СПЕЦИАЛЬНЫЕ ВАРИАНТЫ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
Препаративная ВЭЖХ
К настоящему времени несоздан единый вариант метода препаративной ВЭЖХ, который обладал бы как большойскоростью и эффективностью разделения, так и высокой производительностью иэкономичностью. Поэтому предложены варианты метода, значительно различающиесяпо размерам и эффективности колонок, по производительности работы, требованиямк оборудованию и затратам на оборудование, сорбенты и растворители. При выбореоптимального варианта препаративной ВЭЖХ для каждой конкретной задачи. Исследователюприходится сталкиваться с рядом трудностей и проблем.
Первой и основной трудностьюявляется высокая стоимость узко сепаративных сорбентов, особенно привитых, сразмером частиц от 5 до 20 мкм. Если с этим можно мириться для аналитическихколонок диаметром 2–5 мм, то стоимость резко растет при использованииколонок диаметром 10, 20 или 40 мм и может составить соответственно 200,800 и 3200 рублей (без учета стоимости металлических колонок и работы по ихзаполнению). Кроме того, такие колонки достаточно непросто заполнятьсуспензионным способом.
Вторая трудность–созданиехроматографов, насосы которых могли бы подавать растворитель при давлениях 5–20МПа при расходе 5–100 мл/мин, а инжекторы позволяли бы водить без размыванияпробы объемом 0,5–10 мл. Для таких насосов необходимы довольно мощные,дорогостоящие и тяжелые электродвигатели, сложные и дорогие уплотнения, клапаныи т.д.
Третья трудность–необходимостьрасходования больших объемов растворителей высокой чистоты, что приводит кбольшим затратам труда и времени на их регенерацию и очистку или к большимтратам на их приобретение. Расход растворителя достигает 10 л и более на 1г препаративно выделенного очищенного продукта.
Наконец, существуютпроблемы, связанные с ограниченной растворимостью образца в растворителе,повышенной вязкостью концентрированных растворов, взрыво- и пожароопасностьюработы, необходимостью удаления больших объемов растворителей под вакуумом ит.д.
Конечно, все эти трудностивозрастают по мере роста масштаба работы и количества вещества, которое нужнопрепаративно выделить или очистить. Отсюда первое правило: масштабпрепаративного разделения должен быть мал настолько, насколько позволяютпоставленные задачи.
Многие проблемы, связанные свыделением 1–10 мг чистых веществ для их идентификации современнымивысокочувствительными физико-химическими методами легко разрешаются на обычныханалитических колонках диаметром 4–5 мм путем многократного ввода проб исбора фракций. Как правило, для таких работ не требуется никакого специальногооборудования, кроме обычного аналитического хроматографа, а сбор фракцийосуществляется вручную. Производительность работы можно увеличить безсущественного изменения аппаратуры, заменив аналитическую колонку напрепаративную диаметром 10–14 мм: как правило, насосы способны подавать до5–10 мл/мин растворителя, а инжекторы–вводить 0,1–1 мл пробы. Правда, стоимостьоборудования увеличивается на стоимость такой колонки, однако ипроизводительность работы возрастет в 4–10 раз. Дальнейшего увеличенияколичества выделяемого вещества можно добиться уже только при значительномусложнении и удорожании оборудования.
Так, разделить большиеколичества на аналитическом хроматографе с колонкой диаметром 10–14 ммможно при увеличении продолжительности его работы, чего можно достигнуть путемавтоматизации процесса ввода и сбора образца. Для этого хроматограф должен бытьоснащен коллектором фракций, автоматическим устройством ввода пробы икомпьютером, управляющим их работой. Для некоторых жидкостных насосовпредусмотрена возможность установки специальных препаративных головок, иногда срециклом разделенных фракций, позволяющих использовать эти насосы с колонкамидиаметром 20–25 мм (при производительности до 20–30 мл/мин) или 35–50 мм(до 100 мл/мин). Соответственно петлевой инжектор должен иметь достаточноширокие внутренние каналы и возможность установки петли размером до 10 мл.Конструкция и геометрия петли должны быть такими, чтобы обеспечивалосьминимальное размывание образца при вводе пробы: длинные петли малого диаметрабез резких изменений геометрии потока предпочтительней коротких и большогодиаметра. Нередко удается заметно улучшить разделение, одновременно уменьшивразмывание образца при вводе пробы путем ввода пробы без инжектора, установиввместо него тройник малого Ир объема и вводя пробу вспомогательным насосомвысокого ржавления, работающим короткий отрезок времени. Менее удобнымспособом, дающим сходный результат, является ввод больших проб на колонкушприцем с использованием инжектора с прокалываемой резиновой мембраной, иликраном малого объема, однако при этом ввод пробы (из-за ограниченного давления,которое можно создать шприцем даже хорошего качества: около 5 МПа для шприцаемкостью 1 мл и около 1 МПа–для шприца емкостью 10 мл) осуществляют приостановке потока (выключении основного насоса).
При использовании колонокбольшого диаметра (10 мм и более) особое внимание должно быть уделеновыбору сорбента. Как правило, дорогие узкодисперсные сорбенты с размером частиц5 или 10 мкм для широких колонок использовать нецелесообразно из-за высокойстоимости и трудности суспензионной упаковки. Поэтому часто идут накомпромиссное решение и используют препаративную фракцию того же сорбента сразмером частиц 25–40 мкм или 40–70 мкм, которая выпускается рядом фирм специальнодля этих целей. Преимуществом такого сорбента является возможность упаковкисухим способом в колонки большого диаметра, более низкая стоимость (в 3–6 раздешевле) при полном сохранении химической природы поверхности и пористостисорбента, используемого в аналитическом варианте. Кроме того, при работе сболее крупным сорбентом требуется значительно меньшее давление, что упрощаетработу и позволяет использовать более дешевое оборудование.
Выпускают также сорбенты дляпрепаративной работы с размером частиц 15–25 мкм. Колонки, заполненные такимисорбентами суспензионным методом, имеют высокую эффективность. Прииспользовании непривитого силикагеля, колонок очень большого диаметра (более 20 мм)и при необходимости очистки или выделения очень больших количеств веществанередко практикуется применение дешевого и доступного сорбента. Частоиспользуют силикагель для ТСХ (фракция 5–40 мкм), который нередко фракционируютседиментацией для сужения фракционного состава (отделяют пылевидные частицы,заметно повышающие гидравлическое сопротивление колонки, и наиболее крупные).Нередко применяют наиболее мелкую фракцию (40–70 мкм), имеющуюся в продаже дляколоночной хроматографии. Однако переход на сорбент с другим размером ираспределением пор и с несколько другими химическими свойствами поверхностиможет привести к заметному изменению разделения, удерживания, а иногда даже ипорядка выхода разделяемых компонентов. Такие же изменения наблюдаются и припереходе от привитого сорбента одной фирмы к препаративному сорбенту другойфирмы.
Количество образца, котороеможно ввести на колонку для препаративного разделения, зависит от многихфакторов, и для каждого случая должно определяться экспериментально,предпочтительно с использованием аналитической колонки и растворов образцаразной концентрации. В самом общем виде можно сказать, что масса образца,которую можно ввести, составляет от 0,1 до 1 мг на 1 г сорбента при отсутствиизаметной перегрузки колонки пробой (снижение эффективности колонки менее чем в2 раза). Как правило, препаративные разделения проводят при максимальновозможной перегрузке колонки пробой, поэтому чем больше α для разделяемыхкомпонентов, тем больше можно перегрузить колонку пробой и тем соответственнобольше получить разделенного вещества за препаративный цикл. При разделениипростых смесей, когда работают с большой перегрузкой, эффективностьпрепаративных колонок с мелкими узкодисперсными сорбентами по основным пикамбыстро падает, но по пикам примесей остается высокой, что позволяет отделять ихболее четко. При работе с большой перегрузкой эффективность по основным пикамдля малоэффективных колонок и колонок средней и высокой эффективности близка.Однако по мере усложнения задачи (более сложные смеси, меньше α)допустимая перегрузка уменьшается и малоэффективные колонки становятсянепригодными. они перестают обеспечивать разделение и получение чистыхкомпонентов даже при отсутствии перегрузки.
Растворители, используемыедля препаративной работы. должны быть, как правило, перегнанными,профильтрованными и не содержать примесей, так как в процессе выделения образцаиз фракции упариванием его концентрация (и концентрация примесей, остающихся внем от недостаточно чистого растворителя) увеличивается в 200–1000 раз. Сменарастворителя в препаративной ВЭЖХ с колонками большого диаметра иуравновешивание колонки с новым растворителем обычно достаточно длительны,сопровождаются большим расходом растворителей, поэтому работу надо планироватьтак, чтобы делать это по возможности редко. Раствор образца определенной концентрациидолжен быть приготовлен на основании экспериментов, выполненных на колонке стаким же сорбентом, но меньшего размера: вводят пробы растворов разнойконцентрации и объема и выбирают соотношение, позволяющее нагрузить колонкунаибольшим количеством образца при достаточном для сбора препаративных фракцийв чистом виде разделении. Раствор образца должен быть тщательно профильтрован ине содержать взвесей твердых частиц, в том числе и выпадающих в процессе егохранения до конца препаративной работы. Целесообразно для предохранения колонкиот возможного загрязнения такими частицами ввести в систему фильтр малогообъема между инжектором и препаративной колонкой. Нужно стараться проводить всюпрепаративную работу в максимально сжатые сроки, предохраняя раствор образца исобранные фракции от длительного контакта с воздухом, светом и повышеннойтемпературой. Чем ниже температура и меньше срок хранения раствора, чем быстрееотгоняется растворитель от собранных фракций, тем чище получаются собранныевещества и легче вся дальнейшая работа с ними.
Особое место в препаративнойВЭЖХ занимает эксклюзионная хроматография макромолекул. Этот метод используют впредварительном варианте для выделения целевых веществ или их групп из смесей, содержащихкомпоненты с заметно
различающейся молекулярноймассой. Исключительную важность этот метод имеет для очистки лабильныхбиополимеров. Так, на препаративных колонках с TSK-гелями SWG за один ввод можно очистить100–200 мг ферментов. Разработана технология приготовления высокоэффективныхпрепаративных колонок для эксклюзионной хроматографии синтетических полимеров.Это позволило решить одну из наиболее трудных проблем исследования полимеров – быстроеполучение узких фракций, необходимых для исследовательских целей и длякалибровки аналитических систем. Особенно важным является то обстоятельство,что этим методом можно фракционировать практически любые полимеры, в то времякак классические методы фракционирования не только несоизмеримо болеетрудоемки, но и малопригодны для разделения многих объектов, в частности,образцов с молекулярной массой до 10 000 – 30000.
Следует отметить, что приразделении синтетических полимеров нельзя сильно перегружать колонку. За счетвязкостного эффекта наблюдается сильное смещение удерживаемых объемов, чторезко ухудшает качество получаемых фракций. Тем не менее производительностьпроцесса достаточно высока. Так, при препаративном разделении на колонкеразмером 250х21,5 мм с зорбаксом-сил эффективностью около 10000 т.т. приединовременном вводе 200 мг образца сополимера этилена с винилацетатом (объемдозы 8 мл, концентрация 2,5%) разделение заканчивалось за 5 мин прискорости подвижной фазы (тетрагидрофуран) 16 мл/мин. Такая скорость разделенияпозволила за рабочий день фракционировать 8 г сополимера даже без примененияавтоматического дозатора с ручным отбором фракций каждые 20 с.Характеристики полученных фракций представлены в табл. 3.1.
Эти результаты показывают,что в выбранных условиях удалось получить весьма узкие фракции сополимера смолекулярной массой более 3000. Две последние фракции асимметричны и имеютзаметно большую полидисперсность за счет присутствия продуктов с более высокоймолекулярной массой, сильнее адсорбирующихся на силикагеле.
Чтобы полностью избежатьпроявления адсорбционных эффектов, разделение нужно проводить на колонках сполужесткими гелями.
Таблица 1. Характеристикиузких фракций сополимера этилена с винилацетатом№ фракции Мω Мn Mω/Mn Исходный образец 6300 2700 2,33 2 10700 9300 1,15 3 6600 5600 1,18 4 3600 2950 1,22 5 2000 1450 1,38 6 1650 800 2,06
Микроколоночная ВЭЖХ
Среди специалистов донастоящего времени идут споры о том, какую хроматографию следует считатьмикроколоночной. какую обычной аналитической, но в меньшем масштабе [57, 58].Если жидкостная хроматография с использованием поверхностно-пористых (пелликулярных)сорбентов осуществляется на колонках диаметром около 2 мм и даже 1 мми длиной до нескольких метров, можно ли считать ее микроколоночной ВЭЖХ илинет? Можно ли отнести к области современной микроколоночной хроматографиейранние работы с использованием заполненных микрочастицами размером 5 и 10 мкмтефлоновых колонок, эффективность которых 500 – 1500 т.т.?
Представляетсяцелесообразным считать, что современная микроколоночная ВЭЖХ возникла около 8лет назад и признаками ее появления в окончательно сформированном виде следуетсчитать, во-первых, разработку технологии заполнения высокоэффективных колонокдиаметром 2 и 1 мм, объемом от 50 до 800 мкл и имеющих приведенную ВЭТТ от2 до 5, т.е. такую же, как у современных аналитических колонок, смикрочастицами размером 3, 5, 7 и 10 мкм (до 20 мкм), во-вторых, создание,разработку и серийный выпуск как специально разработанных узлов, так ихроматографов для микроколоночной ВЭЖХ. Достигнутая степень миниатюризации ВЭЖХс колонками диаметром 1 мм уже позволила широко ввести этот метод впрактику и оценить получаемые преимущества резкое снижение расхода растворителяи сорбента (в 15–25 раз), повышение чувствительности метода и снижениеопределяемого минимума вещества в пробе (в 15–25 раз). Это существенно ускориловнедрение жидкостной хроматографии в биологию, биотехнологию, медицину.
Проводимые работы поразвитию микроколоночной ВЭЖХ, направленные на дальнейшую миниатюризациюколонок, очевидно, являются перспективными и нужными, однако их освоение ивнедрение в практику в большой мере сдерживается техническими трудностями.Описаны капиллярные колонки для ВЭЖХ с внутренним диаметром около 5 и 10 мкм, втом числе и с привитыми фазами, позволившие получить эффективность донескольких миллионов т.т.; описаны колонки с привитыми сорбентами, имеющиевнутренний диаметр около 30–50 мкм, также позволившие получить эффективностьоколо миллиона т.т. Однако ввод проб в такие колонки, особенно количественный,стабильная подача растворителей с расходом 0,01–1 мкл/мин при давлениях 10–40МПа, наконец, создание детекторов с объемом кюветы в 1–20 нл, дающих высокуючувствительность, – все это только часть серьезных проблем, решить которыепредстоит в дальнейшем. Сейчас можно предсказать, что в ближайшие 5–10 летмикроколоночные хроматографы с колонками диаметром 0,2–2 мм найдут самоеширокое применение в аналитической практике, хотя и не станут наиболеемассовыми.
Каковы же основные отличияаппаратуры для микроколоночной ВЭЖХ от обычной? Насос должен стабильно подаватьрастворитель при высоких давлениях (5–40 МПа) и небольших расходах (0,1–100мкл/мин). Как правило, обычные насосы для ВЭЖХ либо не работают при такихпараметрах, либо не обеспечивают стабильной подачи. Инжектор должен обеспечиватьвоспроизводимый ввод проб размером 0,1–1 мкл при высоких давлениях (до 40 МПа),что также не удается осуществить, используя старые петлевые инжекторы с петлями10 мкл и более. Для соединения колонки с инжектором и детектором приходитсяидти либо на прямое соединение без использования капилляров, либо использоватькапилляры с внутренним диаметром 50–150 мкм очень небольшой длины (2–5 см).Наконец, детектор должен иметь кювету очень малого объема (0,03–1 мкл), нообеспечивающую высокую чувствительность детектирования (для УФ детекторов длинаоптического пути должна быть от 1 до 10 мм). Для градиентноймикроколоночной ВЭЖХ дополнительно возникают трудности, связанные смикроподачей элюента в начале и конце градиента (от 1% обычного расхода длямикроколонки) и созданием эффективного микросмесителя вместимостью от 1 до 20мкл. Весьма проблематичным становится формирование градиента одним насосом исистемой клапанов на стороне низкого давления, так как устройство такого типа свместимостью 10–40 мкл (включая объемы клапанной системы, подводящих капиллярови поршневой камеры или камер насоса) очень трудно представить.
Какие основные проблемы внастоящее время существуют в микроколоночной хроматографии? Во-первых, этотрудность приготовления высокоэффективных колонок с внутренним диаметром 0,5–2 ммс широким диапазоном сорбентов всех типов. Во-вторых, существует ограниченныйкруг детекторов с микрокюветами вместимостью 0,03–2 мкл, пригодных для работы смикроколонками, которые серийно производят в достаточно широком масштабе и подоступным ценам. Такими детекторами являются некоторые УФ-фотометры,спектрофотометры, флюоресцентные детекторы, электрохимические детекторы. Оченьинтересным и информативным является сочетание микроколоночной ВЭЖХ схроматомасс-спектрометром, позволяющее существенно упростить проблемуинтерфейса для ряда применений, однако высокая стоимость такого детектораограничивает его широкое применение. Разработка детекторов с лазернымиисточниками позволяет создать микрокюветы для рефрактометров и Другихдетекторов, однако стоимость таких детекторов достаточно высока. В-третьих,существуют психологические трудности и инерция производства, поддерживающиеразвитие традиционной ВЭЖХ и сдерживающие развитие микроколоночной.
Отечественный серийныймикроколоночный хроматограф «Милихром» нашел широкое применение как висследовательской работе, так и для контроля на производстве. Он имеетшприцевой насос вместимостью 2500 мкл, выполненный из упрочненного стекла,жидкость контактирует только с высокоинертными материалами: фторопластом,стеклом и танталом, что позволяет использовать высокоагрессивные растворители си добавки. Насос рассчитан на давление 10 Мпа (До 1987 г. – 5 Мпа.) идиапазон подачи растворителя от 1 до 600 мкл/мин. Детектором служит сканирующийспектрофотометр с диапазоном длин волн 190 – 360 нм и временем сканирования от0,15 с, что позволяет осуществлять сканирование в выбранном диапазоне длин волнв без остановки потока. Диапазон оптических плотностей детектора от 12,8 до0,05 единиц адсорбции на всю шкалу в пересчете на длину оптического пути 10 мм.Микрокювета детектора имеет вместимость 1,5 мкл при длине оптического пути 1,5 мм.Оригинально выполнен узел ввода пробы: набор пробы от 0,1 мкл и болееосуществляется засасыванием пробы в иглу путем регулируемого хода шаговогодвигателя, управляющего насосом. Игла с пробой далее уплотняется путемобжимания фторопластового конуса вплотную к верхнему фильтру колонки, и припуске насоса проба без размывания подается через иглу в колонку; тем же путемподается растворитель, промывающий иглу и элюирующий пробу. Таким образом, вводпробы осуществляется без использования микрошприца, при этом удается исключитьошибки, связанные с плохой промывкой шприца от предыдущей пробы и характерныедля начинающего и малоопытного оператора.
В хроматографе предусмотреноиспользование колонок двух типов: стеклянных с внутренним диаметром 1–1,5 мм,рассчитанных на работу при давлении до 1,5 МПа и создание полностью инертнойхроматографической системы, и из нержавеющей стали длиной 60 и 120 мм свнутренним диаметром 2 мм. Все соединительные линии в хроматографевыполнены из толстостенных фторопластовых капилляров, на конце имеющихразвальцовку, по которой и производится уплотнение; при низком давлениииспользуются капилляры из полиэтилена. Шприцевой насос «Милихром» имеет приводот шагового двигателя, что позволяет не только обеспечить высокуювоспроизводимость времени удерживания и количества вводимой пробы, но иформировать при необходимости в камере насоса градиент растворителя заданнойформы и осуществлять градиентное элюирование сложных по составу смесей веществ.Предусмотрена также работа «Милихрома» с микроколлектоPOM фракций,обеспечивающим сбор микрофракций для последующей идентификации другимифизико-химическими методами.
Серийно выпускаютхроматографы, предназначенные для микроколоночной ВЭЖХ, различные зарубежныефирмы. Следует отметить микроколоночный хроматограф «Фэмилик 300 С» фирмы«Джаско», имеющий трехплунжерный насос, микроинжектор вместимостью 1 и 3 мкл,спектрофотометр «Увидек 100 V» с кюветой вместимостью 1 мкл при 5 мм длиныоптического пути и флюориметрический детектор с кюветой вместимостью 2 мкл. Этафирма имеет большой опыт в производстве микроколоночных хроматографов, так какона выпустила в продажу первый микроколоночный хроматограф «Фэмилик 100» в 1976 г.Интересен микроколоночный хроматограф фирмы «Иско», имеющий шприцевой насосвместимостью 50 мл и давлением 70 МПа с подачей растворителя от 0,02 до 600мкл/мин, микроинжектор вместимостью 0,1 мкл и спектрофотометрический детектор скюветами разной вместимости и длины оптического пути от 0,5 мкл и 10 мм до0,03 мкл и 1 мм. Градиентную микроколоночную систему с двумя шприцевыминасосами выпустила фирма «Броунли Лабс»; систему с двумя и тремя растворителямипредлагает фирма «Хьюлетт-Пакард». Набор гибких микроколоночных хроматографовразработан фирмой «Жилсон» – от простейшего изократического с подачейрастворителя от 0,5 мкл/мин при 42 МПа, с микроинжектором на 1 мкл иУФ-детектором на 254 и 280 нм с микрокюветой 1,3 мкл при 5 мм доградиентного хроматографа, имеющего в качестве детектора спектрофотометр стакой же микрокюветой или флюориметрический детектор с микрокюветой. Широкийнабор спектрофотометров с микрокюветами вместимостью 0,5 мкл при 1 ммдлины оптического пути выпускает фирма «Кратос»; она же выпускаетфлюориметрические детекторы с микрокюветами. Изократические хроматографы длямикроколоночной ВЭЖХ выпускают фирмы «Шимадзу», «Кнауэр», «ЛК.Б», «Байо-Рэд»,«Вариан», «Лаборатори Дэйта Контрол» и др.
Большой интерес представляетсочетание микроколоночной ВЭЖХ с масс-спектрометрией. Известно, что присутствиебольших количеств растворителя в элюенте, выходящем из хроматографическойколонки обычного размера (4,6 мм Х 250 мм), обусловливает созданиедостаточно сложного и дорогого интерфейса. Этот интерфейс предназначен дляудаления растворителя и транспортировки проб в ионизационную камерумасс-спектрометра. Если сечение хроматографической колонки уменьшается, как вмикроколоночной ВЭЖХ, в 25–100 раз, т.е. если используют колонки диаметром от0,5 до 1 мм, мощности насосов масс-спектрометра хватает для удалениярастворителя и поддержания высокого вакуума в ионизационной камере, инеобходимость в интерфейсе отпадает. Следует отметить, однако, что еще не решенряд проблем при прямой стыковке микроколонки и масс-спектрометра, таких, какудаление солей из элюента при использовании буферных систем растворителей,резкое снижение температуры на конце микроколонки из-за интенсивного съематепла при испарении растворителя и др.
Большой интерес представляюти другие сочетания микроколоночной ВЭЖХ с физико-химическими методами анализа.Например, показано, что с использованием дисков из бромида калия можно записатьи запомнить хроматографическую информацию, поступающую с микроколонки, и принеобходимости получить ИК-спектр и другую информацию об интересующем пике илиучастке хроматограммы.
ВЭЖХ с градиентом составарастворителя
При разработке методаразделения сложных смесей веществ, особенно биологического и природногопроисхождения, Исследователю часто приходится сталкиваться с тем, что в ихсостав не только входит большое количество соединений, но и сильно различаютсяих свойства. Подобрать в этом случае сорбент и растворитель, которыеобеспечивали бы разделение вcex или большинства интересующих исследователякомпонентов, обычно не удается. Однако еще тогда, когда колонки в хроматографиибыли малоэффективными, было найдено и средство для решения таких задач – использованиерастворителя, элюирующая сила которого постепенно увеличивалась. Это приводилок тому, что как слабо, так и сильно удерживаемые вещества выходили из колонкиза приемлемо короткое время, при этом зоны сильно удерживаемых соединенийсужались и давали более узкие и симметричные пики. Когда эффективность колонокбыла повышена, популярность градиентного элюирования несколько уменьшилась,однако для многих объектов до настоящего времени это единственно приемлемыйвариант – ВЭЖХ с градиентом растворителя, или градиентная ВЭЖХ (ГВЭЖХ).
С какими же проблемамисталкивается исследователь, переходя от изократической ВЭЖХ к градиентной?Проблем здесь несколько, и рассмотрение их целесообразно разделить на связанныес конструкцией прибора, с выбором колонки и с выбором растворителя для ГВЭЖХ.
Прибор для градиентной ВЭЖХ,как видно из самого определения, должен иметь устройство для изменения составарастворителя по заданной исследователем программе. Возможны два варианта такогоустройства: создание градиента при низком давлении растворителей с подачей смесив насос и соэдание градиента при высоком давлении, когда каждый израстворителей (сильный и слабый) подается своим насосом с переменной скоростью,так чтобы элюирующая сила смеси увеличивалась. В приборе для ГВЭЖХ, помимообычных узлов, появляются дополнительно программатор (устройство формированияградиента), управляемые им система клапанов или второй насос (для градиентанизкого и высокого давления соответственно), смеситель. Этим обусловлен первыйнедостаток ГВЭЖХ – приборы для нее примерно вдвое дороже, чем дляизократической ВЭЖХ.
Нередко в состав системы дляГВЭЖХ приходится добавлять дорогое устройство для эффективной дегазациирастворителей продуванием гелия, действием вакуума на растворитель, подаваемыйчерез специальные полупроницаемые трубки и т.д. Это связано с тем, что присмешении плохо дегазированных растворителей всегда выделяются пузырьки, так какрастворимость газа в смеси растворителей обычно отличается от суммырастворимостей в чистых растворителях. Это особенно опасно при градиенте низкогодавления, так как пузырек газа, попавший в клапанную систему и в насос,полностью нарушает их работу. Наконец, в градиентной системе существуетдовольно заметный объем от места формирования градиента растворителя до местаего поступления в колонку: обычно этот объем составляет от 1 до 3 мл илибольше, поэтому состав растворителя, поступающего в колонку, отличается оттого, который формируется в это же время. При работе на колонках малогодиаметра (1–2 мм) и при небольших расходах растворителя (10–200 мкл/мин)это приводит к еще большим отличиям. Затруднительно гомогенное смешениесильного и слабого растворителей, поступающих в смеситель: недостаточноэффективное смешение и неоднородность потока вызывают заметное увеличениешумов, что мешает использовать чувствительные шкалы детектора. Наконец, приградиентном элюировании практически исключается использованиерефрактометрического детектора, так как изменение показателя преломления приизменении состава растворителя приводит к нарушению его работы.
Выбор сорбента и колонки дляГВЭЖХ также имеет свои особенности. Прежде всего, колонка должна быстроприходить в равновесие с растворителем постоянно изменяющегося состава как впроцессе градиентного элюирования, так и при возвращении к исходному составурастворителя при подготовке колонки к новому анализу. Если для старых колонок вжидкостной хроматографии, работавших однократно, градиент формировался ииспользовался один раз, после чего сорбент в колонке заменялся свежим, и этопозволяло применять силикагель и оксид алюминия, то для ГВЭЖХ эти сорбенты неподходят, так как уравновешивание их со слабым растворителем после градиентаслишком длительно. Однако современные обращенно-фазные и другие привитыесорбенты достаточно быстро приходят в равновесие с исходным растворителем послеокончания градиентного элюирования, что позволяет успешно использовать их дляэтих целей. Время, необходимое для уравновешивания колонки, для каждогосорбента устанавливается экспериментально по достижению постоянства времениудерживания веществ, входящих в анализируемую смесь. Это время различно как дляразных сорбентов, так и для разных по составу растворителей, и может колебатьсяот десятков до нескольких сотен минут.
Наконец, очень важноправильно выбрать растворитель и добавки для него при ГВЭЖХ. Если приизократической ВЭЖХ небольшие примеси, присутствующие в растворителе, приходятв равновесие с сорбентом и обычно не дают ложных пиков или
увеличения шумов, то в ГВЭЖХтребования к чистоте растворителей значительно более жесткие. Например, вслучае обращенно-фазной ГВЭЖХ использование воды, недостаточно очищенной оторганических загрязнителей, присутствующих в природной воде или привнесенных впроцессе ионообменной очистки или перегонки, приводит к появлению набораинтенсивных пиков, элюируемых из колонки метанольно-водным илиацетонитрильно-водным градиентом. Перегонка воды часто приводит (еслиаппаратура выбрана неудачно) не к уменьшению, а к увеличению количества исодержания органических загрязнителей, добавляющихся при контакте воды снедостаточно чистой аппаратурой, полимерными пробками и шлангами, смазками наорганической основе и т.д. Кроме того, многие органические вещества,малолетучие сами по себе, способны легко перегоняться с водяным паром и,следовательно, загрязнять конденсат. Наиболее надежным методом очистки воды дляГВЭЖХ следует признать двукратную дистилляцию в стеклянной или кварцевойаппаратуре на шлифах, при этом на первой стадии проводится окисление примесейперманганатом калия, а на второй – обработка щелочью для удаления кислыхвеществ. Если после этого необходима дополнительная очистка, ее проводятпропусканием воды через колонку большого диаметра с крупным (30–100 мкм)обращенно-фазным сорбентом, используемым для препаративной работы иотносительно дешевым. Хранить такую высокочистую воду желательно в темном местев бутыли, тщательно закрытой пробкой. Вода не должна контактировать сполимерами, выделяющими в нее продукты деструкции, стабилизаторы,пластификаторы и другие загрязнители. Желательно не хранить высокочистую водудлительный срок, так как ее чистота сохраняется относительно недолго.
Другие растворители дляГВЭЖХ должны быть квалификации «для УФ-спектроскопии» или «для жидкостнойхроматографии». Производство ацетонитрила и метанола, а также воды таких квалификацийосвоено нашей промышленностью. При хранении, а также использовании такихрастворителей всегда следует помнить о потенциальных загрязнителях и по меревозможности избегать их.
Примеси, находящиеся вметаноле или ацетонитриле, точно так же могут накапливаться на колонке ипроявляться в виде пиков при градиенте. Это легко понять, если представитьсебе, что начальный состав растворителя органический компонент – вода 50: 50.Невымываемая таким растворителем примесь, например нафталин, может бытьдобавлена как в воду, так и в метанол и будет накапливаться в начале колонкиодинаково независимо от компонента системы растворителей, ее содержащего(метанола или воды). Если спустя какое-то время начать градиентное элюирование,нафталин при более сильном растворителе начнет двигаться и выйдет в виде узкогопика.
Наиболее жесткие требованияпредъявляют к растворителю если градиент осуществляется с детектированием придлинах волн ниже 220 или 210 нм, так как в этом случае поглощают и проявляютсяв виде пиков многие примеси, УФ-прозрачные при 254 или 280 нм.
Единственным путемустановления пригодности растворителей для ГВЭЖХ служит проверка в реальныххроматографических условиях с градиентом требуемого состава, но без введенияпробы вещества (холостой градиент). Как правило, проверку проводят сначала наболее грубых шкалах детектора и при длинах волн 254 или 280 нм, а при полученииположительного результата переходят на более чувствительные шкалы и длины волн220 нм и ниже. Если работа по ГВЭЖХ прервана на относительно большой срок(более недели) или один из растворителей (или оба) заменены на новые (даже тойже квалификации и партии), всегда следует до начала работы с образцами создатьхолостой градиент для проверки работоспособности системы в целом.
Следует отметить, что многиедобавки к растворителям, такие, как соли, кислоты, ион-парные и другиереагенты, способны заметно изменить свойства растворителей. Так, накоплениеполифосфатов в солях фосфорной кислоты, используемых для приготовления буферныхрастворов, приводит к существенному дрейфу при градиенте из-за сильногоУФ-поглощения полифосфатов. В некоторых случаях удается уменьшить дрейф в градиентномрежиме, если уравнять УФ-поглощение слабого и сильного
элюирующих растворовдобавкой УФ-поглотителя, такого, как ацетон, к менее УФ-поглощающему раствору.Градиент тем легче осуществить, чем он меньше по диапазону, поэтомуцелесообразно менять растворитель по составу только в тех пределах, которыенеобходимы для разделения. Это позволяет повысить чувствительность, уменьшитьдрейф нулевой линии и количество ложных пиков, а также ускорить какэлюирование, так и возврат системы к исходным условиям для нового анализа.
Если при градиентномэлюировании используют другой тип детектора, например флюориметрический,высокие требования к чистоте растворителей остаются, но меняется ихнаправленность – не должно быть флюоресцирующих примесей. О пригодностирастворителей для работы судят также, осуществляя холостой градиент.
В заключение отметим, что кградиентному элюированию следует прибегать только в тех случаях, когда егоприменение является единственным путем решения данной проблемы. Если проверка вградиентном режиме показала, что возможно использовать изократический вариантдля интересующих. веществ, следует немедленно перейти к нему. Это всегдавыгодно, даже в тех случаях, когда анализ разбивается на два изократичеоких,выполняемых на двух приборах с более сильным и более слабым растворителями.Более воспроизводимые результаты и возможность использовать болеечувствительные шкалы, менее жесткие требования к качеству растворителя – этотолько некоторые из получаемых преимуществ.
Следует также отметить, чтопри работе в обращенно-фазном режиме с системой метанол – вода, вязкостькоторой не аддитивна, а меняется от 1 до 1,5 и затем до 0,6 Мпа•с при переходеот 100% воды к 100% метанола, колонка находится в неблагоприятных условиях, таккак при постоянном расходе давление на колонку сначала возрастает в 1,5 раза, азатем падает в 2 раза к концу градиентного элюирования. Картина повторяется впроцессе регенерации колонки, при возврате к слабому растворителю. Этосокращает срок службы колонки и затрудняет работу с колонками, содержащимимелкий сорбент (менее 5 мкм).
Литература
1. Barth H.G./J. Chromatogr. Sci, 1980, v. 18, No. 9, p. 409–429.
2. Беленький Б.Г., Мальцев В.Г. //В кн.: Прикладная хроматография. М., Наука, 1984, с. 54–64.
3. Энтелис С.Г., Евреинов В.В., Кузаев А.И. Реакционноспособные оли-гомеры. М, Химия, 1985.
4. Janca J., Kleparnik K./J. Liquid Chromatogr., 1982, v. 5, No. 2, p. 193 – 216.
5. Chamberlin T.A., Tulnstra H.E./AnalChem., 1983, v. 55, No. 3, p. 428 – 432.
6. Shulz W.W./J. Liquid Chromatogr., 1980, v. 3, No. 7, p. 941–952.
7. Neff B.L., Overton J.R./J.Liquid Chromatogr., 1984, v. 7, No. 8,p. 1537–1544.
8. Mori S., Suzuki M./J. Liquid Chromatogr., 1984, v. 7, No. 9, p. 1841–1850.
9. Нефедов П.П. Канд. дис. Л., ИВС АНСССР, 1973. 150 с.
10. Виленчик Л. 3., Курбенин О.И., Беленький Б. Л / Высокомол. соед., 1984, т. А26, №10, с. 2223–2226.
11. Grubisic Z., Rempp R., Benoit Я./J. Polym. Sci., 1967, v. B5, No. 9, p. 753.
12. Рафиков С.Р., Будтов В.П., Монаков Ю.Б. Введение в физико-химию растворов полимеров. М., Наука, 1978. 328 с.
13. Samay G /Ada chim. Acad.sci. Hung., 1979, v. 102, No. 2, p. 157–164.
14.Dawkins J.F./StericExclusion Liquid Chromatography of Polymers. Chromatogr. Sci., 1984, v. 25, p.53–116.
15.Kubin M./J. LiquidChromatogr., 1984, v. 7, No. 1, p. 41–68.