--PAGE_BREAK--Захват электрона При захвате электрона, отрицательный заряд 1- сообщается молекуле при присоединении электрона. Этот механизм ионизации в первую очередь наблюдается для молекул с большим сродством к электрону, таких как галогенсодержащие соединения.
Таблица 1.1. Механизмы ионизации, их преимущества и недостатки.
Механизм ионизации
Преимущества
Недостатки
Протонирование (положительные ионы)
· многие соединения присоединяют протон с получением заряда
· многие способы ионизации, такие, как ESI, APCI, FAB, CI и MALDI производят такие частицы
· многие соединения нестабильны в протонированной форме (например, углеводы) или с трудом присоединяют протон (например, углеводороды)
Катионизация (положительные ионы)
· многие соединения присоединяют катион, такой как Na+ или K+ с получением заряда
· многие способы ионизации, такие, как ESI, APCI, FAB и MALDI производят такие частицы
· опыты тандемной масс-спектрометрии на катионизированных молекулах часто дают очень ограниченную информацию по фрагментации
Депротонирование (отрицательные ионы)
· многие полезные вещества в какой-то мере являются кислотами
· многие способы ионизации, такие, как ESI, APCI, FAB и MALDI производят такие частицы
· применимо только для специфических соединений
Перенос заряженных молекул в газовую фазу (положительные и отрицательные ионы)
· полезно для соединений, которые уже заряжены
· многие способы ионизации, такие, как ESI, APCI, FAB и MALDI производят такие частицы
· применимо только для уже заряженных частиц
Отрыв электрона (положительные ионы)
· наблюдается при электронной ионизации и даёт информацию не только о молекулярной массе, но и информацию о фрагментарных ионах
· часто производит слишком сильную фрагментацию
· может быть непонятно, является ли ион с наибольшей массой молекулярным ионом или же фрагментом
Захват электрона (отрицательные ионы)
· наблюдается при электронной ионизации и даёт информацию не только о молекулярной массе, но и информацию о фрагментарных ионах
· часто производит слишком сильную фрагментацию
· может быть непонятно, является ли ион с наибольшей массой молекулярным ионом или же фрагментом
Способы ионизации Вплоть до 1980-х электронная ионизация (EI) была основным способом ионизации для анализа масс. Однако EI ограничивала химиков и биохимиков малыми молекулами, масса которых намного ниже массы большинства биоорганических соединений. Это ограничений побудило таких учёных, как Дж. Б. Фенн, К. Танака, Ф. Хилленкамп, М. Карас, Г. Кукс и М. Барбер, разработать новое поколение способов ионизации, включая бомбардировку быстрыми атомами/ионами (FAB), лазерную ионизацию при помощи матрицы (MALDI) и ионизацию электроспрея (таблица 1.2). Эти способы совершили революцию в биомолекулярном анализе, особенно для больших молекул. Среди них, ESI и MALDI стали по-настоящему «избранными», когда дело касается биомолекулярного анализа.
Таблица 1.2.
Способ ионизации
Аббревиатура
События
Ионизация электроспрея
ESI
испарение заряженных капель
Ионизация наноэлектроспрея
nanoESI
Химическая ионизация при атмосферном давлении
APCI
коронный разряд и перенос протона
Лазерная десорбция/ионизация при помощи матрицы
MALDI
поглощение фотона/перенос протона
Десорбция/ионизация на кремнии
DIOS
Бомбардировка быстрыми атомами/ионами
FAB
десорбция иона/перенос протона
Электронная ионизация
EI
пучок электронов/перенос электрона
Химическая ионизация
CI
перенос протона
MALDI и ESI сейчас являются самыми распространёнными способами ионизаций для биомолекулярной масс-спектрометрии, с их превосходными диапазонами масс и чувствительностью (рис. 1.3). Следующий раздел будет посвящён основам способов ионизации, рассматривая некоторые детали в практических аспектах их применения наряду с механизмами ионизации.
Ионизация электроспрея (ESI) Идея электроспрея, хоть и не нова, была возрождена в связи с её настоящим применением к биомолекулам. Первые эксперименты с электроспреем были проведены Чепменом в поздних 1930-х, а практическое развитие ионизации электроспрея для масс-спектрометрии было завершено Доулом в поздних 1960-х. Доул также открыл важное явление множественной зарядки молекул. Работы Фенна окончательно привели к современной технике ионизации электроспрея в масс-спектрометрии и её применению для биологических молекул.
Суть ESI заключается в следующем. Электрическое напряжение на игле приводит к большому электрическому градиенту на жидкости, который разделяет заряды на поверхности. Это вынуждает жидкость выпячиваться с иглы в форме конуса Тейлора. Верхушка конуса вытягивается в нить до тех пор, пока не достигнет предела Рэлея, при котором поверхностное натяжение и электростатическое отталкивание сравняются и сильно заряженная капля не оторвётся от нити. Капли, которые оторвались от конуса, притягиваются к входу в масс-спектрометр из-за большой разности потенциалов между иглой и входом в масс-анализатор. По мере продвижения капли к анализатору кулоновское отталкивание на поверхности превосходит поверхностное натяжение и капля «взрывается», окончательно высвобождая ионы.[3]
Ионизация электроспрея – метод, который обычно применяется для пептидов, белков, углеводов, малых олигонуклеотидов, синтетических полимеров и липидов. ESI производит газообразные заряженные молекулы прямо из жидкого раствора. Ионизация происходит при создании тонкого спрея сильно заряженных капель в присутствии электрического поля. Образец раствора распыляется из области с сильным электрическим полем на конце металлической форсунки, поддерживаемой при потенциале между 700 и 5000 В. Форсунка (или игла), к которой приложен потенциал, служит для распыления раствора в тонкий спрей заряженных капель. Использование сухого газа, нагревания или оба этих способов применяется к заряженным каплям при атмосферном давлении для испарения из них растворителя. С уменьшением размера капель возрастает плотность заряда на их поверхности. Взаимное кулоновское отталкивание между одинаковыми зарядами на этой поверхности становится настолько велико, что превосходит силы поверхностного натяжения и ионы вырываются из капли через «конус Тейлора» — рис. 1.5. Другая возможность состоит в том, что капля взорвётся, высвобождая ионы. В любом случае свободные ионы направляются в канал через электростатические «линзы», направляясь в вакуум масс-анализатора. Так как ESI включает в себя непрерывную подачу раствора, он применим для использования совместно с ВЭЖХ или капиллярным электрофорезом.[4]
Ионизация электроспрея благоприятствует образованию единично заряженных малых молекул, но также хорошо известно образование в ходе неё многократно заряженных экземпляров больших молекул. Это важное явление, т.к. масс-спектрометр измеряет отношение массы к заряду (m/z) и поэтому многократная зарядка делает возможным наблюдать очень большие молекулы при помощи инструмента с относительно малым диапазоном масс. К счастью, программы, пригодные для всех масс-спектрометров с электроспреем, позволяют произвести вычисления молекулярной массы, необходимые для определения действительной массы многозарядных образцов. Рис. 1.6 и 1.7 показывают различные заряженные состояния двух различных белков, где каждый пик в масс-спектрах может быть соотнесён с различными зарядовыми состояниями молекулярного иона. Многократная зарядка имеет другие важные преимущества в тандемной масс-спектрометрии. Одно из преимуществ состоит в том, что после фрагментации вы наблюдаете больше фрагментарных ионов от многозарядного предшественника, чем от однозарядного.
Многократная зарядка: белок с массой 10000 дальтон и его теоретический масс-спектр с зарядами до +5 показаны на рис. 1.8. Масса белка остаётся такой же в то время, как отношение m/z меняется в зависимости от числа зарядов на белке. Ионизация белка есть обычно результат протонирования, что не только добавляет заряд, но также увеличивает массу белка на число добавленных протонов. Это действие на m/zприменимо одинаково для любого механизма ионизации молекулы, образовавшего положительно или отрицательно заряженный молекулярный ион, включая присоединение или отрыв несущих заряд частиц, отличных от протона (например, Na+ и Cs+). Многократные положительные заряды наблюдаются для белков, в то время как для олигонуклеотидов типично образование отрицательных зарядов (с ESI).
Хотя масс-спектрометры электроспрея снабжены программами, которые подсчитывают молекулярный вес, понимание, как компьютер производит эти вычисления для многократно-заряженных ионов полезно. Уравнения 1.1 – 1.5 и рис. 1.9 представляют простое объяснение, где мы принимаем, что пики p1 и p2 являются соседними и различаются одним зарядом, что эквивалентно добавлению одного протона.
p = m/z
p1 = (Mr + z1)/z1
p2 = {Mr + (z1 — 1)}/(z1 — 1)
(1.1)
(1.2)
(1.3)
p – пик в масс-спектре
m – общая масса иона
z – полный заряд
Mr – средняя масса белка
p1 – значение m/z для p1
p2 – значение m/z для p2
z1 – заряд для пика p1
Уравнения 1.2. и 1.3. могут быть решены для двух неизвестных, Mr и z1.
Для пиков в масс-спектре миоглобина, показанном на рис. 1.9, p1=1542, p2=1696.
1542 z1 = Mr + z1
1696 (z1 — 1) = Mr + (z1 — 1)
Решив два уравнения, находим: Mr = 16,951 Da
для z1 = 11
(1.4)
(1.5)
Растворители для электроспрея Многие растворители могут быть использованы в ESI и выбираются в зависимости от растворимости исследуемых соединений, летучести растворителя и способности растворителя к отдаче протона. Обычно, основными являются протонные растворители, такие, как, метанол, 50/50 метанол/вода или 50/50 ацетонитрил/вода, в то время как апротонные сорастоврители, такие, как 10% ДМСО в воде, а также изопропиловый спирт, используются, чтобы улучшить растворимость для некоторых соединений. Хотя 100% вода и используется в ESI, её относительно низкое давление пара является определяющим фактором чувствительности; лучшая чувствительность получается при добавлении летучего органического растворителя. Некоторые соединения требуют использования чистого хлороформа с добавлением 0.1% муравьиной кислоты для обеспечения ионизации. Такой подход, хоть и менее чувствительный, может быть эффективен для соединений, не растворимых другим образом.[5]
Буферы, такие, как Na+, K+, фосфат и соли представляют проблему для ESI из-за снижения давления пара капель, ведущего к ослаблению сигнала из-за увеличения поверхностного натяжения капель, ведущего к уменьшению летучести. Поэтому летучие буферы, такие, как ацетат аммония, могут быть использованы более эффективно.[6]
Таблица 1.3. Преимущества и недостатки ионизации электроспрея (ESI)
Преимущества
Недостатки
§ практический диапазон масс до 70000 дальтон
§ хорошая чувствительность от фемтомоль до нескольких пикомоль обычно
§ самый мягкий метод ионизации, способный генерировать нековалентные комплексы в газовой фазе
§ легко адаптируется к жидкостной хроматографии
§ легко адаптируется к тандемным масс-анализаторам, таким, как ионные ловушки и тройные квадрупольные инструменты
§ многократная зарядка позволяет производить анализ ионов с высокой массой на приборах с относительно низким m/z диапазоном.
§ нет помех от матрицы
§ присутствие солей и веществ, образующих ионные пары, как, например, ТФА может уменьшить чувствительность
§ сложные смеси могут уменьшить чувствительность
§ одновременный анализ смеси может быть неудовлетворительным
§ многократная зарядка может быть запутанной, особенно при анализе смесей
§ важна чистота образца
§ перенос от образца к образцу
Устройство прибора ионизации электроспрея Неосевая конфигурация ESI, которая сейчас используется во многих приборах для введения ионов в анализатор (как показано на рис. 1.10), показала себя очень эффективной при использовании с большим потоком жидкости. Основное преимущество такой конфигурации состоит в том, что скорость потока может быть увеличена без засорения или закупоривания входного отверстия. Неосевое распыление важно, потому что вход в анализатор более не насыщается растворителем, тем самым предохраняя капли от попадания во входное отверстие и его загрязнения. Наоборот, только ионы направляются ко входу. Это делает ESI ещё более совместимым с ЖХ при скоростях до мл/мин.
Ионизация наноэлектроспрея (nanoESI) продолжение
--PAGE_BREAK--
Электроспрей низкого потока, впервые описанный Вильмом и Манном, называли наноэлектроспреем, наноспреем и микроэлектроспреем. Такой способ ионизации является вариацией ESI, в которой игла спрея сделана очень
маленькой и расположена близко ко входу в масс-анализатор (рис. 1.11). Конечным результатом такой простой корректировки становится увеличение эффективности, которое включает уменьшение необходимого количества образца.
Скорости потока для nanoESI обычно составляют ль десятков до сотен нанолитров в минуту. Чтобы получить такие малые скорости потока, nanoESI использует источники из вытянутого и, в некоторых случаях, металлизированного стекла или плавленого кварца с малым входным отверстием (~ 5 мкм). Растворённый образец вносится в источник и к его концу прикладывается давление порядка 2 атм. Вытекание образца с очень малой скоростью позволяет достигать высокой чувствительности. Также, источники расположены очень близко ко входу в масс-анализатор, поэтому перенос ионов в масс-анализатор намного более эффективен. Например, анализ 5 mM раствора пептида при помощи nanoESI займёт одну минуту, употребив ~50 фемтомоль образца. Такой же эксперимент с обычным ESI за то же время израсходует 5 пикомоль, т.е. в 100 раз больше, чем nanoESI. К тому же, так как капли для nanoESI обычно меньше, чем для обычного ESI (рис. 1.11.), необходимое для образования ионов испарение намного меньше. Следовательно, nanoESI менее чувствительно к солям и другим примесям, т.к. меньшее испарение означает, что примеси не будут концентрироваться так сильно, как при ESI.[7]
Химическая ионизация при атмосферном давлении (APCI)
APCI также стала важным способом ионизации, потому что она генерирует ионы непосредственно из раствора и способна к анализу относительно неполярных соединений. Так же, как и в электроспрее, поток жидкости для APCI (рис. 1.12) вытекает непосредственно в устройство ионизации.
Однако сходство здесь заканчивается. Капли не заряжаются и APCI устройство содержите нагретый испаритель, который обеспечивает быстрое разделение/испарение капель. Молекулы образца в паре проходят через зону ионно-молекулярной реакции при атмосферном давлении.
В APCI ионизация возникает из-за возбуждения/ионизации растворителя коронным разрядом. Т.к. ионы растворителя существуют при атмосферном давлении, химическая ионизация молекул аналита очень эффективна; при атмосферном давлении молекулы аналита сталкиваются с ионами реагента очень часто. Перенос протона (для реакций протонирования MH+) образует положительные ионы, а перенос электрона или отщепление протона ([M-H]-) даёт отрицательные. Сглаживающее влияние сольватных оболочек на ионах реагента и высокое давление газа уменьшают фрагментацию во время ионизации и ведут к образованию практически только нетронутых молекулярных ионов. Многократная зарядка обычно не наблюдается, скорее всего, потому что процесс ионизации более энергичен, чем при ESI.[8]
Фотоионизация при атмосферном давлении (APPI)
Фотоионизация при атмосферном давлении (APPI) стала сейчас важным способом ионизации, потому что она генерирует ионы непосредственно из раствора с относительно малым фоновым сигналом и способна к анализу относительно неполярных соединений. Так же, как и APCI, поток жидкости для APPI (рис. 1.13) вводится прямо в устройство ионизации.
Основное различие между APCI и APPI состоит в том, что в APPI парообразный образец проходит через ультрафиолетовый свет (обычная криптоновая лампа испускает от 10.0 эВ до 10.6 эВ). Часто APPI является намного более чувствительным, нежели ESI или APCI и показывает более высокое соотношение сигнал/шум из-за более низкой ионизации фона. Низкий сигнал фона во многом обусловлен высоким потенциалом ионизации стандартных растворителей, таких, как метанол и вода (10.85 и 12.62 эВ, соответственно), которые не ионизируются криптоновой лампой.
Недостатком ESI и APCI является то, что они образуют фоновые ионы растворителей. В дополнение к этому, ESI особенно подвержен эффектам подавления ионов, а APCI требует испарения при температурах 350-500°C, что может вызвать термическое разложение.
APPI производит ионизацию двумя механизмами. Первый – простое фотовозбуждение, инициирующее испускание электрона с образованием молекулярного катион-радикала (M+). APPI устройство воздействует светом с энергией выше, чем потенциалы ионизации (ИП) большинства целевых молекул, но ниже, чем ИП для большинства молекул растворителей и воздуха, тем самым исключая их как помехи. К тому же, из-за малой избыточной энергии, сообщаемой молекулам, достигается минимальная фрагментация.
Второй механизм – фотоиндуцированная химическая ионизация при атмосферном давлении, которая похожа на APCI в том, что она включает перенос заряда при протонировании (MH+) или потере протона ([M-H]-).
Для инициирования химической ионизации фотоионизирующийся реагент добавляется к элюенту. После фотоионизации реагента происходит перенос заряда на аналит. Типичными реагентами для положительной ионизации являются ацетон и толуол. Ацетон также служит реагентом для отрицательной ионизации.
Механизм ионизации (M+ или [M+H]+), который претерпевает молекула, зависит от сродства к протону аналита, растворителя и типа используемого дополнительного реагента.[9]
Лазерная десорбция/ионизация при помощи матрицы (MALDI) Масс-спектрометрия с лазерной десорбцией/ионизацией при помощи матрицы (MALDI-MS) впервые была использована в 1988 году Танакой, Карасом и Хилленкампом. С тех пор он стал широко распространённым методом для пептидов, белков и большинства других биомолоекул (олигонуклеотидов, углеводов, природных веществ и липидов). Эффективный и направленный перенос энергии во время акта индуцированной лазером десорбции при помощи матрицы приводит к большому выходу ионов незатронутого аналита и позволяет проводить измерения соединений с субпикомолярной чувствительностью. Вдобавок, удобство MALDI для анализа гетерогенных образцов делает его очень привлекательным для масс-анализа сложных биологических образцов, как, например, гидролизат белков.
Хотя точный механизм десорбции/ионизации для MALDI неизвестен, принято считать, что MALDI вызывает ионизацию и перевод образца из конденсированной фазы в газовую посредством лазерного возбуждения и индивидуализации молекул образца из матрицы (рис. 1.14). В MALDI анализе аналит сначала сокристаллизуется с большим молярным избытком матричного соединения, обычно УФ-поглощающей слабой органической кислотой. Облучение такой смеси аналита с матрицей лазером приводит к испарению матрицы, которая несёт аналит в себе. Матрица играет ключевую роль в этом методе. Сокристаллизованные молекулы образца также испаряются, но без прямого поглощения энергии лазера. Молекулы, чувствительные к лазерному излучению, поэтому защищены от прямого возбуждения УФ-лазером.
Матрица MALDI– нелетучий твёрдый материал, обеспечивающий процессы десорбции и ионизации посредством поглощения лазерного излучения. Как результат, и матрица, и любой образец, встроенный в неё, испаряются. Матрица также служит для того, чтобы минимизировать ущерб образцу от лазерного излучения, поглощая большую часть падающей энергии.
Оказавшись в газовой фазе, десорбированные заряженные молекулы затем электростатически направляются из MALDI устройства ионизации в масс-анализатор. Времяпролётные (TOF) масс-анализаторы часто используются для разделения ионов по отношению массы к заряду (m/z). Импульсная природа MALDI очень удобна для TOF анализаторов, т.к. начальный момент времени можно засекать как момент лазерного импульса.
Было разработано несколько теорий для объяснения десорбции посредством MALDI. Модель термических пиков предполагает, что выброс неповреждённых молекул обусловлен слабым колебательным взаимодействием между матрицей и аналитом, что минимизирует перенос колебательной энергии от матрицы к модам молекул аналита, тем самым минимизируя фрагментацию. Теория импульсного давления предполагает, что создаётся градиент давления, перпендикулярный поверхности, и десорбция больших молекул вызвана передачей импульса при их столкновениях с быстро движущимися молекулами матрицы. Обычно считается, что ионизация происходит посредством передачи протона или катионизации во время процесса десорбции.
Полезность MALDI для анализа биомолекул основана на её способности давать информацию о молекулярном весе неповреждённых молекул. Способность давать точную информацию может быть чрезвычайно важна для определения и характеристики белков. Например, белок часто может быть однозначно определён точным анализом масс составляющих его пептидов (полученных химическим или же ферментативным воздействием на образец).[4]
Таблица 1.4. Преимущества и недостатки метода лазернойдесорбции/ионизации при помощи матрицы (MALDI). Преимущества
Недостатки
§ практический диапазон масс до 300000 Da. Экземпляры со значительно большей массой наблюдались при помощи детектора высокого тока;
§ обычная чувствительность порядка нескольких фемтомоль или даже пикомоля. Возможна чувствительность до аттомоля;
§ мягкая ионизация с малой фрагментацией;
§ нечувствителен к солям в концентрациях до миллимолярных;
§ удобен для анализа сложных смесей
§ фон матрицы, который может быть проблемой для соединений с массой ниже 700 дальтон. Помехи этого фона сильно зависят от материала матрицы;
§ возможно фоторазложение при лазерной десорбции/ионизации;
§ кислотные матрицы, используемые в MALDI могут вызывать разложение некоторых соединений
Приготовление образца и матрицы оказывает значительное влияние на качество масс-спектров MALDI белков и пептидов (рис. 1.15). Среди большого разнообразия известных методов приготовления наиболее часто употребляемым является метод высушенной капли. В этом случае насыщенный раствор матрицы смешивается с раствором аналита так, чтобы соотношение матрицы к аналиту было около 5000:1. Аликвота (0.5-2.0 мкл) такой смеси затем помещается на место образца, где затем высушивается. Ниже приведена методика такого приготовления:
· отобрать пипеткой 0.5 мкл образца на подложку;
· отобрать пипеткой 0.5 мкл матрицы на подложку;
· перемешать образец и матрицу втягиванием их в пипетку и выпусканием;
· позволить высохнуть на воздухе.
§ Для пептидов, небольших белков и большинства других соединений: насыщенный раствор α-циано-4-гидроксикоричной кислоты в 50:50 ацетонитрил: вода с 0.1% ТФА.
§ Для белков и других тяжёлых молекул: насыщенный раствор синапиновой кислоты в 50:50 ацетонитрил: вода с добавлением 0.1% ТФА.
§ Для гликопептидов/белков и маленьких соединений: насыщенный раствор 2,5-дигидроксибензойной кислоты (DHB) в 50:50 ацетонитрил: вода.
Рис. 1.15. Обычно используемые в MALDI матрицы и подложка для MALDI с показанным расположением матрицы. Одним из преимуществ MALDI является то, что множество образцов может быть подготовлено в одно и то же время, как видно по этой многообразцовой подложке.
Также образцы могут быть приготовлены последовательным способом. В тонкослойном методе сначала на цель наносится гомогенная «плёнка» матрицы, а затем туда добавляется образец, который абсорбируется ей. Этот метод даёт хорошую чувствительность, разрешающую способность и точность определения. Аналогично, в толстослойном методе нитроцеллюлоза (NC) используется как добавка к матрице. После образования единого слоя NC-матрица на цели добавляется образец. Этот метод приготовления предотвращает образования щелочных аддуктов и значительно увеличивает чувствительность определения, особенно для пептидов и белков, экстрагированных из гелей. Сэндвичевый метод – другой вариант в этой категории. Тонкий слой кристаллов матрицы приготовляется как в тонкослойном методе, затем последовательно добавляются капли (a) водного 0.1% ТФА, (b) образца и (c) матрицы.
Десорбция/ионизация на кремнии (DIOS) DIOS – свободный от матрицы метод, который использует импульсную десорбцию/ионизацию на кремнии (рис. 1.16). Поверхности структурированного кремния, такого, как пористый кремний или кремниевое нановолокно являются УФ-поглощающими полупроводниками с большой площадью поверхности (сотни м2/см3). При применения в масс-спектрометрии с лазерной десорбцией/ионизацией, строение структурированного кремния обеспечивает каркас для накопления молекул растворителя и аналита, а поглощение УФ даёт механизм для передачи энергии лазера аналиту. Такая удачная комбинация свойств позволяет DIOS быть применимым для большого разнообразия биомолекул, включая пептиды, углеводы и небольшие органические соединения различных типов. В отличие от других прямых безматричных методов десорбции DIOS позволяет проводить десорбцию/ионизацию с малым разложением аналита или вообще без него.
DIOS сильно связан с MALDI. Оборудование для DIOS-MS требует только незначительной настройки для использования в MALDI; чип просто закрепляется на обработанной MALDI-подложке и вставляется в масс-спектрометр. Та же длина волны лазера (337 НМ), обычно применяемая в MALDI, подходит и для DIOS. Хотя DIOS сравним с MALDI в отношении чувствительности, у него есть несколько преимуществ из-за отсутствия мешающей матрицы: низкий фон на малых диапазонах массы, такое же размещение водных образцов, упрощённая подготовка образцов. Вдобавок, компоновка в чипах легко адаптируется к автоматической подготовке образца, при которой лазер быстро обрабатывает чип, переходя от одного участка к другому. DIOS может, таким образом, ускорить и упростить крупные анализы соединений с низкой молекулярной массой, так же, как MALDI для макромолекул. Так как массы многих низкомолекулярных соединений могут быть легко измерены, DIOS-MS применим для анализа превращений малых молекул, как ферментативных, так и химических. [3]
Бомбардировка быстрыми атомами/ионами (FAB)
Бомбардировка быстрыми атомами/ионами, или FAB – метод ионизации, схожий с MALDI, так как в нём используется матрица и пучок высокоэнергетических частиц для десорбции ионов с поверхности. Важно, однако, обозначить различия между MALDI и FAB. В MALDI, энергетический пучок представляет собой импульсный лазерный свет, в то время как FAB использует непрерывный пучок ионов. В MALDI матрица обычно твёрдая кристаллическая, а в FAB обычно использует жидкую матрицу. Также нужно отметить, что FAB примерно в 1000 раз менее чувствителен, нежели MALDI.
Бомбардировка быстрыми атомами – мягкий способ ионизации, который требует прямого введения зонда для подачи образца и пучок нейтральных атомов Xe или ионов Cs+ для распыления образца и матрицы с поверхности зонда для подачи. Обычно в FAB спектре обнаруживаются ионы матрицы, наряду с протонированными или катионизированными (например, M+Na+) молекулярными ионами аналита.
продолжение
--PAGE_BREAK--
продолжение
--PAGE_BREAK--Разрешение = M/ΔM (2.1)
где M соответствует m/z, а ΔM является шириной на половине максимума (FWHM или «полушириной»).
Пример измерения разрешения показан на рис. 2.2, где пик имеет m/z 500 и полуширину 1. Получается разрешение M/ΔM = 500/1 = 500.
Разрешающая сила анализатора, в некоторой степени, определяет точность конкретного прибора, как показано на рис. 2.2. Средняя масса молекулы высчитывается с использованием эффективной массы всех изотопов каждого составляющего молекулу элемента. Моноизотопная масса рассчитывается с использованием массы изотопа элемента, имеющего наибольшую распространённость, для каждого из составляющих элементов. Если прибор не разрешает изотопы, он будет давать широкий пик, центр которого соответствует средней массе. Более высокое разрешение может даже разделить индивидуальные изотопы или же сузить пики, позволяя более точно определить их положение.
Диапазон масс Это диапазон m/z анализатора масс. Например, квадрупольные анализаторы обычно определяют m/zдо 3000. Анализатор магнитного сектора обычно определяет m/z до 10000, а времяпролётные анализаторы имеют практически неограниченный диапазон масс.
Тандемный анализ масс (MS/MS или MSn) Это способность анализатора разделять различные молекулярные ионы, генерировать фрагментарные ионы от выбранного и измерять массы фрагментированных ионов. Фрагментированные ионы обычно используются для определения структуры исходных молекулярных ионов.
Обычно тандемная масс-спектрометрия проводится столкновением выбранного иона с молекулами инертного газа, такого как аргон или гелий, и последующим анализом образовавшихся фрагментов. Тандемный анализ масс используется для определения последовательности пептидов, структурных характеристик углеводов, малых олигонуклеотидов и липидов.
Термин «тандемный» анализ масс применяется для событий, последовательных в пространстве или во времени. Тандемный анализ масс в пространстве проводится последовательно расположенными анализаторами, тогда как тандемный во времени анализ масс осуществляется в одном и том же анализаторе, который отделяет нужный ион, фрагментирует его и анализирует фрагментарные ионы. Характеристики тандемного анализа для различных анализаторов приведены в таблице 2.2.
Скорость сканирования Эта характеристика показывает скорость, с которой анализатор сканирует конкретный диапазон масс. Большинству приборов необходимо несколько секунд для полного сканирования, однако это время может сильно разниться в зависимости от анализатора. Времяпролётные анализаторы, например, совершают анализ в миллисекунды и даже быстрее. [12]
Конкретные виды анализаторов Как известно, ESI и MALDI, например, генерируют ионы довольно различными способами. ESI Создаёт ионы в непрерывном потоке заряженных капель при атмосферном давлении, и ионы также создаются непрерывным потоком, по этим причинам квадрупольные анализаторы являются наиболее подходящими для ESI, так как они оба устойчивы к довольно высоким давлениям (~10-5 Торр) а и способны к непрерывному сканированию потока ионов из ESI. MALDI, с другой стороны, образует ионы посредством коротких, наносекундных, импульсов и хорошо совместимо с времяпролётным анализатором, который измеряет точно синхронизированные пакеты ионов, такие, как, например, полученные при помощи лазерного импульса.
Квадрупольный анализатор
Квадрупольный анализатор масс (рис. 2.3) используется с EI-устройствами с 1950-х и до сих пор является самым распространённым анализатором. Интересно, что квадрупольные анализаторы оказались очень удобными для совмещения с ESI и APCI. Квадруполи имеют три основных достоинства. Они устойчивы к относительно высоким давлениям.
Во-вторых, квадруполи имеют значительный диапазон масс – они способны к анализу до m/z порядка 4000, что удобно, так как ионизация электроспрея белков и других биомолекул обычно дают такое распределение заряда, что m/z лежит в пределах от 1000 до 3500. Наконец, квадрупольные масс-спектрометры являются относительно дешёвыми приборами. Учитывая взаимно дополняющие особенности ESI и квадруполей, неудивительно, что первый успешный коммерческий прибор электроспрея был оснащён квадрупольным анализатором масс.
Квадрупольные анализаторы параллельно соединены с радиочастотным (RF) генератором и постоянной разностью потенциалов (DC). При определённой частоте RF, только ионы с соответствующим m/z могут пройти через квадруполь, как показано на рис. 2.3, где только ионы с m/z 100 детектируются. Во всех трёх случаях на рис. 2.3 DC и RF поля одинаковы. Поэтому сканированием RF поля может быть анализирован широкий m/z — диапазон (обычно от 100 до 4000) приблизительно за одну секунду.
Для проведения тандемного анализа масс с квадрупольным прибором,
необходимо разместить три квадруполя в ряд. Каждый квадруполь иг
рает отдельную роль: первый квадруполь (Q1) используется для сканирова
ния определённого m/z диапазона и выбора нужного иона; второй квадруполь
(Q2), также известный как ячейка столкновения, фокусирует и пропускает
ионы через подаваемый на путь пролёта вспомогательный газ (аргон или ге
лий); третий квадруполь (Q3) служит для анализа фрагментарных ионов, ге
нерированных в ячейке столкновения (Q2) (рис. 2.4). Последовательная схе
ма вызванной столк
новением ионизации (CID) показана на схеме 2.1.
Квадрупольная ионная ловушка Анализатор ионной ловушки показан на рис. 2.5 (реальным размером примерно с теннисный мяч) был придуман в то же время, что и квадрупольный анализатор масс, тем же человеком, Вольфгангом Паулом. Кстати, физика в основе обоих этих анализаторов сходна. Однако в ионной ловушке, вместо того, чтобы проходить через квадрупольный анализатор с наложенным радиочастотным полем, ионы ловятся в такое квадрупольное поле. Один из методов использования ионной ловушки для масс-спектрометрии включает в себя генерацию ионов непосредственно внутри при помощи EI, с последующим анализом масс. Другой, более популярный, метод использования ионной ловушки для масс-спектрометрии включает в себя генерацию ионов во внешнем устройстве при помощи ESI или MALDI и использование ионной оптики для введения образца в объём ловушки. Квадрупольная ионная ловушка обычно состоит из кольцевого электрода и двух гиперболических закрывающих электродов (рис. 2.5). Движение ионов, вызванное электрическим полем этих электродов, позволяет поймать или выпустить ионы из ловушки. В нормальном состоянии, радиочастота сканируется, чтобы резонансно возбудить и, вследствие этого, выпустить ионы через маленькие отверстия в «крышках» детектора. По мере того, как сканирование RF достигает более высоких частот, ионы с более высоким m/z возбуждаются, выпускаются и детектируются.
Очень полезной особенностью ионных ловушек является то, что они способны изолировать один вид ионов, выпустив все остальные из ловушки. Изолированные ионы могут быть, затем фрагментированы посредством столкновений, а фрагменты проанализированы. Основное преимущество квадрупольных ионных ловушек – то, что эксперимент с диссоциацией, вызванной многократными столкновениями, может быть проведён быстро без использования дополнительных анализаторов, так, что LC-MS/MS в реальном времени сейчас является обычным делом. Другими важными преимуществами квадрупольных ионных ловушек являются малые размеры и их способность ловить и накапливать ионы для обеспечения лучшего ионного сигнала. Квадрупольные ионные ловушки были приспособлены для ряда различных целей: от EI-MSn (рис. 2.5) биомолекул до их более современных совмещений с MALDI. MSn позволяет многократным MS/MS экспериментам проводиться с последовательными фрагментарными ионами, давая дополнительную фрагментарную информацию. Но главнейшим применением ионных ловушек является определение белков. LC-MS/MS эксперименты проводятся для белковых гидролизатов, давая информацию одновременно по MS и MS/MS. Эта информация позволяет идентифицировать белки и характеризовать пост-трансляционную модификацию. Диапазон масс (~4000 m/z) коммерческих LC-ловушек хорошо соответствует значениям m/z, генерируемым ионизацией электроспрея пептидов, а разрешение позволяет идентифицировать зарядное состояние многозарядных ионов пептидов. Масс-спектрометры квадрупольной ионной ловушки могут анализировать пептиды из трипсинового гидролизата при их содержании порядка 20-100 фмоль. Другим ценным качеством техники ионной ловушки для анализа пептидов является её способность проводить несколько стадий масс-спектрометрии, которые значительно увеличивают количество структурной информации. [13]
Линейная ионная ловушка
Линейная ионная ловушка отличается от трёхмерной (рис. 2.6) тем, что она запирает ионы вдоль оси квадрупольного анализатора масс, используя двумерное (2D) радиочастотное (RF) поле с потенциалами, приложенными к концевым электродам. Основное преимущество линейной ловушки перед 3D – больший объём анализатора, который сам по себе значительно увеличивает динамический диапазон и улучшает диапазон количественного анализа.
Ограничения ионной ловушки: сканирование иона-предшественника, «правило одной трети» и динамический диапазон. Главными ограничениями данных возможностей ионной ловушки, которые удерживают её от того, чтобы быть совершенным средством для фармакокинетики и протеомики, являются следующие: 1) способность давать высокую чувствительность одновременно для тройного квадрупольного сканирования иона-предшественника, и для экспериментов со средним затуханием невозможна для ионных ловушек. 2) Верхний предел соотношения между m/z предшественника и самого мелкого пойманного фрагмента составляет приблизительно 0.3 (также известно как «правило одной трети»). Иллюстрацией правила одной трети является то, что фрагментарные ионы от m/z 900 не будут детектироваться при m/z меньше 300, накладывая значительные ограничения на очередное секвенирование пептидов. 3) Динамический диапазон ионных ловушек ограничен тем, что при слишком большом числе ионов внутри ловушки пространственные влияние зарядов ограничит представительность анализатора. Чтобы обойти это, автоматические сканеры быстро пересчитывают ионы перед тем, как те попадут в ловушку, тем самым ограничивая число вошедших ионов. Но такой подход составляет проблему, если нужный ион сопровождается большим фоном других ионов. Двуфокусирующий магнитный сектор Первые анализаторы масс разделяли ионы при помощи магнитного поля. В магнитом анализе ионы ускоряются в магнитном поле при помощи электрического. Заряженные частицы, движущиеся в магнитно поле, будут двигаться по дуге, радиус которой зависит от скорости ион, силы магнитного поля и m/z иона. Масс-спектр получается сканированием магнитного поля и наблюдением того, как ионы попадают фиксированный точечный детектор. Ограничением магнитных анализаторов является относительно малое разрешение. Чтобы улучшить его, магнитные приборы были модифицированы с добавлением электростатического анализатора, чтобы сфокусировать ионы. Такие приборы называются двухсекторными. Электрический сектор служит как элемент фокусировки кинетической энергии, позволяя только ионам с определённой кинетической энергией проходить через поле, независимо от их m/z отношения. То есть, добавление электрического сектора позволяет только ионам с одинаковой энергией достигать детектора, тем самым уменьшая разброс кинетической энергии, что, в свою очередь, увеличивает разрешение. Нужно отметить, что увеличение разрешения вызывает соответствующее уменьшение чувствительности. Такие двуфокусирующие (рис. 2.7) анализаторы масс используются совместно с ESI, FAB и EI, однако они нешироко используются сейчас, в основном, из-за их больших размеров и успешности времяпролётных, квадрупольных и FTMS анализаторов с ESI и
MALDI. [14]
Квадрупольная-времяпролётная тандемная масс-спектрометрия Линейный времяпролётный (TOF) анализатор масс (рис. 2.7) является простейшим анализатором масс. Он пережил возрождение с изобретением MALDI и его текущее применения для электроспрея и даже газовой хроматографии с масс-спектрометрией электронной ионизацией (GC/MS). Времяпролётный анализ основан на ускорении группы ионов по направлению к детектору, при котором всем ионам сообщается одинаковая энергия при помощи ускоряющего потенциала. Так как ионы имеют одинаковую энергию, но разную массу, лёгкие ионы достигают детектора первыми из-за их большей скорости, в то время как тяжёлые ионы летят дольше из-за их большей массы и, соответственно, более низкой скорости. Поэтому анализатор был назван времяпролётным, потому что масса в нём определяется по времени прибытия ионов. Масса, заряд и кинетическая энергия – всё это вносит свой в клад в время прибытия иона к детектору. Так как кинетическая энергия (KE) иона равна ½ mv2, скорость иона может быть представлена как v = d/t = (2KE/m) ½. Ионы проходят расстояние d за время t, а t зависит от m/z. В этом уравнении v = d/t = (2KE/m) ½, принимая z = 1. Другим представлением этого уравнения, более чётко показывающим, как определяется масса, является m=2t2 KE/d2, где KE=const.
Времяпролётный рефлектрон (рис. 2.8) сейчас широко используется для ESI, MALDI, а в последнее время и для приложения электронной ионизации для ГХ/МС. Он комбинирует времяпролётную технологию и электростатическое зеркало. Рефлектрон служит для увеличения времени (t), которое нужно ионам, чтобы достичь детектора, при этом уменьшая распределение кинетической энергии, тем самым уменьшая временное распределение Δt. Так как разрешение определяется как масса пика, делённая на его ширину или m/Δm (или t/Δt, так как m пропорциональна t), увеличение t и уменьшение Δt приводит к росту разрешения. Поэтому TOF рефлектрон даёт более высокое разрешение по сравнению с простым прибором TOF посредством увеличения длины пути и фокусировки энергии посредством рефлектрона. Нужно отметить, что увеличенное разрешение (обычно выше 5000) и чувствительность на TOF рефлектроне значительно уменьшается при высоких массах (обычно при m/z свыше 5000).
Другим типом тандемного анализа масс, MS/MS, является также возможное комбинирование MALDI и TOF рефлектрона. MS/MS осуществляется с особенности MALDI – фрагментации, которая происходит после ионизации, или распадом после источника (PSD). Времяпролётные приборы сами по себе не разделяют пост-ионизационные фрагментарные ионы от одного и того же иона-прекурсора, потому что и прекурсор, и фрагментарные ионы имеют одинаковую скорость и поэтому достигают детектора в одно и то же время. Рефлектрон даёт преимущество в том, что фрагментарные ионы имеют разную кинетические энергии и разделяются на основании того, как глубоко ионы проникают в поле рефлектрона, тем самым давая спектр фрагментарных ионов (рис. 2.9 и 2.10).
продолжение
--PAGE_BREAK--
продолжение
--PAGE_BREAK--