А.Б.Рубин, О.Р.Кольс, Т.Е.Кренделева и др.
Разнообразиеживых систем во многом определяется многообразием структуры и функции клеточныхмембран. Они не только формируют клетку и внутриклеточные структуры, отделяютклетку от внешней среды, защищают ее от проникновения патогенных и чужеродныхсоединений, но и играют роль селективного, тонко регулируемого, барьера. Крометого, мембраны — ключевой элемент в генерации электрических импульсов, осуществлениимежклеточных контактов, преобразовании и запасании в форме АТФ энергии света иокислительно-восстановительных реакций, а также в регуляции процессов секреции,повреждения и старения клетки. Мембранные рецепторы обеспечивают восприятиесвета, химических медиаторов, механических стимулов, температуры, электрическогополя и др. Чем меньше размеры клеток, тем больше их удельная поверхность и темболее важную роль играют мембраны в жизнедеятельности клетки. Все эти процессыи явления, механизмы их взаимодействия и регуляции составляют важный разделсовременной биофизики клетки.
Первичные физико-химические молекулярные процессы
Накафедре проводятся исследования процессов генерации и проведении возбуждения внервных клетках (нейрон, глиальная клетка и аксон). Изучается состояниеплазматических мембран и основные процессы ионного транспорта. Выявленыизменения ряда параметров, характеризующих состояние плазматической мембраны(мембранный потенциал, содержание мембраносвязанного Са2+, ритмическоевозбуждение), субклеточных органелл (потенциал внутренней мембраны митохондрий,содержание восстановленных флавопротеинов, вязкость мембран) и цитоплазмы(изменение показателя преломления) пейсмекерного нейрона при действиинейромедиаторов. Процессы перераспределения Са2+ между плазматической мембранойи внутриклеточными органеллами в пейсмекерном нейроне исследуют при термо-, хемо-и механостимуляции локализованных в коже экстерорецепторов и при воздействиинейромедиаторов и NO на нейрон в составе ганглия. Установлено, что измененияэлектрической активности нейронов при стимуляции экстерорецепторов и действиинейромедиаторов сопровождаются перераспределением Са2+ в цитоплазме: десорбциейСа2+, связанного на плазматической мембране клетки, увеличением концентрацииСа2+ в цитоплазме, входом Са2+ в митохондрии и стимуляцией работыэлектрон-транспортной цепи, а также связыванием Са2+ субклеточными структурамии регулярными изменениями оптической плотности цитоплазмы.
Развиваемоенаправление непосредственно связано с нейрофизиологией и физиологией крови, цитологией,а также нейрохимией, молекулярной биологией и моделированием. Эти работы имеютважное практическое применение в рамках медицинской биофизики. Основнымподходом данных исследований является работа на нативных (то есть находящихся вприродном состоянии) функционирующих объектах — изучение биоэлектрогенеза, переносакислорода эритроцитами и др.
Применяютсямикроэлектродные методы («пэтч-клямп»), методы микроскопии (флуоресцентнаямикроскопия, спектроскопия комбинационного рассеяния, интерференционнаямикроскопия, конфокальная микроскопия), а также радиоспектроскопия (ЭПР, ЯМР) иизотопные методы.
Мембранные процессы в растительной клетке
Работынацелены на изучение электрохимических и фотобиологических процессов, протекающихв хлоропластах и на плазмалемме клетки в индукционный период фотосинтеза и настадии стационарного фотосинтеза. Изучается фотогенерация мембранногопотенциала Δφ в хлоропластах. Наиболее быстрые изменения мембранногопотенциала (от 10 мкс до 1 с), протекают на тилакоидных мембранах хлоропластов.С использованием уникально крупных хлоропластов печеночного мха Anthocerosустановлено, что мембранный потенциал, наряду с градиентом рН (ΔpH), играетважную роль в биоэнергетике в качестве движущей силы для синтеза АТФ. ИзмеренияΔφ позволяют оценивать проводимость тилакоидных мембран исопрягающего фактора.
Электрическийпотенциал тилакоидов оказывает существенное влияние на фотосинтетическийперенос электронов, что проявляется в изменениях флуоресценции хлорофиллаодиночных хлоропластов при сдвигах Δφ за счет пропускания тока черезмикроэлектрод. В зависимости от редокс-состояния первичного акцептораэлектронов в фотосистеме II (ФС II), биполярные импульсы тока вызываютсимметричные или асимметричные сдвиги флуоресценции. Предложена математическаямодель, объясняющая влияние Δφ на флуоресценцию хлоропластов. Явлениявозбудимости отвечают за быстрое закрывание листьев у сейсмочувствительных(мимоза) и ряда насекомоядных растений. Потенциалы действия (ПД) возникают и впроводящих пучках многих высших растений в ответ на механические итемпературные стимулы. Вместе с тем, исследования на Anthoceros показали, чтоимпульсы типа ПД могут возникать в ответ на короткое (3 с) яркое освещение.Генерация импульсов исчезает при подавлении фотосинтеза и активности H+ — АТФазырастительной клетки. Генерация ПД под влиянием импульса света сопровождаетсядлительными (10—15 мин) изменениями в состоянии фотосинтетического аппарата.
Светозависимаяпространственная самоорганизация потоков H+ и активности фотосинтезанаблюдается в клетках харовых водорослей, удобных для исследования многихфундаментальных биологических процессов, поскольку они совмещают способность кфотосинтезу с электровозбудимостью и способностью формировать кальциевыеотложения. У неосвещенных клеток водоросли Chara (длина одной клетки которыхможет достигать 10 см) профиль рН среды однороден по длине клетки, однако насвету в профиле pH возникают чередующиеся кислые и щелочные зоны с перепадом рНпорядка 3-х единиц. Неоднородный профиль рН отражает гетерогенное распределениеактивных транспортных систем плазмалеммы, он согласован с профилемфотосинтетической активности в слое хлоропластов. Создана математическая модельпроисходящих процессов.
Недавноустановлено, что однократная генерация ПД сглаживает неоднородный профиль рН напериод до 10—40 мин в зависимости от интенсивности света и уровня Ca2+ в среде.Влияние короткого электрического сигнала — ПД — аналогично эффекту длительного(20 мин) помещения клетки в темноту. Сглаживание профиля рН обусловленоостановкой H+ — насоса в кислых зонах и снижением H+ — проводимости в щелочныхзонах. Генерация ПД вызывает быстрое подавление фотосинтетического переносаэлектронов, более сильное в щелочных зонах. Анализ световых зависимостей идействия ионофоров говорит о том, что влияние ПД на флуоресценцию хлорофилла иквантовый выход переноса электронов в фотосистеме II обусловлено возрастаниемΔpH на тилакоидной мембране. Нарушение согласованных функций хлоропластови плазмалеммы под влиянием ПД, вероятно, вызвано почти 100-кратным повышением вцитоплазме уровня Са2+, являющегося регулятором многих внутриклеточныхпроцессов.
Проницаемостьклеточных мембран для малых незаряженных молекул (неэлектролитов) и газов
Хотядавно высказывались предположения о том, что в клеточных мембранах существуютпоры для просачивания воды, длительное время преобладало мнение, что она простодиффундирует через клеточную мембрану. В конце 1950-х годов было установлено, чтов мембранах эритроцитов есть специальные каналы, через которые вода проходит, аионы — нет. При этом клеточный «водопровод» обладает потрясающей пропускнойспособностью: до миллиарда молекул воды в секунду. Логично было предположить, что,как и в случае других веществ, например сахаров и аминокислот, транспорт водычерез мембрану происходит с помощью белка. Но какой именно белок выполняетданную функцию? Этот вопрос довольно долго оставался без ответа.
Отсутствиезаряда у частиц существенно затрудняет исследование их трансмембранноготранспорта, и до последнего времени транспорт неэлектролитов оставался наименееизученным. Недавно было показано, что мембранный белок аквопорин образует вмембране водную пору, непроницаемую для ионов. Пространственная структурааквапорина напоминает цилиндрический канал, по которому движутся молекулы воды.Аминокислоты в белке расположены таким образом, что полярность создаваемого имиэлектростатического поля «переключается» в центре молекулы на обратную. Поэтомумолекулы воды, дойдя до середины канала, переворачиваются так, что их дипольныемоменты в верхней и нижней части канала направлены в противоположные стороны.Такое переориентирование предотвращает просачивание через канал ионов. Кнастоящему времени известно около 200 разновидностей белков водных каналов урастений и животных, в том числе 11 — у человека. Благодаря аквапоринам клеткине только регулируют свой объем и внутреннее давление, но и выполняют такиеважные функции, как всасывание воды в почках животных и корешках растений.
Открытиеаквапоринов стимулировало интерес к чрезвычайно важной проблеме функционированияклетки — механизмам трансмембранного транспорта молекул простых газов и другихмалых незаряженных молекул. Прежде всего это касается молекулярного кислорода иего синглетно возбужденной формы, а также СО2, CO, NO, NH3 и др. Постоянный иинтенсивный транспорт кислорода через клеточные мембраны — яркая особенностьаэробной жизни, обусловленная в первую очередь его необходимостью для процессовдыхания и окислительного фосфорилирования. До последнего времени господствоваломнение, что диффузионное сопротивление липидного бислоя для кислородапрактически не отличается от сопротивления слоя воды аналогичной толщины, и еготрансмембранный транспорт осуществляется путем простой диффузии.
Впоследние годы на кафедре биофизики развернуты систематические исследованиямембранного транспорта малых незаряженных молекул и, в первую очередь, кислорода.С помощью специально разработанного прямого метода измерения трансмембранногопотока кислорода было установлено, что диффузионное сопротивление липидныхслоев для кислорода на два — три порядка выше, чем ранее полагали. Это связанос существованием кислородных каналов в клеточных мембранах, осуществляющихинтенсивный кислородный транспорт. Прежде всего, это относится к мембранамэритроцитов, содержащих значительное количество аквапорина.
Найденыусловия, при которых интенсивность потока кислорода определяется диффузионнымсопротивлением мембраны эритроцитов, а диффузионное сопротивление водной фазы, окружающейклетку, минимизируется. Установлено, что диффузионное сопротивление мембраныэритроцитов для кислорода существенно меньше, чем можно было ожидать в условияхпростой диффузии через липидный бислой. Ингибирование каналов аквапориновприближает диффузионное сопротивление мембран для кислорода к сопротивлениюлипидного бислоя.
Диапазоныдействующих концентраций и величины наблюдаемых эффектов торможения потоковкислорода и воды совпадают. Это означают, что канальный транспорт кислорода иводы в мембранах эритроцитов имеет общую природу. Получены доказательства важнойроли мембранного транспорта кислорода в физиологии газообмена человека, вчастности, при больших физических нагрузках и различных заболеваниях.
Проблемы клеточного анабиоза
Способностьк переходу в анабиоз (состояния организма, при котором жизненные процессынастолько замедлены, что отсутствуют видимые проявления жизни) присуща многимживым системам. Это состояние обычно для низших растений (мхи, лишайники), покоящихсяспор микроорганизмов и семян высших растений. Семена растений представляютсяудобным объектом для изучения анабиоза. При анабиозе в клетках семян происходятдеструктивные процессы, которые, в конце концов, приводят семена к гибели. Этипроцессы протекают достаточно медленно, на что указывает возможностьдлительного (годы, десятилетия, и даже столетия) сохранения семенамижизнеспособности.
Оказалось,что в семенах медленно развиваются свободно-радикальные процессы деструкции исшивки макромолекул. Продукты перекисного окисления (перекиси и альдегиды)участвуют в необратимых сшивках белков, липидов и нуклеиновых кислот. При этомнаблюдается слабое свечение воздушно-сухих семян, являющееся фосфоресценциейпри комнатной температуре.
Проведенныена семенах бобовых культур исследования позволили разработать метод оценкикачества индивидуальных семян. Показано, что в каждой партии семян можновыделить три фракции — сильные (I), ослабленные (II) и мертвые (III).Распределение семян по трем фракциям может изменяться в ходе хранения и приразличных воздействиях (УФ, ионизирующая радиация, гипертермия и др.). Вещества,тормозящие перекисное окисление липидов (эндогенные антиоксиданты, амидогуанини др.) продлевают сроки хранения семян. Семена перспективно использовать и вкачестве модели при исследовании общей проблемы старения.
Важнымфактором жизнедеятельности является вода, на долю которой приходится основнаячасть содержимого живой клетки; она является прекрасным полярным растворителем,а также стабилизатором биологически важных структур, хотя ее роль этим неограничивается. Поэтому чрезвычайно важным являются как фундаментальные, так иприкладные проблемы изучения роли воды в биологических процессах. Исследования,выполненные на модельных и биологических системах, привели к выводу, что водаво многом определяет равновесие сил в пределах макромолекул, мембран и другихсистем. Отражением этого равновесия сил является динамическая структура белкови мембран. Именно с динамикой белков и мембран связана эффективность многихбиологических процессов. Оказалось, что макромолекулы ферментов характеризуютсяболее интенсивным внутренним движением по сравнению с неферментными белками.Это, возможно, связано с более жесткими требованиями к процессам регуляции вслучае ферментов, где не только сам субстрат, но и продукты его реакции недолжны оказаться токсичными для организма.
Особенностидинамической структуры биополимеров играют важную роль и на клеточном уровнеорганизации. Здесь изменение динамики в процессах сорбции-десорбции белковприводит к заметному изменению числа степеней свободы и энтропии системы и, соответственно,к малому изменению свободной энергии в подобных процессах. В результатепоявляется еще один связанный с водой важный механизм управления биологическимипроцессами с помощью слабых воздействий. Связь между резкой активациейметаболизма и появлением воды в жидкой фазе была четко показана при изученииизменения состояния воды в ходе набухании семян растений.
Решающуюроль в жизнеспособности живой клетки играет подвижная вода. Проводимые накафедре исследования позволили обнаружить неизвестный ранее механизм удержанияподвижной воды. Для более чем 100 видов и штаммов грибов, мхов и лишайников спомощью метода ЯМР было показано, что в воздушно-сухих клетках устойчивых кпотере воды видов всегда сохраняется некоторое количество подвижной свободнойводы. У неустойчивых форм, в том числе у разных штаммов одного вида, такая водаобычно отсутствует. Обычно у устойчивых форм ее количество составляет порядканескольких процентов, а у криптококков, обитающих в условиях высокогорныхпустынь Восточного Памира с резкими колебаниями температуры и влажности втечение суток, количество подвижной воды достигает 30% от веса воздушно-сухойбиомассы.
Список литературы
Дляподготовки данной работы были использованы материалы с сайта bio-cat.ru/