--PAGE_BREAK--
Як видно із результатів, наведених у табл.1 у 6 пробандів з підозрою на ССА та одного пробанда з підозрою на ХП були виявлені типові зміни каріотипу, що дозволило одразу поставити остаточний діагноз. Так, у двох випадках із клінічними ознаками, характерними для СВХ, було підтверджено діагноз – СВХ. В обох випадках делеція охоплювала критичну для розвитку СВХ ділянку 4p16. У першого пацієнта ідентифіковано втрату близько двох третин короткого плеча хромосоми 4 – del(4)(p14.1). Дитина мала важкі ВВР та померла у віці 1 міс. Рання верифікація діагнозу дозволила провести медико-генетичне консультування батьків дитини з приводу планування подальшої вагітності. У другого пацієнта з характерною для СВХ, однак, менш виразною клінічною картиною виявлено делецію у ділянці 4p16.2 та підтверджено діагноз СВХ. У іншого пацієнта з підозрою на ХП виявлено мозаїчний варіант СВХ. Ймовірно, наявність del(4)(p16.2) лише в 50% клітин обумовила стерту клінічну картину, що не дозволило лікарю запідозрити СВХ. Таким чином, наші дослідження збігаються та підтверджують загально прийняте наукове поняття про те, що при СВХ розмір делетованої хромосомної ділянки корелює з фенотиповою картиною та важкістю перебігу захворювання (Zollino, 2000).
Дослідження каріотипу у одного пацієнта з підозрою на синдром „котячого крику” виявило делецію половини короткого плеча хромосоми 5 із залученням критичної ділянки 5р15.2. Отже, було підтверджено попередній клінічний діагноз. Діагноз дитині верифіковано у віці 1 року та 3 міс. Однією з причин того, що батьки дитини звернулися за медичною допомогою, окрім розумового відставання дитини, була наявність у пробанда ВВС, а саме — відкритого артеріального протоку. Наші дані збігаються з літературними (Marinescuetal., 1999), згідно яких клінічна картина при синдромі „котячого крику” не корелює з розміром інтерстиціальної делеції.
Вперше в Україні стандартним цитогенетичним методом підтверджено попередній діагноз ССМ у двох пацієнтів. Обидва пробанди мали типовий для ССМ фенотип, який і дозволив запідозрити наявність цього синдрому. В той же час, поведінка дітей не була характерною для ССМ, однак, враховуючи їхній ранній вік на момент обстеження, можливо припустити, що характерні ознаки можуть з’явитися пізніше. Особливістю нашого дослідження було те, що обидві пацієнтки мали ВВС, які за даними деяких авторів зустрічаються лише у третини хворих з ССМ (Wongetal., 2003). В одному з цих випадків ВВС потребував оперативної корекції. За даними аналізу літератури це п’ятий випадок опису тетради Фалло при ССМ (Myersetal., 2004). Згідно GirirrajanS., ВВС зустрічаються серед пробандів із делецією короткого плеча хромосоми 17, яку можливо виявити за допомогою цитогенетичного аналізу (Girirrajanetal., 2005) (рис. 1). Отримані нами результати збігаються з останніми припущеннями та підтверджують необхідність застосування стандартного цитогенетичного методу на першому етапі діагностики ССА, особливо для пацієнтів з ВВС та підозрою на ССМ.
Рис.1. Каріограма пацієнта з синдромом Сміта-Мадженіса.
Стрілкою вказано делецію короткого плеча хромосоми 17 у ділянці p11.2, пунктиром вказано інверсію хромосоми 9. GTG-забарвлення. Об’єктив 100.Каріотип пацієнта: 46,XX,del(17)(p11.2p11.2),inv(9)(p12q12)
Наведені в світовій літературі дані показують, що діагностика синдрому „котячого ока” ускладнена варіабельністю клінічних та цитогенетичних характеристик (Berendsetal., 2001; Meinsеtal., 2003). У нашому дослідженні пацієнт не мав колобоми райдужки та преаурікулярних дермоїдних привісків, однак поєднання ВВС та ректо-анальної атрезії, що є характерними для синдрому, дозволило запідозрити трисомію за хромосомою 22. Під час стандартного цитогенетичного аналізу нами було виявлено наявність додаткової хромосоми 22 з делецією в ділянці q11.2. та верифіковано діагноз – синдром „котячого ока”. Враховуючи той факт, що на сьогодні у світі описано лише близько 60 випадків синдрому „котячого ока”, кожний виявлений та підтверджений випадок має свою наукову цінність і є важливим для розширення знань про кореляцію фенотипу-каріотипу та можливості діагностики даного синдрому.
В інших трьох випадках нами виявлено зміни хромосомного матеріалу, які не вирішували питання щодо верифікації діагнозу ССА в зв’язку з тим, що у виявлених структурних перебудовах досліджувані хромосоми 15, 22 участі не брали (2 випадки), або наявність/відсутність критичної ділянки в структурно-перебудованій хромосомі була під сумнівом (1 випадок). Так, у пробанда з підозрою на синдром мікроделеції 22q11.2 виявлено структурну перебудову за участю хромосом 12 та 22, каріотип пацієнта: 46,XX,der(12)t(12;22)(q12;q11.2),-22. Для встановлення походження дериватної хромосоми проведено каріотипування батьків цієї дитини. Каріотип батька: 46,XY, каріотип матері: 46,XX,t(12;22)(q12;q11.2). Критична для розвитку синдрому мікроделеції 22q11.2 ділянка q11.2 була задіяна у реципрокній транслокації, яку виявлено в каріотипі у матері. В той же час в результаті проведення стандартного цитогенетичного аналізу не було можливим достовірно визначити наявність чи відсутність критичної ділянки в дериватній хромосомі пробанда (табл. 2). Це стало підставою для подальшого лабораторного дослідження даного випадку.
Таблиця 2
Порівняння між частковими каріограмами пробанда з підозрою на синдром мікроделеції 22
q
11.2 та його матері.
У іншому випадку за допомогою аналізу хромосом метафазної конденсації у пробанда з підозрою на СПВ виявлено робертсонівську транслокацію між хромосомами 14 та 22. При цитогенетичному аналізі в родині пацієнта встановлено: каріотип матері – 46,XX, каріотип сестри – 46,XX. У батька виявлено таку саму структурну перебудову, як і у пробанда. Дитина мала характерні для СПВ клінічні ознаки, тому наявність структурної перебудови батьківського походження не відігравала визначальної ролі у виникненні та розвитку клінічної картини. В той же час, у дитини не було виявлено делеції критичної ділянки хромосоми 15, що потребувало подальшого аналізу із застосуванням більш чутливих методів.
При дослідженні каріотипу пацієнта з підозрою на синдром мікроделеції 22q11.2 та характерними клінічними ознаками стандартним цитогенетичним методом виявлено інверсію хромосоми 9, яка оцінюється як поліморфізм. Інших змін хромосомного матеріалу на рівні метафаз у каріотипі виявлено не було, тому діагноз на даному етапі дослідження не встановлено.
Всього, за результатами стандартного цитогенетичного аналізу верифіковано діагноз у 7 пацієнтів з 78 (8,97%). Застосування стандартного цитогенетичного методу не дозволило верифікувати діагноз у 71 особи (85,89%), що потребувало подальшого дослідження їхнього каріотипу із використанням чутливіших методів діагностики ХП.
Високочутливий цитогенетичний методзастосованоу 74 осібз метою виявлення мікроделеції в критичних ділянках досліджуваних хромосом 4, 5, 7, 15, 22 та для уточнення точок розривів — з’єднання у структурно перебудованих хромосомах, виявлених під час стандартного цитогенетичного методу.
В результаті проведення аналізу хромосом прометафазної конденсації попередній клінічний діагноз — синдром мікроделеції 22q11.2 підтверджено у трьох пробандів з 31 особи (3,85%), у яких стандартним методом делецію критичної ділянки не було виявлено. З метою запобігання хибно позитивних чи хибно негативних результатів проведено перевірку отриманих даних за допомогою FISH-методу. В одному випадку у пацієнта та у його матері за допомогою високочутливого цитогенетичного методу уточнено точки розривів-з’єднання при структурній перебудові, що не вдалося визначити стандартним цитогенетичним методом: каріотип пробанда після аналізу точок розривів-з’єднання було уточнено з 46,XX,der(12)t(12;22)(q12;q11.2)mat,-22 на 46,XX,der(12)t(12;22)(q13.2;q11.2)mat,-22. В той же час, навіть після застосування високочутливого методу, питання про наявність чи відсутність критичної ділянки q11.2 хромосоми 22 у цього пробанда залишилося відкритим, і даний випадок потребував подальшого дослідження з використанням більш чутливих методів. Для 61 особи (78,21%) остаточний діагноз на даному етапі не встановлено.
Таким чином, використання цитогенетичних (стандартного та високочутливого) методів дозволило верифікувати діагноз у 10 пацієнтів з 78 осіб та виявити батьківське походження дериватних хромосом у двох випадках. Крім того виявлено інші хромосомні перебудови без участі критичних ділянок у трьох пацієнтів. Інформативність цитогенетичних методів для підтвердження попереднього клінічного діагнозу СВХ, синдрому „котячого крику”, ССМ та синдрому „котячого ока” склала 100%, синдрому мікроделеції 22 q11.2 – 3,85%, для клінічних діагнозів СВБ та СПВ – 0%. Загальна інформативність цитогенетичних методів склала 12,82%.
Молекулярно-цитогенетичне дослідженняпроведено у 71 із 78 пацієнтів, які мали попередній клінічний діагноз ССА (за винятком 7 пацієнтів, яким діагноз було верифіковано за допомогою стандартного цитогенетичного методу). За допомогою FISH-методу вперше в Україні нами підтверджено клінічний діагноз у 18 осіб із 21 пацієнта з СВБ (86%), у 9 осіб із 19 пацієнтів з СПВ (47%) та у 13 осіб із 31 пацієнта з синдромом мікроделеції 22q11.2 (42%).
Застосування FISH-методу дозволило спростувати попередній клінічний діагноз у трьох із 21 пацієнта з СВБ (14%) і у 18 осіб із 31 обстеженого пацієнта з синдромом мікроделеції 22q11.2 (58%).
В зв’язку з тим, що до розвитку СПВ можуть призводити різні етіологічні чинники, а саме: делеція, мікроделеція в критичній ділянці, функціональна делеція або уніпарентна дисомія та мутація в центрі імпринтингу, навіть наявність двох сигналів локус-специфічного зонду у критичній ділянці 15q11.2-q13 не дозволила спростувати попередній клінічний діагноз. Тому, у 10 осіб із 19 пацієнтів з СПВ остаточний діагноз не було верифіковано (53%).
Отже, при дослідженні каріотипу 71 пацієнта з підозрою на ССА FISH-методом діагноз підтверджено у 40 пацієнтів (51,28%) та спростовано у 21 пацієнта (26,92%). Діагноз не верифіковано у 10 пробандів (12,82%). Таким чином рівень інформативності застосування молекулярно-цитогенетичного методу в нашому дослідженні склав 78,2%.
Важливо відзначити, що із 71 пацієнта для чотирьох (два пробанди з підозрою на СВБ та два пробанди з підозрою на синдром мікроделеції 22) діагноз підтверджено при молекулярно-цитогенетичному дослідженні на інтерфазних ядрах. Така необхідність виникла внаслідок низького мітотичного індексу у цих хворих. На сьогодні, інтерфазний метод посідає значне місце у виявленні ХП при проведенні пренатальної діагностики (Ворсанова, 2006). Наші дані показують, що цей метод може бути методом вибору при необхідності швидкої верифікації діагнозу ССА. Однак, після встановлення або спростування діагнозу на інтерфазних ядрах, обов’язковим є проведення стандартного цитогенетичного аналізу для перевірки наявності інших змін хромосомного набору, що і було нами вище показано.
В зв’язку з тим, що у 10 пацієнтів з попереднім клінічним діагнозом СПВ діагноз не верифіковано, ДНК пацієнтів та їхніх батьків було відправлено на молекулярний аналіз. В результаті проведення аналізу метилування ДНК та мікросателітного аналізу у трьох пацієнтів діагноз СПВ підтверджено, у двох – спростовано. Для 5-ти пацієнтів результати молекулярно-генетичного обстеження виявились не інформативними (6,4%).
Аналіз даних, отриманих при проведенні комплексного дослідження пацієнтів з підозрою на ССА із залученням стандартного та високочутливого цитогенетичних методів, FISH-аналізу та молекулярного аналізу показав, що процес підтвердження або спростування попереднього клінічного діагнозу є складним та охоплює декілька етапів. Комплексне застосування цитогенетичних, молекулярно-цитогенетичних та молекулярних методів дозволило верифікувати діагноз у 93,6% пацієнтів з підозрою на ССА.
У відповідності з одержаними результатами, нами було створено загальний алгоритм лабораторного генетичного обстеження пацієнтів з підозроюна ССА (рис. 2) та розроблено диференційно-діагностичний підхід з цілеспрямованим використанням лабораторних генетичних методів для кожного нозологічного випадку.
Алгоритм лабораторного генетичного обстеження пацієнтів з підозрою на ССА
Перший етап лабораторного генетичного обстеження – цитогенетичний аналіз.
Усім пацієнтам із попереднім клінічним діагнозом ССА проводять стандартне цитогенетичне дослідження.
· У разі виявлення делеції/дуплікації критичних ділянок хромосом 4, 5, 7, 15, 17, 22 або їхньої участі у структурних перебудовах з іншими хромосомами з втратою критичної ділянки діагноз підтверджується. Пацієнт та члени його родини направляються для завершення медико-генетичного консультування до лікаря-генетика.
· При виявленні інших структурних перебудов, у яких критична ділянка не задіяна та при необхідності встановлення точок розривів-з’єднання можливим є використання високочутливого цитогенетичного аналізу.
· Виявлення структурних перебудов у каріотипі дитини обумовлює необхідність каріотипування батьків дитини, що дозволяє встановити батьківське походження перебудованих хромосом та уточнити точки розривів у хромосомах, які брали участь у структурній перебудові.
· При відсутності метафазних пластинок на хромосомних препаратах одразу переходять до другого етапу –використовуютьFISH-аналіз на інтерфазних ядрах.
Варто зазначити, що для пацієнтів, у яких діагноз був підтверджений за допомогою FISH-методу на інтерфазних ядрах, у подальшому ми рекомендуємо провести стандартний цитогенетичний аналіз із метою виключення інших структурних перебудов у каріотипі, оскільки вони можуть впливати на стан дитини.
При характерній клінічній картині ССА і нормальному каріотипі переходять до
другого етапу – молекулярно-цитогенетичної діагностики.
· FISH-діагностику проводять усім пацієнтам з попереднім клінічним діагнозом ССА, у яких на першому етапі не виявлено делецію критичної ділянки досліджуваної хромосоми.
· При виявленні мікроделеції критичної ділянки діагноз підтверджується, і родина повертається до лікаря-генетика для подальшої консультації.
· Якщо мікроделецію критичної ділянки не виявлено, діагноз спростовується, і пацієнт направляється до лікаря-генетика. У цьому випадку найвірогідніше, що
--PAGE_BREAK--