«Олексина»

ПЕРМСКОЕ НАУЧНО - ПРОИЗВОДСТВЕННОЕ ОБЪЕДИНЕНИЕ "БИОМЕД" УТВЕРЖДАЮ: Генеральный директор НПО "Биомед" _____________В.Ф.Петров"___"________19___гИММУНОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА БАД «ОЛЕКСИН»Зам. генерального директора НПО «Биомед» по научной работе, доктор медицинских наук О.А.ТимашеваРуководитель лаборатории биологически активных препаратов, научный руководитель, доктор медицинских наук, профессор, академик РАЕН В.Ф.Петров ^ СПИСОК ИСПОЛНИТЕЛЕЙОтветственный исполнитель:Ведущий научный сотрудник лаб. биологически активных препа- ратов НИИВС НПО"Биомед" канд биол. наук Г.М.СафоноваИсполнители:Старший научный сотрудник лаб. экологической иммунологии института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, канд. мед. наук Ю.И.ШиловМладший научный сотрудник лаб. биологически активных препара- тов НПО «Биомед» Е.Н.Перевозчикова Младший научный сотрудник лаб. биологически активных препара- тов НПО «Биомед» Н.В.СтарцеваМладший научный сотрудник лаб. биологически активных препара- тов НПО «Биомед» М.Г.Хилько Врач-терапевт А.Б.ПеревозчиковЛаборант лаборатории биологически активных препара- тов НПО «Биомед» Н.Ю.Бизяева Содержание Введение 4 1. Изучение иммуномодулирующих свойств БАД «Олексин» 5 1.1. Изучение влияния «Олексина» на первичный иммунный ответ 5 1.1.1.Исследование влияния «Олексина» на количество форменных элементов белой крови и морфометрические показатели тимуса и селезенки мышей при первичном иммунном ответе 5 1.1.2. Изучение влияния «Олексина» на клеточный иммунный ответ 7 1.1.3. Влияние «Олексина» на гуморальный иммунный ответ 8 1.2. Характеристика иммунотропной активности «Олексина» на модели индуцированной циклофосфамидом иммуносупрессии 9 1.3. Характеристика иммунотропной активности «Олексина» на модели глубокой иммуносупрессии 12 1.4. Изучение влияния «Олексина» на фагоцитарную активность макрофагов 131.4.1. Влияние «Олексина» на функцию перитонеальных макрофагов и макрофагов селезенки 131.4.2. Влияние «Олексина» на функциональную активность макрофагов селезенки на фоне иммуносупрессии 14 1.5. Характеристика влияния «Олексина» на иммунную систему мышей, подвергнутых иммобилизационному стрессу 14 1.5.1. Влияние «Олексина» на гемограмму и морфометрические показатели органов лимфомиелоидной системы мышей, подвергнутых иммобили- зационному стрессу 15 1.5.2. Влияние «Олексина» на фагоцитарную активность нейтрофилов периферической крови мышей, подвергнутых иммобилизационному стрессу 19 1.5.3. Влияние «Олексина» на фагоцитарную активность макрофагов органов лимфомиелоидной системы мышей, подвергнутых иммобилизационному стрессу 192. Исследование адаптогенной активности БАД «Олексин» 23 2.1. Исследование действия «Олексина» на функциональное состояние двигательного анализатора 23 2.2.Влияние «Олексина» на болевую чувствительность 24 2.3. Изучение влияния «Олексина» на поведенческие реакции 25 3. Изучение антиоксидантной и противоопухолевой активностей БАД «Олексин» 29 3.1. Оценка антиоксидантной активности БАД «Олексин» in vitro 29 3.2. Оценка противоопухолевой активности БАД «Олексин» 31 Заключение 33 Список использованных источников 34ВВЕДЕНИЕ В данном отчете представлены материалы по оценке иммуномодулирующей, адаптогенной, противоопухолевой, антиоксидантной активностей биологически активной добавки к пище «Олексин». Экспериментальное изучение иммуномодулирующей активности «Олексина» проведено в соответствии с требованиями МЗ РФ к лекарственным препаратам и МУК 2.3.2.721-98 «Определение безопасности и эффективности биологически активных добавок к пище». Животные, используемые в экспериментах, содержались в стандартных условиях вивария НПО «Биомед». «Олексин» - биологически активная добавка к пище, парафармацевтик, полученная из листьев персика обыкновенного (^ Persica vulgaris Mill.) по экологически чистой технологии, обладающая широким спектром фармакологического действия, в том числе иммуномодулирующим, противоопухолевым, антиоксидантным и адаптогенным. «Олексин» содержит комплекс природных соединений фенольной природы (флавоноиды, кумарины, дубильные вещества, сапонины, фенолкарбоновые кислоты). Общее количество полифенольных (окисляемых) веществ в «Олексине» составляет не менее 4%. В последние два десятилетия природные полифенольные соединения привлекают всеобщее внимание исследователей не только как объект химического изучения, но и в качестве перспективных веществ для получения биологически активных препаратов и лекарственных средств. Об этом свидетельствует возросший за последние годы интерес к веществам данной группы как к источникам капилляроукрепляющих, противовоспалительных, желчегонных, антисклеротических, противо-опухолевых и других препаратов [1, 2]. Фенольным соединением называется вещество, содержащее в своей молекуле ароматическое (бензольное) кольцо, которое несет одну или более гидроксильных групп. Образование фенольных соединений – одна из характерных особенностей растительной клетки [3]. Широкое изучение фенольных соединений показало, что вещества данной группы обладают разносторонним действием на организмы животных и человека [1, 2, 4-8]. Ранее других было обнаружено их действие на стенки кровеносных капилляров – Р-витаминоподобное действие [2, 9]. Другими важными свойст-вами ряда флавоноидов является их антиаггрегационная способность [10-12], противовоспалительное [6, 13-19] и жаропонижающее действие [6, 20]. Для ряда флавоноидных соединений показана антимикробная [15, 21-24] и противовирусная активность [6]. Представители группы изофлавоноидов обладают эстрогенным действием [2]. Флавоноиды могут выступать в качестве радиопротекторов [25] и как радиопотенциирующие средства [26, 27]. Флавоноиды оказывают положительное влияние на метаболизм печени, усиливая желчеотделение [28-30] и повышая детоксикационную функцию [6, 30, 31]. Ряд соединений обладает мочегонным действием [23, 32, 33], другие - повышают тонус кишечника [34, 35]. Показана анаболизирующая активность некоторых флавоноидных соединений [36], сахароснижающие свойства [37], нейротропное [19, 38], адаптогенное [35], антиатеросклеротическое [39-43] действия. Одним из важных свойств производных γ-пирона и других полифенольных соединений является их противоопухолевое действие. Противоопухолевая активность обнаружена у флавонов, флавонолов, лейкоантоцианидинов, катехинов и других представителей флавоноидов [6, 26, 27, 44-48]. В настоящее время антиоксидантной активности флавоноидов уделяется огромное внимание, как возможному механизму, через который реализуются биологические эффекты данной группы соединений [49-56]. Имеется большое количество работ, указывающих на взаимосвязь адаптогенных, иммуномодулирующих, противоопухолевых и ряда других свойств фенолов с их антиоксидантной активностью [57-72]. Широко известны такие растения, как солодка, календула, бессмертник, софора японская, зверобой, а также березовый гриб чага [1, 73, 74]. Их лечебное действие объясняют присутствием в них веществ фенольной природы (флавоноидов, танинов, кумаринов и др.). К растениям, содержащим вещества фенольной природы относится и персик. Целебные свойства этого растения известны с древних времен. Наиболее велика роль персика в древней китайской культуре, где он почитался как символ долголетия и ценился наряду с женьшенем, как тонизирующее и общеукрепляющее средство. Несомненный интерес вызывают материалы о применении экстрактов из плодов, листьев и цветков персикового дерева в медицине Древнего Китая, Кореи и Средней Азии [75-78]. ^ 1. ИЗУЧЕНИЕ ИММУНОМОДУЛИРУЮЩИХ СВОЙСТВ БАД «ОЛЕКСИН»Изучение влияния «Олексина» на первичный иммунный ответИсследование влияния «Олексина» на количество форменных элементов белой крови и морфометрические показатели тимуса и селезенки мышей при первичном иммунном ответе Мышей иммунизировали внутрибрюшинно субоп­тимальной дозой корпускулярного антигена - 5106 эритро­цитов барана в 0,5 мл изотонического раствора натрия хлорида. «Олексин» вводили один раз в сутки в течение 3-х дней перорально с помощью зонда в дозах 0,00125; 0,0025; 0,005; 0,01 и 0,02 мл/кг в 0,5 мл дистиллированной воды с иммунизацией антигеном через 1 час после последнего применения БАД. Контрольные животные получали по 0,5 мл дистиллированной воды по аналогичной схеме. Оценивали влияние БАД in vivo на массу и клеточ­ность центральных (тимуса) и периферических (селезенки) органов иммунитета, а также на показатели белой крови мышей. На 5-е сутки после иммунизации мышей забивали путем декапитации, собирали кровь для анализа гемограммы, вскрывали, выделяли тимус и селезенку. Органы взвешивали на торсионных весах. Для оценки динамики изменения массы органа введён коэффициент, представляющий собой процентное отношение массы органа данного животного к массе его тела. Количество лейкоцитов периферической крови мышей, лейкоцитарную формулу и клеточность органов иммунной системы оценивали по общепринятым методикам. Данные по влиянию «Олексина» на показатели белой крови мышей представлены в табл. 1. Установлено, что «Олексин» в дозе 0,01 мл/кг достоверно повышает количество лейкоцитов периферической крови мышей. В этой дозе, а также в дозе 0,005 мл/кг «Олексин» увеличивал и количество лимфоцитов периферической крови. БАД ни в одной из испытанных доз не оказала существенного влияния на количество нейтрофилов, эозинофилов и моноцитов периферической крови мышей. Об этом свидетельствует отсутствие статистически достоверных отличий между показателями опытной и контрольной групп мышей. Данные по изменениям весового коэффициента тимуса и селезенки (отношение массы органа к массе животного в процентах) и количества клеток в них представлены в табл. 2. Как видно из таблицы, в двух наименьших дозах «Олексин» оказал статистически значимое, по сравнению с контролем, увеличение массы и клеточности тимуса и селезенки. В наибольшей из доз он повышал только количество кариоцитов селезенки. Таблица 1 Влияние «Олексина» на состав лейкоцитов периферической крови мышей Группа живот-ных Доза, мл/кг Коли-чество наблю- дений Количест-во лейко-цитов кро-ви, х109/л Количество форменных элементов крови, х109/л Нейтрофилы п/яд с /яд Эози-нофилы Моно-циты Лимфо-циты Контроль 9 4,67  0,43 0,35 0,05 1,45 0,21 0,02 0,01 0,21 0,07 2,62 0,29 Олексин 0,02 8 5,00  0,77 0,38 0,09 1,38 0,38 0,01 0,007 0,23 0,05 2,99 0,41 0,01 8 6,08 0,4 * 0,46 0,08 1,71 0,16 0,01 0,01 0,18 0,02 3,69 0,23** 0,005 8 5,61  0,33 0,30 0,02 1,58 0,13 0,02 0,01 0,18 0,02 3,51 0,26* 0,0025 8 5,33  0,41 0,31 0,06 1,43 0,08 0,01 0,008 0,15 0,02 3,4 0,34 0,00125 8 5,15  0,19 0,33 0,07 1,64 0,13 0,01 0,009 0,1 0,02 3,03 0,20 Примечание. Здесь и в последующих таблицах и рисунках звездочками отмечены показатели, статистически значимо отличающиеся от контрольной группы с разными уровнями значимости: *- р  0,05; ** - р  0,01; *** - р  0,001. Таблица 2 Влияние «Олексина» на массу, клеточность тимуса и селезенки Группа животных Доза, мл/кг Количе- ство наблю-дений Весовой коэффициент, % ЯСК, х 106/орган 1. Тимус Контроль 9 0,30  0,01 67,7  8,7 Олексин 0,02 8 0,32  0,01 88,5  7,2 0,01 8 0,30  0,03 68,5  4,8 0,005 8 0,30  0,01 73,2  5,4 0,0025 8 0,37  0,02 * 110  4,3 *** 0,00125 8 0,38  0,01 ** 94,4  4,6 * 2. Селезенка Контроль 9 0,72  0,03 110,5  3,6 Олексин 0,02 8 1,10  0,26 172,519,8** 0,01 8 1,10  0,26 135,6  14,9 0,005 8 0,85  0,06 134,2  7,2* 0,0025 8 0,88 0,03 ** 161,06,1*** 0,00125 8 0,87  0,04 * 138,15,7*** 1.1.2. Изучение влияния «Олексина» на клеточный иммунный ответ Опыты выполнены на нелинейных мышах-самцах массой 18-20 г. Мышей сенсибилизировали эритроцитами барана 2·107, которые вводили внутрибрюшинно в 0,5 мл изотонического раствора натрия хлорида. «Олексин» вводили трехкратно в дозах 0,00125; 0,0025; 0,005; 0,01 и 0,02 мл/кг в 0,5 мл дистиллированной воды. Введение эритроцитов барана осуществляли одновременно с последним введением препарата. Контрольные животные получали по 0,5 мл дистиллированной воды по такой же схеме, что и опытные. На пятые сутки вводили разрешающую дозу эритроцитов барана (1108 клеток в 0,02 мл изотонического раствора натрия хлорида подкожно в подошвенную поверхность стопы задней лапы). В контрлатеральную лапу вводили в том же объеме растворитель (изотонический раствор натрия хлорида). Через 24 часа после разрешающей инъекции антигена оценивали выраженность иммунного воспаления по изменению толщины стопы. Развитие реакции гиперчувствительности замедленного типа у мышей контрольной группы проявилось появлением через 24 часа после разрешающей инъекции антигена иммунного воспаления, выраженность которого составила 16,4 ± 0,73 %. (табл. 3). Таблица 3Влияние «Олексина» на развитие реакции гиперчувствительности замедленного типа Группа животных Доза,мл/кг Количество наблюдений Выраженность иммунного воспаления(индекс реакции, %) Контроль 10 16,4  0,73 Олексин 0,02 10 7,8  0,57*** 0,01 10 7,9  0,37*** 0,005 10 14,9  0,41 0,0025 10 16,8  0,72 0,00125 10 9,2  0,63*** Введение «Олексина» в дозах 0,02; 0,01 и 0,00125 мл/кг приводило к угнетению развития реакции ГЗТ. ^ 1.1.3. Влияние «Олексина» на гуморальный иммунный ответ Мышей иммунизировали внутрибрюшинно субоп­тимальной дозой корпускулярного антигена - 5106 эритро­цитов барана в 0,5 мл изотонического раствора натрия хлорида. «Олексин» вводили один раз в сутки в течение 3-х дней перорально с помощью зонда в дозах 0,00125; 0,0025; 0,005; 0,01 и 0,02 мл/кг в 0,5 мл дистиллированной воды с иммунизацией антигеном через 1 час после последнего применения препарата. Контрольные животные получали по 0,5 мл дистиллированной воды по аналогичной схеме. К 5-му дню первичного иммунного ответа у контрольных мышей происходило накопление антителообразующих клеток в селезенке, их число составило 123,1 ± 3,46 на 106 ЯСК или 13646±683 на орган (табл. 4). При определении титра специфических антител на 7-е сутки опыта было выявлено, что уровень гемагглютининов у контрольных мышей (в виде отрицательного log2 титра антител) был равен 9,250,16 (табл. 5). Иммуностимулирующий эффект БАД проявился в дозах 0,00125; 0,0025; 0,005 и 0,02 мл/кг, о чем свидетельствовало увеличение абсолютного количества АОК на орган. В дозах 0,0025 и 0,005 мл/кг число АОК было выше показателей контроля не только в абсолютном, но и в относительном выражении (на 106 ЯСК селезёнки). Титр гемагглютинирующих антител (по -log2 титра) на 7-е сутки достоверно повысился у животных, получавших «Олексин» в дозах 0,02 и 0,0025 мл/кг (табл. 5). В дозе 0,01 мл/кг «Олексин» не влиял на гуморальный иммунный ответ. Таблица 4 Влияние «Олексина» на количество АОК при первичном иммунном ответе Группа животных Доза, мл/кг Коли-чество наблю-дений Число АОК на 106 ЯСК селезёнки Число АОК на селезенку Контроль 9 123,1  3,4 13646  683 Олексин 0,02 8 132,1  4,6 22475 2286** 0,01 8 131,8  2,7 17824 1924 0,005 8 143,0  7,4* 19089 1150** 0,0025 8 149,4 11,4* 24291 2374*** 0,00125 8 136,5  8,0 18829 1168** Таблица 5 Влияние «Олексина» на уровень антител при первичном иммунном ответе Группа животных Доза, мл/кг Количество наблюдений Титр гемагглютининов, (-log2 титра) Контроль 10 9,250,16 Олексин 0,02 10 10,250,16*** 0,01 10 9,620,26 0,005 10 9,870,29 0,0025 10 10,5 0,32** 0,00125 10 9,870,29 ^ 1.2. Характеристика иммунотропной активности «Олексина» на модели индуцированной циклофосфамидом иммуносупрессии В экспериментальной иммунопатологии для скрининга потенциальных иммуномодуляторов общепризнана модель иммунодефицита, индуцированного введением циклофосфамида (ЦФ). Экспериментальный иммунодефицит моделировали введением мышам-самцам массой 18-20 г внутрибрюшинно 100 мг/кг циклофосфа­мида (ЦФ) однократно и трехкратно (в течение 3-х дней 1 раз в сутки). На модели однократного введения ЦФ проводили исследование влияния «Олексина» на массу и клеточность органов иммунитета (тимуса и селезенки), показатели гемограммы животных, титр гемагглютининов в сыворотке крови и число АОК на высоте первичного иммунного ответа к эритроцитам барана (по методикам описанным выше). «Олексин» вводили перорально 1 раз в сутки в течение 3-х дней в дозах 0,00125; 0,0025; 0,005; 0,01 и 0,02 мл/кг в 0,5 мл дистиллированной воды. Иммунизацию осуществляли одновременно с последним введением препарата. «Олексин» начинали вводить через сутки после введения ЦФ. Показатели опытных групп животных сравнивались с результатами оценки в двух контрольных группах мышей: контроль 1 - животные, получавшие по 0,5 мл дистиллированной; контроль 2 – получавшие ЦФ и по 0,5 мл дистиллированной воды. У контрольных мышей, иммунизированных эритроцитами барана и не получавших циклофосфамид, на 5-е сутки первичного иммунного ответа количество лейкоцитов в крови составляло (х109/л) 6,8 ± 0,81, палочкоядерных нейтрофилов - 0,25±0,12, сегментоядерных нейтрофилов - 2,28 ± 0,36, эозинофилов - 0,04 ± 0,03, моноцитов - 0,23 ± 0,10, лимфоцитов 3,970,3. Однократное введение циклофосфамида (табл.6) животным за сутки до начала введения препарат (контроль 2) приводило к снижению общего количества лейкоцитов на 46,6 %, лимфоцитов на 60 %. Как видно из табл.6, «Олексин» в дозах 0,02 и 0,005 мл/кг восстанавливал сниженное ЦФ количество лейкоцитов. Восстановление общего количества лейкоцитов, наблюдаемое при введении БАД в дозах 0,02 и 0,005 мл/кг, связано с увеличением количества лимфоцитов. В дозе 0,0025 мл/кг «Олексин» также восстанавливал сниженное ЦФ количество лимфоцитов. Введение ЦФ (табл. 7) приводило к снижению массы тимуса мышей на 24%, массы селезенки на 29 %, количества тимоцитов на 32%, количества спленоцитов на 31,8 % в сравнении с аналогичными показателями у животных, не получавших иммунодепрессант (контроль 1). Применение «Олексина» в дозе 0,00125 мл/кг устраняло дефект иммунитета, проявляющийся уменьшением количества тимоцитов и спленоцитов, о чем свидетельствует полное восстановление исследуемых показателей. Таблица 6 Влияние «Олексина» на количество лейкоцитов и их состав в периферической крови мышей на фоне иммуносупрессии, вызванной однократным введением ЦФ Группа живот-ных Доза, мл/кг Коли-чество наблю-дений Количест-во лейко-цитов кро-ви, х109/л Количество форменных элементов крови, х 109/л Нейтрофилы п/яд с/яд Эозино-филы Моно-циты Лим-фоциты Контроль 1 9 6,8 0,81* 0,25 0,12 2,28 0,36 0,04 0,03 0,23 0,10 3,97 0,30 *** Контроль 2 9 3,63 0,75 0,20 0,08 1,61 0,46 0,01 0,008 0,17 0,07 1,62 0,19 Олек-син 0,02 9 7,41 0,81** 0,39 0,09 2,32 0,39 0,01 0,01 0,32 0,13 4,35 0,38*** 0,01 8 5,86  0,89 0,35 0,06 2,67 0,80 0,01 0,01 0,34 0,26 2,47 0,44 0,005 9 5,64 0,48 * 0,20 0,04 1,92 0,27 0,02 0,01 0,28 0,05 2,80 0,38* 0,0025 9 5,54 0,58 0,21 0,04 2,40 0,26 0,02 0,01 0,21 0,04 2,68 0,31* 0,00125 8 4,76  0,27 0,21 0,03 2,58 0,14 0,03 0,01 0,21 0,05 1,71 0,23 Примечание. Здесь и в табл.7-10, 13-20: *; **; *** – относительно контроля 2. Введение ЦФ животным (контроль 2) вызывало угнетение накопления АОК в селезенке (табл. 8) и уменьшение количества антител, образующихся к эритроцитам барана (табл. 9). «Олексин» нормализовал нарушенные ЦФ показатели. Нивелирование иммуносупрессирующего действия ЦФ проявилась увеличением под влиянием БАД в дозах 0,02, 0,01 и 0,00125 мл/кг уровня антителообразующих клеток в селезёнке и уровня гемагглютининов во все апробируемых дозах. При этом установлено, что наибольшие сдвиги в титре антител вызвало применение меньшей из использованных доз (табл. 9). Таблица 7Влияние «Олексина» на массу, клеточность тимуса и селезенки на фоне иммуносупрессии, вызванной однократным введением ЦФ Группа живот-ных Доза, мл/кг Количество наблюдений Весовой коэффициент, % ЯСК, х106/орган 1.Тимус Контроль 1 9 0,37 0,02* 132,515,7* Контроль 2(ЦФ) 9 0,28  0,02 89,210,4 Олек-син 0,02 9 0,33  0,02 116,816,1 0,01 8 0,31  0,03 98,214,1 0,005 9 0,28  0,02 96,011,9 0,0025 9 0,23  0,02 91,69,4 0,00125 8 0,27  0,01 138,58,9 ** 2.Селезенка Контроль 1 9 1,240,09* 285,525,3* Контроль 2(ЦФ) 9 0,880,09 194,519,9 Олек-син 0,02 9 1,320,19 228,334,5 0,01 8 1,340,15* 261,7  41,1 0,005 9 1,340,07** 223,1  20,3 0,0025 9 1,290,13* 183,3 15,2 0,00125 8 1,340,14 * 270,7 16,7* Таблица 8 Влияние «Олексина» на количество АОК при первичном иммунном ответе на фоне иммуносупрессии, вызванной однократным введением ЦФ Группа животных Доза, мл/кг Количество наблюдений Число АОК на 106 ЯСК селезёнки Число АОК на селезенку Контроль 1 9 95,7718,38** 272085558** Контроль 2(ЦФ) 9 37,11 4,78 75031228 Олексин 0,02 9 94,7519,00** 196293774** 0,01 8 76,5 17,08* 186164058* 0,005 9 51,0 13,33 117313215 0,0025 9 48,2515,70 76582029 0,00125 8 85,5 14,02** 229573807** Таблица 9 Влияние «Олексина» на уровень антител при первичном иммунном ответе на фоне иммуносупрессии, вызванной однократным введением ЦФ Группа животных Доза, мл/кг Количество наблюдений Титр гемагглютининов, (-log2 титра) Контроль 1 10 9,370,18* Контроль 2 (ЦФ) 10 8,750,16 Олексин 0,02 10 10,00,18*** 0,01 10 9,250,16* 0,005 10 10,250,16*** 0,0025 10 9,250,17* 0,00125 10 10,620,18*** ^ 1.3. Характеристика иммунотропной активности «Олексина» на модели глубокой иммуносупрессии На модели глубокого иммунодефицита, достигнутого трехкратным внутрибрюшинным введением циклофосфамида в дозе 100 мг/кг мышам массой 18-20 г, изучено влияние «Олексина» на титр гемагглютининов к эритроцитам барана по методике и количество Т-лимфоцитов селезенки в цитотоксической реакции с антитимоцитарной сывороткой. «Олексин» использовали однократно перорально в дозах 0,0025; 0,01 и 0,02 мл/кг через сутки после последнего введения ЦФ. Трехкратное введение циклофосфамида (табл. 10) животным (контроль 2) вызвало снижение количества Т-лимфоцитов на 30 % и титра гемагглютининов на 23%. Таблица 10 Влияние «Олексина» на число Т-лимфоцитов и титр гемагглютининов в селезенке на фоне иммуносупрессии, вызванной трехкратным введением ЦФ (n=10 в каждой группе) Группа животных Доза, мл/кг Т- лимфоциты, % Титр гемагглютининов, (-log2 титра) Контроль 1 44,8  1,97*** 11,2  0,3*** Контроль 2 (ЦФ) 32,2  1,70 8,6  0,2 Олексин 0,02 34,8  1,60 9,6  0,4* 0,01 26,0  3,20 8,0  0,3 0,0025 59,0  5,50*** 12,8  0,2*** Как видно из табл. 10, «Олексин» в наименьшей из доз полностью восстанавливал сниженное трехкратным введением циклофосфамида количество Т-лимфоцитов и повышал титр гемагглютининов к эритроцитам барана.^ 1.4. Изучение влияния «Олексина» на фагоцитарную активность макрофагов1.4.1. Влияние «Олексина» на функцию перитонеальных макрофагов и макрофагов селезенки На беспородных мышах-самцах массой 18-20 г изучено влияние «Олексина» на функциональную активность перитонеальных и селезеночных макрофагов в отношении микробных частиц инактивированного Staphylococcus aureus штамма 209Р. «Олексин» вводили однократно внутрижелудочно в дозах 0,001; 0,01 и 0,1 мл/кг. В качестве контроля использованы животные, которым вводили эквиобъемное количество дистиллированной воды. Макрофаги выделяли по общепринятым методикам. Концентрацию клеток в полученных суспензиях доводили до 5х106/мл. Затем в культуру вносили частицы Staphylococcus aureus. О фагоцитарной функции макрофагов судили по изменению процента фагоцитоза и фагоцитарного числа. Исследование фагоцитарной активности показало, что БАД активирует фагоцитоз ^ Staphylococcus aureus штамма 209Р перитонеальными макрофагами мышей во всех исследованных дозах, что проявляется увеличением как процента фагоцитоза, так и фагоцитарного числа (табл. 11). Введение «Олексина» во всех апробируемых дозах повышало количество макрофагов селезенки, участвующих в захвате микробных частиц Staphylococcus aureus (процент фагоцитоза). В наименьшей дозе (0,001 мл/кг) “Олексин” повышал и фагоцитарное число (табл.12). Таблица 11 Влияние «Олексина» на фагоцитоз перитонеальными макрофагами ^ Staphylococcus aureus штамма 209Р (n=10 в каждой группе) Группа животных Доза, мл/кг Процент фагоцитоза Фагоцитарное число Контроль 70,8  3,2 1,89  0,11 Олексин 0,1 83,5  2,2** 2,78  0,35* 0,01 89,0  1,5*** 3,17  0,40** 0,001 92,6  2,3*** 3,78  0,29*** Таблица 12 Влияние «Олексина» на фагоцитарную активность макрофагов селезёнки в отношении ^ Staphylococcus aureus штамма 209Р (n=10 в каждой группе) Группа животных Доза, мл/кг Процент фагоцитоза Фагоцитарное число Контроль 76,0  0,94 2,21  0,11 Олексин 0,1 86,0 2,11*** 2,60  0,17 0,01 86,4 1,94*** 2,42  0,06 0,001 89,2 2,58*** 2,75  0,17* ^ 1.4.2. Влияние «Олексина» на функциональную активность макрофагов селезенки на фоне иммуносупрессии Патологическое снижение активности макрофагов в организме может стать одним из главных звеньев в патогенезе вторичных иммунодефицитов. Поэтому представлялось целесообразным изучение влияния «Олексина» на фагоцитарную активность макрофагов в модели лекарственной (циклофосфамидиндуцированной) иммуносупрессии. «Олексин» во всех апробируемых дозах оказал стимулирующее воздействие на фагоцитарную активность макрофагов селезенки, сниженную однократным введением циклофосфамида в дозе 100 мг/кг за сутки до введения препарата (табл. 13). При этом необходимо отметить, что наибольшую эффективность проявила наименьшая доза. Таблица 13 Влияние «Олексина» на фагоцитарную активность макрофагов селезёнки в отношении ^ Staphylococcus aureus штамма 209Р на фоне иммуносупрессии (n=10 в каждой группе) Группа животных Доза, мл/кг Процент фагоцитоза Фагоцитарное число Контроль1 76,0 1,9 * 2,21  0,13 * Контроль2 64,6 1,3 1,79  0,13 Олексин 0,1 78,6 1,8 *** 2,20  0,27 0,01 83,6 2,8 *** 2,64  0,35 * 0,001 84,0 3,1 *** 2,69  0,24 ** ^ 1.5. Характеристика влияния «Олексина» на иммунную систему мышей, подвергнутых иммобилизационному стрессуДля изучения биологического действия «Олексина» на иммунную систему животных, подвергнутых стрессу, осуществляли 9-часовую иммобилизацию мышей-самцов массой 18-20 г в пластмассовых клетках в положении на спине. «Олексин» вводили перорально один раз в сутки в течение 3-х дней в дозах 0,00125; 0,005 и 0,02 мл/кг в 0,5 мл дистиллированной воды. Контрольные животные, подвергавшиеся иммобилизации (контроль 2), получали по 0,5 мл дистиллированной воды по той же схеме. Для анализа выраженности стрессорной реакции использовали дополнительный контроль – животные, получавшие в течение 3-х суток дистиллированную воду, но не подвергавшиеся иммобилизации (контроль 1). Оценивали влияние БАД in vivo на клеточ­ность и/или массу центральных (тимуса, костного мозга) и периферических (селезенки, паховых лимфатических узлов) органов иммунитета, на показатели гемограммы, а также на фагоцитарную активность нейтрофилов периферической крови и макрофагов селезенки, костного мозга и лимфатических узлов. Животных забивали декапитацией, собирая кровь для определения количества эритроцитов и лейкоцитов, изучения нейтрофильного фагоцитоза формализированных эритроцитов барана (ФЭБ). Количество эритроцитов, лейкоцитов периферической крови мышей и лейкоцитарную формулу оценивали по общепринятой методике. Выделение органов, определение их массы и весового коэффициента проводили по вышеописанной методике. Влияние препарата на фагоцитарную активность нейтрофилов периферической крови оценивали по модифицированному методу В.Н. Каплина (1993). Для изучения влияния препарата на фагоцитарную активность нейтрофилов к 0,025 мл гепаринизированной крови добавляли 0,0125 мл ФЭБ в концентрации 200.106/мл , 0,0125 мл полной питательной среды (ППС) с НЕРЕS, встряхивали и инкубировали в течение 30 минут при +37С. Далее готовили мазки по вышеописанной схеме. Фагоцитарную активность клеток анализировали по проценту фагоцитоза, фагоцитарному числу, фагоцитарному индексу (количество объектов фагоцитоза, которое приходится на одну фагоцитирующую клетку). Рассчитывали также абсолютное количество участвующих в фагоцитозе нейтрофилов крови, исходя из абсолютного числа нейтрофилов и процента фагоцитоза, и абсолютное число объектов фагоцитоза (фагоцитарное число, умноженное на абсолютное количество нейтрофилов). Помимо этого, проведена оценка показателей фагоцитоза в клеточных суспензиях органов лимфомиелоидного комплекса по методу Ю.И.Шилова и С.В. Гейна (1998). Показатели фагоцитоза, учитывая сложности идентификации нефагоцитирующих макрофагов и их дифференциации от дендритных и других сходных по морфологии клеток, рассчитывали по отношению ко всем ядросодержащим клеткам клеточных суспензий. ^ 1.5.1 Влияние «Олексина» на гемограмму и морфометрические показатели органов лимфомиелоидной системы мышей, подвергнутых иммобили-зационному стрессу Изучение относительных показателей периферической крови животных, подвергнутых иммобилизации (контроль 2), выявило характерные для стресса изменения в структуре лейкоцитарной формулы: уменьшение лимфоцитов и эозинофилов и увеличение сегментоядерных нейтрофилов (табл. 14). Снижение количества эозинофилов и увеличение количества сегментоядерных нейтрофилов в периферической крови данной группы животных присутствовало и в абсолютных цифрах (табл. 15). «Олексин» практически не влиял на показатели белой крови, за исключением некоторого снижения количества палочкоядерных нейтрофилов при применении препарата в дозе 0,005 мл/кг (табл. 14 и 15). У контрольных и опытных групп животных отсутствовала существенная разница в количестве эритроцитов.Таблица 14 Влияние «Олексина» на относительные показатели белой крови мышей на фоне иммобилизационного стресса Группа животных Доза, мл/кг Количество наблюдений Нейтрофилы п/яд,% с/яд,% Эозинофилы,% Моноциты, % Лимфоциты, % Контроль 1 10 12,0 1,9 19,5  2,8* 0,37 0,15* 2,3  0,7 65,7  4,66* Контроль 2 (стресс) 10 12,7 2,3 29,8  3,3 0 4,8  1,7 52,4  4,15 Олексин 0,02 10 10,0 2,0 31,5  3,6 0,09 0,09 4,2  1,1 54,1  5,69 0,005 10 4,2 1,0* 36,0  5,4 0 2,4  0,6 57,3  5,54 0,00125 10 8,7 1,7 27,7  3,6 0,10 0,10 3,4  1,0 60,1  1,02 Таблица 15 Влияние «Олексина» на количество эритроцитов и лейкоцитов и их состав в периферической крови мышей на фоне иммобилизационного стресса (n = 10 в каждой группе) Группа животных Доза, мл/кг Эритро-циты, х1012/л Лейко-циты, х109/л Количество форменных элементов крови, х 109/л Нейтрофилы п/яд с/яд Эозинофилы Моноциты Лимфоциты Контроль 1 8,0 0,4 4,1 0,2 0,500,08 0,83 0,14* 0,015 0,004* 0,09 0,03 2,73 0,25 Контроль 2 (стресс) 8,2 0,4 4,7 0,4 0,580,14 1,42 0,21 0 0,19 0,07 2,52 0,27 Олексин 0,02 7,6 0,8 5,0 0,5 0,510,13 1,68 0,32 0,001 0,001 0,22 0,07 2,52 0,38 0,005 8,5 0,5 3,6 0,3 0,140,03* 1,38 0,28 0 0,08 0,01 2,03 0,21 0,00125 9,2 0,5 3,9 0,4 0,340,07 1,15 0,26 0,002 0,002 0,14 0,04 2,32 0,25 Иммобилизация животных вызывала существенное изменение морфометрических показателей органов иммунной системы (табл. 16). У мышей, подвергнутых стрессу (контроль 2), происходило уменьшение массы и клеточности тимуса, селезенки и лимфатических узлов. Влияние стресса на клеточность костного мозга носило противоположный характер и проявлялось увеличением количества кариоцитов. Применение «Олексина» в наибольшей дозе (0,02 мл/кг) приводило к восстановлению измененных морфометрических показателей тимуса, костного мозга, селезенки, лимфатических узлов (табл. 16). При введении «Олексина» в дозе 0,00125 мл/кг происходило увеличение числа клеток тимуса сниженного стрессом. Таблица 16 Влияние «Олексина» на массу и клеточность тимуса, селезенки, периферических лимфатических узлов (паховых) и клеточность костного мозга на фоне иммобилизационного стресса (n=10 в каждой группе) Группа живот-ных Доза, мл/кг Тимус Селезенка Лимфатические узлы Костный мозг Весовой коэффи-циент, % ЯСК х106 /ор-ган Весовой коэффи-циент, % ЯСК х106 /ор-ган Весовой коэффи-циент, % ЯСК х106 /ор-ган ЯСК х106 /ор-ган Контроль 1 0,330,04* 129,0 16,2*** 0,550,09 89,5  9,2** 0,200,01** 13,68  2,31** 9,43  2,66* Контроль 2 (стресс) 0,190,01 47,5  5,5 0,320,05 49,7  7,5 0,120,01 5,34  0,73 20,46  2,02 Олек-син 0,02 0,270,02* 95,1 16,5* 0,760,15* 119,3 17,3** 0,160,01 8,28  0,72* 13,78  1,91* 0,005 0,160,01 37,5  5,2 0,440,10 62,0  7,3 0,090,02 6,11  1,16 16,06  1,98 0,00125 0,190,02 69,4  5,7* 0,240,02 50,5  5,41 0,080,03