--PAGE_BREAK--
1.3 Влияние загрязнения на экологические функции почв
Почва, является неотъемлемой частью любого биогеоценоза и биосферы в целом. При этом, она выполняет ряд экологическихфункций, в т.ч. глобальных биосферных, обеспечивающих стабильность биосферы и саму возможность существования жизни на Земле [3].
В настоящее время принято деление экологических функций почвы на две большие группы: экосистемные (биогеоценотические) функции почвы и глобальные (биосферные) функции почвенного покрова [4].
1.3.1 Экосистемные (биогеоценотнческие) функции
почвы
Являясь частью любого наземного биогеоценоза, почва выполняет ряд экосистемных (биогеоценотических) функций (рис. 1). Загрязнение почвы приводит к их нарушению.
1. Функции почвы, обусловленные физическими свойствами: жизненное пространство, жилище и убежище, механическая опора, депо семян и других зачатков.
В рассматриваемом аспекте наиболее важными являются такие физические свойства почвы как структура, плотность, влагоемкость, водопроницаемость, темпeрaтyрa, теплопроводность и др.
Многочисленные данные свидетельствуют, что при загрязнении почвы предприятиями железнодорожного транспорта ухудшается структура почвы, увеличивается плотность, уменьшается общая порозность, снижается водопроницаемость, ухудшается водно-воздушный режим почв [5].
В результате девегетации усиливаются процессы эрозии и дефляции почвы. В последнем случае наблюдается разрушение почвы, которое делает невозможным выполнение почвой не только этой группы функций, связанной с физическими свойствами, но и любых других ее функций.
При загрязнении физические свойства почв изменяются в последнюю очередь. Это происходит только при очень значительном накоплении загрязнений в почве — около 10 ПДК и более [6].
Рис.1. Экосистемные (биогеоценотические) функции почвы[7]
2. Функции почвы, связанные преимущественно с ее химическими, физико-химическими и биохимическими свойствами: источник элементов питания; депо влаги, элементов питания и энергии; сорбция веществ, поступающих из атмосферы и с грунтовыми водами; сорбция микроорганизмов; стимулятор и ингибитор биохимических и других процессов.
Выполнение перечисленных функций зависит от таких свойств почвы как содержание и запасы гумуса и элементов минерального питания, влагоемкость, щелочно-кислотные и окислительно-восстановительные условия, активность ферментов и др.
Высокие дозы загрязнений вызывают алифатизацию гумуса, что ведет к увеличению содержания углеводов, гидролизуемости гумуса, степени окисляемости гумуса и соответственно значений крнцентрации гумуса[8].Загрязнение почв предприятиями железнодорожного транспорта влияет и на качественный состав гумуса, в основном снижается содержание гуминовых кислот и увеличивая содержания фульвокислот[6].
Как правило, загрязнения почвы ингибируют процессы азотфиксации, аммонификации, нитрификации и минерализации. Однако, в ряде случаев, при невысокой концентрации загрязнений или в богатых гумусом почвах, отмечается усиление интенсивности этих процессов, вследствие чего возрастает содержание в почве доступных растениям форм азота, а часто и фосфора, т.е. происходит улучшение питательного режима почвы [9].
Загрязнение почвы практически всегда ведет к снижению ферментативной активности почв, так как ингибирование ферментов является характерным свойством загрязнений железнодорожного транспорта.
Изменение вышеуказанных свойств происходит уже при менее значительном загрязнении почвы — около 1 ПДК и более.
3.Информационная группа биогеоценотических функций почвы: сигнал для ряда сезонных и других биологических процессов; регуляция численности, состава и структуры биоценозов; пусковой механизм некоторых сукцессий; «память» биогеоценоза. По сравнению с вещественной и энергетической сторонами природных процессов и явлений информационный аспект исследуется относительно недавно. Отчасти именно поэтому сведения о влиянии загрязнений на эту группу экологических функций почвы практически отсутствуют. Исключение составляет информация об изменении численности, состава и структуры биоценозов.
По имеющимся данным, загрязнение почв объектами железнодорожного транспорта оказывает значительное влияние на общую численность, видовой состав и активность почвенной микробиоты. При загрязнении почв железнодорожным транспортом численность почвенных микроорганизмов может снижаться, не изменяться, и даже увеличиваться. [6] Более однозначными являются изменения состава и структуры комплекса почвенных микроорганизмов, которые проявляются в снижении видового разнообразия [10].
4.Целостные биогеоценотические функции почвы: аккумуляция и трансформация веществ и энергии, находящихся в биогеоценозе или поступающих в него; санитарная функция; буферный и защитный биогеоценотический экран; условия существования и эволюции организмов.
Выполнение почвой этой группы функций зависит от всех ее свойств. На примере данной группы функций наиболее отчетливо прослеживаются обратные связи между загрязнением почвы железнодорожным транспортом и способностью почвы выполнять свои экологические функции. С одной стороны, именно указанные функции призваны предотвращать негативные последствия загрязнения почв железнодорожным транспортом, с другой стороны, когда свойства почвы, определяющие эти функции, не выдерживают антропогенного пресса, и происходит срыв в их работе, тогда и возникают нарушения в функционировании почвы и всей экосистемы. Именно под устойчивостью данных функций должна пониматься устойчивость почвы к загрязнению объектами железнодорожного транспорта.
О влиянии загрязнения объектами железнодорожного транспорта на группу целостных биогеоценотических свойств почвы можно судить по показателям фитотоксичности почвы. Загрязнения объектов железнодорожного транспорта приводят к увеличению фитотоксических свойств почвы [11].
Ухудшение целостных функций почвы происходит одновременно с ухудшением группы химических, физико-химических и биохимических функций почвы, т.е. при содержании загрязнений около 1 ПДК и более [6].
1.3.2 Глобальные (биосферные) функции почвенного
покрова
Помимо охарактеризованных биогеоценотических функций почвы, почвенный покров, как компонент биосферы, выполняет ряд биосферных функций (табл. 3). Проанализируем влияние загрязнений железнодорожного транспорта на способность почвы выполнять основные биосферные функции.
1.Среда обитания, аккумулятор и источник вещества и энергии для организмов суши. Загрязненная железнодорожным транспортом почва является малопригодной или вовсе непригодной для обитания большинства живых организмов. Даже если почва не становится безжизненной, то формирующиеся на ней биоценозы отличаются малым объемом биомассы, низкой скоростью биологических процессов, узким видовым составом (биоразнообразием), слабой устойчивостью и т.д
Таблица 3
Глобальные функции почв[12]
Сферы влияния
Литосфера
Гидросфера
Атмосфера
Биосфера в целом
биохимическое преобразование верхних слоев литосферы
трансформация поверхностных вод в грунтовые
поглощение и отражение солнечной радиации
среда обитания, аккумулятор и источник вещества и энергии для организмов суши
источник вещества для образования минералов, пород, полезных ископаемых
регулирование влагооборота атмосферы
связующее звено биологического и геологического круговоротов
передача аккумулирован-ной солнечной энергии в глубокие части литосферы
участие в формировании речного стока
источник твердого вещества и микроорганизмов, поступающих в атмосферу
фактор биопродуктивности водоемов за счет приносимых почвенных соединений
поглощение и удержание некоторых газов от ухода в космическое пространство
защитный барьер и условие нормального функционирования биосферы
защита литосферы от чрезмерной эрозии и условие ее нормального развития
сорбционный защищающий от загрязнения барьер акваторий
регулирование газового режима атмосферы
фактор биологической эволюции
2.Сопряжение большого геологического и малого биологического круговоротов веществ на земной поверхности. Следствием снижения интенсивности биологических процессов является ослабление биологического круговорота вещества и усиление геологического. Это выражается в развитии эрозии почв, усилении процессов денудации суши, приводит к удалению с поверхности суши биофильных элементов.
3.Регулирование химического состава атмосферы и гидросферы. В почве, загрязненной объектами железнодорожного транспорта, происходит изменение биогеохимическихи геохимических процессов, что отражается на направленности трансформации и миграции веществ между почвой, атмосферой и гидросферой. Например, ослабление интенсивности почвенного «дыхания» снижает поглощение почвой кислорода и выделение в атмосферу углекислою газа.
4.Защитный барьер биосферы. Почва, в большей степени, чем другие компоненты биосферы, нейтрализует в себе значительную часть загрязняющих биосферу веществ, в частности загрязнений железнодорожного транспорта, тем самым, предотвращая их поступление в живое вещество. При загрязнении железнодорожным транспортом буферные (защитные) свойства почвы снижаются.
5.О6еспечение существования жизни на Земле. Венцом всех охарактеризованных экологических функций почвы выступает ее плодородие, обеспечивающее возможность существования жизни на континентах в современной форме, а также жизнь и хозяйственную деятельность человека. Загрязнение объектами железнодорожного транспорта снижает почвенное плодородие, продуктивность и устойчивость экосистем, ухудшает здоровье и качество жизни населения, сокращает продолжительность жизни.
Нарушение общебиосферных функций, выполняемых почвой, в результате целого комплекса причин, только одной из которых является загрязнение объектами железнодорожного транспорта, в настоящее время принимает планетарный характер. Этот процесс вносит свою отрицательную лепту в развитие глобального экологического кризиса и создает угрозу стабильного существования биосферы.[6]
Глава 2. Ферментативная активность как показатель эколого-функционального состояния почвы
2.1 Показатели эколого-функционального состояния почвы и выбор наиболее информативных показателей
Мониторинг и диагностика почв приобретают в настоящее время актуальное значение, как для проведения фундаментальных научных исследований, так и для выполнения практических производственных мероприятий [13].
Наиболее полным исследование состояния загрязненных объектами железнодорожного транспорта почв, будет в том случае, если будут определены следующие показатели:
— прямые показатели загрязнения почв: общее (валовое) содержание загрязнений, содержание подвижных (экстрагируемых) форм загрязнений, мощность загрязненного слоя и др.;
— показатели изменения свойств почв под действием загрязнителей: активность почвенных ферментов, скорость основных микробиологических процессов, численность почвенных микроорганизмов и структура микробоценоза, содержание подвижных соединений азота и фосфора, фитотоксичность и др.;
— показатели устойчивости почв к загрязнению: емкость почвенного поглощающего комплекса, содержание и запасы гумуса, щелочно-кислотные условия, окислительно-восстановительные условия и др. [14]
Выбор показателей для мониторинга эколого-функционального состояния почв, должен основываться на следующих критериях:
— информативность показателя (тесная корреляция между показателем и антропогенным фактором);
— высокая чувствительность показателя;
— хорошая воспроизводимость результатов;
— незначительное варьирование показателя;
— небольшая ошибка опыта;
— простота, малая трудоемкость и высокая скорость метода определения;
— широкая распространенность метода в стране и за рубежом, соответствие принятым стандартам.
С другой стороны, нет смысла определять необоснованно большое количество разнообразных показателей эколого-функционального состояния почвы. Практика показала, что для объективной достоверной оценки эколого-функционального состояния почвы достаточно определения набора наиболее информативных показателей.
Выбор показателей для мониторинга и диагностики эколого-функционального состояния почв должен проводиться в зависимости от целей и задач исследования, вида антропогенного воздействия на почву, имеющейся лабораторно-аналитической базы, подготовки персонала и других критериев.
Определение всего комплекса показателей загрязнения является очень трудоемким и дорогостоящим мероприятием и возможнотолько в очень редких случаях. Более целесообразным представляется определить узкий набор показателей, достаточно объективно отражающих последствия загрязнения. Очевидно, что это должны быть показатели изменения свойств почв под действием загрязнителей (показатели второй группы), поскольку степень их изменения уже зависит от параметров загрязнения (показатели первой группы) и от устойчивости почв к загрязнению (показатели третьей группы). Далее из показателей изменения свойств почв (вторая группа) следует отдать предпочтение биологическим показателям, так как они первыми реагируют на антропогенное воздействие. И, наконец, из большого количества биологических показателей следует выбрать наиболее чувствительные и наименее вариабельные.
Не все биологические показатели, используемые в настоящее время в научных исследованиях, одинаково хорошо подходят для мониторинга и диагностики состояния почв. Различные свойства почвы по-разному и в неодинаковой степени реагируют на внешнее воздействие, в частности, на загрязнение объектами железнодорожного транспорта [6].
2.2 Ферментативная активность и ее значимость для оценки эколого-функционального состояния почвы
Ферментативная активность почв[от лат. fermentum— закваска] -способность почвы проявлять каталитическое воздействие на процессы превращения экзогенных и собственных органических и минеральных соединений благодаря имеющимся в ней ферментам. Характеризуя ферментативную активность почв, имеют в виду суммарный показатель активности. Ферментативная активность различных почв неодинакова и связана с их генетическими особенностями и комплексом взаимодействующих экологических факторов. Уровень ферментативной активности почв определяется активностью различных ферментов (инвертазы, протеаз, уреазы, дегидрогеназ, каталазы, фосфатаз), выражаемой количеством разложенного субстрата за единицу времени на 1 г почвы [15].
Источниками почвенных ферментов служит все живое вещество почв: растения, микроорганизмы, животные, грибы, водоросли и т. д. Накапливаясь в почве, ферменты становятся неотъемлемым реактивным компонентом экосистемы. Почва является самой богатой системой по ферментному разнообразию и ферментативному пулу. Разнообразие и богатство ферментов в почве позволяет осуществляться последовательным биохимическим превращениям различных поступающих органических остатков. Ферментативная активность затрагивает наиболее важные повторяющиеся превращения в биохимических циклах углерода, азота, фосфора, серы и других соединений. Под действием ферментов органические вещества распадаются до различных промежуточных и конечных продуктов минерализации. При этом образуются доступные растениям и микроорганизмам питательные вещества. А также высвобождается энергия.
Экологическая значимость ферментативной активности определяется следующим:
— уникальное богатство почв ферментами;
— главнейшая экологическая функция ферментов — разрушение первичного органического вещества и синтез вторичного, обогащение почв биогенными элементами и гумусом;
— ферменты выполняют роль катализаторов энергетического и вещественного обмена в почве;
— ферменты почв являются регуляторами связей между компонентами географических экосистем;
— ферменты почв участвуют в превращениях минеральной массы почв, как главной составляющей ее вещественного состава;
— ферменты участвуют в формировании гумусного состояния почв как интегрального показателя плодородия земель.[16]
Какова же значимость ферментативной активности для оценки эколого-функционального состояния почвы? Был проведен сравнительный анализ разных методов оценки состояния почвы. В основу анализа положено сравнение вариабельности полученных данных и чувствительности методов к выявлению разных уровней загрязнения почвы. Зафиксирован следующий ряд биологических свойств почв по степени их устойчивости к загрязнению объектами железнодорожного транспорта: активность катализы > активность инвертазы> активность уреазы = активность фосфатазы > скорость разложения мочевины > целлюлозолитическая способность > интенсивность накопления свободных аминокислот > фитотоксичность > численность микроскопических грибов > численность актиномицетов > численность бактерий > численность спорообразующих бактерий.[6]
Д.Г. Звягинцевым с соавт [14] установлено, что данные, полученные биохимическими методами, имеют относительно низкие коэффициенты варьирования – в интервале 2-20%, в среднем 5-10%, в то время как данные, полученные микробиологическими методами (посев и определение биомассы), находятся в интервале 5-100%, в среднем 20-40%. Кроме того, биохимические показатели являются более чувствительными к возрастанию доз загрязнений. Об этом свидетельствуют коэффициенты корреляции между показателями и содержанием в почве.
Результаты проведенного исследования [6] полностью подтверждают выводы, полученные Д.Г. Звягинцевым с соавт. [14]для загрязненных дерново-подзолистых почв. Аналогичные закономерности зафиксированы для черноземов обыкновенных, загрязненных объектами железнодорожного транспорта.
Таким образом, несмотря на то, что микробиологические показатели первыми реагируют на загрязнение, их реакция хуже коррелирует (или вовсе не коррелирует) с содержанием в почве загрязнений от объектов железнодорожного транспорта, чем реакция биохимических показателей. Кроме того, микробиологические показатели отличаются намного более значительным варьированием, по сравнению с биохимическими показателями. И, наконец, микробиологические показатели являются существенно более трудоемкими и дорогостоящими в определении, а также требуют исполнения высококвалифицированным персоналом. Поэтому, при проведении мониторинга и диагностики состояния почв, в первую очередь, следует определять биохимические показатели как более чувствительные, менее варьирующие, менее трудоемкие и менее дорогостоящие по сравнению с микробиологическими показателями.
Из биохимических показателей, в первую очередь, рекомендуются показатели изменения ферментативной активности: каталазы, инвертазы, уреазы, фосфатазы и ряда других почвенных ферментов. Именно активность ферментов наилучшим образом коррелирует с содержанием в почве загрязнений, поскольку ингибирование каталитической активности ферментов является характерным свойством загрязнений от объектов железнодорожного транспорта, основным механизмом их токсического действия. Таким образом, изменение ферментативной активности является ведущим показателем влияния загрязнения объектов железнодорожного транспорта на свойства почвы. Показатели микробиологической активности, фитотоксичности почвы, состояния растений и почвообитающей фауны являются вторичными, опосредованными через ингибирование загрязнениями железнодорожного транспорта ферментов живых организмов.[17]
В пользу особого значения ферментативной активности как показателя происходящих в почве процессов также свидетельствует следующий факт. Ферментативный пул является результатом реализации реально функционирующей части генофонда данного микробного сообщества (и даже генофонда всей экосистемы).[18]
В том, что ферментативная активность лучше остальных показателей применима для диагностики состояния почв можно убедиться, обратившись к табл.4.
--PAGE_BREAK--
Оценка применимости биологических методов исследования почв для биодиагностики и биоиндикации [19]
Показатель
Метод
Информативность
Чувствительность
Производительность анализа
Временные флуктуации
Пространственная неоднородность
Оборудование и реактивы
Сложность анализа
Воспроизводимость
Точность(ошибка определения)
Квалификация исполнителей
Средний балл по методу
Численность микрофлоры
Чашечный метод Коха
4
8
5
2
2
3
5
4
4
5
4,1
Качественный состав микрофлоры
Морфо-физиологическая диагностика
7
10
2
2
2
2
1
1
1
2
3,1
Численность микрофлоры
Прямое микроскопирование
8
7
8
5
5
4
8
6
6
8
6,3
Ферментативная активность
Определение концентрации субстрата
(продукта реакции)
8
10
10
8
8
8
9
8
10
9
8,8
Численность мезофауны
Метод раскопок
5
7
7
3
3
9
9
7
6
8
6,2
Биомасса мезофауны
Весовой метод
5
7
7
5
4
10
9
7
6
10
6,7
Состав мезофауны
Метод раскопок
6
8
5
1
2
8
3
2
3
3
4,2
Микроартроподы
Электронная выгонка с последующим определением
6
7
4
2
6
7
2
2
3
2
4,3
Водоросли
Разные методы
6
9
6
1
1
6
6
2
6
5
4,8
«Дыхание»
Адсорбционный метод поглощения СО2
8
9
8
1
6
10
10
3
8
10
7,0
Нитрификация
Накопление субстратов после инкубации образца
7
9
6
8
8
7
7
4
8
8
7,1
Разложение мочевины
Экспресс-метод Аристовской, Чугуновой
7
7
9
8
8
10
10
4
8
10
7,9
Содержание гумуса
Мокрое озоление хромовой смесью по Тюрину
8
5
9
9
8
8
8
5
10
9
7,8
Состав гумуса
Фракционно-групповой состав по Пономаревой-Плотниковой
8
7
4
8
7
7
6
3
8
7
6,4
Продуктивность, урожайность
Весовой метод
10
7
4
8
8
8
6
4
8
8
7,0
Средний балл по категории
6,9
7,8
6,3
4,7
5,2
7,1
6,6
4,1
6,3
6,9
6,1
--PAGE_BREAK--
Глава 3. Комплексное обследование ферментативной активности почвы как инструмент мониторинга эколого-функционального состояния почвы
3.1 Общие представления о мониторинге окружающей среды (ОС)
Мониторинг окружающей среды – организованная сеть наблюдений для сбора данных о состоянии окружающей среды. Одна из главных его задач – накопление и обработка результатов информации о состоянии окружающей среды.
Контролируемые объекты и компоненты. В сферу экологического контроля входят следующие контролируемые объекты:
1) воды – пресные, поверхностные, морские, подземные, атмосферные осадки, талые, сточные;
2) воздух – атмосферный, природных заповедников (фон), городов и промышленных зон, рабочей зоны;
3) почвы;
4) донные отложения;
5) растения, пища и корма, животные ткани.
Наиболее сложным и трудоемким является почвенно-химический или почвенно-экологический мониторинг.[24]
3.2 Принципы почвенно-экологического мониторинга
Оценку эколого-функционального состояния почв можно рассматривать как часть почвенно-экологического мониторинга. В основе почвенного мониторинга должны лежать следующие основные принципы:
1) разработка методов контроля наиболее уязвимых свойств почв, изменение которых может вызвать потерю плодородия, ухудшение качества растительной и животной продукции, деградацию почвенного покрова;
2) постоянный контроль важнейших показателей почвенного плодородия;
3) ранняя диагностика негативных изменений почвенных свойств;
4) разработка методов контроля сезонной динамики почвенных процессов, изменением свойств почв при длительных антропогенных нагрузках.
Среди наиболее уязвимых свойств почв и особо опасных процессов, которые проявляются во всех почвах любых природных зон, — потеря гумуса и изменение его качественного состава, увеличение кислотности или щелочности, изменения состава обменных катионов, загрязнение почв пестицидами, детергентами и другими органическими соединениями, угнетение почвенной биоты.
Невозможно организовать в целях экологического мониторинга эффективные наблюдения, не учитывая взаимосвязь и постоянное взаимодействие природных компонентов, изменение структурно-функциональных характеристик их отдельных звеньев при поступлении ксенобиотиков, которые вызывают изменение других звеньев, функционально с ними связанных. Поэтому выбор чувствительных к антропогенному воздействию показателей состояния экосистемы может меняться в зависимости от задач исследования. Однако, на любом уровне – микроскопическом, локальном или глобальном в ходе почвенно-экологического мониторинга особого внимания заслуживают методы исследования процессов образования и перераспределения в почвах химических веществ.[24]
3.3 Исследование ферментативной активности почвы
Как уже говорилось выше, при проведении мониторинга и диагностики состояния почв, в первую очередь, следует определять биохимические показатели: рекомендуются показатели изменения ферментативной активности. Определение ферментативной активности основано на учете количества переработанного в процессе реакции субстрата или образующегося продукта реакции в оптимальных условиях температуры, рН среды, концентрации субстратов, величины навески почвы, времени инкубации. Для количественного определения конечных продуктов реакции применяются различные химические, фотометрические, колометрические, и другие методы. Для качественных измерений наличия ферментов в почве широко используются хроматографические методы.
Сущность методов определения активности ферментов почвы заключается в следующем: навеску почвы насыщают антисептиком, добавляют буферный раствор с рН, оптимальным для данного фермента, и определенное количество субстрата. Реакционную смесь в основном при температуре 30 — 370С выдерживают в термостате в течение определенного времени при периодическом перемешивании и после этого проводят количественный учёт или качественную идентификацию продуктов реакции. Активность фермента выражают в количествах переработанного субстрата или образующегося продукта реакции в течение определенного промежутка времени и рассчитывают на единицу веса почвы или гумуса. Такие условия позволяют определить максимальную потенциальную ферментативную активность почвы. [25]
Таким образом, определив активность некоторого комплекса ферментов (табл.5) можно судить об эколого-функциональном состоянии почвы, а исследовав период восстановления ферментативной активности можно судить о последствиях воздействия загрязняющих веществ на почву (табл.6). Подробно методы определения ферментативной активности будут описаны ниже.
Таблица 5
Шкала сравнительной оценки ферментативной активности почвы[26]
Активность
Каталаза,
см3 О2 на г за 1 мин
Дегидрогеназа,
мг ТФФ на 10 г
за 24 ч
Фосфатаза,
мг Р2О5 на 10 г
за 24 ч
Уреаза,
мг NН3 на 10 г
за 24 ч
Протеаза,
мг альбумина на 10 г за 24 ч
Инвертаза,
мг глюкозы на 1 г
за 24 ч
Очень слабая
0-3
>0,5
>3
0-0,5
>5
Слабая
1-3
3-7
0,5-1,5
3-10
0,5-1,0
5-15
Средняя
3-10
7-15
1,5-5,0
10-30
1-2
15-50
Высокая
10-30
15-22
5-15
30-100
2-3
50-150
Очень высокая
>30
>22
>15
>100
>3
>150
Таблица 6
Оценка воздействия загрязняющих веществ на почву[26]
Период восстановления ферментативной активности, дни
Оценка последствий
Лабораторные условия
Полевые условия
15
30
Не оказывает влияния
15 – 30
30 – 60
Незначительное влияние, но возможны отрицательные последствия
>30
>60
Существенное влияние, возможны серьезные экологические последствия
Глава 4. Материалы и методы
4.1 Основные требования, предъявляемые к методам определения активности ферментов в почве
Почва является сложной гетерогенной системой, в которой большинство биохимических реакций происходят на интерфазе жидкого, твердого и газообразных компонентов. Это создает много методологических проблем при изучении почвенных ферментов. Главная методологическая трудность заключается в необходимости отделения внутриклеточной активности функционально активных микроорганизмов от изучаемой внеклеточной ферментативной активности почвы. Другая трудность заключается в том, что так как почва является сильным адсорбентом, некоторые субстраты и продукты их ферментативной реакции могут сорбироваться почвенными компонентами. Это приводит к искажению результатов их количественного измерения. Поэтому в каждом конкретном случае необходимо это принимать во внимание при выборе субстрата и экстрагентов продуктов реакции.[25]
Активность ферментов максимальна в верхних наиболее биогенных почвенных горизонтах и вниз по почвенному профилю падает, что связано с уменьшением запасов органического вещества, меньшим количеством животных, микроорганизмов, корней растений в нижних горизонтах.[27]
Инактивация деятельности микроорганизмов в почвенных пробах. Ферметативную активность почвы определяют в присутствии почвенных микроорганизмов в реакционной среде. Современные методы почвенной энзимологии дают общую характеристику активности почвенных ферментов, присутствующих в почве вне клеток живых организмов (свободные внеклеточные ферменты и внутриклеточные ферменты, связанные с фрагментами разрушающихся мёртвых клеток микроорганизмов и тканей растений), и ферментов, которые могут выделяться живыми микроорганизмами в процессе определения ферментативной активности почвы в результате неполного ингибирования. Отсюда вытекает главная методологическая проблема почвенной энзимологии: провести эффективную инактивацию роста и физиологических процессов микроорганизмов в почвенной пробе, чтобы предотвратить выделение новых ферментов и в то же время оставить почвенные ферменты неизменёнными и не нарушить химические и физические свойства почвы, что может привести к изменению их активности.
Основное требование к инактиваторам: они не должны разрушать клетки микроорганизмов (плазмолиз) и изменять проницаемость клеточных оболочек для ферментов, субстрата и продуктов реакции. Эффективная инактивация жизнедеятельности микроорганизмов предотвращает поступление в почву дополнительных количеств ферментов, утилизацию субстрата и продуктов реакции микроорганизмами, которые могут значительно исказить истинные значения показателей ферментативной активности исследуемой почвы.
Определение ферментативной активности может дать надёжный результат только в том случае, если концентрация субстрата не снижается в результате обстоятельств, не связанных с ферментативным превращением его, и если концентрация продуктов, образующихся из субстрата под воздействием ферментов, не изменяется вследствие процессов, не связанных с исследуемой ферментативной реакцией (адсорбция, связывание другими соединениями почвы).
На скорость ферментативной реакции влияет множество факторов. К ним относятся температура инкубации, концентрация водородных ионов, состав применяемых буферных растворов, концентрация субстрата, величина навески почвы, наличие различных активаторов и ингибиторов и т. д. При разработке почвенно – энзимологических методов определяют оптимальные значения этих констант, которые для разных групп и даже отдельных ферментов различны.
Навеска почвы и концентрация субстрата.Измерение активности ферментов в почве производят в определенных количествах почвенной пробы. С увеличением навески почвы скорость ферментативной реакции линейно возрастает (рис. 2)
Рис.2. Влияние количества почвы на скорость ферментативной реакции
Концентрацию субстрата выбирают с таким расчетом, чтобы скорость ферментативной реакции была постоянной в течение всего периода экспозиции и количество молекул субстрата хватило для насыщения всех молекул ферментов, содержащихся в данной навеске почвы, до конца реакции. Для этого требуют некоторый избыток субстрата. Однако большой избыток субстрата снижает скорость реакции.
Оптимальная концентрация субстрата устанавливается опытным путем для определенных величин навески почвы. Иногда произвольно берут разные навески почвы и концентрации субстратов, что является недопустимым. Для получения сопоставимых данных условия должны быть стандартизированы. В первую очередь необходимо установить минимальную величину навески почвы, в которой с достаточной точностью можно обнаружить активность изучаемого фермента, и соответственно этой навеске определить оптимальную величину концентрации субстрата.
Существенным требованием к субстратам является их хорошая растворимость. Нерастворимые или слаборастворимые субстраты трудно вступают во взаимодействие с ферментами.
Реакция среды и буферные растворы.Скорость ферментативных реакций зависит от значений рН среды. Максимальная активность ферментов проявляется лишь в узком интервале значений рН, которые называют оптимум рН действия данного фермента. Как уменьшение, так и увеличение рН приводит к снижению активности ферментов (рис. 3). Поддержание оптимального и постоянного значений рН в реакционной среде на протяжении опыта при определении ферментативной активности является одним из важных методологических условий. Опытным путем устанавливается значение оптимума рН ферментов. При этом следует учесть, что почвы с различными значениями рН неодинаково влияют на сдвиг рН буферного раствора. Это зависит от буферности самой почвы, существенные сдвиги могут быть в малобуферных кислых и щелочных почвах. При определении оптимумов рН ферментов почвы после прибавления реакционной смеси к почве значение рН суспензии доводится до соответствующей величины значения буферного раствора потенциометрическим титрованием.
При определении ферментативной активности для обеспечения заданной рН используют буферные растворы с величиной рН, соответствующей оптимуму действия данного фермента. Предлагается также определять ферментативную активность почвы при рН почвы, так как почва — сама буферная система. Однако это зависит от цели определения активности фермента. При решении прикладных задач по ферментативной диагностике почв предпочтительно определять активность почвы при почвенном значении рН, а при исследовании чисто фундаментальных почвенно – энзимологических вопросов рН среды должен быть оптимальным для данного фермента.
Рис.3. Влияние рН среды на активность ферментов
Важное значение имеет катионно – анионный состав буферного раствора: различные катионы и анионы оказывают неодинаковое влияние на отдельные ферменты и на почвы. Так, фосфат-ионы будут ингибировать фосфатазу, если используется фосфатный буфер при определении фосфатазной активности почвы; ионы аммония могут ингибировать уреазу, если использовать аммиачный буферный раствор. Лимонно-кислые ионы буферных растворов будут связываться с ионами железа, если их много в почве. Другим важным требованием к буферным растворам является, чтобы они не растворяли и экстрагировали из почвы окрашенное органическое вещество, что будет мешать при последующем спектрофотометрическом и титрометрическом анализе продуктов ферментативной реакции. Поэтому экспериментально подбирают необходимый состав буферного раствора для каждого вида фермента и с учетом свойств почвы.
Температура инкубации.Скорость ферментативных реакций зависит от температуры. По мере повышения температуры до определенного значения скорость реакции возрастает, при высоких температурах ферменты денатурируют и теряют свою активность. Низкие температуры снижают ферментативную активность. Максимальную активность ферментов в почве обнаруживают в пределах температур от 45 до 600С (рис.4). Однако активность почвенных ферментов не определяют при оптимальных значениях температуры, так как они сильно отличаются от естественной температуры почвы за вегетативный период. Кроме того, в результате относительной деятельности сроков инкубации (от нескольких часов до нескольких суток) при таких температурных условиях может происходить некоторая термическая инактивация ферментов и разложение некоторых субстратов. Определение активности почвенных ферментов обычно производят при температуре 30 – 500С. Однако, согласно рекомендациям Международного союза по номенклатуре и классификации ферментов, необходимо придерживаться стандартной температуры 30 0С.
Рис.4. Влияние температуры на активность нуклеазы в почве (выщелоченный чернозем)
Продолжительность инкубации.Ферментативную активность почвы необходимо определять при начальной скорости реакции и сохранять ее постоянной в течение всего времени экспозиции (рис.5). Скорость ферментативной реакции во времени может падать в результате следующих причин:
1. уменьшения концентрации субстрата ниже насыщающей концентрации, поскольку он расходуется в процессе реакции, а также может адсорбироваться почвой;
2. частичного разрушения самих ферментов во время реакции;
3. влияния образующихся продуктов реакции, особенно на ферменты при длительных сроках.
Рис.5. Изменение скорости фосфатазной реакции в почве (дерново-подзолистая почва)
При этом возможны два типа влияния: специфическое торможение активности ферментов продуктами реакции и обратимость ферментативных реакций, так как по закону действующих масс скорость обратимых реакций пропорциональна произведению концентраций реагирующих веществ.
В связи с относительной низкой активностью фермента в почве время компостирования почв с субстратом продолжительное – от нескольких часов до нескольких суток. Необходимо время инкубации сократить до минимума, чтобы исключить отрицательный эффект вышеуказанных факторов и возможность роста колоний некоторых видов микроорганизмов.
Перемешивание реакционной смеси в процессе инкубации.Ферменты в почве находятся преимущественно в адсорбированном или ином связанном состоянии почвенными коллоидами. Постоянный приток субстрата к ферментам и удаление продуктов реакции из зоны действия ферментов достигаются периодическим взбалтыванием реакционной смеси в процессе инкубации. Имеет значение частота встряхивания, которую устанавливают опытным путем при определении активности каждого фермента. Необходимо поддерживать одинаковую периодичность и энергичность встряхивания в процессе инкубации реакционной смеси.
Количественная экстракция продуктов реакции. Одним из важных требований к методам почвенной энзимологии является полная экстракция из почвы продуктов ферментативной реакции, по количеству которых измеряют активность фермента. В качестве экстрагентов используют соответствующие буферные растворы, различные растворители. Измеряют количество экстрагированного компонента продуктов ферментативной реакции, который не адсорбируется или минимально адсорбируется почвой. Например, при определении фосфатазной активности лучше измерять количество органической части продуктов гидролиза фенилфосфата или фенолфталеинфосфата, используемых в качестве субстрата – фенола и фенолфталеина, так как ортофосфат активно связывается почвой и по ортофосфату можно получить заниженные показатели ативности.
Контрольные пробы.В почве всегда присутствуют вещества, аналогичные продуктам распада большинства органических веществ, применяемых в качестве субстратов при почвенно-энзимологических исследованиях (глюкоза, аминокислоты, фосфор, аммоний и др.). Поэтому для корректировки результатов определения активности ферментов ставят следующие контрольные опыты.
1. Контроль на неферментативное превращение субстрата(контроль без фермента — К.б.ф.). Строго обязателен, особенно при определении активности окислительно-восстановительных ферментов, потому что в почве всегда присутствуют переменно-валентные катионы (Сu, Мn, Мо и др.), способные переносить электроны и осуществлять окислительно-восстановительные превращения. Обычно неферментативный гидролитический распад субстратов в почве незначителен или отсутствует. Для инактивации ферментов параллельные навески почв в реакционных сосудах стерилизуют сухим жаром при 180°С в течение 2-3 ч или автоклавируют при 2 атм. в течение 1 ч несколько раз. При этих условиях ферменты, иммобилизованные в почве, полностью инактивируются. Однако такие контроли нецелесообразны в тех случаях, когда продукты ферментативных реакций определяют фотометрическим методом или титрованием. Нагревание почвы при высокой температуре сильно изменяет её органическое вещество, оно становится растворимым и окрашивает фильтраты. Вместо жёсткой термической инактивации ферментов часто используют специфические химические ингибиторы: соли тяжёлых металлов, цианиды и др. В стерилизованную сухим жаром или обработанную ингибитором почву вносят антисептик, буферный раствор, субстрат и дальше проводят те же самые операции, что и с опытными пробами. В случае применения ингибитора фермента после инкубации в опытные сосуды добавляют такое же количество ингибитора. Могут быть использованы и другие эффективные способы инактивации ферментов при минимальном воздействии на почвенные свойства.
2. Контроль на почвенные вещества, учитываемые вместе с продуктами ферментативной реакции (контроль без субстрата -К.б.с). Нестерильную почву обрабатывают толуолом, вносят буферный раствор и соответствующий объём воды вместо субстрата. Дальнейшие операции аналогичны опытным процедурам.
3. Контроль на чистоту реактивов и субстрата и на спонтанный распад субстрата(контроль без почвы К.б.п) В реакционные сосуды наливают указанные в соответствующей методике количества субстрата, буфера и антисептика и эту контрольную смесь обрабатывают как опытную. Достаточно поставить один контроль для данной серии реактивов и субстрата.
При определении активности гидролитических ферментов можно ограничиваться постановкой контроля без субстрата и контроля без почвы, так как известно, что неферментативный гидролиз органических соединений в почве незначителен и за короткий срок инкубации при определении ферментативной активности почвы не может вносить существенной коррективы на результаты опыта. Кроме того, проведение этого контроля довольно хлопотно. Однако предварительно следует убедиться в том, что неферментативный гидролиз субстрата в почве не происходит, особенно в случае содержания в почве значительных количеств различных техногенных химических ингредиентов (загрязнителей), для чего ставят несколько контролей без фермента. При определении активности окислительно-восстановительных ферментов достаточен контроль без фермента, так как он включает в себя контроль без субстрата и контроль без почвы. При расчете ферментативной активности почвы (ФАП) сумму показателей контрольных проб вычитают из показателя опытных вариантов (ПР — продукт реакции), разница соответствует количеству продукта, образовавшегося в результате ферментативного превращения субстрата ФАП = ∑ ПР — ∑ К.б.ф., К.б.с, К.б.п. При пересчёте на единицу веса почвы (на 1 г, 100 г и т.д.) продукт ферментативной реакции характеризует ферментативную активность почвы.
продолжение
--PAGE_BREAK--
Единицы измерения активности ферментов в почве.Активность фермента выражают в единицах ферментативного действия, что представляет собой изменения, производимые ферментом в субстрате в определённый отрезок времени при строго определённых условиях: концентрации субстрата, рН, температуре и т.д. Как методы определения активности ферментов, так и выражение результатов измерений активности весьма разнообразны. Для отдельных ферментов предложены крайне различные и произвольные единицы. Например, ферментативную активность выражают в физических изменениях субстрата (изменение вязкости, поляризации, оптической плотности), количествах продуктов реакции, количествах превращенной или остаточной части субстрата, ферментных или энергетических единицах и т.д. Отсутствие стандартных единиц измерения активности ферментов не даёт возможности сопоставить результаты даже при применении единых методов.
Наряду с разработкой стандартных условий определения активности ферментов в почве необходимо стандартизировать и способы выражения величин скорости ферментативных реакций. По-видимому, в настоящее время целесообразно сохранить наиболее широко используемую единицу измерения — количество продуктов ферментативного превращения субстрата (мкг, мг, мл, см3, мкМ и др.) на единицу веса почвы за единицу времени при 30 °С. В то же время, в соответствии с рекомендацией Международного биохимического союза по ферментам (Номенклатура ферментов, 1979) за единицу измерения принята стандартная ферментная единица (ФЕ). 1 ФЕ соответствует такому количеству фермента, которое при заданных условиях катализирует превращение 1 мкМ субстрата в 1 мин. В условиях почвенных ферментов это количество может быть рассчитано на единицу веса почвы (например, на 1 г почвы). Однако в почвенно-энзимологических исследованиях в связи с большой гетерогенностью по составу и состоянию ферментов в почве и незначительной их активности в отличие от чистых ферментных препаратов трудно производить перерасчёты на ферментные единицы. В почве определяется не активность конкретной ферментативной молекулы, а ферментативную активность почвы, т.е. проявление некоторой каталитической функции содержащихся в различном состоянии в почвенной массе ферментов (свободных, внеклеточных, внутриклеточных, иммобилизованных, связанных с клеточными фрагментами). В ферментных единицах может быть выражена активность ферментсодержащих препаратов, получаемых экстракцией из почвы. Это фундаментальное направление в почвенной энзимологии в настоящее время получает своё развитие.[25]
4.2 Методы определения активности ферментов различных классов
По типу катализируемых реакций все известные ферменты разделены на шесть классов:
1. Оксидоредуктазы, катализирующие окислительно-восстановительные реакции.
2. Гидролазы, катализирующие реакции гидролитического расщепления внутримолекулярных связей в различных соединениях.
3. Трансферазы, катализирующие реакции межмолекулярного или внутримолекулярного переноса химической группы и остатков с одновременным переносом энергии, заключенной в химических связях.
4. Лигазы (синтетазы), катализирующие реакции соединения двуxмолекул, сопряжённые с расщеплением фирофосфатных связей АТФ или другого аналогичного трифосфата.
5. Лиазы, катализирующие реакции негидролитического отщепления или присоединения различных химических групп органических соединений по двойным связям.
6, Изомеразы, катализирующие реакции превращения органических соединений в их изомеры.
В почве широко распространены и довольно подробно изучены оксидоредуктазы и гидролазы, имеющие очень важное значение в почвенной биодинамике.[25]
4.2.1 Каталаза
(Н2О2: Н2О2 –оксидоредуктаза)
Каталаза катализирует реакцию разложения перекиси водорода с образованием воды и молекулярного кислорода:
Н2О2 + Н2О2 О2 + Н2О.
Перекись водорода образуется в процессе дыхания живых организмов и в результате различных биохимических реакций окисления органических веществ. Токсичность перекиси водорода определяется его высокой реакционной способностью, которую проявляет синглетный кислород, *О2. Его высокая реакционная способность приводит к неконтролируемым реакциям окисления. Роль каталазы заключается в том, что она разрушает ядовитую для организмов перекись водорода.
Каталаза широко распространена в клетках живых организмов, в том числе микроорганизмов и растений. Высокую каталазную активность проявляют также почвы.
Методы определения каталазной активности почвы основаны на измерении скорости распада перекиси водорода при взаимодействии ее с почвой по объему выделяющегося кислорода (газометрические методы) или по количеству неразложенной перекиси, которое определяют перманганатометрическим титрованием или колориметрическим методом с образованием окрашенных комплексов.
Исследованиями Е.В. Даденко и К.Ш. Казеева установлено, что при хранении образцов активность каталазы из всех ферментов снижается в наибольшей степени, поэтому ее определение необходимо проводить в первую неделю после отбора образцов.
Метод А.Ш. Галстяна
[1978]
Ход анализа. Для определения активности каталазы используют прибор из двух соединенных резиновым шлангом бюреток, которые заполняют водой и уравновешивают ее уровень. Поддерживание определенного уровня воды в бюретках свидетельствует о достижении температурного равновесия в приборе. Навеску (1 г) почвы вносят в одно из отделений сдвоенной колбы. В другое отделение колбы приливают 5 мл 3-процентного раствора перекиси водорода. Колбу плотно закрывают каучуковой пробкой со стеклянной трубкой, которая соединена с измерительной бюреткой с помощью резинового шланга.
Опыт проводят при температуре 20 °С, так как при другой температуре скорость реакции будет отличаться, что исказит результаты. В принципе важна температура не воздуха, а перекиси, именно она должна быть 20 0С. Если температура воздуха значительно выше 20 0С (летом), рекомендуется проводить анализ в подвале или в другом прохладном помещении. Рекомендованное в таких случаях применение водяной бани с температурой 20°С вряд ли эффективно.
Начало опыта отмечают по секундомеру или песочным часам в тот момент, когда перекись смешивается с почвой, и содержимое сосуда встряхивают. Взбалтывание смеси производят в течение всего опыта, стараясь не касаться колбы руками, держа ее за пробку. Выделяющийся кислород вытесняет из бюретки воду, уровень которой отмечают через 1 и 2 мин. Рекомендация определять количество кислорода через каждую минуту в течение 3 мин ввиду прямолинейности реакции разложения перекиси лишь увеличивает затраты времени на анализ.
Данная методика позволяет одному исследователю за день проанализировать активность каталазы более чем 100 образцов. Удобно проводить анализ вдвоем, используя 5-6 сосудов. При этом один человек непосредственно занимается анализом и следит за уровнем бюретки, а второй следит за временем, записывает данные и моет сосуды.
Контролем служит стерилизованная сухим жаром (180°С) почва. Некоторые почвы, соединения и минералы обладают высокой активностью неорганического катализа разложения перекиси даже после стерилизации — до 30-50 % от общей активности.
Активность каталазы выражают в миллилитрах О2, выделяющегося за 1 мин из 1 г почвы.
Реактивы: 3-процентный раствор Н2О2. Концентрацию пергидроля обязательно периодически проверяют, рабочий раствор готовят непосредственно перед анализом. Для установления концентрации пергидроля на аналитических весах в мерной колбе емкостью 100 мл взвешивают 1 г Н2О2, объем доводят до метки и взбалтывают. Помещают 20 мл полученного раствора в конические колбы на 250 мл (3 повторности), добавляют 50 мл дистиллированной воды и 2 мл 20-процентной Н2SO4. Затем титруют 0,1 н. раствором КМnО4. 1 мл раствора КМnО4 соответствует 0,0017008 г Н2О2. После установления концентрации пергидроля готовят 3-процентный раствор разбавлением дистиллированной водой. Титровальный раствор КМnО4 готовят из фиксанала и выдерживают несколько дней для установления титра.
4.2.2 Дегидрогеназы
(субстрат: НАД (Ф)-оксидоредуктазы).
Дегидрогеназы катализируют окислительно-восстановительные реакции путем дегидрирования органических веществ. Они проходят по следующей схеме:
АН2 + В А+ ВН2
В почве субстратом дегидрирования могут быть неспецифические органические соединения (углеводы, аминокислоты, спирты, жиры, фенолы и т.д.) и специфические (гумусовые вещества). Дегидрогеназы в окислительно-восстановительных реакциях функционируют как переносчики водорода и разделяются на две группы: 1) аэробные, передающие мобилизированный водород кислороду воздуха; 2) анаэробные, которые передают водород другим акцепторам, ферментам.
Основным методом обнаружения действия дегидрогеназ является восстановление индикаторов с низким редокс-потенциалом типа метиленовой сини.
Для определения активности дегидрогеназ почвы в качестве водорода применяют бесцветные соли тетразолия (2,3,5-трифенилтетразолий хлористый — ТТХ), которые восстанавливаются в красные соединения формазанов (трифенилформазан — ТФФ).
Ход анализа. Навеску (1 г) подготовленной почвы аккуратно через воронку помещают на дно пробирки емкостью 12-20 мл и тщательно перемешивают. Прибавляют 1 мл 0,1 М раствора субстрата дегидрирования (глюкоза) и 1 мл свежеприготовленного 1-процентного раствора ТТХ. Пробирки помещают в анаэростат или вакуумный эксикатор. Определение проводят в анаэробных условиях, для чего воздух эвакуируют при разрежении 10-12 мм рт. ст. в течение 2-3 мин и ставят в термостат на 24 ч при 30 °С. При инкубировании почвы с субстратами толуол в качестве антисептика не прибавляют, так как; он сильно ингибирует действие дегидрогеназ. Контролем служат стерилизованная почва (при 180°С в течение 3 ч) и субстраты без почвы. После инкубации в колбы добавляют 10 мл этилового спирта или ацетона, встряхивают 5 мин. Полученный окрашенный раствор ТФФ фильтруют и колориметрируют. При очень интенсивной окраске раствор разбавляют спиртом (ацетоном) в 2-3 раза. Используют 10-мм кюветы и светофильтр с длиной волны 500-600 им. Количество формазана в мг рассчитывают по стандартной кривой (0,1 мг в 1 мл). Активность дегидрогеназ выражают в мг ТТФ на 10 г почвы за 24 ч. Ошибка определения до 8 %.
Реактивы:
1) 1-процентный раствор 2,3,5-трифенилтетразолия хлористого;
2) 0,1 М раствор глюкозы (18 г глюкозы растворяют в 1000 мл дистиллированной воды);
3) этиловый спирт или ацетон;
4) трифенилформазан для стандартной шкалы. Для составления калибровочной кривой готовят ряд растворов в этиловом спирте, ацетоне или толуоле с концентрацией формазана (от 0,01 до 0,1 мг формазана в 1 мл) и фотоколориметрируют, как описано выше.
При отсутствии формазана его получают восстановлением ТТХ гидросульфитом натрия (сульфитом аммония, порошком цинка в присутствии глюкозы). Исходная концентрация раствора ТТХ 1 мг/мл. К 2 мл исходного раствора ТТХ добавляют на кончике ланцета кристаллический гидросульфит натрия. Выпавший осадок формазана извлекают 10 мл толуола. В таком объеме толуола содержится 2 мг формазана (0,2 мг/мл). Дальнейшим разведением готовят рабочие растворы для шкалы.
4.2.3 Инвертаза
(β-фруктофуранозидаза, сахараза)
Инвертаза является карбогидразой, она действует на β-фруктофуранозидазную связь в сахарозе, раффинозе, генцианозе и др. Наиболее активно этот фермент гидролизует сахарозу с образованием редуцирующих сахаров — глюкозы и фруктозы:
инвертаза
С12Н22О11 + Н2О С6Н12О6 + С6Н12О6
сахароза глюкоза фруктоза
Инвертаза широко распространена в природе и встречается почти во всех типах почв. Очень высокая активность инвертазы обнаружена в горно-луговых почвах. Активность инвертазы четко коррелирует с содержанием гумуса и почвенным плодородием. Рекомендуется при изучении влияния удобрений для оценки их эффективности. Методы определения активности инвертазы почв основаны на количественном учете восстанавливающих сахаров по Бертрану и по изменению оптических свойств раствора сахарозы до и после воздействия фермента. Первый способ может быть применен при изучении фермента с очень широкой амплитудой активности и концентрации субстрата. Поляриметрический и фотоколориметрический способы более требовательны к концентрации сахаров и неприемлемы для почв с высоким содержанием органического вещества, где получаются, окрашенные растворы; поэтому эти методы ограниченно применяются в почвенных исследованиях.
Модифицированный колориметрический метод Ф.Х. Хазиева
Ход анализа. Навески (1 г) подготовленной почвы помещают в колбы емкостью 50 мл, добавляют 5 мл 3-процентного свежеприготовленного раствора сахарозы на фосфатном буфере (рН 4,9) и каплю-две толуола. При биодиагностике почв активность инвертазы определяют без добавления буфера — при рН почвы. Колбы закрывают корковыми пробками, осторожно встряхивают и помещают в термостат при 30 0С на 24 ч. Контролем служат субстраты без почвы и почва, стерилизованная сухим жаром, при 180 0С в течение 3 ч. В течение инкубации колбы периодически встряхивают. После инкубации в колбы добавляют 25 мл дистиллированной воды, взбалтывают и фильтруют. В случае высокой активности инвертазы (особенно в горно-луговых и торфянистых почвах с высоким содержанием гумуса) количество добавляемой воды увеличивают до 50-100 мл. В случае низкой активности количество дистиллята уменьшают до 5-10 мл. Разведение учитывают при расчетах активности фермента.
Берут пипеткой 6 мл фильтрата в пробирку объемом 15-20 мл. Добавляют пипеткой 6 мл реактива Феллинга, перемешивают. Пробирку с ярко-синим раствором нагревают на кипящей водяной бане 10 мин. При нагревании часть меди реактива Феллинга восстанавливается и выпадает в осадок красного цвета, при этом раствор осветляется. Далее пробирки охлаждают, содержимое центрифугируют 1-3 мин при 1500-3000 об./мин. Колориметрируют при длине волны 630 нм в кюветах шириной 1 см..
Окрашенный раствор лучше колориметрировать на фотоэлектроколоримотре КФК-3 с непрерывной шкалой, так как использование КФК-2 или.подобных ему приборов с ограниченной шкалой дает неточные результаты, ввиду того что большинство значений ложится в левой недробной половине шкалы.
Количество глюкозы (мг/мл) определяют по калибровочной кривой. Полученные данные умножают на 30 (общий объем раствора). Активность инвертазы выражают в миллиграммах глюкозы на 1 г почвы за 24 ч
Реактивы:
1) свежеприготовленный 3-процентный раствор сахарозы (для хранения раствора в течение нескольких дней добавляют несколько капель толуола);
2) толуол;
3) реактив Феллинга (готовый реактив не хранится и готовится смешиванием двух растворов перед анализом: раствор-1 — 100 г сегнетовой соли (калий-натрий виннокислый) растворяют в дистиллированной воде, прибавляют 75 г КОН или NaOHи доводят объем до 500 мл; раствор-2 — 20 гCuSO4растворяют в дистиллированной воде и доводят до 500 мл);
4) стандартный раствор глюкозы. Исходный раствор: 6 мг глюкозы в 1 мл дистиллированной воды. Рабочие растворы готовят, доводя 1, 2, 5, 10, 15, 20 мл исходного раствора (соответственно 0,06, 0,12, 0,30, 0,6, 0,9 и 1,2 мг глюкозы в 1 мл раствора) дистиллятом в мерных колбах до 100 мл. Далее к 6 мл растворов добавляют реактив Феллинга и дальше действуют по описанной выше методике.
4.2.4 Протеазы (пептид-гидролазы)
Протеолитичеекне ферменты катализируют гидролитическое расщепление белковых веществ до пептидов и гидролиз этих продуктов до аминокислот.
Протеазы делят на две группы: протеиназы и пептидазы. Первые из них расщепляют настоящие белки, а вторые катализируют распад полипептидов и дипептидов до аминокислот. Однако такое деление довольно условно.
При определении активности протеаз в почве в качестве субстрата обычно применяют казеин, желатину и некоторые пептиды. Активность протеаз учитывают по количеству аминокислот или других кислоторастворимых продуктов, освобождающихся при распаде белковых субстратов в почве, либо по изменению физических свойств субстрата, например но уменьшению вязкости.
Колориметрические методы основаны на учете количества аминокислот, образующихся при протеолизе внесенных в почву белков, путем связывания их в окрашенные комплексы.
Метод А.Ш. Галстяна [1978]
Ход анализа. 1 г почвы помещают в стеклянную колбу емкостью 50 мл, прибавляют 5 мл 1-процентного раствора желатины или казеина, приготовленного на фосфатном буфере (рН 7,4), и 0,2 мл толуола. Колбу тщательно встряхивают, закрывают корковой пробкой и ставят в термостат на 24 ч при температуре 30 0С, периодически встряхивают. После инкубации добавляют 5 мл воды и содержимое колбы фильтруют. Из фильтрата берут 5 мл раствора в пробирку, прибавляют 0,5 мл 0,1 н. серной кислоты и 3 мл 20-процентного сернокислого натрия для осаждения белков. Затем снова фильтруют в пробирку и добавляют 1 мл 2-процентного раствора нингидрина. Смесь тщательно взбалтывают и нагревают на кипящей водяной бане в течение 10 мин. Полученный окрашенный раствор из пробирки переливают в мерную колбу объемом 50 мл, объем доводят дистиллированной водой до метки и проводят фотоколориметрирование, используя зеленый светофильтр (длина волны 500-560 нм). Контрольные пробы ставят со стерилизованной сухим жаром почвой и субстратом без почвы. Количество аминокислот в переводе на глицин находят по калибровочной шкале, составленной на чистый глицин.
Активность протеазы выражают в миллиграммах глицина на 1 г почвы за 24 ч.
Реактивы:
1) 1-процентный раствор желатины или казеина в фосфатном буфере (рН 7,4) — при биодиагностике используют водный раствор;
2) толуол;
3) фосфатный буфер (рН 7,4);
4) 0,1 н. Н2SO4;
8) 2-процентный раствор нингидрина: 2 г нингидрина растворяют в 100 мл ацетона. Рабочий раствор готовят, смешивая 95 мл ацетонового раствора с 1 мл СН3СООН и 4 мл воды. Поскольку раствор нестойкий, готовят его только перед употреблением;
7) стандартный раствор глицина: водный раствор глицина концентрации 100 мкг в 1 мл. Путем соответствующих разбавлений готовят рабочие растворы, окрашивают нингидрином (как описано выше) и составляют шкалу.
4.2.5.
Уреаза (карбамид-амидогидролаза)
Уреаза гидролизует карбамид (мочевину) до аммиака и углекислого газа:
уреаза
NH2—С—NH2+ Н20 2 NH3+ CO2
║
О
В почве мочевина (карбамид) образуется в процессе превращения азотистых органических соединений — белков и нуклеиновых кислот. В значительном количестве карбамид вносится с навозом и в форме концентрированного азотного удобрения. Образовавшийся в результате уреазной реакции аммиак служит непосредственным источником азотного питания растений. Поэтому активность уреазы является одним из важнейших показателей биологической активности почв. Методы определения активности уреазы почвы основаны на учете количества аммиака, образующегося при гидролизе карбамида.
Ход анализа. Навески (1 г) подготовленной почвы помещают в колбы на 50 мл, добавляют 5 мл 3-процентной мочевины и 1-2 капли толуола. Контролем служат стерилизованная почва (180 °С, 3 ч) и субстраты без почвы. Колбы закрывают корковыми пробками, встряхивают и ставят в термостат при 80 0С на 24 ч. В течение инкубации колбы периодически встряхивают. По окончании инкубации в колбу добавляют 15 мл 1,0 н. раствора KClи встряхивают в течение 5 мин для вытеснения из почвы аммиака. Содержимое колбы переносят в центрифужную пробирку и центрифугируют 5-10 мин при 3000 об./мин или фильтруют через складчатый беззольный фильтр. Берут пипеткой 2-10 мл фильтрата (в зависимости от содержания аммиака, в черноземах — 2 мл) в мерную колбу на 50 мл, дистиллированной водой доводят объем до 30 мл, перемешивают. Прибавляют из бюретки 2 мл 30-процентного раствора калия-натрия виннокислого, перемешивают. Прибавляют из бюретки 2 мл реактива Несслера, перемешивают, доводят водой до метки, перемешивают. Колориметрируют на фотоэлектроколориметре в кюветах шириной 30 мм с синим светофильтром (длина волны 400 нм).
Количество аммиака рассчитывают до предварительно составленной калибровочной кривой. Стандартный раствор: 0,1 мг NH3в 1 мл воды.
Примечание. Дистиллированную воду необходимо проверять на содержание аммиака. Контроль — предварительно стерилизованная сухим жаром почва при 180 0С в течение 3 ч.
Активность уреазы выражается в миллиграммах NН3 на 10 г почвы в сутки:
NН3 = (а — б) · p· 10 / н, где
а — количество аммиака по графику, мг;
б — количество аммиака в контроле по графику, мг;
р — разведение;
н — навеска воздушно-сухой почвы, г.
Реактивы:
1) 3-процентный раствор мочевины;
2) 1 н. раствор КСl(74,5 г хлористого калия растворить в дистиллированной воде и довести до 1 л);
3) 30-процептный раствор сегнетовой соли;
4) реактив Несслера;
5) стандартный раствор NH4Clв концентрации 0,005 мг N—NH3, в 1 мл.
4.2.6 Фосфатаза
(фосфогидролазы моноэфиров ортофосфорной кислоты)
При определении фосфатазной активности в качестве субстрата используют различные моноэфиры фосфорной кислоты. Наиболее широко применяют водорастворимые соли фенолфталеинфосфата, фенилфосфата, глицерофосфата, α- или β-натрилфосфата и n-нитрофенилфосфата… При их ферментативном гидролизе выделяются минеральный фосфор и органический радикал субстрата.
Методы определения фосфатазной активности почвы основаны на количественном учете неорганического фосфора (молибденовокислым аммонием и др.) или спиртовой части гидролизованного субстрата.
Метод А.Ш. Галстяна и Э.А. Арутюнян [1966]
Ход анализа. 1 г воздушно-сухой почвы помещают в колбу емкостью 50 мл, добавляют 1 мл воды, прибавляют 1 мл 1 -процентного раствора фенолфталеинфосфата натрия, 1-2 капли толуола. Колбу закрывают корковой пробкой, встряхивают и ставят в термостат на 1 ч при 30 °С. После инкубации прибавляют 45 мл воды, 2 мл 10-процентного NH4OH, взбалтывают и фильтруют через плотный фильтр. Окрашенный в розовый цвет фильтрат колориметрируют на ФЭК с синим светофильтром. В случае мутной вытяжки для просветления раствора перед аммиаком в колбу добавляют 1 мл насыщенного раствора алюмокалиевых квасцов. Контролем служит стерилизованная почва (180 0С, 3 ч) и субстрат без почвы. Количество образующегося фенолфталеина находят по калибровочной кривой, составленной с различными концентрациями спиртового раствора фенолфталеина. Найденный в фильтрате фенолфталеин пересчитывают на отщепленный фосфор. При этом исходят из того, что в фенолфталеинфосфате одна молекула фенолфталеина связана с двумя молекулами фосфорной кислоты.
Активность фосфатазы выражают в миллиграммах Р2О5 на 100 г почвы за 1 ч.
Реактивы:
1) 1-процентный водный раствор фенолфталеинфосфата натрия;
2) 10-процентный NH4OH;
3) насыщенный раствор алюмокалиевых квасцов;
4) стандартный раствор фенолфталеина: 0,01 г фенолфталеина растворяют в 60 мл этанола и объем доводят водой до 100 мл (в 1 мл 0,1 мг фенолфталеина). В мерные колбы емкостью 100 мл берут соответствующие количества стандартного раствора (в мл) с содержанием от 0,1 до 2 мг фенолфталеина и окрашивают, как описано выше.[25]
4.3 Методика мониторинга эколого-функционального состояния почвогрунтов полосы отвода по показателям ферментативной активности
4.3.1 Геолого-географическая характеристика района отбора проб
При проведении работы был обследован участок железнодорожных путей с отводами, проходящий вдоль ст. Пискаревка. Протяженность участка – 50 м. Железнодорожные пути проходят в непосредственной близости к жилой застройке, к парковой зоне и к территориям промышленных объектов.
Места отбора проб показаны на карте – схеме (рис.6).Пробы отобраны вдоль железнодорожных путей (наличие зеленых насаждений, травяной покров, отсутствие жилой застройки).
4.3.2 Методика отбора проб и подготовка их к анализу
Определение точек отбора проб почвы осуществляется в соответствии с настоящим регламентом и ГОСТ 17.4.3.01-83 (СТ СЭВ 3847-82), ГОСТ 17.4.4.02-84. Масса пробы, предназначенная для химического анализа, должна быть не менее 1 кг.
Все пробы должны быть зарегистрированы в журнале отбора проб и пронумерованы. На каждую пробу должен быть заполнен сопроводительный талон в соответствии с ГОСТ 17.4.4.02-84. Пробы следует упаковывать, транспортировать и хранить в емкостях из химически нейтрального материала. Допускается использование для этих целей полиэтиленовых пакетов. В процессе транспортировки и хранения почвенных проб должны быть приняты меры по предупреждению их вторичного загрязнения. Хранение проб необходимо осуществлять при температуре +5°С. Пробы почвы высушивают до воздушно-сухого состояния по ГОСТ 5180-84. Воздушно-сухие пробы хранятся в стеклянной таре. Пробу почвы подготавливают к анализу следующим образом: почву рассыпают на кальке и разминают пестиком крупные комки, затем выбирают включения — корни растений, насекомых, кости животных, новообразования и друзы гипса, известковые журавлики и другие инородные включения. Далее образец почвы растирают в ступе пестиком и просеивают через сито с диаметром ячеек 1 мм.
Рис.6. Места отбора проб вдоль железнодорожных путей станции Пискаревка
4.3.3 Приготовление посуды и реактивов
Аппаратура, материалы:
- пипетки стеклянные градуированные вместимостью 10 и 25 мл по ГОСТ 12487-67, соединенные резиновым шлангом;
- весы аналитические;
- мерные колбы вместимостью 100 мл с плотными пробками;
- резиновый шланг для соединения колбы с пипеткой;
- шприц для введения перекиси водорода в колбу с почвой.
Реактивы:
— 3-процентный раствор Н2О2.
4.3.4 Методика отбора проб, учитывающая вариабельность свойств почв
в пространстве
Важным вопросом при проведении мониторинга эколого-функционального состояния почвогрунтов полосы отвода является вопрос о возможности распространения результатов, полученных на типичном участке при проведении исследования, на прилегающие территории. Этот вопрос является особенно актуальным при исследовании биологических свойств почв, которые отличаются значительной вариабельностью.
Для решения данного вопроса было проведено геостатистическое исследование закономерностей варьирования биологических свойств почвы в пространстве. Объектом исследования была выбрана территория станции Пискаревка, почвы которой являются подзолистыми. Образцы почвы для анализов были отобраны с шагом 50 см на отрезке 50 м. В образцах была определена каталазная активность почвы (табл. 7). Геостатика каталазной активности представлена на рис. 7. По данным каталазной активности была построена полувариограмма (рис. 8). Использование полувариограммы позволяет объективно проанализировать изменения исследуемого признака в пространстве, в частности, оценить однородность территории. Для этого методом максимального правдоподобия была подобрана математическая модель соответствующая полученной полувариограмме [28].
Рис.7 Геостатика (пространственное варьирование) каталазной активности подзолистой почвы станции Пискаревка
Рис.8 Полувариограмма каталазной активности подзолистой почвы станции Пискаревка
Полученная в результате исследования полувариограмма каталазной активности может быть описана как модель с нулевым радиусом корреляции (т.е. интервал, внутри которого значения каталазной активности пространственно зависимы, отсутствует) или 100% эффектом самородка[1]:
γ(h) = c0, где
γ – полувариограмма; h– шаг; с0– дисперсия, вызванная «эффектом самородка».
Эта модель описывает ситуацию, когда в принятом масштабе никакая структура данных не выявляется, то есть наблюдающаяся вариация, является бесструктурной или «шумом». В этом случае следует констатировать тот факт, что исследуемая территория может быть признана однородной по отношению к каталазной активности при шаге измерений 50 см. Поскольку активность каталазы является характерным показателем биологических процессов в почве [6], то полученные выводы можно распространить на биологические свойства почвы в целом.
Таким образом, было выявлено, что территория станции Пискаревка является однородной по биологическим свойствам почвы. Поэтому прогноз экологических последствий загрязнения почвогрунтов небольшого участка станции Пискаревка (50 м), основанный на биологических показателях, может быть распространен на всю исследуемую территорию.
Вставить методику проведения исследования (ее особенности при именно нашем исследовании – сказать что за основу был взят метод – Галстян. Отметить, что бралась свежая почва, что 2 неудобные колбы и соединения заменены одной небольшой стандартной емкостью с резиновой герметичной пробкой. (стандартной для почвенных исследований). Что емкость и пробка легко стерилизуются и транспортируются и соединяются пластиковыми шлангами с мерными пипетками.
Как проводилась, особо отметить проведения большого количества исследований за рабочую смену, экономический эффект и т.д.
4.3.5 Результаты исследования проб
Таблица 7
4.3.6 Оценка состояния почвогрунтов полосы отвода
Выявление однородности почвы на станции Пискаревка по биологическим свойствам дает возможность брать пробы для оценки эколого-функционального состояния почвы на небольшом участке данной территории.
Далее предлагается определять активность наиболее хорошо изученных ферментов, которые представлены в табл.5. Для определения ферментативной активности рекомендуется использовать методы, описанные в пункте 4.2.
Так как ферментативная активность наилучшим образом коррелирует с содержанием в почве загрязнений [6], то по полученным значениям ферментативной активности дается оценка состояния почвогрунтов полосы отвода станции Пискаревка.
Пробы почвы также возможно исследовать по периоду восстановления ферментативной активности и по полученным данным оценить последствия загрязнения почв данной территории.
Выводы:
1) Проведение геостатического исследования позволяет экономить рабочее время и трудозатраты за счет того, что исследуется небольшой участок всей территории.
2) Геостатическое исследование дает возможность выявлять однородность почвы по биологическим свойствам, что является очень важным в вопросе распространения результатов, полученных на небольшом участке, на прилегающие территории. Нет необходимости исследовать состояние почвогрунтов на всей территории, достаточно отобрать пробы в одном месте. Это дает возможность уменьшить стоимость исследования.
3) Для выявления однородности почвы достаточно определить из всех биологических показателей только каталазную активность, так как она является характерным показателем биологических процессов в почве. Это также дает возможность уменьшить стоимость исследования, поскольку не нужны реактивы для определения других биологических показателей.
4) Исследование каталазной активности может быть проведено по экономичному варианту, позволяющему сократить время проведения исследования, уменьшить расход посуды и трудозатрат.
5) Ферментативная активность исследованного участка почвы оценивается по предложенной классификация – как средняя по каталазной активности. Что позволяет сделать вывод о том, что на момент исследования состояние почвогрунтов полосы отвода можно признать удовлетворительным.
Глава
5. Эколого-экономическая оценка природоохранных мероприятий
5.1 Общие сведения
Железная дорога – это линейный объект большой протяженности, вдоль которого располагается множество обслуживающих стационарных предприятий. Весь этот комплекс оказывает существенное влияние на природную среду, так же как и природная среда влияет на условия работы железной дороги.
Воздействие железнодорожного транспорта имеет свои особенности. Это прежде всего негативное влияние стационарных предприятий и передвижных объектов (локомотивов, вагонов, контейнеров), определенная концентрация подвижного состава в зонах жилой застройки, что особенно влияет на здоровье людей и санитарное состояние окружающей среды. Сюда же следует отнести и несовершенство технологии перевозочного процесса; сверхнормативные сроки службы перевозочных средств; недостаточные темпы изменения структуры вагонного парка в сторону его специализации и большую долю неисправного парка вагонов, используемых под массовые перевозки, что тоже не способствует их сохранности.
Причиной загрязненности территорий железнодорожных путей и предприятий являются также утечки нефтепродуктов на пути и межпутья из цистерн во время перевозок, разлив смазочных материалов во время заправки букс колесных пар на приемо-отправочных и экипировочных пунктах, попадание на поверхность земли масла при экипировке локомотивов и нефтепродуктов на территории складов горюче-смазочных материалов. Кроме того, смазка попадает на путь из букс, особенно при остановке и трогании поездов с места.
В полосе отвода в процессе эксплуатации железных дорог почва загрязняется перевозимыми грузами, особенно нефтепродуктами. Нефтяное загрязнение создает новую экологическую обстановку, что приводит к глубокому изменению всех звеньев естественных биоценозов или их полной трансформации. Общая особенность всех нефтезагрязненных почв – изменение численности и ограничение видового разнообразия педобионтов (почвенной мезо- и микрофауны и микрофлоры). Загрязнение нефтепродуктами приводит к массовой гибели почвенной мезофауны: через три дня после аварии большинство видов почвенных животных полностью исчезает или составляет не более 1% контролируемых. Наиболее токсичными для них оказываются легкие фракции нефти. Комплекс почвенных микроорганизмов реагирует на нефтяное загрязнение повышением валовой численности и усилением активности. Прежде всего это относится к углеводородокисляющим бактериям, количество которых резко возрастает относительно незагрязненных почв. В процессе разложения нефти в почвах общее количество микроорганизмов приближается к фоновым значениям, но численность нефтеокисляющих бактерий еще долгое время превышает численность тех же групп в незагрязненных почвах.
Изменение экологической обстановки приводит к подавлению фотосинтезирующей активности растительных организмов. Прежде всего это сказывается на развитии почвенных водорослей: от их частичного угнетения и замены одних групп другими до выпадения отдельных групп или полной гибели всех водорослей. Особенно значительно подавляют развитие водорослей сырая нефть и минеральные воды.
Изменяются фотосинтезирующие функции высших растений, в частности злаков. Эксперименты показали, что при высоких дозах загрязнения (более 20 л/м2) растения даже через год не могут нормально развиваться на загрязненных почвах.[29]
Для обеспечения экологической безопасности железнодорожного транспорта разрабатываются новые технологии, позволяющие исключить возможность загрязнения окружающей среды, а также оборудование для очистки загрязненных грунтов и земляного полотна. Одной из наиболее эффективных и универсальных технологий является микробиологическая очистка грунтов.
Биологические методы очистки грунтов и почв находят все более широкое применение и в нашей стране, и особенно за рубежом. Они основаны на способности различных групп живых организмов в процессе жизнедеятельности разлагать или аккумулировать в своей биомассе многие загрязнители.
Биологические методы имеют ряд преимуществ, в первую очередь — это экологическая чистота и безопасность, а также минимальное нарушение физического и химического состава очищаемых объектов. Большинство технологий биологической очистки являются дешевыми и не очень трудоемкими. Их эффективность высока при низких концентрациях нефтепродуктов, когда большинство других методов уже не работает.
Хронические разливы нефти являются серьезной угрозой окружающей среде и здоровью людей. Они приводят к нарушению функционирования почвенных микробных сообществ и быстрой потере продуктивности земель.
Изучение микробиологических параметров почвы показало, что загрязнение почвы смесью углеводородов приводит к увеличению численности и активности микроорганизмов почвенного сообщества.
Для повышения эффективности экологического контроля почвы от углеводородов нефти предлагается применение биологических методов. Одним из таких методов является определение ферментативной активности микроорганизмов почвы. Способность микроорганизмов разрушать углеводороды определяется активностью их ферментов. Известно шесть классов ферментов: оксиредуктазы, трансферазы, гидролазы, лиазы, изомеразы, лигазы. Все они очень важны в процессе очистки почвы от нефтепродуктов. Особенно большая роль принадлежит оксиредуктазам, осуществляющим первые этапы разрушения соединений почвы до более простых, которые затем подвергаются деструкции с помощью других ферментов.
Главным фактором, определяющим активность ферментов, является наличие в почве питательных веществ. Кроме этого, чем сильнее загрязнение почвы, тем меньше ее ферментативная активность.[30]
5.2 Определение величины предотвращенного экологического ущерба
Экономический ущерб от ухудшения и разрушения почв и земель под воздействием антропогенных нагрузок проявляется главным образом в деградации почв и земель; загрязнении земель химическими веществами; захламлении земель несанкционированными свалками, другими видами несанкционированного и нерегламентированного размещения отходов.
Общая величина предотвращенного ущерба (ПЗ) от ухудшения и разрушения почв и земель в рассматриваемом районе определяется суммированием всех видов предотвращенных ущербов.
Расчетная формула имеет следующий вид:
, где
— величина предотвращенного в результате природоохранной деятельности ущерба от деградации почв и земель на рассматриваемой территории, тыс.руб./год;
— величина предотвращенного в результате природоохранной деятельности ущерба от загрязнения земель химическими веществами на рассматриваемой территории, тыс.руб./год.[31]
5.3 Расчет величины предотвращенного в результате природоохранной деятельности экологического ущерба от ухудшения и разрушения почв и земель
Оценка величины предотвращенного экологического ущерба от деградации почв и земель в результате осуществления природоохранных мероприятий производится по формуле:
, где
НС – нормативная стоимость земель, тыс. руб./га (прил. 5) [31];
S – площадь почв и земель, сохраненная от деградации в результате проведенных природоохранных мероприятий, га;
kП – коэффициент природохозяйственной значимости почв (прил. 6) [31].
Норматив стоимости освоения новых земель НС для Ленинградской области и Санкт — Петербурга в ценах 2008 года составляет 81∙12=972тыс.руб./га;
Площадь железнодорожной станции Пискаревка и прилегающей к ней территории составляет 5,8 га;
kП = 1.
Тогда величина предотвращенного в результате природоохранной деятельности экологического ущерба от деградации почв и земель на рассматриваемой территории составит:
= 972 ∙ 5,8 ∙ 1 ≈ 5638 тыс.руб.
Оценка величины предотвращенного экологического ущерба от загрязнения земель химическими веществами производится по формуле:
, где
kon — коэффициент, учитывающий класс опасности отхода (прил. 8) [31];.
Нефтепродукты относятся к отходам 3-го класса опасности, следовательно, kon = 2.
Предотвращенный экологический ущерб от загрязнения земель нефтепродуктами:
= (972 · 5,8 · 1) · 2 ≈ 11275 тыс.руб.
продолжение
--PAGE_BREAK--Суммарная величина предотвращенного экологического ущерба от разрушения и загрязнения нефтепродуктами почв на рассматриваемой территории составит:
ПЗ= 5638 + 11275 ≈ 16913 тыс.руб.
Расчет суммарной величины предотвращенного в результате природоохранной деятельности экологического ущерба от деградации и загрязнения почв сведен в табл.8
Таблица 8
Расчет суммарной величины предотвращенного ущерба
Выводы
1. Рассчитан предотвращенный экологический ущерб от деградации почв и земель.
2. Рассчитан предотвращенный экологический ущерб от загрязнения земель нефтепродуктами.
3. Рассчитана суммарная величина предотвращенного экологического ущерба от разрушения и загрязнения нефтепродуктами почв на рассматриваемой территории.
--PAGE_BREAK--По расчетному световому потоку с учетом допустимого отклонения (+20%) по справочной литературе [33]подбираем типовой источник света — люминесцентные лампы в осветительных приборах, тип люминесцентных ламп — ЛДЦ (световой поток одной лампы – 2200 лм).
Теперь, когда определены основные условия освещения, можно приступать к определению количества ОП:
Вывод:для искусственного освещения лаборатории площадью 28 м2 необходимо 7 осветительных приборов с двумя источниками света типа ЛДЦ (световой поток — 2200лм) в каждом.
Глава 7. Безопасность жизнедеятельности в чрезвычайных ситуациях
7.1 Обеспечение безопасности железнодорожных путей и ликвидация аварийных ситуаций при перевозке опасных грузов (ОГ)
На железнодорожной станции Пискаревка производится формирование и расформирование составов из вагонов-цистерн, перевозимых хлор (Cl2).
Вид отправки хлора – повагонная.
Грузовместимость вагона – 57,5 т, стандартная грузовместимость – 47,6т.
Требуется:
1) охарактеризовать транспортную опасность перевозимого опасного груза;
2) изложить требования безопасности при транспортировке опасного груза железнодорожным транспортом;
3) определить порядок необходимых действий по ликвидации аварийной ситуации с опасным грузом.
7.2 Характеристика транспортной опасности при перевозке хлора
Общие понятия об опасных грузах и транспортной опасности. К опасным грузам относятся вещества, материалы и изделия, обладающие опасными физико-химическими свойствами, проявление которых при нарушении условий транспортного процесса может привести к гибели или заболеванию людей и животных, нанести вред окружающей среде и причинить материальный ущерб. Поэтому эти грузы при перевозке представляют собой определенную транспортную опасность и требуют строгого соблюдения специальных условий и установленных правил безопасности, принятия мер предосторожности при их погрузке, транспортировке и выгрузке.
Транспортная опасность — это обобщенная характеристика опасных физико-химических свойств груза, указывающая на его неблагоприятное влияние в определенных условиях транспортного процесса на обслуживающий персонал и население, окружающую природную и техногенную среду. К таким обобщенным характеристикам опасных грузов, обуславливающим вид транспортной опасности, относятся: взрывоопасность, пожароопасность, окисление, ядовитость (токсичность), инфекционность, радиоактивность, едкость или коррозионность.
Взрывоопасность вещества — это его способность под воздействием внешнего импульса к внезапному и мгновенному превращению (взрыву), представляющему опасность для жизни людей и окружающей среды в результате воздействия выделяющейся тепловой энергии, образования и распространения в пространстве воздушной ударной волны и резкого скачка избыточного давления, дробления окружающей среды и разброса осколков и отдельных обломков на значительные расстояния.
Пожароопасность вещества — это его способность к само- или легковоспламенению, поддержанию или ускорению процесса горения, то есть к возникновению или быстрому развитию пожара.
Окисление — способность вещества, в основном групп соединений кислорода и водорода, при взаимодействии с другими веществами разлагаться с выделением кислорода или водорода и образовывать самовоспламеняющиеся и взрывчатые смеси, то есть приводить к возникновению пожаров и взрывов.
Ядовитость (токсичность) и инфекционность — это свойства вещества нарушать биохимические функции и поражать (отравлять) организм, вызывая при вдыхании, попадании внутрь желудка (проглатывании), в глаза и на кожу заболевание или смерть людей и животных, заражение окружающей природной среды.
Радиоактивность — самопроизвольный распад ядер атомов некоторых химических элементов, сопровождающийся испусканием ионизирующих излучений, которые вызывают изменения физических и химических свойств веществ и материалов, внутриклеточных связей и гибель клеток живых организмов.
Едкость и коррозионноеть — способность вещества, в основном кислот и оснований (щелочей), вызывать при непосредственном контакте некроз (отмирание) живых тканей организма или коррозию (разрушение) металлов и других материалов.[35]
Основные свойства хлора.Хлор (Cl2) –желто – зеленый газ с резким, раздражающим запахом, в 2,5 раза тяжелее воздуха. Облако зараженного воздуха скапливается в низких участках местности, может проникать в нижние этажи и подвальные помещения зданий.Газ плохо растворяется в воде, но хорошо – в некоторых органических растворах. Температура кипения 34,10С ниже нуля, при обычном давлении затвердевает при 1010С ниже нуля. Перевозится хлор в сжиженном состоянии.
Находит широкое применение в промышленности, в том числе для отбеливания тканей и бумажной массы, в производстве пластмасс, каучуков, растворителей, в цветной металлургии, а также в коммунально – бытовом хозяйстве для обеззараживания питьевой воды.[36]
Взрыво- и пожароопасность.Хлор не горюч, но поддерживает горение, пожароопасен в контакте с горючими материалами. Емкости с хлором могут взрываться при нагревании. Взаимодействие с металлами при увлажнении может вызвать образование воспламеняющихся (горючих) газов. [37]
Краткая физико – химическая характеристика хлора:
- плотность: 1,553 т/м3;
- температура кипения: — 34,10С;
Токсодозы средние ингаляционные:
- пороговые: 0,3 мг·мин/л;
- смертельные: 6,0 мг·мин/л;
Характерный запах: резкий удушливый.
Содержание хлора в воздухе:
- ПДК в рабочих помещениях – 0,001 г/м3;
- Порог ощущения – раздражающее действие при концентрации 0,01 г/м3.[38]
Опасность для человека.Возможен смертельный исход при концентрации 0,25 г/м3 и вдыхании в течение 5 минут.
Хлор опасен при: вдыхании, попадании на кожу, попадании в глаза. При вдыхании воздуха с высокими концентрациями хлора признаками отравления являются одышка, удушье, синюшность кожи, возбуждение, шумное клокочущее дыхание, потеря сознания, при средних и низких концентрациях — резкие загрудинные боли, мучительный сухой кашель, одышка, обильная пенистая мокрота, сердцебиение; при попадании хлора на кожу и в глаза- химический ожог. При взрывах возможны травмы. [37]
Классификационный шифр хлора– 2243. Определим свойства хлора по классификационному шифру.
- первая цифра классификационного шифра — 2 указывает на то, что хлор относится ко второму классу — сжатым и сжиженным газам (СГ);
- вторая цифра — 2 означает, что данный газ относится ко второму подклассу, то есть является ядовитым невоспламеняющимся;
- третья цифра — 4 определяет отнесение этого газа к четвертой категории второго подкласса. Номера категорий любого подкласса определяются в табл. 2.1 [35] по порядковому размещению соответствующих групп номеров знаков опасности. Для четвертой категории второго подкласса и класса — это четвертая по счету группа номеров знаков опасности, она составляет 2,6а/5,8, которые соответствуют номерам классов и видам транспортной опасности и указывают на наличие в данном газе, кроме основных опасных свойств (2 — газ, 6а — ядовитый), еще и дополнительных: 5 — окисляющий и 8 — едкий или коррозионный газ;
- четвертая цифра классификационного шифра — 3 означает, что этот газ относится ко второй группе (степени опасности), то есть является сжиженным.
Степень токсичности.Хлор относится ко 2-ой степени токсичности, т.е. является высоко опасным. Основные показатели и критерии оценки токсичности хлора приведены в табл.1.
Таблица 9
Основные показатели и критерии оценки токсичности хлора
(ГОСТ 12.1.007-76)
Основные показатели
Нормы для 2–ой степени токсичности (высоко опасной)
ПДК в воздухе рабочей зоны, мг/м3
0,1-1
ССК при проглатывании, мг/м3
15-150
ССК при попадании на кожу, мг/кг
100-500
ССК (Д) в воздухе (при вдыхании), мг/м3
500-5000
КВИО
300-30
продолжение
--PAGE_BREAK--