крестовой системой обозначения. За агглютинационный титр принимали то наибольшее разведение сывороток, при котором еще наблюдалась видимая агглютинация, оцениваемая в четыре креста.
2.1.7. Определение активности лизоцима в сыворотке крови. Сыворотку крови, отделяли общепринятым методом. Предварительно готовили 1/15М фосфатный буфер (рН 6,2), для чего использовали два исходных раствора: 4,539 г х. ч. КН2РО4 растворенный в 500 мл дистиллированной воды и 2,375 г х. ч. Nа2НРО4Ч12Н2O, растворенный в 200 мл дистиллированной воды. При смешивании этих растворов в определенном соотношении, получали рН буфера 6,2.
Для приготовления 1 % агара «Дифко» на 1/15М фосфатном буфере брали 1 г сухого агара, помещали в колбу на 200 мл и заливали 99 мл 1/15М фосфатного буфера. Колбу закрывали ватно-марлевой пробкой, помещали в кипящую баню и выдерживали 25-30 мин.
Расплавленный агар охлаждали до 60-70°С и вносили в него ацетоновый порошок Micrococcus lysodeikticus из расчета 10-20 мг на 100 мл объема. Необходимое количество порошка перед внесением в агар суспендировали в 3-5 мл 1/15М фосфатного буфера. Полученную смесь перемешивали до получения однородной взвеси.
Полученную смесь разливали в чашки Петри с таким расчетом, чтобы подучить толщину слоя 4 мм.
После застывания агара в нем при помощи тонкостенной трубочки вырезали лунки диаметром 5 мм на расстоянии 2-3 см от краев чашки и друг от друга. Для подсыхания лунок чашки помещали в термостат приоткрытыми на 60 мин. Исследуемые пробы сыворотки крови разводили соответственно 1/15М фосфатным буфером 1:10, 1:2 и 1:5. Каждую пробу после разведения заливали в отдельную лунку в объеме 0,05 мл.
Параллельно с исследуемым материалом 1/15М фосфатным буфером разводили стандартный кристаллический лизоцим так, чтобы получить его растворы с концентрацией 0,5 мкг/мл, 1; 3; 5; 10; 20; 40; 60; 80 и 100 мкг/мл. По 0,05 каждого разведения стандартного лизоцима разливали по отдельным лункам.
Чашки Петри с исследуемым материалом и стандартным лизоцимом выдерживали 48 ч во влажной камере при комнатной температуре (22-24°С).
После экспозиции при помощи линейки измеряли диаметр зон лизиса Micrococcus lysodeikticus вокруг лунок с исследуемым материалом и стандартным лизоцимом.
Первоначально на полулогарифмической бумаге строили калибровочную кривую, используя результаты, полученные при измерении зон лизиса вокруг лунок с раствором стандартного лизоцима в различных концентрациях. Для этого значения, отражающих диаметры зон лизиса субстрата в миллиметрах, откладывали по оси абсцисс, а показатели концентрации стандартного лизоцима в мкг/мл, вызывающих лизис по оси ординат. Точки пересечения первых и вторых значений соединяли между собой, при этом получалась прямая линия.
Расчет результатов проводили следующим образом. Диаметр зоны лизиса Micrococcus lysodeikticus вокруг лунки с сывороткой крови составил 9,5 мм. На калибровочном графике этому значению соответствовала концентрация 2,5 мкг/мл стандартного лизоцима. Сыворотку крови перед исследованием разводили 1:10 1/15М фосфатным буфером. Следовательно, концентрация лизоцима в исследуемой пробе сыворотки крови равнялась 2,5Ч10=25 мкг/мл. Так как, литическая активность стандартного лизоцима изменяется в результате изготовления и хранения, полученное абсолютное значение выражали в единицах относительной активности. Активность стандартного лизоцима составляла 20600 ед/мг или 20,6 ед/мк, активность лизоцима исследуемой пробы сыворотки молозива равнялась 20,6Ч25 =515,0 ед/мл.
2.1.8. Определение содержания комплемента в сыворотке крови.
Исследовали сыворотку крови, полученную из яремной вены животных. Предварительно готовили веронал-мединаловый буфер: 0,575 г веронала растворяли в 50 мл дистиллированной воды, подогретой до 60° С, охлаждали и добавляли 8,5 г хлорида натрия, 0,375 г мединала, 0,5 мл раствора содержащего 1 М MgCl2 и 0,3 М CaCl2 (100 мл Н2О + 19 г MgCl2Ч6Н2О г + 6 г CaCl2). Объем доводили до 200 мл дистиллированной водой. Буфер хранили в холодильнике. Перед употреблением буфер разводили дистиллированной водой (1:4). Физиологический раствор: 8,5 г хлорида натрия растворяли в 1 л дистиллированной воды и фильтровали.
Эритроциты барана. Кровь у барана брали из яремной вены в колбу с бусами и встряхивали в течение 10-15 мин для предотвращения свертывания. Дефибринированную кровь фильтровали через двойной слой марли. Эритроциты барана отмывали 3 раза центрифугированием по 10 мин при 3000 об/мин. Из отмытых эритроцитов готовили 5 % взвесь на физиологическом растворе и стандартизовали на ФЭК. С этой целью эритроциты лизировали: к 1 мл отмытых эритроцитов добавляли 9 мл дистиллированной воды. Лизированные эритроциты фотоколориметрировали при зеленом светофильтре против воды. Оптическая плотность лизата — 1,08 при длине 541 мкм в кювете 10 мм.
Для определения титра гемолизина, готовили вначале основное разведение гемолитической сыворотки 1:100 (0,1 мл сыворотки + 9,9 мл буфера), затем из этого разведения поучали разведения от 1:1000 до 1:4000. | |1:1000 |1:1200 |1:1500 |1:2000 |1:2500 |1:3000 |1:3500 |1:4000 | |Буфер, мл |0,9 |1,1 |1. 4 |1,9 |2,4 |2,9 |3,4 |3,9 | |Гемолизин |0,1 |0,1 |0,1 |0,1 |0,1 |0,1 |0,1 |0,1 |
Гемолитическую систему готовили следующим образом. К стандартизованной 5 % взвеси эритроцитов барана медленно, при постоянном помешивании, добавляли равный объем гемолизина в тройном титре. Так, если полный гемолиз наблюдался в пробирке с разведением гемолитической сыворотки 1:1200, то для приготовления гемолитической системы брали разведение 1:400 (0,1 мл цельной гемолитической сыворотки и 39,9 мл буфера). Пробирки с гемолитической системой встряхивали и инкубировали при 37° С в течение 1ч для сенсибилизации эритроцитов барана.
Исследуемую сыворотку, разводили 1:10, разливали в 10 пробирок и доводили буферным раствором (физиологическим) до 1,0 мл. После этого в каждую пробирку добавляли 1 мл гемолитической системы, то есть сенсибилизированных эритроцитов барана, 2-я пробирка — контрольная. |Исследуемая сыворотка|0,05|0,1 |0,15|0,2 |0,25|0,3 |0,35|0,4 |0,45|0,5 | |(1:10), мл | | | | | | | | | | | |Буферный раствор |0,95|0,9 |0,85|0,8 |0,75|0,7 |0,65|0,6 |0,55|0,5 | |Сенсибилизированные |1,0 |1,0 |1,0 |1,0 |1,0 |1,0 |1,0 |1,0 |1,0 |1,0 | |эритроциты барана | | | | | | | | | | |
Пробирки инкубировали при 37° С в течение 45 мин, охлаждали в холодильнике 10 мин, центрифугировали при 1500 об/мин и колориметрировали на ФЭК в кюветах (10мм) с зеленым светофильтром против воды и определяли процент гемолиза.
Для определения активности комплимента в гемолитических единицах готовили шкалу и кривую гемолиза. Для приготовления шкалы гемолиза к 1 мл стандартной 5 % взвеси эритроцитов барана прибавляли 3 мл дистиллированной воды в результате чего происходил гипотонический лизис эритроцитов (100 % гемолиз). Пробирку центрифугировали (при 1500 об/мин 10 мин) и готовили шкалу гемолиза: |100 % гемолиз эритроцитов|0,1 |0,2 |0,3 |0,4 |0,5 |0,6 |0,7 |0,8 |0,9 |1,0 | |на дистиллированной воде | | | | | | | | | | | |Буферный раствор, мл |0,9 |0,8 |0,7 |0,6 |0,5 |0,4 |0,3 |0,2 |0,1 |0 | |Гемолиз, % |10 |20 |30 |40 |50 |60 |70 |80 |90 |100 |
Полученные разведения и исходный раствор колориметрировали на ФЭК в кюветах (1 мм) и строили график зависимости коэффициентов экстинции от процента гемолиза. На оси абсцисс откладывали процент гемолиза, на оси ординат — показатели экстинции, соответствующие данному проценту гемолиза.
Расчет 50 % гемолитических единиц комплемента в 1 мл проводили следующим образом. После титрования исследуемой сыворотки, инкубации ее при 37° С в течение 45 мин, выдержки в течение 10 мин в холодильнике при 4° С и центрифугирования пробирку из шкалы гемолиза с одной 50 % единицей комплемента (№5) сравнивали с пробирками из ряда титрования сыворотки. Если содержимое пробирки №5 соответствовало по цвету пробирке №6, из ряда титрования комплемента исследуемой сывороткой, то есть дозе комплемента 0,3 мл, то расчет вели следующим образом.
0,3 мл сыворотки (разведение 1:10) соответствует одной 50 % гемолитической единице комплемента, а в 1 мл исследуемой сыворотки содержится:
0,3 мл (1:10) — 1
1,0 мл — Х
Х =[pic] = 3,33 ел/мл.
2.1.9. Определение содержания пропердина в сыворотке крови. Для определения титра пропердина исследуемую сыворотку разводили мединал- вероналовым буфером (рН 7,2-7,4), начиная с 1:10 до 1:320. В центрифужные пробирки вносили по 0,2 мл каждого разведения сыворотки, до 0,2 мл суспензии инулина (соответствует 3 мг сухого вещества) и по 0,2 мл комплемента в рабочем титре. В контрольный ряд пробирок вместо инулина добавляли по 0,2 мл буфера. Все пробы (опытные и контрольные) помещали на 1 ч в термостат при 37° С, после чего центрифугировали, переносили супернатант в отдельные пробирки по 0,3 мл и добавляли по 0,2 мл стандартной гемолитической системы. Реакцию учитывали после 20-минутной экспозиции при 37° С. За титр пропердина принимали то наибольшее разведение сыворотки, в котором наблюдается полная задержка гемолиза, и в каком разведении в контрольном ряду отличается полный гемолиз. Данные рассчитывали по формуле: |Разведение, в котором отмечен|— |Разведение, в котором отмечена |Ч10 | |полный гемолиз в контроле | |полная задержка гемолиза в опыте| | |Разведение, в котором отмечен полный гемолиз в контроле |
Полученные результаты выражали в ед/мл. При полной задержки гемолиза в разведении 1:35 в опыте, а в контроле — полный гемолиз в разведении 1:50, содержание пропердина в 1 мл испытуемой сыворотки составляет:
[pic]Ч10 = 3 ед/мл.
Тестированные показатели: комплементарную, лизоцимную, пропердиновую активность, а также содержание иммуноглобулинов в сыворотке крови, молоке и молозиве крупного рогатого скота определяли по методам В. Г. Дорофейчук, 1968; X. Я. Грант, Л. И. Яворский, И. А. Блумберг, 1973; И. М. Архангельский, 1976; В. Н. Андреев, Г. И. Подопригора, 1977; Е. С. Фортинская, А. М. Наумова, Е. А. Маркова, 1977; О. Н. Грызлова, П. А. Емельяненко, В. Н. Денисенко, 1978; Э. Бем, 1979; П. А. Емельяненко, О. И. Грызлова, Г. Н. Печникова и М. Н. Тулупова, 1980; Э. С. Коган, 1981; Г. В. Павлов, Г. Н. Печникова, Смолянская- О. О. Суворова, 1988; В. В. Биктимиров, 1993.
При определении лизоцима, учитывая замедленную активность фермента крупного рогатого скота, приводили тщательную подготовку материалов к исследованию, чтобы избежать ошибок, связанные с действием на тест-микробы других литических факторов исследуемой пробы.
При тестировании комплементарной активности сыворотки крови тщательно осуществляли подбор индикаторной системы чувствительной к комплементу крупного рогатого скота.
Для определения пропердина использовали модифицированный метод предложенный П. А. Емельяненко и др., 1980.
2.1.10. Изучение бактерицидной активности сывороток крови. Для определения бактериостатической и бактерицидной активности сывороток крови О. В. Смирнова, Т. А. Кузьмина (1966) предложили фотонефелометрический метод.
В нашей работе мы учитывали изменения оптической плотности питательной среды с микробами и питательной среды с испытуемой сывороткой крови и микробами сразу после соединения и через 3-, 5-, 7-, 9-, 12- и 24-часовой инкубации.
Для нефелометрического метода чистую культуру Е. coli высевали на МПА и выращивали в термостате при температуре 37° С в течение 24 ч. Затем смывали стерильным изотоническим раствором хлористого натрия и стандартизовали до содержания в 1 мл 2 млрд. микробных тел. Из этой взвеси производили посев на МПБ в пробирки и сутки выращивали в термостате при вышеуказанной температуре.
Для определения бактерицидной активности сывороток крови мы использовали питательную среду (обогащенный пептоном бульон Хоттингера), содержащую 200 мг% амминного азота.
В стерильные кюветы с рабочей длиной 10 мм стерильной пипеткой разливали по 4,5 мл бульона Хоттингера, затем добавляли по 0,5 мл испытуемой сыворотки крови и суточную бульонную культуру Е. coli по одной бактериологической петле (диаметр петли 4 мм).
Контрольные кюветы заполняли теми же компонентами, что и опытные с той лишь разницей, что в один кювет вместо сыворотки добавили 0,5 мл стерильного изотонического раствора хлорида натрия. Содержимое всех кювет тщательно перемешивали стерильной стеклянной палочкой, после чего все кюветы закрывали ватно-марлевыми пробками. Оптическую плотность среды определяли на фотоэлектроколориметре ФЭК-М, используя зеленый светофильтр. После этого кюветы ставили в термостат при температуре 37° С. Повторно определяли оптическую плотность содержимого кювет через 3, 5, 7, 9, 12 и 24 ч. Установку «0» на ФЭК-е производили с помощью кюветы, заполненной дистиллированной водой. Оценку бактерицидной активности сыворотки крови проводили по формуле:
А=100- [pic]Ч100,
Где: А — бактерицидная активность (в %);
Д — оптическая плотность;
Т — время экспозиции кювет в термостате (в часах).
Затем вычисляли среднюю «напряженность бактерицидной активности» (НБА) по формуле:
Средняя НБА = [pic],
Где: НБА — средняя напряженность бактерицидной активности молозивной сыворотки;
А1, А2, А3.....Аn — бактерицидная активность сыворотки молозива через 3, 5, 7, 9, 12 и 24ч (в %);
Т1, Т2, Т3....... Тn — продолжительность термостатирования (в часах).
2.1.11. Постановка опсонофагоцитарной реакции. При постановке опсонофагоцитарной реакции руководствовались методикой, описанной В. Я. Мозгис (1982). Для приготовления антигена культуру Е. coli выдерживали в термостате при температуре 37° С в течение 18-24 ч в МПБ, а затем на МПА в течение 24 ч. Проверяли на чистоту и смывали стерильным изотоническим раствором хлорида натрия. По оптическому стандарту доводили концентрацию до 2-х млрд. микробных тел в 1 мл. Приготовленную взвесь нагревали в водяной бане при 70° С в течение 30 мин.
Для опсонофагоцитарной реакции применяли только суточную агаровую культуру Е. coli.
Исследования проводили в следующей последовательности. В пронумерованные стерильные пробирки наливали до 0,5 мл 2 % прокипяченного и охлажденного раствора лимоннокислого натрия, 1 мл крови от исследуемых телят и тщательно смешивали, сюда же вносили по 0,5 мл антигена. После осторожного перемешивания пробирки помещали в термостат при 38° С на 3 мин, предварительно погрузив их на 2-3 мин в водяную баню с температурой 38° С. Затем пробирки из термостата извлекали, готовили мазки, сушили на воздухе, нумеровали, фиксировали в метиловом спирте в течение 5 мин и окрашивали по Романовскому-Гимза.
Для приготовления рабочего раствора краски, дистиллированную воду усредняли фосфатными буферами: 1. Двухосновной фосфат натрия (Na2HPO4Ч12H2O) — 17,814 г на 1 л (рН 8,302). 2. Одноосновной фосфат калия (KH2PO4) — 13,638 г на 1 л (рН 4,529). Если к литру дистиллированной воды прибааляли по 5 см3 того и другого раствора, то рН такой воды был равен 6,813.
Краску готовили ex tempore из расчета 1,5 капли краски на 1 мл усредненной воды с рН 6,813. Мазки окрашивали в течение 45 мин, промывали водопроводной водой и высушивали на воздухе. Окрашенные мазки исследовали под иммерсионной системой микроскопа и окуляра 7Ч.
Подсчет фагоцитированных микробов производили в 100 нейтрофилах. На основе подсчета определяли фагоцитарную интенсивность (среднее число поглощенных микробов одним нейтрофилом) и фагоцитарную активность (процент фагоцитирующих нейтрофилов). С кровью подопытных животных поставили 450 реакций.
2.1.12. Определение содержания иммуноглобулинов в сыворотке крови, молозиве и молоке крупного рогатого скота. Предварительно готовили фосфатный буфер 0,03М, рН 3,0. С этой целью 10,74 г натрия фосфорнокислого двух замещенного (Na2HPO4Ч12H2O) и 5,84 г хлорида натрия помещали в мерную колбу, растворяли в дистиллированной воде и доводили объем до 1 л. Подобным образом готовили раствор из 4,08 г однозамещенного фосфорнокислого калия (KH2PO4) и 5,84 г хлорида натрия.
Растворы под контролем потенциометра смешивали в соотношении обеспечивающим рН буфера 8,0.
Пробы сывороток крови получали путем выдержки взятой крови из яремной вены животных 20-30 мин при 37° С в термостате. После отделения образовавшегося сгустка от стенок пробирок стеклянной палочкой, кровь помещали на 16-20 ч в холодильник. На следующий день сыворотку отсасывали в стерильную центрифужную пробирку, центрифугировали 15-20 мин при 3000 об/мин.
Пробы молозива и молока после взятия выдерживали 16-20 ч при 4° С и центрифугировали в течение 1 ч при 6000 об/мин. Затем снимали верхний слой жира, отсасывали надосадочную жидкость, которую и использовали для определения.
Пластинки из 3 %-ного агара «Дифко», смешанного с антисывороткой готовили следующим образом: 360 мг агара помещали в колбу, заливали 12 мл буфера и прибавляли 0,25 мл 1 %-ного раствора мертиолата. Колбу помещали в баню с холодной водой, которую затем нагревали до кипения и выдерживали смесь до полного расплавления агара.
После расплавления гель охлаждали до 56° С и к нему приливали равный объем антисыворотки в рабочем разведении и снова нагревали до температуры 56° С. Смесь тщательно перемешивали и выливали на стекло, помещенное на столике с уровнем в строго горизонтальном положении.
После застывания геля в нем делали лунки диаметром 2 мм на расстоянии 15 мм друг от друга.
При определении содержания иммуноглобулина G пробы сыворотки крови разводили буфером рН 8,0 в 20 и 30 раз. Пробы молозива первого дня лактации в 100, 50 и 20 раз, пробы молозива последующих дней лактации — в 50, 20 и 10 раз, использовали не разведенные и разведенные в 10 раз пробы молока.
При определении содержания иммуноглобулина М пробы сыворотки крови и молозива разводили в 10 и 5 раз, пробы молока использовали не разведенными и разведенными в 5 раз.
При определении содержания иммуноглобулина А пробы сыворотки крови использовали не разведенными, пробы молозива и молока — не разведенными и разведенными в 5 и 2 раза.
Пробы сыворотки крови получали от новорожденных телят до приема молозива во всех случаях использовали не разведенными.
Подготовленные пробы крови, молозива, и молока вносили в лунки геля с антисывороткой с помощью пастеровской пипетки. При этом лунку заполняли полностью, не переливая пробы за ее пределы.
Параллельно с опытными пробами на каждом стекле ставили контроль — разливали в лунки стандартный препарат определенного иммуноглобулина. При этом его разводили буферным раствором с таким расчетом, чтобы в 1 мл раствора препарата содержалось 5,0; 2,0; 1,0; 0,5; 0,2 и 0,1 мл белка. Таким образом, на каждом стекле получалось 6 лунок с контрольной пробой препарата.
После заполнения лунок, стекла помешали в эксикатор с водой и выдерживали при комнатной температуре, при определении содержания иммуноглобулинов G и А в течение 24 ч, а при определении иммуноглобулина М — 48 ч.
По окончании сроков инкубации стекла извлекали из эксикатора и измеряли диаметр кольца преципитата вокруг лунок с помощью линейки Беринг-Верке, после окрашивания агаровых пластин. С этой целью стекла с агаром погружали на двое суток в буфер. В течение этого срока буфер трижды заменяли новой порцией. После отмывания от не участвующих в реакции веществ, пластинки агара высушивали при комнатной температуре под фильтровальной бумагой. Затем пластинки (без фильтровальной бумаги) помещали в 0,1 %-ный раствор амидо-черного 10В на 3 ч, промывали трехкратно раствором уксусной кислоты и высушивали.
Для приготовления 0,1 %-ного раствора амидо-черного 10В, брали 1 г краски, растворяли в 100 мл ледяной уксусной кислоты (СН3СООН), после чего объем раствора доводили дистиллированной водой до 1 л. Раствор хранили в темной посуде при комнатной температуре. Раствор уксусной кислоты для промывания: брали 70 мл ледяной уксусной кислоты и доводили объем дистиллированной водой до 1 л.
Для расчета содержания иммуноглобулинов в испытываемых пробах строили калибровочную кривую на полулогарифмической бумаге: на оси ординат откладывали концентрацию белка в пробах стандарта, по оси абсцисс — диаметр кольца преципитации. Калибровочную кривую строили отдельно по каждому иммуноглобулину определенного класса.
Количество иммуноглобулина в испытуемой пробе определяли путем сравнения диаметра кольца преципитации вокруг ее лунки с калибровочной кривой [G. Mancini, A. O. Carbonara and J.F. Heremans, 1965; У. Дж. Герберт, 1974; В. М. Чекишев, 1977; П. А. Емельяненко, О. И. Грызлова, Г. Н. Печникова и М. Н. Тулупова, 1980; P. В. Петров, 1987; Н. С. Жосан, 1989; Н. В. Матузенко, Е. В. Андреев, А. И. Собко, 1990].
2.1.13. Экспресс-метод для определения содержания иммунных глобулинов. Кровь получали от телят из яремной вены до приема молозива и через 24 ч после рождения. Сначала ее выдерживали около часа в (30-35° С), а затем в холодильнике 10-12 ч. После чего отделяли сыворотку в отдельные пробирки.
Раствор цинк сульфата (208 мг/л ZnSO4Ч7H2O) готовили в мерной колбе на дистиллированной воде, которую выдерживали 4-5 дней и затем кипятили в течение 10-15 мин с целью растворения диоксида углерода.
Для приготовления стандарта мутности брали 3 мл раствора хлорида бария (BaCl2Ч2H2O) в 100 мл дистиллированной воды, вносили в мерную колбу на 100 мл и доводили до метки 0,2N раствором серной кислоты. Полученный раствор соответствует 20 ед. цинк сульфатному тесту [A. D. MсEwan, E. W. Fisher, I. E. Selman and W. J. Penhale, 1970].
Калибровочную таблицу для калориметрического определения содержания иммуноглобулинов на ФЭК-56М получали путем разведения стандарта мутности.
Для определения иммунных глобулинов подбирали пробирки одинакового диаметра и наливали в каждую по 6 мл цинк сульфатного раствора, а в контрольною пробирку — 6 мл дистиллированной воды. Во все опытные пробирки (по количеству образцов) и в контрольную добавляли по 0,1 мл исследуемой сыворотки и выдерживали при комнатной температуре (20° С) 60 мин. После экспозиции пробирки взбалтывали, чтобы обеспечить одинаковое перераспределение осадка и помещали в фотоэлектроколориметр, который предварительно устанавливали на «0» по дистиллированной воде. Измерение проводили на ФЭК-56М, ври длине волны 400±5 нм (синий светофильтр) в кюветах толщиной слоя 10 мм. Показание прибора ФЭК-56М определяли образцах сыворотки через контрольную пробирку умножением различия на фактор 10. 20 единиц цинк сульфатного теста помутнения были эквивалентны соответственно 20-30 мг/мл содержания колостральных иммунных глобулинов в сыворотке крови теленка [A. D. MсEwan, E. W. Fisher, I. E. Selman and W. J. Penhale, 1970].
2.1.14. Определение уровня пассивной защиты у новорожденных телят. Метод основан на том, что белки сыворотки крови могут преципитироваться различными солями, включая сульфит натрия (Na2SO3). Этот феномен зависит от концентрации соли и молекулярной характеристики белков. Готовили 14-, 16-, и 18 %-ный растворы Na2SO3, используя для этих целей безводный реактив. Соответственно 14, 16 и 18 г его растворяли в 100 мл дистиллированной воды. Кроме безводного сульфита натрия использовали Na2SO3Ч7Н2О, при этом количество его для приготовления соответствующих концентраций увеличивали вдвое.
В пробирки вносили по 1,9 мл раствора сульфита натрия каждой концентрации и добавляли по 0,1 мл испытуемой сыворотки. Пробирки тщательно встряхивали и выдерживали 1 ч при комнатной температуре. Реакцию считали отрицательной, если преципитат не образуется и положительной, если видны хлопья преципитированного белка или заметно даже небольшое его присутствие, в данном случае уровень иммуноглобулинов в испытуемой сыворотке соответствует промежуточному значению. Концентрация иммуноглобулина меньше 5 мг/мл соответствовала помутнению при концентрации 18 %; от 5 до 15 мг/мл — 16 и 18 %, и больше 15 мг/мл — 14, 16 и 18 % сульфита натрия. [N. E. Pfeiffer, T. C. McGuire, 1977; N. E. Pfeiffer, T. C. McGuire, R. E. Bendel and J. M Weikel, 1977; Ю. Н. Федоров, 1988].
Сывороточный гемолиз не влиял на результаты преципитации иммуноглобулинов.
2.1.15. Выделение лактоглобулина из колостральной сыворотки. Лактоглобулины из сыворотки молозива получали солевым методом. За основу взяли методику фракционного высаливания противогриппозных сывороток.
К сыворотке добавляли два или три объема дистиллированной воды в зависимости от содержания белка. В смесь, при перемешивании мешалкой, добавляли тонкой струей насыщенный раствор сернокислого аммония. После тщательного перемешивания смесь оставляли в покое на 10-15 ч в холодильнике до полного формирования осадка.
Лактоглобулин сыворотки молозива подвергался высаливанию 38 объемными процентами насыщенного раствора сернокислого аммония по формуле:
Х=[pic], где: Х — объем насыщенного раствора сернокислого аммония;
С — требуемая концентрация сернокислого аммония;
Y — объем разбавленной молозивной сыворотки. рН насыщенного раствора сернокислого аммония — 7,3-7,5.
Выпавший осадок лактоглобулина отделяли от раствора путем фильтрации через воронку Бюхнера с двойным слоем хроматографической бумаги.
Плотный осадок переносили в целлофановые мешочки и подвергали диализу в проточной водопроводной воде, а затем в дистиллированной воде до тех пор, пока в растворе не обнаруживалось даже следов сернокислого аммония, что проверяли реактивом Несслера.
По окончании диализа определяли концентрацию белка (рефрактометрически) в растворе лактоглобулина и дистиллированной воды разбавляли его до содержания 10 % белка. К раствору добавляли хлорид натрия до изотонического насыщения.
Подученный препарат подвергали стерилизующей фильтрации через фильтр Зейтца с пластинкой СФ и расфасовывали по ампулам и флаконам.
Стерильность полученного препарата подтверждали высевом на МПБ, МПА и среду Китт-Тарроци, а безвредность на белых мышах и морских свинках. Посевы выдерживали в термостате при 37° С восемь суток. Лактоглобулин вводили подкожно двум морским свинкам массой 230-240 г в дозе по 3 мл и четырем белым мышам массой 16-18 г по 0,5 мл с последующим наблюдением за животными в течение 5 дней.
Исключение примесей балластных белков в препарате производили электрофоретически. Препарат хранили в холодильнике при температуре +3 +5° С.
2.2. Изучение специфической иммунологической реактивности телят в постнатальный период.
Уровень иммуноглобулинов в сыворотке крови телят до приема молозива и через 24 ч после рождения определяли цинк-сульфатным методом [A. D. MсEwan, E. W. Fisher, I. E. Selman and W. J. Penhale, 1970].
Концентрацию иммуноглобулинов молозива коров с учетом их возраста вычисляли по уровням линейной регрессии [H. Balbierz, M. Nicolaijczuk, J. Zeilinski, 1983].
Эффективность колостральных иммуноглобулинов изучали по отношению содержания иммуноглобулинов в сыворотке крови неонатальных телят к количеству поступивших с молозивом.
Количественную характеристику абсорбции колостральных иммуноглобулинов классов G, М и А устанавливали методом радиальной иммунодиффузии [G. Mancini, A. O. Carbonara and J.F. Heremans, 1965; В. М. Чекишев, 1977]. Выделенные иммуноглобулины классов G, М и А служили антигенами для иммунизации кроликов [R. A. Wilson and I. W. Jutila, 1976] с целью получения соответствующих моноспецифических антисывороток.
Степень катаболизма иммуноглобулинов изучали определением их классов в сыворотке крови методом радиальной диффузии. Иммуноглобулины в фекалиях определяли по E. F. Logan, W. J. Penhale, 1972; Р. П. Маслянко, 1982.
После измерения диаметров зон преципитации концентрацию иммуноглобулинов рассчитывали математическим способом, исходя из прямо пропорциональной зависимости между ней и квадратом диаметра кольца [Э. Бем, 1979].
Колостральную сыворотку отделяли после добавления сычужного фермента. Лактоглобулин получали добавлением к сыворотке молозива насыщенного раствора сульфата аммония с последующим диализом против 0,01М рН 7,6 Na2HPO4; KН2PO4.
Статистическую обработку результатов исследования проводили с использованием критерия достоверности Стьюдента.
2.2.1. Уровень иммуноглобулинов в сыворотке крови телят до приема молозива и через 24ч после рождения и взаимосвязь между концентрацией иммуноглобулинов и проявлением синдрома нарушения пищеварения. Проведенные исследования показали, что концентрация колостральных иммунных глобулинов в крови телят до приема молозива составила 0,18±0,08 мг/мл, этот уровень главным образом связан с IgМ. Через 24 часа после приема молозива содержание иммуноглобулинов достигло 23,94±1,71 мг/мл или увеличилось в 133 раза (табл. 2.1).
Таблица 2.1
Содержание иммунных глобулинов в сыворотке крови новорожденных телят
(n=20).
|Группы телят |Средн|Диспер|Средне|Средняя |Точност|Доверительн|Относит| | |яя |сия |е |арифмети|ь |ый |ельная | | |арифм| |квадра|ческая |прямых |интервал, |ошибка | | |етиче| |тическ|ошибка |измерен|мг/мл |(погреш| | |ская,| |ое | |ий | |ность),| | |мг/мл| |отклон| | | |% | | | | |ение | | | | | |До приема |0,18 |0,0035|0,019 |0,008 |0,02 |0,16-0,20 |11,1 | |молозива | | | | | | | | |Через 24 ч |23,94|14,69 |3,83 |1,71 |4,75 |18,19-28,69|19,8 | |после рождения:| | | | | | | | | | | | | | | | | |I группа — | | | | | | | | |контроль | | | | | | | | |II группа — |18,26|0,16 |0,4 |0,18 |0,49 |17,77-18,75|2,68 | |энтеритная | | | | | | | | |форма | | | | | | | | |колибактериоза | | | | | | | | |III группа — |15,37|0,66 |0,43 |0,19 |0,53 |14,84-15,90|1,24 | |септическая | | | | | | | | |форма | | | | | | | | |колибактериоза | | | | | | | |
Новорожденные телята с содержанием иммуноглобулинов 23,94± 1,71 мг/мл (доверительный интервал 19,19-28,69 мг/мл) переболели легкой формой колибактериоза на третьи сутки. Даже такая высокая концентрация иммуноглобулинов не обеспечивала иммунологический статус новорожденных телят, что связано со значительной инфицированностью внешней среды и снижением вследствие этого защитного уровня молозива.
Содержание иммуноглобулинов через 24 часа в сыворотке крови телят сильно варьирует и составляет от 19,85 мг/мл до 29,11 мг/мл. Такая разница объясняется количеством проглоченного теленком молозива.
Способность новорожденных животных адаптироваться к изменениям внешней среды лимитировано и изменение условий, не влияющих на взрослых животных, может плохо отразиться на состояние здоровья телят. Известно, что стресс является способствующим фактором возникновения колибактериоза у телят. Причиной стресса могут быть различные нарушения условий содержания, порой самые безобидные, поэтому предотвратить стресс весьма трудно. Даже перемещение является причиной стресса, который приводит к увеличению уровня заражения инфекционными агентами. Низкая температура, сквозняки, влажная подстилка способствуют возникновению и распространению инфекции. Следовательно, иммунологический статус, необходимый для защиты организма, зависит от количества молозива, проглоченного теленком в первые минуты жизни и условий внешней среды.
Исходя из этого, невозможно точно указать количество колостральных иммуноглобулинов, обеспечивающих иммунологическую защиту животных.
При концентрации иммуноглобулинов в сыворотке крови телят 18,26±0,18 мг/мл (доверительный интервал 17,77-18,75 мг/мл) заболевание протекает с расстройством пищеварения,и сопровождается средней тяжестью дегидратации а также диареей. Такие телята отказываются от молозива, с трудом поднимаются, задняя часть туловища испачкана фекалиями, влажная.
Длительность течения болезни при такой концентрации иммуноглобулинов обычно составляет 4-6 дней. Уровень иммуноглобулинов в сыворотке крови телят с энтеритной формой колибактериоза ниже, чем в контрольной группе (Р