Аллергические заболевания органов дыхания у детей Полиморфизмы генов NO-синтаз и их ассоциация с бронхиальной астмой и патогенетическими признаками болезни у детей Главными патогенетическими признаками бронхиальной астмы БА считают атопию и состояние бронхиальной гиперреактивности. Оксид азота играет важную роль в развитии БА, поскольку он, являясь сигнальной молекулой, участвует
в механизмах формирования как атопии, так и гиперреактивности бронхов Barnes P.J 1998 Lundberg J.O.N Weitzberg E 1996. Синтез NO осуществляется семейством NO-синтаз КФ 1.14.13.39 нейро-нальной NOS-I, эндотелиальной NOS-III и индуцибельной NOS-II. Все они являются продуктами различных генов, расположенных на разных хромосомах
GINА, 2002. I Grasemann H. et all 1999. Существуют исследования, показывающие связь полиморфных вариантов генов NO-синтаз с уровнем вырабатываемого эндогенного оксида азота, что в свою очередь зависит от активности мРНК генов NO-синтаз. Учитывая вышесказанное, можно ожидать значительный вклад полиморфизмов промоторной области генов NO-синтаз как факторов риска в развитие заболеваний, при которых отмечается
нарушение нормальной выработки NO, в частности при БА. Цель данного исследования - изучение ассоциации полиморфизмов промоторной области генов NO-синтаз у детей, больных БА, с клиническими и функциональными характеристиками болезни. Нами обследовано 88 детей в возрасте от 7 до 13 лет мальчиков, девочек, больных БА, находившихся на лечении в отделении аллергологии
Областной детской больницы в 2002-2003гг. Средний возраст больных составил 10,51,8 лет. Диагноз БА верифицировался в соответствии с положениями Национальной программы Бронхиальная астма у детей. Критерии лечения и профилактика. Средняя продолжительность заболевания к моменту обследования составила 3,30,5 года. Контрольную группу составили 26 практически здоровых детей того же возраста, проживающих в г.
Томске. Для оценки функции внешнего дыхания ФВД проводили анализ кривой поток-объем и показателей спирометрии. Исследование ФВД выполняли по стандартной методике на аппарате Master Lab Pro Эрих Йегер, Германия. Степень реактивности дыхательных путей оценивали в мета-холиновом тесте РС20. Измерение уровня общего сывороточного IgE было проведено с использованием твердофазного иммуноферментного анализа с использованием стандартного набора
Вектор Бест, г.Новосибирск. Выделение геномной ДНК из венозной крови обследуемых проводили методом фенол-хлороформной экстракции. Полиморфизм генов NO-синтаз в промоторной области определяли по следующей методике. Состав реакционной смеси 50 мкл 67 мМ трис-НС1, рН 8,8 16,7мМ сульфат аммония 1,5 мМ хлорид магния по 0,2 мМ каждого dNTP 0,1 твин-20 50-100 нг геномной ДНК человека 2 ед. tag-полимеразы, по 5 пикомоль каждого из прай-меров, специфичных для
NOS-I, NOS-II, NOS-II1 NOS-I sense primer-5-TTCGGCTGTGCTTTGATGGA-3 NOS-I anti-sense primer-5-GTTGACCGACTGGATTTAGGGCTCT-3 NOS-II sense primer-5-GCCTTCTGGAACCTGGGATTT-3 и NOS-II anti-sense primer-5-TTCGACTCGCTACAAAGTTAT-3 NOS-III sense primer-5-GCCAAGGGCACCGGCATCACCAGGA-3 NOS-
III anti-sense primer-5-GTTACCAGCACCAGCGTCTCGT-3 Условия проведения полимеразной цепной реакции ПЦР преднагрев 95 С -5 мин. основная программа - 38 циклов 95 С- 15 с денатурация 55 С - 15 с отжиг 72 С-40 с синтез 2-й цепи заключительная стадия 72 С - 1мин. Термоциклер - Терцик ДНК-Технология, г.Москва. В результате ПЦР получали фрагменты ДНК длиной 656, 500, 260 пар нуклеотидов соответственно для
NOS-I, NOS-II, NOS-III. Для выявления полиморфизмов использовали анализ конформационного полиморфизма одноцепочечных фрагментов ДНК SSCP, single-strand conformational polymorphysm. Тотальную РНК выделяли с помощью коммерческого набора TRIZOL GibcoBRL, Life Technologies. ПолиА-PHK получали на колонках с олиго-dTцеллюлозой ICN, США и проводили обратную транскрипцию в течение 1 ч при 37
С. кДНК амплифицировали с праймерами, специфичными для мРНК NOS-I, NOS-II, NOS-III, синтезированными на ДНК-синтезаторе ASM 800 мРНК NOS-I sense-5-ATGGCTTGCCCCTGGAAGTT-3 мРНК NOS-I anti sense-5-GCCACAACAGTGGCAACAT-3 мРНК NOS-II sense-5-AGTTTGACCAGAGGACCCAG-3 мРНК NOS-II anti sense-5-CGAGGAGGCTGCCCTGCAGA-3 мРНК NOS-
III sense-5-GTTGATGCGGAGGGAACCGA-3 мРНК NOS-III anti sense-5-GAACTGGAAGTAACGTGCCG -3 Глицеральдегид 3-фосфат дегидрагепаза ГАФД использована как положительный контроль экспрессии мРНК. Показатели экспрессии выражали в процентах относительно активности ГАФД, которая принималась за 100. ГАФД Sense primer - 5-GAAGCTCACTGGCATGGCCTTCC-3 Anti-sense primer - 5-CATGTGGGCCATGAGGTCCA-3.
Оценку специфичности продуктов амплификации проводили с помощью nested-ПЦР. Оценку нормальности распределения полученных результатов по каждой величине проводили с помощью критерия Колмагорова-Смирнова. Статистическую обработку результатов для признаков с нормальным распределением проводили с использованием t-критерия Стьюдента, для признаков, не соответствующих нормальному закону распределения, применяли U-mecma Манна-Уитии. Корреляционный анализ проводили с использованием критерия
Пирсона. Сравнение распределения частот паттернов в группах обследованных проводили с использованием точечного критерия Фишера. Относительный риск RR-Relative Risk вычисляли по формуле RRa0,5.d0,5b0,5Hc0,5 где а - число больных с наличием данного паттерна b - с отсутствием данного паттерна cud- число здоровых, с наличием и отсутствием данного паттерна соответственно параметр 0,5 в этой формуле используется как поправка на малочисленность выборки.
При оценке результатов было принято, что RR 1 рассматривали как положительную ассоциацию заболевания с данным полиморфным вариантом фактор риска, a RR 1 как отрицательную ассоциацию фактор устойчивости. Результаты При изучении уровня экспрессии NO-синтаз у детей, больных БА различной степени тяжести, установлена высокая активность матричной РНК мРНК NOS-I при тяжелой и среднетяжелой БА р 0,05.
В свою очередь активность мРНК NOS-III у всех больных детей, вне зависимости от тяжести заболевания, была достоверно выше р 0,05, чем в группе контроля. Следует отметить, что при тяжелой БА активность мРНК NOS-II была достоверно выше, чем при БА легкой и средней степени тяжести, а также почти в 10 раз превышала уровень экспрессии NOS-II в контрольной группе табл.
1. Уровень экспрессии мРНК генов NO-синтаз у больных бронхиальной астмы различной степени тяжести Уровень экспрессии мРНК генов NO-синтаз у больных бронхиальной астмой и в контрольной группе Уровень экспрессии мРНКNOS1NOS2NOS3Уровень экспрессии мРНК контрольная группа4,40,1816,370,611,480,16Уровень экспрессии мРНК БА легкой степени тяжести4,00,2229,02,725,00,34Уровень экспрессии мРНК БА средней степени тяжести13,00,2571,06,832,00,3Уровень экспрессии мРНК
БА тяжелой степени14,00,39156,03,864,00,26Примечани е - р 0,05 по сравнению с группой контроля Уровень экспрессии мРНКNOS-1NOS-2NOS-3паттерны1112132122232 431323334Уровень экспрессии МРНК БА6,29 0,336,77 0,496,31 0,592,3 4,0894,5 2,586,7 2,36151,25 2,33,9 0,294,5 0,012,75 0,264,47 0,58Уровень экспрессии мРНК контроль3,86 0,094,75 0,255,8 0,215,8 1,4619,3 1,6715,7 0,63 1,48 0,192,6 0,422,5 0,261,0 0,01Примечание р 0,05 по сравнению с группой контроля. Методом корреляционного анализа установлена обратная связь между
уровнем экспрессии NOS-II и показателями, характеризующими функцию легких, такими как ОФВ1г-0,5 р0,0001, ФЖЕЛ г-0,4 р0,001, ПВС г-0,2 р0,04. Наиболее высокий коэффициент корреляции получен между активностью мРНК NOS-I и изменениями, характерными для бронхиальной обструкции ОФВ г-0,6 р0,0001, ОФВ ФЖЕЛ г-0,24 р0,025. В рамках проводимого исследования было обнаружено три полиморфных
варианта паттерна в промоторной области гена NOS-I NOS-11, NOS-12 и NOS-13. В группе больных БА средней степени тяжести частота встречаемости паттерна NOS-13 была достоверно выше р 0,05, чем в группе контроля и в группах с легкой и тяжелой БА. В промоторной области гена NOS-II было идентифицировано четыре вида паттернов NOS-21, NOS-22, NOS-23 и NOS-24. У больных среднетяжелой
БА паттерн NOS-21 встречался в 1,5 раза чаще, чем в других группах р 0,05. Обнаружено, что у здоровых детей и у детей с легкой Б А отсутствовал паттерн NOS-24, тогда как при тяжелой и среднетяжелой БА частота его встречаемости составляла 4,5 и 4,8 соответственно. Для промоторной области гена NOS-III было получено четыре полиморфных варианта
NOS-31, NOS-32, NOS-33 и NOS-34. Установлено, что при БА легкой и средней степени тяжести значительно чаще встречался паттерн NOS-34 30,4 и 23,8 соответственно против 11,5 в группе контроля. При тяжелой БА достоверно возрастала частота паттерна NOS-33 р 0,05. При наличии паттернов NOS-34 и или NOS-24 обнаружено достоверное повышение экспрессии
мРНК по сравнению другими вариантами полиморфизмов в этих генах р 0,05 табл.2. Относительный риск RR для данных паттернов составлял 1,53 и 2,17 соответственно. Полученные результаты в данном случае доказывают наличие положительной ассоциации заболевания с полиморфными вариантами NOS-24 и NOS-34 фактор риска. Наряду с этим у больных БА установлена положительная зависимость между уровнем
IgE и наличием паттерна NOS-34 г0,2 р0,04 и отрицательная при наличии NOS-31 г-0,2 р0,04. Следует также отметить, что в контрольной группе частота обнаружения паттерна NOS-31 была достоверно выше, чем у детей с БА 80,8 и 68,6 соответственно р 0,05, a RR составил 0,64, что может рассматриваться как отрицательная ассоциация паттерна NOS-31 с данным заболеванием фактор устойчивости. Таким образом, наличие у детей определенных полиморфных
вариантов промоторной области генов NO-синтаз может оказывать влияние на феноти-пические проявления БА и важных патогенетических признаков болезни. В развитие астматического синдрома включено множество генов разных локу-сов, каждый из которых может вносить небольшой вклад в общую подверженность заболеванию. Гены NO-синтаз являются лишь одними из множества генов предрасположенности к БА, взаимодействующих между собой и с окружающей средой.