Функциональная активность лейкоцитов в условиях
воздействия на организм высокой и низкой температур
А. Д. Тяпкина, В. Д. Горичева
На
живые организмы оказывают влияние различные факторы внешней среды. При
экстремальных воздействиях, к которым относятся перегревание и переохлаждение
организма, происходят изменения гомеостатических констант, и прежде всего
относящихся к системе крови [1]. Лейкоциты, имеющие высокую реактивность,
быстро включаются в реакции адаптации.
Целью
проведенного исследования было комплексное изучение функциональных свойств
лейкоцитов при перегревании и переохлаждении организма.
Материал и методы исследования
Опыты
проведены на лабораторных белых крысах (90 животных) с исходной массой тела
330-400 г. В эксперименте было выделено 7 групп животных: две интактные,
служившие контролем, и 5 экспериментальных: 1 группа - легкая степень теплового
поражения, 2 - средняя степень теплового поражения, 3 группа - тяжелая степень
теплового поражения, 4 группа - переохлаждение организма, 5 группа -
переохлаждение организма в условиях алкогольной интоксикации. Три первых группы
животных выдерживали в термокамере при t +400С без доступа к воде. Животных 4-й
и 5-й групп подвергали охлаждению в воде температурой +15°С. Животным 5-й
группы дополнительно вводили в пищевод через эластичный зонд этиловый спирт
(30%) в количестве 1 мл на 100г массы тела.
Смешанную
кровь для исследования брали путем декапитации у предварительно
наркотизированных животных. Для предотвращения свёртывания использовали гепарин
в количестве 10 ед/мл. Полученную кровь центрифугировали 10 мин. при 1500
об/мин. Собирали лейкоциты. Примесь эритроцитов разрушали 0,83% раствором
хлорида аммония. Клетки дважды отмывали изотоническим буфером (раствор
Дюльбекко). Отмытые клетки ресуспендировали и подсчитывали их концентрацию в
камере Горяева.
Фагоцитоз
Для
исследования поглотительной способности нейтрофилов использовали частицы
латекса размером 0,8 мкм. Смесь лейкоцитов с латексом в соотношении 1: 50
инкубировали в термостате при 37°С в течение 30 мин., встряхивая пробирку с
лейкоконцентратом через каждые 5 мин. Затем в фиксированных метанолом и
окрашенных азур-эозином мазках подсчитывали процент фагоцитирующих клеток
(фагоцитарная активность, ФА) и среднее число поглощенных частиц (фагоцитарный
индекс, ФИ) [2].
Миграционная активность
Для
постановки миграции под агарозой использовали классический вариант, описанный в
многочисленных монографиях и статьях. Агарозу с добавлением культуральной
клеточной среды 199 наслаивали на предметные стекла. Для оценки спонтанной
миграции в агаровом геле с помощью пробойника вырезали одну лунку, в которую
помещали суспензию лейкоцитов (7-10x105клеток). На втором стекле ставили
реакцию индуцированной миграции. Для этого вырезали группу из двух
расположенных на расстоянии, равном диаметру пробойника (2,5 мм), лунок: одну -
для клеточной суспензии, вторую - для хемоаттрактанта. В качестве хемоаттрактанта
использовалась свежая плазма крови. Стекла помещали во влажную камеру при 37°С
в атмосфере воздуха с 5% содержанием СО2 на 2 часа, затем погружали в 2%
раствор глутарового альдегида на 60 мин. После фиксации и удаления агарозы
клетки окрашивали азур-эозином по Романовскому. В обоих случаях для оценки
локомоционной активности измеряли площадь распространения клеток и рассчитывали
хемотаксический дифференциал - отношение изменений площади индуцированной
миграции по сравнению со спонтанной к площади клеточного ареала при
самопроизвольной миграции (%) [3].
Адгезионная способность
За
основу проводимых манипуляций была взята методика, описанная Megе J.-L. с
соавт. 40 мкл суспензии лейкоцитов помещали в капилляр с внутренним диаметром
0,56 мм, предварительно обработанный аутоплазмой. Клетки инкубировали во
влажной камере при 370С в течение 60 мин. Дальнейшие процедуры были следующими.
Клеточную взвесь осторожно удаляли из капилляра при напряжении сдвига около 0,1
Н/м2. Капилляр повторно заполняли раствором Дюльбекко и освобождали от
содержимого при напряжении сдвига 30 Н/м2. Считали число клеток в исходной
суспензии, а также первом (неадгезировавшие и с малой силой сцепления) и втором
(со средней силой сцепления) смыве. Из полученных данных рассчитывали число
клеток, оставшихся в капилляре (с большой силой сцепления) [4].
Результаты
исследований и их обсуждение
В
ходе исследований были получены следующие результаты.
Изменения
поглотительной способности нейтрофилов в условиях гипертермии выявили поэтапное
увеличение фагоцитарной активности и числа поглощенных частиц (табл. 1).
Прирост изученных показателей по сравнению с контролем составил: 20 минут
перегревания - ФА - 8%, ФИ - 7%; 75 минут - ФА - 16%, ФИ - 37%; 120 минут - ФА
- 24%, ФИ - 52%. При охлаждении животных до состояния холодного наркоза
фагоцитарная активность менялась незначительно (1%), а число поглощенных частиц
возрастало (увеличение ФИ - 19%). Охлаждение в условиях алкогольной
интоксикации негативно сказывалось на функциональной активности нейтрофилов:
достоверно снижались оба показателя ФА - 10%, ФИ - 37% (табл. 2).
Таблица
1
Показатели
фагоцитарной активности у животных, подвергавшихся перегреванию
Группа
Фагоцитарная активность(%)
Фагоцитарный индекс (отн. ед.)
Контроль
75±1,7
7,5±0,4
I группа животных
81±0,8 *
8,0±0,2*
II группа животных
87±1,1 *
10,3±0,3*
III группа животных
93±0,7 *
11,4±0,4*
Примечание:
* - достоверность различий по сравнению с контролем (p