--PAGE_BREAK--Адаптация галофильных бактерий Н. halobiumET1001. В случае с Н. halobiumET1001 адаптацию проводили как на агаре, содержащим 99,9 ат.% тяжёлую воду путём рассева штамма до отдельных колоний, так и на жидкой среде с тяжёлой водой. В обычных для этой бактерии условиях культивирования (37°С, на свету) в клетках синтезировался фиолетовый пигмент по всем характеристикам не отличающийся от нативного бактериородопсина.
2. ИЗУЧЕНИЕ РОСТА И БИОСИНТЕЗА БАС ПОЛУЧЕННЫМИ ШТАММАМИ
Изучение ростовых характеристик М. jlagellatumна средах, содержащих CH3OH/CD3ODи D2O, а также 13СНзОН. Данные по росту штамма М. Jlagellatumна минимальных средах с добавкой 1об.% метанола СНзОН и его меченных аналогов (СDзOD/13СНзОН) и содержащих ступенчато увеличивающиеся концентрации тяжёлой воды приведены в таблице I. Как видно из таблицы I, на средах, содержащих тяжёлую воду и изотопные аналоги метанола – дейтеро-метанол CD3OD и 13С-метанол 13CH3OH, выходы микробной биомассы составили 81% и 72% соответственно, а на средах с 74,5 об.% тяжёлой водой выход биомассы составил 29%, что в 3,4 раза ниже, чем в контрольных экспериментах, когда использовали обычную воду и метанол СНзОН (табл. 1, опыты 1,3,8). Как видно, способность к росту у М. flagellatumсохранялась лишь в среде, содержащей 74,5 об.% тяжёлой воды. Выше этой концентрации наблюдалось ингибирование скорости роста бактерий.
Таблица 1. Влияние изотопного состава среды на рост штамма M.flagelaum.
Номер Компоненты среды, об% Величина Выход Время опыта лаг-фазы биомассы генерации Н2О D2O СНзОН СDзОD часы % ч
1
99,0
0
1,0
0
0
100
1,1
2
99,0
0
0,5
0,5
0,2
91,0
0,8
3
99,0
0
0
1,0
0,8
81,0
1,0
4
49,5
49,5
1,0
0
2,4
76,0
1,4
5
49,5
49,5
0,5
0,5
5,7
75,0
1,2
6
49,5
49,5
0
1,0
6,7
70,0
1,3
7
24,5
74,5
1,0
0
5,6
29,0
1,4
8
99,0
0
1,0 'ЗСНзОН
0
0,1
72,0
1,0
Как и следует из литературных данных (Складнее Д. А, 1990), введение стабильного изотопа углерода |3С не приводит к летальным последствиям для клетки, что мы и наблюдали в случае с М. flage/talum. В целом, полученные для М. flagellatumданные могут свидетельствовать о том, что адаптация к тяжёлой воде определяется как видовой специфичностью метилотрофных бактерий, так и особенностями их метаболизма. Кроме этого, из таблицы 1 следует, что данный подход можно эффективно использовать для введения в синтезируемые БАС двойной изотопной метки (дейтерий- и изотоп углерода 15C).
Изучение ростовых и биосинтетических характеристик Б. methylicumна средах, содержащих CH3OH/CD3ODи D2O. Данные по росту исходного и адаптированного к тяжёлой воде штамма В. methylicumи максимальному уровню накопления L-фенилаланина в культуральной жидкости на минимальных средах с добавкой 2 об.% метанола и его дейтерированного аналога СН3OН/CD3OD, содержащих ступенчато увеличивающиеся концентрации тяжёлой воды, представлены в таблице 2. Как видно из табл. 2, в отсутствии дейтерий-меченных субстратов продолжительность лаг-фазы не превышала 24 ч (см. табл. 2, опыт 1). С увеличением концентрации тяжёлой воды в среде продолжительность лаг-фазы увеличивалась до 64,4 ч на средах с 98 об.% тяжелой водой и 2 об.% CD3OD (табл. 2, опыт 10). Отмечено, что длительность времени клеточной генерации с увеличением степени изотопного насыщения среды дейтерием постепенно увеличивается, достигая 4,9 часов на максимально дейтерированной среде (табл. 2, опыт 10).
Таблица 2.
Влияние изотопного состава среды на рост штамма В. mehylicum и уровень накопления L-фенилаланина в культуральной жидкости*.
Номер Компоненты среды, об% лаг-фаза Выход Время Выход опыта биомассы генер. L-Phe, Н2 О D2O СH3ОН CD3OD ч % ч %
1
98
0
2
0
24,0
100
2,2
100
2
98
0
0
2
30,3
92,3
2,4
99,1
3
73,5
24,5
2
0
32,1
90,6
2,4
96,3
4
73,5
24,5
0
2
34,7
85,9
2,6
97,1
5
49,0
49,0
2
0
40,5
70,1
3,0
98,0
6
49,0
49,0
0
2
44,2
60,5
3,2
98,8
7
24,5
73,5
2
0
45,8
56,4
3,5
90,4
8
24,5
73,5
0
2
49,0
47,2
3,8
87,6
9
0
98,0
2
0
60,5
32,9
4,4
79,5
10
0
98,0
0
2
64,4
30,1
4,9
71,5
10'
0
98,0
0
2
39,9
87,2
2,9
95,0
'Данные (1-10) приведены для В. methylicum, не адаптированного к средам с высоким содержанием дейтерия.
Данные 10' приведены для адаптированного В. methylicum.
Как видно из табл. 2, опыт 2, дейтерометанол CD3OD не вызывал существенного ингибирования роста и не оказывал влияния на выход микробной биомассы, в то время как на средах с 98 об.% тяжёлой водой микробный рост подавлялся. Так, на среде, содержащей 98 об.% тяжёлой воды и 2 об.% дейтерометанола СDзОD, выход микробной биомассы был снижен в 3,3 раза no-сравнению с контролем. Важно то, что выход микробной биомассы и уровень накопления L-фенилаланина в культуральной жидкости при росте адаптированного к тяжёлой воде штамма В. inethylicumв полностью дейтерированной среде изменяются по сравнению с контрольными условиями на 12,8% и 5% соответственно (табл. 2, опыт 10').
За счёт использования данного штамма В. methylicumудалось выделить порядка 1 г L-Phe из 1 л среды.
Исследование биосинтеза L-фенилаланина штаммом В. methylicum.Общей особенностью биосинтеза L-Phe в протонированных средах было значительное увеличение его продукции на ранней фазе экспоненциального роста В. inethylicum, когда выход микробной биомассы был незначителен (рис. I).
Рис. I. Динамики роста В. methylicum(la, 10'а, 10а) и накопления L-Phe в культуральной жидкости (16, 10'б, 106) на средах с различным изотопным составом: 1 а, б — исходный микроорганизм на протоннрованной среде М9; 10' а, б -адаптированный В. methylicumна полностью дейтерированной среде; 10 а, б — еадаптированный микроорганизм на полностью дейтерированной среде.
Во всех изотопных экспериментах наблюдалось ингибирование биосинтезаL-фенилаланина на поздней фазе экспоненциального роста и снижение его концентрации в ростовых средах. Согласно данным по микроскопическому исследованию растущей популяции микроорганизмов, наблюдаемый характер динамики секреции L-Phe не коррелировал с качественными изменениями ростовых характеристик культуры на различных стадиях роста, что служило подтверждением морфологической однородности микробной популяции. Скорее всего, накопленный в процессе роста фенилаланин ингибировал ферменты собственного пути биосинтеза. Кроме того, мы не исключаем возможность, что при ферментации без рН-статирования может происходить обратное превращение экзогенного фенилаланина в интермедиаторные соединения его биосинтеза, что отмечено в работах других авторов (Ворошилова Э. Б., Гусятипер М. М., 1989). Данные по исследованию культуральной жидкости методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) показали, что кроме L-фенилаланина данный штамм В. methylicumсинтезирует и накапливает в культуральной жидкости другие аминокислоты (аланин, валин, лейцин, изолейцин), четко детектируемые масс-спектрометрическим анализом (см. след, главу).
Изучение качественного и количественного состава внутриклеточных сахаров В. subtilis. Входе выполнения работы был изучен качественный и количественный состав внутриклеточных Сахаров при росте В. subtilisна среде с 99,9 ат.% тяжёлой воды (см. табл. 3). Как видно из таблицы 3, в гидролизатах биомассы данного штамма фиксируются глюкоза, фруктоза, рамноза, арабиноза, сахароза и мальтоза.
Таблица 3.
Качественный и количественный состав внутриклеточных Сахаров В. subtilisпри росте на 99,9 %тяжёлой воде.
Компонент Содержание в биомассе, % Рост на Н2О Рост на 99,9% D2O
Глюкоза
20,01
21,40
Фруктоза
6,12
6,82
Рамноза
2,91
3,47
арабиноза
3,26
3,69
мальтоза
15,30
11,62
сахароза
8,62
—
Изучение аминокислотного состава биомассы метилотрофных бактерий В. tnethylicum. Аминокислотный состав суммарных белков биомассы В. methylicum, полученного в ходе многоступенчатой адаптации к тяжёлой воде показан в таблице 4. Результаты исследования показали небольшое снижение содержания в дейтерированном белке Ala, Leu и Нis по сравнению с белком, полученным на обычной воде (табл. 4).
Таблица 4.
Качественный и количественный состав аминокислот общих белков биомассы В. methylicum.
Аминокислота Содержание в белке, % Рост на Н2О Рост на 98% D2O
Gly
8,03
9,69
Ala
12,95
13,98
Val
3,54
3,74
Leu
8,62
7,33
His
4,14
3,64
Phe
3,88
3,94
Tyr
1,56
1,82
Asp
7,88
9,59
Glu
11,68
10,38
Lys
4,37
3,98
His
3,43
3,72
Thr
4,81
5,51
Met
4,94
2,25
Arg
4,67
5,27
Изучение ростовых и биосинтетических характеристик В. subtilisна средах, содержащих тяжёлую воду и гидролизаты метилотрофных бактерий. Кривые, отражающие динамику роста, ассимиляции глюкозы и накопление инозина в культуральной жидкости штаммом В. subtilisв условиях протонированной среды и среды, с 99,9 ат.% тяжёлой воды представлены на рис. 2.
Как видно из рис. 2, при переносе клеток со стандартной на дейтерированную среду выход микробной биомассы, продолжительность лаг-фазы и длительность времени клеточной генерации в целом изменяются незначительно. При росте исходного штамма В. subtilisпа среде, содержащей обычную воду уровень накопления инозина в культуральной жидкости достигал величины 17,3 г/л после пяти суток культивирования (рис. 2). Уровень накопления инозина на дейтерированной среде был снижен в 4,4 раза по-сравнению с исходным штаммом на протонированной среде (рис. 2). Низкие уровни секреции инозина на дейтерированной среде коррелируют со степенью конверсии глюкозы в этих условиях. Так, кривая конверсии глюкозы на полностью дейтерированной среде имела меньший угол наклона, чем на среде с обычной водой, что свидетельствует о том, что при росте на дейтерированной глюкоза расходуется менее эффективно (рис. 2).
Рис.2. Динамики роста B.subtilis (1a, 2a), конверсии глюкозы (1б,2б) и накопления инозина в культуральной жидкости (1в,2в) на средах с различным изотопным составом: 1 а, б, в-B. Subtilis на обычной протонированной среде; 2 а, б, в-B.subtilis на полностью дейтерированной среде с гидролизатом дейтеро-биомассы метилотрофных бактерий.
Полученные для исследуемых микроорганизмов данные, в целом, подтверждают устойчивое представление о том, что адаптация клетки к тяжёлой воде является фенотипическим явлением, поскольку адаптированные к тяжёлой воде клетки возвращаются к нормальному росту и биосинтезу в протонированных средах после некоторого лаг-периода. В то же время обратимость роста на D2O/H2O-cpeдax теоретически не исключает возможности того, что этот признак стабильно сохраняется при росте в тяжёлой воде, но маскируется при переносе клеток на дейтерированную среду. Можно предположить, что клетка реализует лабильные адаптивные механизмы, которые способствуют функциональной реорганизации работы ферментных систем в тяжёлой воде. Также не исключено, что наблюдаемые при адаптации эффекты связаны с образованием в тяжёлой воде более прочных и стабильных связей, чем связей с участием водорода. По теории абсолютных скоростей разрыв С-Н-связей может происходить быстрее, чем C-D-связей, подвижность дейтерия D+меньше, чем подвижность протия Н+, константа ионизации D2O в 5 раз меньше константы ионизации Н2О (CrespyJ., KalzH.H., 1979). С точки зрения физиологии, наиболее чувствительными к замене протия на дейтерий могут оказаться аппарат биосинтеза макромолекул и дыхательная цепь, т. е. именно те клеточные системы, которые используют высокую подвижность протонов и высокую скорость разрыва водородных связей.
3. ИЗУЧЕНИЕ СТЕПЕНЕЙ ВКЛЮЧЕНИЯ ИЗОТОПОВ ДЕЙТЕРИЯ и УГЛЕРОДА 13С в МОЛЕКУЛЫ ЭКЗОГЕННЫХ АМИНОКИСЛОТ B. methylicumи М. flagellatum.
Получение препаратов культуральных жидкостей, содержащих экзогенные дейтерий — и 13С-аминокислоты. Дейтерий-меченные аминокислоты были выделены в составе препаратов лиофилизованных интактных культуральных жидкостей, свободных от белков и полисахаридов, при росте штамма В. methylicumна минимальных средах с добавкой 2 об% метанола СНзОН и с различным содержанием тяжёлой воды. |3С-аминокислоты были получены за счет культивирования штамма М, flagellatumна среде, содержащей обычную воду и 1 об% 13С-метанол |3СНзОН. Данные по степеням включения дейтерия и 13С в молекулы экзогенных аминокислот двух исследуемых штаммов приведены в таблице 5. Во всех анализируемых образцах культуральной жидкости независимо от рода штаммов методом масс-спектрометрии электронного удара были обнаружены аланин, валин, лейцин/изолейцин и фенилаланин (табл. 5). В масс-спектрах дериватизованной культуральпой жидкости M.flagellatwnв дополнение к вышеобозначенным аминокислотам также фиксировался глицин.
Получение метиловых эфиров дансил-и карбобензокси-проазводных аминокислот.Степени включения изотопов дейтерия и мзотопа углерода 13С в мультикомпонептные смеси аминокислот в составе культуральной жидкости и белковых гидролизатов определяли методом высокочувствительной масс-спектромстрии электронного удара метиловых эфиров Dns-аминокислот или в виде Z-производных аминокислот после их препаративного разделения методом обращённо-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии ОФ ВЭЖХ.
Аналитическое и препаративное разделение Z-производных аминокислот проводили методом ОФ ВЭЖХ, разработанным Егоровой Т. А. (Егорова Т. А., 1993). Степени хроматографической чистоты выделенных из культуральных жидкостей В. methylicwnи М. flagellatum2-й Dns-производных дейтерий- и 13С-аминокислот составили 93-95%, а выходы 65-87% соответственно.
Предложенная нами модификация метода получения производных аминокислот заключалась в прямой химической обработке препаратов культуральной жидкости, полученной после отделения клеток, DnsCI (и ZCI) и CN2H2. Реакцию проводили в щелочной среде в водно-органическом растворителе в соотношении DnsCl (ZCI) -аминокислота, равным 5:1 (см. схему ниже).
продолжение
--PAGE_BREAK--