Полимерные сорбенты для распределительной хроматографии
Ограниченный рабочий диапазон рН и сорбционная активность остаточных силанольных групп сорбентов на основе силикагеля стимулировали разработку полимерных сорбентов для распределительной хроматографии, в которой устранены указанные недостатки.
Первый сорбент этого типа, названный PRP-1 {Polymer Reversed Phase}, разработан фирмой «Гамильтон». Он представляет собой жесткий стирол-дивинилбензольный гель с удельной поверхностью 415 м2/г, объемом пор 0,79 cм3/г и средним диаметром пор 7,5 нм, который выдерживает давление до 28 МПа. Более 98% его сферических частиц имеют диаметр 10 мкм, что обеспечивает высокую эффективность (40 000т. т./м) и низкое сопротивление колонок. Фирма выпускает также готовые колонки с PRP-1 длиной 150 и 250 мм с внутренним диаметром 4,1 мм.
Еще большую эффективность имеет сорбент PRP-1 с размером зерен около 5 мкм, который выпускают с 1984 г. набитым в колонки размером 150Х4,1 мм. По селективности данный материал подобен обращенно-фазным сорбентам C18 но работоспособен в диапазоне рН=1-13 при концентрации буферных солей до 0,5-1 М. Кроме того, его можно использовать в эксклюзионной хроматографии для разделения молекул с молекулярной массой от 2Х103 до 105, а также в ион-парной хроматографии.
Сорбенты RS-пак серии D фирмы «Шова Денко», изготовленные на основе различных пористых полимеров, перекрывают широкий диапазон полярности. Эти материалы имеют размер зерен 6 мкм и выпускаются набитыми в колонки размером 150Х8 мм с гарантированной эффективностью 5000 т. т. (для DM-614-4000 т. т.) на колонку.
Сорбент DS-613 представляет собой гидрофобный полистирольный гель, похожий на PRP-1. Материалы DE-613, DM-614 и ДС-613 изготавливают на базе полиметакрилата, гидрофильного сложного полиэфира и полистирола с гидрофильными дестителямя соответственно. Сорбент ДМ-614 по полярности эанимает промежуточное положение между привитыми сорбентами C8 и Np и может применяться как в обращенно-фазном, так и в нормально-фазном варианте ВЭЖХ.
Все сорбенты RS-пак серии D устойчивы в диапазоне pH=2-12, характеризуются практически полной адсорбционной инертностью и высокой разделяющей способностью.
Наряду с перечисленными выше материалами выпускаются также некоторые полимерные сорбенты специального назначения. Примером может служить колонка «µ-сферогель - 7,5% карбогидрат», предназначенная для анализа низших олиго-сахаридов и полиолов. Сферический сорбент, которым заполнена эта колонка, представляет собой кальциевую соль сульфированHOГO стирол-дивинилбензольного геля с плотностью сшивки 7,5% и диаметром зерна 8 мкм. Размеры колонки 300Х7,5 мм, рабочая температура 80-90 °С, предел давления 7 МПа, максимальная скорость подвижной фазы (вода, возможна добавка до 30% ацетонитрила) 0,6 мл/мин, гарантированная эффективность 27000 т. т./м. На рис. 3 показана хроматограмма смеси сахаридов на этой колонке.
Последние достижения по использованию полимерных сорбентов в ВЭЖХ рассмотрены работе, где описано их применение для разделения аминокислот и органических кислот, пептидов, белков, углеводов, неорганических ионов и различных полимеров.
Сорбенты для эксклюзионной хроматографии
В эксклюзионной хроматографии разделение происходит на колонках, заполненных пористыми сорбентами (гелями), которые должны иметь большой объем пор, выдерживать достаточно высокие давления и не взаимодействовать с анализируемыми веществами. Эти сорбенты подразделяются на две группы, каждая из которых имеет свои достоинства и недостатки-полужесткие (органические) и жесткие (неорганические) гели. Последний не являются гелями в собственном смысле этого слова, так как их пористая структура сформирована заранее и не связана с набуханием в растворителе. Такие материалы принято называть аэрогелями.
Главной характеристикой сорбентов для эксклюзионной хроматографии является размер пор, определяющий диапазон молекулярных масс, которые можно разделить на данном геле. Этот диапазон определяют по соответствующей калибровочной кривой, построенной в координатах VR-lg M. Сорбенты с очень узким распределением пор по размерам характеризуются высокой разрешающей способностью в небольшом диапазоне молекулярных масс. Напротив, более широкое распределение пор приводит к увеличению диапазона разделения за счет снижения разрешающей способности. Наилучшими характеристиками обладают сорбенты с умеренно узким распределением пор, которые имеют максимальную длину линейного участка калибровки.
В связи с практической важностью данных по диапазонам проницаемости в этом разделе приведены калибровочные кривые для многих наиболее известных материалов. Последние существенно облегчают сравнение и правильный выбор сорбентов для решения конкретных аналитических задач.
Полужесткие гели
Эти органические гели представляют собой сшитые сополимеры с большой плотностью сшивки, способные ограниченно набухать в используемых растворителях.
Гидрофильные гели предназначены для работы в водных растворах, а гидрофобные - в органических средах. Наиболее типичными представителями полужестких гелей являются сшитые сополимеры стирола с дивинилбензолом с размером частиц 10 мкм и менее, предназначенные для работы в органических растворителях. Они выпускаются с широким набором пор, охватывающим весь возможный диапазон разделения по молекулярной массе (от 102 до 108) и выдерживают давление до 10-20 МПа. Эти материалы поступают в продажу только в виде готовых колонок с эффективностью до 20-50 тыс. т.т./м, которые широко применяют для исследования синтетических полимеров и олигомеров. Размер пор стирол-дивинилбензольных гелей нельзя измерить абсолютными методами, к тому же для одного и того же сорбента в разных растворителях он неодинаков, так как набухаемость геля в них различна. Поэтому для этих материалов размер пор оценивают в условных единицах, представляющих собой максимальную длину вытянутой цепи молекулы трансполистирола в ангстремах, которая уже не способна проникать в поры геля, при использовании тетрагидрофурана в качестве подвижной фазы.
Большинство колонок со стирол-дивинилбензольными гелями можно использовать при температурах до 140-150 °С, что позволяет проводить разделение наиболее трудно растворимых димеров, например полипропилена. Ассортимент подвижных раз, совместимых с этими материалами, ограничен главным образом тетрагидрофураном, ароматическими и хлорированными углеводородами. Для ряда полярных полимеров часто применяют диметилформамяд. Нельзя использовать воду, спирты, сложные эфиры, ацетон и другие полярные растворители.
Гели с наиболее мелкими порами, имеющие предел эксклюзии до 5000, часто используют для разделения малых молекул. Диаметр пор самых мелкопористых сорбентов (типа ц-стирогеля 100 А) в набухшем состоянии составляет около 3 нм, степень их набухания является наиболее высокой, а круг пригодных подвижных фаз более узок, чем для гелей с крупными порами.
Большинство современных полужестких гелей выдерживает давление 10-15 МПа. Однако, фирма «Шова Денко» для вы-вускаемых ею колонок Шодекс устанавливает значительно меньшие предельные давления (< 2 МПа для сорбентов с размером зерна около 10 мкм). Авторам не удалось выяснить причину столь жесткого ограничения; к тому же в литературе имеются примеры разделения на наборах колонок Шодекс, где давление как минимум вдвое превышало рекомендованные фирмой пределы.
Колонки со стирол-дивинилбензольными сорбентами, выпускаемые разными фирмами, заметно различаются по эффективности и размеру линейного участка калибровочной кривой (рис. 4). Эти различия вызваны особенностями микроструктуры пор, размером и тщательностью сепарирования и упаковки частиц сорбента. Наиболее эффективными являются колонки шодекс типа KF, ультрастирогель и TSK-гель серии XL. Гарантированная эффективность этих колонок достигает 45 - 50 тыс. т.т./м. Линейный участок калибровочной кривой для стирол-дивинилбензольных гелей обычно соответствует изменению молекулярной массы в пределах 1-2 порядков.
Некоторые фирмы выпускают специальные колонки, заполненые смесью сорбентов различной пористости в таких соотношениях, которые обеспечивают наилучшую линейность калибровочной кривой в диапазоне 4-5 порядков. Естественно, что разделительная емкость таких колонок относительно невелика, но они очень удобны для предварительного исследования полимерных материалов с неизвестным ММР, а также для быстрого сравнительного анализа различных образцов, в частности, в аналитическом контроле производства.
Большой интерес для эксклюзионной хроматографии представляют гели сферон. Эти макропористые сорбенты с высокой плотностью сшивки получают сополимеризацией оксиэтилметакрилата с этилендиметакрилатом. Они набухают как в воде, таК и во многих органических растворителях, в частности, в тетрагидрофуране. Степень набухания гелей в разных растворителях почти одинакова и не меняется в широком интервале эачений рН и ионной силы, что позволяет рассматривать их как универсальные сорбенты для эксклюзионной хроматографии в органических растворителях и водных системах. Иногда можно заменять водный растворитель на органический в провесе разделения, т.е. работать в режиме градиентного элюирования.
Гели сферон обладают высокой удельной поверхностью (50-200 м2/г), механической прочностью (допустимое давление выше 10 МПа) и термостойкостью до 200 °С. Выпускается пять типов гелей разной пористости с пределом эксклюзии по декстрану от 6-Ю4 до 108. Нижний предел проницаемости гелей всех типов одинаков и составляет около 103. Высокая химическая стойкость позволяет использовать сфероны. в диапазоне рН = 1-12.
Для ВЭЖХ используют фракции сферона с размером зерен менее 25 мкм, которые очень желательно дополнительно седиментировать. С 1985 г. начат выпуск сорбентов сферой микро с размером зерен 12, 16 и 20 мкм, которые отличаются более узким распределением по размеру частиц и повышенной механической прочностью. В литературе приведено много примеров использования сферонов для разделения гидрофильных полимеров, белков, нуклеиновых кислот и других биологических объектов. При этом неоднократно наблюдали заметную адсорбцию некоторых биополимеров на матрице геля, что иногда повышает эффективность разделения.
В последние годы разработан ряд новых полимерных сорбентов для эксклюзионной хроматографии в водных системах. На рис. 5 приведены калибровочные кривые для некоторых материалов. Гели шодекс ОН-пак изготавливают на основе поливинилового спирта (серия Q) и полиглицидилметакрилата (серия В). Первые предназначены для разделения в низкомолекулярной области (М<1500 по полиэтиленгликолю или 5000 по декстрану), а вторые - для высокомолекулярного диапзона. Оптимальная рабочая температура для колонок с этими материалами составляет 50 °С. Сорбенты типа ионпак 5 представляет собой сульфированные стирол-дивинилбензольные гели и особенно пригодны для разделения полиолов и исследования молекулярно-массового распределения полисахаридов (рис. 4.8) при рабочих температурах 40-80 °С. TSK-гели типа PW дают очень хорошие результаты при определении ММР водорастворимых синтетических полимеров (полиакриламиды, соли полиакриловой кислоты, поливинилпирролидон и т.д.), а также алеиновых кислот, полиэтиленоксида и полисахаридов. Эти материалы обладают наилучшими характеристиками для высокоэффективной эксклюзионной хроматографии поликатионов в водНОЙ среде. В качестве подвижных фаз при анализе неионных веществ на этих сорбентах используют воду или 0,005 - 0,1 М водные растворы солей (например, NaCI или КСl); для разделения полиэлектролитов на TSK-геле типа PW применяют буферные системы. Наиболее мелкопористые гидрофильные гели очень эффективны для разделения низиомолекулярных соединений.
К недостаткам полужестких гелей следует отнести ограничение по растворителям, значительное время уравновешивания колонок и возможное снижение их эффективности при замене подвижной фазы, а также относительно невысокое предельное рабочее давление. Кроме того, эффективность колонок с полужесткими гелями может резко понизиться при попадании в них пузырьков воздуха. Воздух блокирует поры геля и очень трудно удаляется. Поэтому при работе с полужесткими гелями требуется особенно тщательная дегазация растворителя и внимательная сборка хроматографической системы.
Жесткие гели
Из жестких неорганических сорбентов в эксклюзионной хроматографии используют, главным образом, силикагели и в значительно меньшей степени пористые стекла. Основными достоинствами этих материалов является возможность использования с любым растворителем, простота их замены, высокая устойчивость к давлению и температуре и относительная легкость упаковки, колонок. Главный недостаток жестких гелей - адсорбционная активность, которая в наибольшей степени выражена у пористых стекол. Для ее устранения поверхность модифицируют силанизацией или прививкой различных групп, в частности сложноэфирных (µ-бондагель Е), остатков глицерина (гликофаза G/CPG) и др. К сожалению, модификацией поверхности полностью подавить адсорбцию обычно не удается. Поэтому приходится устранять ее путем различных добавок к подвижной фазе, которые взаимодействуют с сорбентом сильнее, чем анализируемые вещества. При работе в органических средах в качйстве модифлкаторов часто применяют тетрагидро-фуран и додигликоли (если, конечно, нельзя по каким-либо причинам, вести разделение в чистом полярном растворителе). При работе в водных растворах и анализе полиэлектролитов к элюенту добавляют, различные соли (иногда кислоты и основания), подавляющие: адсорбционные и полиэлектролитные эффекты. Друдой недостаток жестких гелей-ограниченное разрешение в области низких молекулярных масс: для данного диапазона лучше использовать полужесткие сорбенты.
Первоначально для разделения полимеров применяли различные промышленные силикагели. Изучен ряд силикателей, выпускаемых в СССР, и предложен набор из четырех марок (КСК-2; КСК-1; силохром СХ-1 и МСА-2500), перекрывающий диапазон молекулярных масс от 103 до 106. Главный недостаток промышленных силикагелей заключается в плохой воспроизводимости их характеристик за счет весьма широких допусков, которые вполне допустимы при их использовании в технике. Кроме того, существенным затруднением является необходимость размола и выделения узких фракций с требуемым размерим частиц, как описано в разд. 5.1. Поэтому были разработаны силикагели, специально предназначенные для эксклюзионной хроматографии. Первым из таких сорбентов был лихросфер. Сферические частицы сорбента имеют большой удельный объем пор, хорошие механические свойства и позволяют получить колонки достаточно высокой эффективности.
Значительно лучшие результаты достигаются при использовании зорбакса PSM, получаемого по особой технологии. Этот сорбент выпускают с тремя размерами пор, перекрывающих диапазон молекулярных масс от 102 до 2-106. Для снижения адсорбции при работе в органических растворителях его поверхность силанизируют, а в водных системах используют не обработанный сорбент. Зорбакс PSM характеризуется исключительной однородностью пор, что в сочетании с малым диаметрОМ частиц и их умеренно узким распределением по размеру обеспечивает высокую эффективность колонок.
Комбинация колонок с зорбаксами PSM-60 и PSM-1000 дает линейную калибровочную зависимость в диапазоне от 2-102 до 2-106. Фирмой «Дюпон» выпущены «тримодальные» колонки, содержащие смесь зорбаксов PSM-60, PSM-300 и PSM-3000, с линейной калибровочной зависимостью в пределах 102-107 Для обеспечения необходимой селективности разделения рекомендуется использовать наборы из двух и более колонок. Зорбакс PSM, видимо, является лучшим из жестких сорбентов, не дназначенных для исследования биополимеров. Калибровочные кривые для жестких сорбентов по полистиролу в тетрагидрофуране приведены на рис. 8.
Пористые стекла в немодифицированном виде в последнее время применяют редко, так как они обладают значительно большей адсорбционной активностью, чем силикагель. Отличительной особенностью пористых стекол является чрезвычайно узкoe распределение пор по размеру, поэтому они характеризуются очень высокой селективностью разделения, но в малом диапазоне молекулярных масс.
К сорбентам для высокоэффективной эксклюзионной хроматографии белков, ферментов и других биологических объектов предъявляются значительно более жесткие требования по инертности поверхности, чем к сорбентам для разделения синтетических полимеров. Кислые силанольные пруппы силикагеля обладают высокой адсорбционной активностью, проявляют слабые ионообменные свойства и способны денатурировать белковые молекулы. Поэтому поверхность жестких сорбентов очень тщательно модифицируют прививкой монослоев нейтральных гидрофильных органических гpyпn. К таким сорбентам относятся ц-бондагель Е и материалы, содержащие глицерильные группы. Поверхность ц-бондагеля Е модифицирована алифатически-ми эфирными группами. Колонки с этим сорбентом можно использовать с любыми растворителями от пентана до буферных растворов в области рН от 2 до 8. Они характеризуются высокой разрешающей способностью, но из-за малого рабочего объема (примерно 1,2 мл на колонку) требуется особо точная подача подвижной фазы.
Качество получаемых сорбентов во многом определяется полнотой реакции. Теоретически в указанную реакцию может вступить примерно половина всех силаноль-ных групп. Однако оставшиеся группы не могут взаимодействовать с сорбентами, так как экранируются глицерильными группами. При недостаточной степени покрытия полного экранирования не пооисходит и начинает проявляться «силанольная активность» незамещенных групп. Содержание таких активных групп, характеризующее уровень дезактивации сорбентов, часто оценивают по степени сохранения ферментативной активности лабильных ферментов после их пропускания через хроматографическую колонку.
Наиболее известными представителями материалов указанного типа является гликофаза CPG, получаемая из пористых стекол марки CPG (Controlled Porous Glass), лихросфер диол и синхропак GPC. Эти гели характеризуются весьма высокой инертностью: так, потеря ферментов при хроматографировании на лихросфере диол обычно не превышает 2-7%. Сорбенты синхропак GPC, по данным фирмы, обеспечивают полное сохранение ферментативной активности.
Наилучшими свойствами для эксклюзионной хроматографии биополимеров обладают TSK-гели типа SW. Поверхность этих материалов покрыта гидрофильными ОН-грутопами по особой технологии, обеспечивающей исключительную инертность сорбента, практически не уступающую сефадексу. Поэтому эксклюзионное разделение, как правило, не осложняется побочными сорбционными процессами. TSK-гели SW выпускают с тремя размерами пор; и они перекрывают диапазон молекулярных масс от 5*102 до 4*105 (по декстрану) или до 106 (по глобулярным белкам). За счет большого объема пор колонки, с этими гелями характеризуются высокой разделительной способностью, а их гарантированная эффективность составляет 16 тыс. т.т./м.
Хотя подавляющее большинство разделений на жестких гелях с привитыми гидрофильными группами проводят в водных системах, эти материалы могут быть использованы и в сочетании с полярными органическими элюентами (тетрагидрофуран, диметилформамид, этанол), что расширяет возможности их применения.
Успехи, достигнутые за последние несколько лет при разработке сорбентов для высокоэффективной эксклюзионной хроматографии, позволяют предполагать, что в скором времени будут созданы новые материалы с еще более высокими характеристиками.
Сорбенты для ионообменной хроматографии
В ионообменной хроматографии применяют разнообразные сорбенты, используемые как для разделения белков, так и для разделения неорганических ионов и небольших молекул. Эти сорбенты можно разделить на при основных вида: ионообменные смолы, пелликулярные материалы и силикагель с химически привитой фазой, обладающей ионообменными свойствами. Пелликулярные сорбенты в настоящее время практически не применяют, их используют лишь для заполнения предколонок и при воспроизведении старых методов.
Применяемые в ВЭЖХ ионообменные смолы, как правило, являются сополимерами стирола и дивинилбензола, к которым привиты ионные функциональные группы.
Синтетические смолы являются гелями, каркас которых или матрица состоят из сети пространственно закрепленных между собой углеродных цепей. С матрицей жестко соединены фиксированные ионы, несущие заряд и придающие смоле свойства ионообменника. Сама матрица гидрофобна, а гидрофильные фиксированные ионы придают ей способность к набуханию, превращая смолу в полуэлектролит. Набухаемость смолы зависит от числа поперечных связей в молекуле или сшивки.
Твердость и механическая прочность сополимера стирола и дивинилбензола также зависит от степени сшивки, т.е. от процентного содержания дивинилбензола. Ионообменная смола с высокой степенью сшивки, содержащая 8-12% дивинилбензола, способна не изменять объем в различных растворителях и выдерживать большие давления без сжатия (усадки).
Обычно ионообменные смолы представляют собой микропористые сферические частицы диаметром менее 10 мкм. Сульфо-группы придают им способность к катионному обмену, а триалкиламмониевые - к анионному. Они обладают приемлемой эффективностью и высокой ионообменной емкостью. Емкость различных смол колеблется от 3 до 10 ммоль/г.
Эти материалы находят ограниченное применение из-за сравнительно низкой эффективности, что связано с очень медленной диффузией молекул образца в микропоры полимера. К достоинствам этих смол следует отнести стабильность и селективность.
Основные ионообменные смолы, применяемые в ВЭЖХ, и их характеристики приведены в приложении 2.
Интересны ионообменные хелатные смолы, которые могут связывать ионы некоторых металлов, образуя с ними комплексы более прочные, чем с ионами других металлов. Селективность смолы можно улучшить, изменяя кислотность среды. Смола ХАД-4 имеет большое число пор диаметром 50 нм и удельную поверхность 780 м2/г. Ионообменная хелатная смола хелекс 100 содержит функциональную группу иминодиуксусной кислоты - CpN(CpCOO) 2
Другим типом сорбента, ранее применявшимся в ионообменной хроматографии, являются те же ионообменные смолы, нанесенные на пелликулярные частицы или привитые к ним. Поверхностно-пористые или пелликулярные материалы имеют тонкую пленку ионообменной смолы, обычно 1-3 мкм толщины, нанесенную на частицы диаметром 40 мкм. Во всех случаях диффузия в тонком слое увеличивается и эффективность колонки возлегает, однако ионообменная емкость резко падает. Максимальная емкость колонки размером 2 мм Х 25 см, заполненной пелликулярной ионообменной смолой, составляет около 1 мкг. дя работы с пелликулярными материалами пригодны лишь фотометры и спектрофотометры. Эти материалы применяют в основном в качестве сорбента для заполнения предколонок, так как набивку ими можно проводить «сухим» способом.
Добиться высокой эффективности разделения удалось при использовании микрочастиц полностью пористого силикагеля, которому равномерно привита фаза, имеющая ионообменные группы. Силикагелевая основа делает материал более прочным. Проблемы набухания или усадки колонки редко возникают. Материал устойчив к любым буферным растворам, растворителям и высоким температурам (до 80 °С). Однако сильнокислотные или слабоосновные растворы (2>рН>7,5) могут привести разрушению силикагелевой основы. Как правило, эффективность, полученная на привитых ионообменниках, сравнима с эффективностью обращенно-фазных материалов одинакового зернения.
Коммерческие ионообменные силикагели различаются по структуре пор и по типу присоединенной функциональной группы, по общей поверхности пор и форме частиц. Активные группы вводят сульфированием, хлорметилированием и последующим минированием. Даже если поверхность силикагеля полностью покрыта кремнеорганическими соединениями, остается большое число непрореагировавших поверхностных ОН-групп, которые ведут себя как слабые кислоты в ионообменном процессе. Вследствие этого основные ионообменники, привитые на силикагель, являются бифункциональными. К силикагелю прививают следующие группы: кислотные-карбокси-, сульфодиол-; основные - амино, алкил-амино; амфотерные аминоокси- или аминокарбокси- Обычно силикагель обрабатывают фенилтрихлорсиланом, затем сульфируют олеумом или хлорсульфоновой кислотой. Трифенилсилильная группа более устойчива к сульфированию, чем фенил или нафтилсилильная.
В силикагелях-материалах, доступных как образцу, так и противоиону, быстро устанавливается массопередача, что приводит к высокой эффективности колонки. Силикагели с привитыми группами делятся на микро- и макропористые в зависимости от диаметра внутренних пор. Микропористые материалы, имеющие небольшие по диаметру поры, позволяют молекулам растворителя, например воды, а также небольших ионов проникать в полимерную матрицу и задерживают большие молекулы. Большинство полимерных ионообменных силикагелей имеют микроструктуру. Полимерные смолы макропористого типа зачастую используют в жидкостной хроматографии низкого давления. Макропористые силикагели с привитыми ионообменными группами стали применять при разделении больших молекул, наnpимеp белков. Однако устойчивость сорбента невелика из-за растворения его в водной подвижной фазе.
Литература
Ohmacht R., Halasz /./Chromatographia, 1981, v. 14, p. 155-161, p. 216 - 226.
Engelhardt H., Muller Я./J. Chromatogr, 1981, v. 218, p. 395-407.
Bredeveg R.A., Rothman L.D., Pfeiffer C.D./Anal Chem, 1979, v. 51, No. 12, p. 2061-2063.
Nice E. С., ОНага M.J./J. Chromatogr, 1978, v. 166, p. 263-267.
Atwood J.G., Goldstain J./J. Chromatogr. Sci, 1980, v. 18, p. 650-654.) 6. Pearson J.D., Lin N. Т., Regnier F.E./Anal Biochemistry, 1982, v. 124, p. 217-230.
Rimer J., McKlintock R., Galyean R. e. a./J. Chromatogr, 1984, v. 288, p. 303-328.
Rimer L, McKlintock R./J. Chromatogr, 1983, v. 268, p. 112-119.
Wise S.A., Bonnett W.J. e. a./J. Chromatogr. Sci, 1981, v. 19, p. 457 - 465.
| ! |
Как писать рефераты Практические рекомендации по написанию студенческих рефератов. |
| ! | План реферата Краткий список разделов, отражающий структура и порядок работы над будующим рефератом. |
| ! | Введение реферата Вводная часть работы, в которой отражается цель и обозначается список задач. |
| ! | Заключение реферата В заключении подводятся итоги, описывается была ли достигнута поставленная цель, каковы результаты. |
| ! | Оформление рефератов Методические рекомендации по грамотному оформлению работы по ГОСТ. |
| → | Виды рефератов Какими бывают рефераты по своему назначению и структуре. |