2СЕРОЛОГИЧЕСКИЕРЕАКЦИИ
СЕРОЛОГИЯ — раздел иммунологии, изучающий взаимодействие АГ
и АТ впробирочных реакциях (in vitro).
Серологические реакции — реакции сиспользованием АГ или АТ
(проводящиеся invitro).
Серологическими методами (в диагностике инфекционных заболе-
ваний) называютсовокупность пробирочных реакций, основанных на
АГ-АТ-взаимодействии./2640к/99/
1) Направленны на выявление в сывороткекрови и других жид-
костях организмаАТ к АГ возбудителей инфекционных болезней.
2) Проброчные реакции, имеющие целью обнаружение в сыворотке
крови и других субстратах растворимых микробных АГ с помощью
стандартныхиммунных сывороток.
Серологические реакции проводятся сиспользованием
1) АГ для поиска АТ
2) АТ для поиска АГ
4+ 0 /?/ 4 IN VIVO (кожныепробы, РН in vivo ...)
4- серопрофилактика (введение АГ,АТ)
4В серологчиеские методы не входятреакции, которые ставят на
4людях илиживотных (реакция Шика, Дика), исерологическая иден-
4тификациякультур микроорганизмов (это один из этапов бактерио-
4логическогометода.
КЛАССИФИКАЦИЯ СЕРОЛОГИЧЕСКИХРЕАКЦИЙ
1. Двухкомпонентные
— простые (РА, РП)
— розеточные тесты (РОК)
— цитофлюоресцентные методы
— сложные (РН /гемадсорбции, токсина, ..., РТГА, РНГА, ре-
акция прямойимунофлюоресценции, реакции адгезии).
Реакции адгезии отличаются взаимодействиемчастиц, например,
клетки, ссерологически активной поверхностью, вт.ч. с другой
клеткой. /2260к/
2. Трехкомпонентные
— простые
— реакция бактериолиза,
— реакция коагглютинации
— сложные
— реакция непрямойиммунофлюоресценции,
— РИА,
— РЭМА,
— литические тесты (РСК, определение АОК с помощью
эритроцитарных АГ-ов),
— использование электронного парамагнитного и ядер-
но-магнитного резонанса) /7271/87/,
Материал для серологических реакций:
— сыворотка крови (парные сыворотки). Заморозка в течение
10-14 дней.
— ликвор,
— моча,
— фильтрат испражнений,
— промывные воды бронхов, полости рта,глотки, носа /2640к/,
желудка.
— Слизь (шейки матки,… — здесь АТ поройбольше, чем вы сы-
воротке)
Учет серологических реакций осуществляетсявидуально, иногда
с помощью лупы иредко — микроскопа. /2640к/99/
При оценке серологических реакций применяют3 главных крите-
рия /2640к/99/:
— наличие и интенсивность реакции (в плюсахи др.),
— диагностический титр, заранее отработанный для всех забо-
леваний,
— нарастание титра АТ в течение болезни в 4и более раза.
В процессе оценки серологических реакцийчасто возникает не-
обходимость дифференцировки
1) специфической реакции (на видовые итиповые антигены) от
группоспецифической (на межвидовые АГ) [Группоспец. АГ
Salm. — табл.]
4-- дифференцировка помоноспецифическим антисывороткам,
4-- по скорости нарастания титраАТ, которая выше к специ-
4фическим АГ, 0
4-- по реакции адсорбции АТизбытком антигена
4-- по легкости диссоциации ИК под влияниемдиссоцирующих
4факторов 0
2) ИО на текущую инфекцию от ИО на перенесенноеранее заболе-
вание ииммунизацию. /2640к/99/
5-- Оценивают по темпу нарастанияАТ.
При постановке любой серологической реакции параллельно с
опытом ставятся _контроли на каждый компонент реакции .:
— микробная культура не должна образовыватьхлопья при ана-
логичномвстряхивании;
— сыворотка и антисыворотка не должны быть с хлопьями
(хлопья появляются в процессе хранения белков в связис посте-
пенным оголениемуглеводных компонентов; углеводныекомпоненты
белков, будучи жесткими разветвленными структурами,«запутыва-
ются друг вдруге", обуславливая агрегацию белков);
— эритроциты не должны быть лизированы;
— сыворотка морской свинки, используемая как источник комп-
лемента, должнализировать эритроциты (т.е. работать):компле-
мент + ЭБ — лизис;
— диагностикум не должен содержать хлопьев ипр.
— при поиске АГ обязательно используетсяпараллельно музей-
ный АГ, которыйдолжен однозначно выявляться при проведении ме-
тодики (это значит, что все компоненты реакции«работают», ме-
тодика поставленаправильно).
3РЕАКЦИИ АГГЛЮТИНАЦИИ/РА/
РА — реакции склеивания микробов, частиц латекса или эрит-
роцитов /реакциягемагглютинации - РГА/. АГ-несущие частицы
склеиваютсяантителами и выпадают в видимый осадок.
1Титром сыворотки 0 считают максимальное разведение, дающее
агглютинацию АГ.
┌ ┐
0 0 0 0 0 = │ 0 0 │
/ / / / / / │ / / /│
│ │ │ │ │ │ ││ │ │ │
└ ┘n
0 — клетка
>── — молекула антитела
1) _ 2Прямая РА
В этой реакции антитела (агглютинины)непосредственно агглю-
тинируюткорпускулярные АГ (агглютиногены).
— 1Зернистая 0 агглютинацияпроисходит при склеивании микробов,
содержащихО-антиген.
— 1Хлопьевидная 0 агглютинацияпроисходит с бактериями, имеющи-
ми жгутики(Н-антигены).
а) 2Прямая реакция агглютинации (РА)
— _Ориентировочная РА . (напредметном стекле)
1Постановка реакции:
│Микробная суспензия
│+ антисыворотка к микробу
1Результат: 0 — хлопья(агглютинаты)
5Для определения микробного вида (серотипирования) на пред-
5метноестекло наносится 1 капля (0,05мл) диагностической сыво-
5ротки, разведенной физиологическим раствором 1:25. На вторую
5половину стекла наносится капля физиологического раствора
5(контроль). К каждой капле добавляется равный объемиспытуемой
5культуры.Слегкапокачивая стекло, наблюдать затечением реак-
5ции: феномен агглютинации проявляется выпадением хлопьев и
5просветлениемжидкости в капле. В контролемикробная культура
5должнаостаться мутной и гомогенной. 0
— _Развернутая РА . проводитсяв ряду пробирок или лунок для
раститровки сыворотки больного(определения титра АТ)
1Постановка реакции:
│Сыворотка больного, содержащая АТ к микробу — рас-
│ титровка
│+ микробная суспензия (равное количество во все про-
│ бирки или лунки
1Результат: 0 — хлопья(агглютинаты) микробов
5Для определения антител в сыворотке крови больного поста-
5вить вштатив 7 пробирок и налить в каждую из них по 0,5 мл фи-
5зиологическогораствора. Добавить в первую пробирку 0,5мл сы-
5вороткибольного, разведенную в 50 раз, перемешать. 0,5 мл из
5первойпробирки перелить во вторую, перемешать;из второй про-
5бирки 0,5мл перелить в третью и т.д. Из последней пробирки вы-
5лить дляравенства объемов 0,5 мл в банку с дезраствором.В каж-
5дуюпробирку добавляют по 2 капли антигена или диагностикума.
5Оформить 2 контроля — контроль антигена (для исключения спон-
5таннойагглютинации) и контроль сыворотки в исходном разведении
51:50.
5Рабочая схема РА:
5──────────────────────────────────────────────────────────────
5Ингредиенты │ Ряд пробирок
5│------------------------------------------------
5│ 1 │ 2 │ 3 │ 4 │ 5 │ 6 │ 7
5──────────────────────────────────────────────────────────────
51.Физраствор 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 - 0,5
52.Сыворотка 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
5больного 1:50
5Полученные
5титры 1:100 1:200 1:400 1:800 1:1600 1:50 -
53.Диагнос-
5тикум в
5каплях 2 2 2 2 2 - 2
5Инкубация в термостате 2 часа при370С, затем при
5необходимости 24 часа прикомнатной температуре.
5Учет результатов реакции проводятчерез 24 часа по следующей
5схеме:
5++++ полная агглютинация, жидкость прозрачная, выраженный
5осадок;
5+++ жидкость слегка опалесцирует, но осадок хорошо выражен;
5++ или + сомнительная реакция, жидкость равномерно мутная,
5осадок отсутствует. 0
5- отрицательная реакция, жидкостьравномерно мутная,
5осадок отсутствует.
5Титром агглютинирующей сывороткисчитается то ее максималь-
5ноеразведение, при котором еще происходит реакция не менее,
5чем на триплюса.
5Артефакты:
5- наличие СРБ, агглютинирующего микробы (стафилококки,
5стрептококки)
5- наличие перекрестных антигенов
б) 2Прямая реакция гемагглютинации(РГА)
— вирусами (эритроцитов любого видаживотного)
— при смешивании двух разногруппных пробкрови (определе-
ние групп крови)
1Постановка реакции:
│Субстанция, склеивающаяэритроциты (сыворотка, вирусы)
│+ эритроциты — хлопья
1Результат: 0 — хлопья (означаютприсутствие АТ)
1Варианты постановки:
— _Ориентировочная РА . (напредметном стекле)
— _Развернутая РА . проводитсяв ряду пробирок или лунок для
раститровки сыворотки больного(определения титра АТ)
5Материал с вирусом титруют от 1/10 до1/1280. 0,5мл данного
5материаласмешивают с 0,5мл 1-2% эритроцитов. Инкубируют 30 ми-
5нут при37оС или 45 минут при комнатной температуре. Титром ви-
5русасчитается его наибольшее разведение, прикотором наблюда-
5етсяагглютинация эритроцитов.
5Прямая гемагглютинация, вызываемаябактериями, коррелирует с
5ихспособностью прикрепляться к клеткам макроорганизма, отража-
5етвирулентные свойства. (Предложен метод селекции наиболее ак-
5тивныхклеток из культуры путем их адсорбции на эритроцитах с
5последующимвысевом на плотные среды.)-[11ц301-81]
2) _ 2Непрямая РА
= 2РНГА (РПГА 0;РНГА=РПГА 2) (реакция пассивной 0 2или 0 2непрямойге-
2магглютинации)
1Варианты постановки:
— _Ориентировочная РА . (напредметном стекле)
— _Развернумая РА . проводитсяв ряду пробирок или лунок для
раститровки сыворотки больного(определения титра АТ)
┌ ┐
│ .0. .0. │
│ / / /│
│ │ │ │ │
└ ┘n
К носителю (эритроцитам, стафилококку,частицам латекса /ла-
текс-агглютинация/и пр. химическим способом«пришивают» анти-
гены, ампулируюти выпускают в биотехнологической промышленнос-
ти какдиагностикумы.
1Постановка реакции:
│Сыворотка больного — раститровка
│+ диагностикум в каждую лунку---
1Результат: 0 — «зонтик» (реакция агглютинации есть),
— «пуговка» (РА нет)
Последняя ячейка с положительной пробой(«зонтиком») означа-
ет титр АТ.
5Сорбция на носителе либо АГ (РНГА=РПГА), либо АТ (обратная
5РПГА).
5Реакция ставится в двухвариантах. Антиген (РПГА) или анти-
5тела(РНГА) связываются с крупным носителем с последующим выяв-
5лениемуровня специфических иммуноглобулинов или антигена.
5Исследуемый антиген «сшивается» танином или глютаровым ди-
5альдегидомс эритроцитами или частицами латекса.
5Сыворотка больного, прогретая 30минут при 56оС, раститровы-
5вается(0,5мл) и смешивается с 2 каплямиэритроцитарного диаг-
5ностикума.
3) _ 2Проба Кумбса . 0(непрямая пассивная гемагглютинация;
антиглобулиновый тест)
Для постановки этой реакции необходимаантиглобулиновая сы-
воротка,которую получают путем иммунизациикролика иммуногло-
булинамичеловека.
Используется для определения неполных(функционально однова-
лентных) антител, например, «ро»-антителк эритроцитам плода
прирезус-конфликте, ряд аутоантител, АТ к некоторым микробам и
пр. Эритроцитыплода в условиях in vivo не агглютинируют, одна-
ко при обработкеих in vitro антисывороткой к гамма-фракции ан-
тител человекапроисходит РА на стекле (= _ориентировочная . реак-
ция Кумбса). К сыворотке добавляется антиген (резус-фактор) и
затемантисыворотка против гамма-глобулинов, что вызовет агглю-
тинациюзагруженных эритроцитов. _Развернутая . реакция Кумбса (в
ряду пробирок илилунок) применяется для определения титра цир-
кулирующих неполныхантител в сыворотке больного.
┌ ┐
│ 0 0 │
│ / / / /-АТ 41 0│
│ │ │ │ │ │
│ / / / │
│ │ │ │ │
│ АТ 42 0 АТ 42 0 АТ 42 0 │
└ ┘n
1Постановка реакции:
│Сыворотка (АТ 41 0)--- раститровка
│+ эритроциты (с Rh-антигеном)
│+ антисыворотка кFc-фрагменту Ig G (АТ 42 0).
1Результат: 0 — «зонтик» (реакция агглютинации есть),
— «пуговка» (РА нет)
Последняя ячейка с положительной пробой(«зонтиком») означа-
ет титр АТ.
4) _ 2Реакциякоагглютинации 0 2(РКОА 0, РКА 2)
1Варианты постановки:
— _Ориентировочная РА . (напредметном стекле) — хлопья
— _Развернумая РА . проводитсяв ряду пробирок или лунок для
раститровки сыворотки больного(определения титра АТ)
L[+]
┌ │ ┐
│ ┌─┴─┐ 4 0 │
│0> 4── 0┤St.├ 4─ 0─
│ └─┬─┘ 4 0 │
│ │ │
└ ┘n
К носителю — клеткам инактивированногозолотистого стафило-
кокка (Staphylococcus aureus), несущего на своей поверхности
белок А(функциональный аналог FcR) добавляют необходимые АТ
(антисыворотку) и после инкубации - исследуемую жидкость с
предполагаемымиАГ-ми.
1Постановка реакции:
│Стафилококковый диагностикум
│+ АГ
1Результат: 0 — «зонтик» (реакция агглютинации есть),
— «пуговка» (РА нет)
Последняя ячейка с положительной пробой(«зонтиком») означа-
ет титр АТ.
5Реакция Ко-агглютинации (РКА) предложена в 1973г. Kronvall
5дляпостановки диагноза пневмококковой инфекции. Сейчас она ис-
5пользуетсядля диагностики эшерихиозов, коклюша,менингококко-
5вой,стрептококковой инфекции, сальмонеллезови шигеллезов, а
5такжедля обнаружения некоторых бактериальных токсинов.
5/2119к/85/
5Реакция пригодна для идентификацииразличных антигенов путем
5агглютинациистафилококков, сенсибилизированных антителами про-
5тивдетерминант бактериальной, вирусной или неинфекционной при-
5роды./2111к/
5Например, для индикации шигелл зонне в молоке, кефире и в
5материалах от людей. Для определения чувствитель-
5ности РКОАставили с 10-кратными разведениями 1 млрд. микробной
5взвесишигелл Зонне. Чувствительность РКОА составила 108-109
5микробныхтел в 1 мл взвеси. /2111к/
5Стафилококковый реагент выпускается Ленинградским НИИЭМ им.
5Пастераи используется его 2% взвесь. Для сенсибилизации ис-
5пользуютсясыворотки с титром антител в РПГА не ниже 1:12800.
5/2111к/
5На предметное стекло капают 2 каплипо 0,1 мл диагностикума
5ииспытуемый материал. Положительнымрезультатом считалось об-
5разованиеагглютината с полным просветлением смеси. (Контроль -
5сфизраствором и реакция с заведомоинфицированным материалом.)
4Определение энтеротоксинав реакции
4коагглютинации
4Культуру сальмонелл осаждают (8000 об./мин.;20 минут), к
4осадкумикробов добавляют 0,5 мл дистиллированной воды, готовят
4лизат,вновь центрифугируют (8000 об./мин.;20 минут) и с надо-
4садком(супернатантом) проводят реакцию. /1804к/88/
4В реакции используют диагностикум — золотистый стафилококк с
4«пришитыми»к нему антителами к токсину. 2-3 капли реагента + 1
4каплясупернатанта культуры сальмонелл больного — РА (оценка
4+, ++,+++, ++++ после 3-минутного покачивания). /1804к/88/
5) _ 2РТГА (реакция торможениягемагглютинации)
Гемагглютинин (НА) вирусов заблокирован антителами (первые
ячейки с" _пуговками ." = РА нет):
L[+]
┌ ┐
│ ┌───┐ ┌───┐ │
│──── │Эр.│ ──── │Эр.│ ──── │
│ └───┘ 7 0 └───┘ │агглютинации
└ ┘эритроцитов
нет
0- вирус (=торможение
>── — антитела агглютинации)
При «следовых» количествах антителк гемагглютитину (НА) или
ихотсутствии гемагглютинин («клей для эритроцитов») вирусов
остается«открытым» (не закрыт антителами) и происходит склеи-
вание эритроцитов(последние ячейки с " _зонтиками ." = РА есть):
L[+]
┌ ┐
│┌───┐ ┌───┐ │
│0│Эр.│0│Эр.│0│
│└───┘ └───┘ │
└ ┘n
а) Определение титра АТ к определенному вирусу (добавляется
антисыворотка кНА /гемагглютинин видоспецифичен/ данного виру-
са).
1Постановка реакции:
│Сыворотка больного — раститровка
│+ суспензия музейныхинактивированных вирусов
│ (или диагностикум)
│+ эритроциты любого видаживотного
1Результат: 0 — «зонтик» (реакция агглютинации есть, АТ нет
— «пуговка» (РА нет, АТесть
Последняя ячейка с положительной пробой(«пуговкой») означа-
ет титр АТ.
б) Определение типа вируса, допустим, гриппа (А, А или С) у
больного повыделенной культуре
1Постановка реакции:
3 ряда лунок в иммунологическойпланшете:
│Антисыворотка к вирусу гриппатипа А — раститровка
│Антисыворотка к вирусу гриппатипа В — раститровка
│Антисыворотка к вирусу гриппатипа С — раститровка
│+ Вирус-содержащий материал отбольного (культура, но-
│ совая жидкость) во все 3 ряда
│ (Или наоборот, раститровка в 3 рядах вирусов + АТ,
│ если нужно сориентироваться в количестве вирусов)
│+ эритроциты любого видаживотного
1Результат: 0 — ряд с «пуговками» означает тип вируса.
5- Сыворотку титруют (1/10-1/2560) — 0,25мл;
5- добавляется вирус в четырехкратномтитре (разведение в 4
5раза отисходного титра)
5- инкубируют 30 минут при 37оС
5- добавляют 0,5мл 1-2% взвеси эритроцитов
5- инкубируют 30 минут при 37оС или45 минут при комнатной
5температуре.
в) Определение типа вируса, допустим, гриппа (А, А или С) у
больного поналичию антител в сыворотке крови
1Постановка реакции:
3 ряда лунок в иммунологическойпланшете:
│Сыворотка больного — раститровка в 3 рядах
│+ Музейный вирус типа А (впервый ряд)
│+ Музейный вирус типа В (вовторой ряд)
│+ Музейный вирус типа С (втретий ряд)
│+ эритроциты любого видаживотного
1Результат: 0 — ряд с наибольшимколичеством «пуговок» означает
наибольший титр АТ убольного к данному типу
вируса, что предположительно говорит о соот-
ветствующем гриппе (длядоказательства оценива-
ют титр АТ в динамике с интервалом в 2 недели;
при увеличении титра минимум в4 раза можно го-
ворить об острой инфекции исоответствующем за-
болевании).
3РЕАКЦИИИММОБИЛИЗАЦИИ
Реакции иммобилизации основаны на способности специфических
АТ, циркулирующих в сыворотке больных, подавлять подвижность
различныхмикроорганизмов.
На практике нашли применение реакции иммобилизации бледной
трепонемы ихолерного вибриона.
3РЕАКЦИИ ПРЕЦИПИТАЦИИ(РП)
— реакции взаимодействия между антигеном иантисывороткой с
образованиемвидимого «осадка»(преципитата) — преципитирующих
иммунныхкомплексов (ПИК). 5МАТ(моноклональные АТ) одновалент-
5ные,поэтому в РП пока не используются. 0
┌─────────────────РП ────────────────────┐
_В жидкой фазе . _Вагарозе . (1%)
- реакциикольце- — в т.ч.электрофоретические
преципитации (в этом случае агарозаварится
-нефелометрия наверонал-мединаловом буфере
(ВМБ, рН 8,6)
Механизм взаимодействия антигенов и антител:
АГ │ АГ=АТ │ АТ
(пропорциональное
количество АГ и АТ;1:1)
│ │ │ │ │ │ │
│ │
┌───┐ о о │ / / / / / │ Y Y ┌───┐