Эколого-биохимические исследования в модельной водной
экосистеме
И. К. Проскурина, К. Е. Гусева, А. Е. Агапова
Исследования
влияния различных химических соединений на биологические молекулы, в том числе
на ферменты, весьма актуальны в настоящее время, поскольку они дают возможность
выявить новые тест-функции для мониторинга окружающей среды.
Большое
количество работ посвящено изучению влияния соединений тяжелых металлов на
живые организмы растительного и животного происхождения [1, 8, 9, 12]. В
меньшей степени в литературе представлены данные о влиянии органических
соединений [8]. Целью данной работы явилось исследование влияния фенола и
N,N'-диметилмочевины на активность катала-зы элодеи канадской, содержащейся в
модельном водоеме.
Каталаза
(КФ 1.11.1.7) - весьма распространенный фермент, она находится почти во всех
аэробно дышащих клетках и у некоторых факультативных анаэробов. Функция
каталазы заключается в защите организма от активных кислородсодержащих
радикалов и пероксида водорода [5,7]. Активность каталазы весьма различна не
только в разных организмах одного и того же вида или разновидности, но и у
одного и того же организма в различных его органах в зависимости от возраста
или стадии развития, от физиологического состояния и от многих других причин.
Исследования показали, что отклонения от среднестатистического значения в
активности каталазы могут доходить до 250%. Эти данные показывают, с какой
осторожностью надлежит относиться к выводам об активности каталазы в
зависимости от вида и рода живого организма или от внешнего воздействия [7].
Вот почему исследования влияния каких-либо токсикантов на активность каталазы
целесообразно проводить в модельной экосистеме, это позволит исключить влияние
других факторов
на
активность исследуемого фермента и перенести полученные результаты на
естественные водоемы. Моделирование экологических процессов и проведение
эколого-биохими-ческих исследований включает в себя разработку моделей для
понимания, предсказания и оценки нынешних и вероятных будущих воздействий и
реагирования экосистем на множество стрессов на разных уровнях. Модельная
экосистема позволяет имитировать поведение системы или ее компонентов при
заданных условиях, не прибегая к проведению эксперимента над всей системой и
обеспечивая сохранение внешних условий, близких к естественным, а также
позволяет формировать требуемые начальные и текущие условия эксперимента и
эффективный контроль в течение заданного промежутка времени [3, 6, 13].
Созданная нами модель водной экосистемы включает элементы концептуальной и
имитационных моделей. Имитационные модели - это уменьшенные копии отдельных
подсистем; концептуальные модели представляют собой блоковые схемы воздействия
тех или иных подсистем в пределах более широких систем. Каждая модель должна
иметь постоянные факторы и ряд переменных. Для модели водной экосистемы такими
переменными могут быть объем воды, концентрация кислорода, температура и рН
воды, количество водных организмов, содержание химических соединений.
Предпочтительно, чтобы модель включала 2 переменных фактора. Используемая в
нашем эксперименте модель включает следующие факторы: а) постоянные -общий
объем воды (9 л), прозрачность воды, количество и состав грунта (0,5 кг),
температурный режим (18-19 °С), освещенность, количество растений;
б)
переменные - концентрация токсиканта - фенола или N,N'-диметил-мочевины, время
воздействия токсиканта. Важной составляющей в работе с биологическими моделями
является статистический метод обработки полученных данных, так как
исследователь всегда имеет дело с конкретной особью, у которой видовые качества
в какой-то мере маскируются индивидуальными особенностями, связанными с его
функциональными свойствами, - это индивидуальные отклонения в ту или иную
сторону от «видового усреднения». Поэтому для исключения индивидуальных
отклонений и выявления общих закономерностей все эксперименты были выполнены в
3-х биологических и 5-7 аналитических последовательностях.
Методы исследования
В
качестве исходного материала для исследований использовался экстракт стеблей и
листьев элодеи канадской, взятой из прудов Петропавловского парка г. Ярославля.
Экстракт приготовляли путем гомогенизации 0,5 г листьев и стеблей элодеи с
небольшим количеством кварца и дистиллированной воды. Затем полученную массу
переносили в мерную колбу на 25 мл и доводили до метки дистиллированной водой.
Экстракт немедленно фильтровали и использовали для исследований.
Активность
каталазы определяли колориметрическим методом [4]. Принцип метода основан на
способности перокси-да водорода образовывать с солями молибдена стойкий
окрашенный комплекс. В опыте использовались холостая, контрольная и опытная
пробы. В каждую пробу вносили 1 мл трис-HCl буфера рН=7,8, в холостую и опытные
- по 2 мл пероксида водорода, а в контрольную - 2 мл дистиллированной воды; в
контрольную и опытные пробы затем прибавляли по 0,1 мл экстракта элодеи
канадской. Реакцию останавливали через 10 минут добавлением 1 мл 4%-ного
раствора мо-либдата аммония во все пробирки, после этого в холостую пробу
приливали 0,1 мл экстракта. Интенсивность окраски в каждой пробе измеряли на
ФЭКе при длине волны 410 нм против контрольной пробы. Активность каталазы
рассчитывали по формуле:
Е
= (А хол - А оп)*V*t*K, где Е - активность каталазы (мкат/мл); Ахол и Аоп -
экстинкция холостой и опытной проб;
V
- (0,1 мл) объем вносимой пробы; t - время инкубации;
К
- коэффициент миллимолярной экс-тинкции Н2О2 (22,2 * 103 мМ-1*см-1) В
эксперименте использовались различные концентрации токсикантов: фенола -1, 5,
10, 20 ПДК - [1 ПДК = 0,001 мг/л]; N,N'- диметилмочевины - 1, 5, 10, 20 ПДК (по
данным ПДК мочевины) - [1 ПДК = 0,001 мг/л]. Выбор концентрации токсикантов не
был случайным. Онова-нием служили данные ГорСЭС 2001 г. по содержанию фенола в
реке Волга (3 ПДК) и в реке Которосль (6 ПДК) в черте города.
Результаты исследований
Исследования
проводились в период май-июнь и сентябрь-ноябрь 2000-2002 гг. Определение
активности каталазы элодеи канадской в отсутствии токсиканта показало сезонные
изменения: так, в летний период активность составляла 22200±890 мкат/мл., а в
осенний - 33300±2000 мкат/мл., то есть осенью активность каталазы на 30% выше.
Вероятно, повышение активности каталазы в осенний период связано с накоплением
за период вегетации перекисных соединений.
До
изучения влияния токсикантов на активность каталазы интересно было исследовать
изменение активности фермента во времени при содержании элодеи канадской в
искусственном водоеме. Измерение активности проводили в течение 20 суток через
каждые 2-е суток. Эти эксперименты показали, что активность исследованного
фермента не изменяется на протяжении восьми суток, а затем плавно начинает
расти (рис. 1). На 15-е сутки наблюдается увеличение активности в 1, 25 раза по
сравнению с первыми сутками. Поэтому исследование влияния токсикантов проводили
в течение восьми суток с тем, чтобы исключить естественные временные изменения
активности каталазы.
Рис.
1. Сезонные изменения активности каталазы элодеи канадской (при содержании в
чистом модельном водоеме)
Исследование
влияние фенола в разных концентрациях на активность каталазы элодеи канадской
(табл.1) показало, что активность исследуемого фермента не изменяется при
воздействии токсиканта в концентрации 1 ПДК, что и следовало ожидать, так как
ПДК - это предельно допустимая концентрация вещества, не оказывающая
какого-либо вредного воздействия на организм. При воздействии фенола в
концентрации 5 ПДК происходит незначительное падение активности каталазы на 2-е
(18%) и 5-е (5%) сутки и снижение активности фермента (более 35%) на 8-е сутки
содержания растения в загрязненном фенолом водоеме.
Резкие
колебания активности каталазы наблюдаются при воздействии фенола в концентрации
10 ПДК. По истечении 2-х суток воздействия фенола активность каталазы падает
почти в 2,5 раза, на 5-е сутки, напротив, увеличивается в 2 раза по сравнению с
контролем, а на 8-е сутки вновь падает ниже значения контрольной пробы.
Исследование воздействия фенола в концентрации 20 ПДК показало, что активность
каталазы сначала возрастает на 20%, а потом постепенно падает. Такие изменения
активности каталазы еще раз подтверждают данные о сложности взаимодействия
фенола с растениями [2]. Как было ранее установлено [10, 11], фе-нольные
соединения реагируют с растениями быстро, однако они химически неустойчивы и
разлагаются в водной среде путем прямого окисления или с участием фенолоксидаз
растительного происхождения. Промежуточные продукты окисления фенолов - хиноны
- имеют высокую реакционную способность и могут рассматриваться как вторичные
токсины.
В
нашем исследовании, вероятно, на 5-е сутки воздействия фенола в концентрации 10
ПДК происходит накопление пе-рекисных соединений, что приводит к увеличению
активности каталазы, дальнейшее содержание элодеи в загрязненном водоеме ведет
к истощению резервов растения, что приводит к его гибели на 20-е сутки.
Таблица
1
Активность
каталазы элодеи канадской при воздействии фенола
Концентрация N,N'-
диметилмо-чевины
Активность каталазы (мкат/л)
при воздействии фенола
контроль
2-е сутки
5-е сутки
8-е сутки
1ПДК
22200±900
22200±900
22300+1000
22500±4000
5 ПДК
22200±900
18200±1170
21300±760
14600±1300
10ПДК
22200±900
9800±430
45730±900
20400±900
20ПДК
22200±900
27000±1170
21000±700
19500±440
Результаты
исследования активности каталазы элодеи канадской в случае загрязнения
модельного водоема N,N'- диметилмочевины в концентрации 1, 5, 20 ПДК
представлены в табл. 2.
Таблица
2
Активность
каталазы элодеи канадской при воздействии N, N' - диметилмочевины
Концентрация N,N'-
диметилмочевины
Активность каталазы (мкат/мл)
контроль
2-е сутки
5-е сутки
8-е сутки
1ПДК
33300±750
33300±400
32200±400
33100±550
5 ПДК
33300±750
31100±1400
16400±1200
14700±900
юпдк
33300±750
28100±1200
26600±1500
17300±1700
20ПДК
33300±750
25700±900
22600±1500
11500±1200
Как
видно из представленных данных, N,N'-диметилмочевина в концентрации 1 ПДК не
оказывает влияния на активность исследуемого фермента (рис.2). При воздействии
токсиканта в концентрации 5, 10 и 20 ПДК наблюдается понижение активности
каталазы во времени. Такое падение активности фермента может быть вызвано двумя
причинами: либо NN-диметилмочевина снижает синтез белка в элодее, либо продукты
метаболизма токсиканта in vivo ингибируют каталазу.
Сравнивая
результаты, полученные при загрязнении модельного водоема фенолом и
N,N'-диметилмочевиной, можно констатировать, что выбранные токсиканты оказывают
разное действие на активность каталазы элодеи канадской, что позволяет сделать
заключение о разных механизмах воздействия выбранных токсикантов и их
метаболитов на каталазу элодеи канадской.
Список литературы
1.
Будников Г.К. Тяжелые металлы в экологическом мониторинге водных систем // СОЖ.
1998. №5. С. 238.
2.
Ганочкин Л.Д., Плеханов С.Е., Баттах М., Максимов В.Н. Адаптационно-токсикологические
аспекты комбинированного действия фенола, меди и кадмия на зеленые
микроводоросли // Вестник Московского университета, сер. Биология. 1995. №3. С.
41.
3.
Гурман В.И., Дыхта Д.И. Эколого-экономические системы: модели, информация.
Новосибирск: Наука, 1987. С. 80-123.
4.
Королюк М.А., Иванова Л.И., Майорова Н.О., Токарев В.Е. Метод определения
активности каталазы // Лабораторное дело. 1988. №1. С. 16.
5.
Краткая химическая энциклопедия. М.: Советская энциклопедия, 1963. С. 455-456.
6.
Мизинцев В.П. Применение моделей и методов моделирования в дидактике. М.:
Знание, 1977. С. 4-7,26-31.
7.
Михлин Д.М. Биохимия клеточного дыхания. М.: АН СССР, 1960. С. 246-260.
8.
Пурмаль А.П. Антропогенная токсикация планеты // СОЖ, 1998. №9. С. 39-52.
9.
Ровинский Ф.Я. Методы анализа загрязнения окружающей среды: токсичные металлы и
радионуклиды. М.: Атомиздат, 1978. С. 85-112.
10.
Роговин В.В., Муштакова В.М., Фомина В.А. Действие некоторых ксенобиотиков на
зависимый от пе-роксидазы иммунитет растений // Известия РАН. 1996. №5. С. 613.
11.
Стом Д.И. Фитотоксичность и механизмы детоксикации фенолов водными растениями /
Автореф. дисс. ... д-ра хим. наук. Киев, 1982. С. 3-6, 13-28, 37-38.
12.
Трахтенберг И.М. Тяжелые металлы во внешней среде. Минск: Наука и техника, 1994.
195 c.
13.
Фиштейн Г.Н. Моделирование экосистем на основе одноклеточных организмов. М.:
МГУ, 1983. С. 186-223.
14.
Экологические исследования в управлении исследований и разработок агентства по
охране окружающей среды США: обзор новых направлений // Проблемы окружающей
среды и природных ресурсов. 2001. №12. С. 21-28.
Для
подготовки данной работы были использованы материалы с сайта http://www.yspu.yar.ru