--PAGE_BREAK--
Рисунок 7
-
ВЭЖ-хроматограмма водного экстракта зимолюбки зонтичной
Существенную практику препаративного выделения индивидуальных растительных соединений из-за трудоемкости технологических приемов и высокой себестоимости конечного продукта следует считать оправданной при наличии в них преобладающих компонентов[2].
5.Качественное определение
Фенольные гликозиды, имеющие свободную гидроксильную группу, дают все реакции, характерные для фенолов, например, с железоаммониевыми квасцами, реакцию диазотирования и др [1, 11].
В случае если фенольный гидроксид гликозирован, как у салицина, реакции проводят после предварительного гидролиза гликозида кислотами или ферментами. Эти же качественные реакции используют для обнаружения фенольных гликозидов на хроматограммах[1, 13].
В случае хроматографирования в тонком слое силикагеля хроматограммы можно обработать кроме перечисленных реактивов еще и 4%- ной Н2SO4в абсолютном этиловым спирте[13].
При этом фенольные гликозиды в зависимости от строения обнаруживаются в виде желтых, красных, оранжевых и голубых пятен[13].
При обработке хроматограмм раствором нитрата серебра и щелочью фенольные гликозиды обнаруживаются в виде коричневых пятен с различными оттенком[1, 13].
При обработке хроматограмм реактивом Паули фенольные гликозиды в зависимости от строения проявляются в виде желтых, оранжевых или красных пятен[1, 13].
6. Методики обнаружения
фенольных гликозидов
Ниже я приведу некоторые возможные методики обнаружения фенольных гликозидов в ЛРС, описанные в литературе и НД [1, 2, 8, 12-15].
1. 0.5 гр измельченного сырья кипятят с 10 мл Н2О 2-3 минуты и после охлаждения фильтруют. К 1 мл фильтрата прибавляют кристаллик сульфата закисного Fe, жидкость окрашивается сначала в сиреневый, затем темно- фиолетовый цвет, и наконец, образуется темно- фиолетовый осадок (арбутин) [1].
2. К 1 мл фильтрата (в фарфоровой чашке) прибавляем 4 мл раствора аммиака и 1 мл 10% раствора Naфосфорно — молибденовокислого в 10%- ной HCl; появляется синее окрашивание (арбутин) [1, 2].
3. 0.5 гр мелкоизмельченного растительного сырья заливают 5 мл этилового спирта и экстрагируют при периодическом встряхивании и слабом нагревании на водяной бане в течение 1 часа [1, 14].
Полученное извлечение с помощью капилляра наносят на бумагу (3-4 прикосновения капилляра) и хроматографируют восходящим способом в 5%- ной уксусной кислоте до прохождения фронта растворителя 15-17 см(хроматограмма проходит в течение 1 часа при использовании бумаги FN-3). Хроматограмму вынимают, высушивают, обрабатывают раствором 10%- ной спиртовой щелочи и затем реактивом Паули[14].
Арбутин имеет самое высокое значение R=0.75, отделяется от сопутствующих гликозидов и проявляются в виде ярко-красного пятна. Аналогичные результаты можно получить на пластинке “Силуфол” при хроматографировании в системе хлороформ-этиловый спирт (7:3) с последующей обработкой раствором щелочи и реактивом Паули[14].
Хроматограммы до и после обработки реактивами целесообразно просматривать в УФ свете с целью идентификации сырья по отдельным компонентам[16].
Схема хроматограммы экстракта брусники показана на рисунке8[14].
Рисунок 8 —
Схема хроматограммы экстракта брусники
1-е направление – 15% уксусная кислота;
2-е направление – БУВ (н-бутанол – уксусная
кислота – вода)
4. Согласно ГФ РБ и Европейской Фармакопее [16, 17]идентификациюфенольных гликозидовв листьях толокнянки проводят методом тонкослойной хроматографии. К 0.5 г. измельченного сырья прибавляют 5 мл смеси из равных объемов метанола и воды, нагревают с обратным холодильником в течение 10 минут. Горячее извлечение фильтруют. Фильтр промывают смесью из равных объемов метанола и воды и доводят до объема 5 мл этим же растворителем.
В качестве раствора сравнения используют 25 мг арбутина, 25 мг галловой кислоты и 25 мг гидрохинона растворяют в метаноле и доводят до объема 10,0 мл этим же растворителем.
Пластинка: ТСХ пластинка со слоем силикагеля.
Подвижная фаза: кислота муравьиная безводная–вода-этилацетат (6:6:88 об/об/об).
Наносимый объем пробы: 10 мкл раствора сравнения и 20 мкл испытуемого раствора в виде полос.
Фронт подвижной фазы: не менее 15 см от линии старта.
Высушивание: при температуре от 105 до 110 С до исчезновения запаха растворителей.
Проявление: пластинку опрыскивают раствором 10 г/л дихлоринохлоримида в метаноле. Затем опрыскивают раствором 20 г/л натрия карбоната безводного. Просматривают при дневном свете.
Согласно ГФ РБ [14] идентификацию арбутина в листьях брусники проводят следующим образом.
Испытуемый раствор.К 0,5 г измельченного сырья прибавляют 5 мл смеси из метанола и воды (50:50, об/об) и кипятят с обратным холодильником в водяной бане в течение 10 мин. Горячее извлечение фильтруют. Фильтр и пробирку промывают смесью из метанола и воды (50:50, об/об) и доводят до объема 5 мл этим же растворителем.
Раствор сравнения. 2,5 мг арбутина растворяют в 5 мл метанола.
Пластинка. ТСХ пластинка со слоем силикагеляGР.
Подвижная фаза: этилацетат — кислота муравьиная безводная — вода (44:3:3, об/об/об).
Наносимый объем пробы:по 10 мкл в виде полос.
Фронт подвижной фазы:не менее 15 см от линии старта.
Высушивание:при температуре от 100°С до 105°С.
Проявление:пластинку опрыскивают раствором 10 г/л 4-аминопиразолона, затем раствором 20 г/л калия ферроцианида и проявляют в парах аммиака. Просматривают при дневном свете.
Результаты:Арбутин: зона красного цвета. На хроматограмме испытуемого раствора в верхней половине могут обнаруживаться и другие зоны. Пирозид — зона красного цвета.
7. Количественное определение
При количественном определении фенолгликозидов применяют химические (титриметрические) и инструментальные (спектрофотометрические и хроматографические) методы анализа.
Нормативно-техническая документация предусматривает количественное определение арбутина в листьях толокнянки и брусники. Метод определения основан на иодометрическом титровании гидрохинона, полученного после извлечения и гидролиза арбутина [16].
Разработан спектрофотометрический метод определения салидрозида в экстрактек корневищ с корнями родиолы розовой, который можно использовать для количественного определения салидрозида в растительном материале[1].
Исходя из строения фенольных гликозидов и их УФ спектров, возможно количественное хромато-спектрофотометрическое определение всех представителей этой группы[14].
И хотя сейчас всё более широкое применение получают инструментальные методы установления колличественного содержания фенолгликозидов [16], ещё применяется и включён в НТД [16] титриметрический метод количественного определения.
Рассмотрим подробнее методы количественного определения фенолгликозидов в ЛРС.
7.1 Титриметрический метод количественного определения фенолгликозидов [16]
Около 0.5 гр (точная навеска) сырья, измельченного и просеянного через сито с диаметром отверстий 1 мм, помещают в колбу вместимостью 100 мл, заливают 50 мл воды и нагревают с обратным холодильником поддерживая слабое кипение, в течение 30 мин. Горячее извлечение фильтруют в мерную колбу вместимостью 100 мл через бумажный фильтр, избегая попадания частиц сырья на фильтр. В колбу с сырьем повторно прибавляют 25 мл воды и кипятят в течение 20 мин. Горячее извлечение вместе с сырьем переносят на тот же фильтр и остаток на фильтре дважды промывают горячей водой порциями по 10 мл. К фильтрату прибавляют 3 мл раствора свинца (II) ацетата основного, перемешивают, охлаждают и доводят водой до объема 100,0 мл. Колбу помещают в водяную баню и выдерживают до полной коагуляции осадка. Горячую жидкость полностью отфильтровывают в колбу через бумажный фильтр, прикрывая воронку часовым стеклом. Охлаждают, к фильтрату прибавляют 1 мл кислоты серной, колбу взвешивают с точностью до 0,01 г и кипятят с обратным холодильником в течение 1,5 ч, поддерживая равномерное и слабое кипение. Охлаждают до комнатной температуры, взвешивают, доводят массу колбы до первоначальной водой, и полностью отфильтровывают через бумажный фильтр в колбу вместимостью 250 мл. К фильтрату прибавляют 0,1 г порошка цинка и встряхивают в течение 5 мин.
Жидкость нейтрализуют натрия гидрокарбонатом (около 1—2 г) по красной лакмусовой бумаге, прибавляют еще 2 г натрия гидрокарбоната и после его растворения фильтруютчерез бумажный фильтр.
50,0 мл фильтрата переносят в плоскодонную колбу вместимостью 500 мл, прибавляют 200 мл воды и немедленно титруют из микро- или полумикробюретки 0,1 М раствором йода до появления синего окрашивания, не исчезающего в течение 1 мин, используя в качестве индикатора раствор крахмала, свободный от йодидов.
1мл 0.1н раствора йода соответствует 0.01361 арбутина. Процентное содержание арбутина в растительном материале х в пересчете на абсолютно сухое сырье вычисляют по формуле:
Х= V0.01361∙2∙100∙100 / m(100-w)
где V— объем 0.1н раствора йода, израсходованного на титрование, мл;
m— масса навески сырья, гр; w— потеря в массе сырья при высушивании, %
Содержание арбутина в сырье регламентируется НТД.
Известно, что в зеленых листьях бадана толстолистного содержится арбутина 20%, в листьях брусники- 10-16%.
Способ выделения арбутина из листьев бадана включает: двух- кратную экстракцию сырья кипящей водой, фильтрацию и сепарирование извлечения, осаждение полифенолов раствором ацетата свинца, отделение осадка, упаривание фильтрата до сухого остатка, двух- кратную эктракцию сухого остатка 96%-ным этанолом, упаривание этанольного экстракта и обработка маслянистого остатка смесью хлороформ- этанол, кристаллизация арбутина из этой смеси. Выход арбутина-4%. Способ позволяет получить получить химически чистый арбутин без примесей, что подтвердается данными УФ-, ИК, ПМР-спектров. УФ- спектр арбутина имеет максимальное поглощение при 285 нм, в ИК- спектре имеются для характерные для арбутина полосы поглощения при 817, 831, 1513, 1447.
7.2 Инструментальные методы
Среди инструментальных методов определения можно выделить фотоэлектроколориметрический и спетрофотометрический. Рассмотрим эти методы на примере колличественного определения арбутина.
Воснове определения арбутина фотоэлектроколориметрическим методом лежит реакция образования азокрасителя после его взаимодействия с диазотированным сульфаниламидом (например, сульфацил-натрий) [14].
Количественное содержание определяется по калибровочному графику. Осаждение полифенолов проводится раствором свинца ацетата основного. Потери арбутина при данном способе определения составляют около 1,5%. Это объясняется тем, что очистка извлечения от сопутствующих полифенольных соединений раствором свинца ацетата основного приводит к соосаждению арбутина [14].
Спектрофотометрический метод для определения арбутина основан на измерении оптической плотности в видимой области спектра после получения антипиринового красителя. В качестве реактивов, например, используют 2% водный раствор 4-аминоантипирина, аммиак и 2% водный раствор калия феррицианида. Окрашенный продукт извлекают хлороформом и измеряют оптическую плотность окрашенного продукта на спектрофотометре при длине волны 455 нм. [14, 15].
8. ЛР и ЛРС, содержащие феногликозиды
8.1 Брусника обыкновенная(
Vaccinium
vitis
idaea
, сем.-
Vaccinaceae
)
Вечнозеленый низенький ветвистый кустарничек, высотой до 25 см. Корневище ползучее. Стебли прямостоячие, ветвистые. Листья очередные, мелкие, кожистые, блестящие, эллиптические, с завернутыми на нижнюю сторону краями, с черными точесными железками. Цветки белые или розоватые, в кистях на концах ветвей, венчик колокольчатый. Цветет в мае- июне. Плод — округлая многосеменная, шаровидная красная ягода.Плоды созревают в августе- сентябре [10].
Распространение брусники связано с равнинными сухими и свежими с моховым покровом сосновыми борами, а также с пихтовоелово- кедровой горной тайгой, где в надпочвенном покрове преобладают мхи, встречается черника, грушанки, линнея[10].
Химический состав. Фармакологические свойства. Листья и ягоды содержат гликозид арбутин (в листьях до 9%), который в организме отщепляет гидрохинон, а также флавоноиды, дубильные вещества, органические кислоты- яблочную, лимонную, винную, бензойную, обладающую антисептическим действием, сахара, аскорбиновую кислоту, микроэлементы, финонциды, каротин и другие вещества[1, 2].
Применение. Водные настои и отвары листьевприменяют в научной медицине как мочегонное, антисептическое и вяжущее средство при воспалениях почек и мочевого пузыря, поносах, подагре и ревматизме. Ягоды брусники рекомендуют при авитоминозах. Сушеные ягоды входят в витаминные и мочегонные сборы. Морс из ягод полезен при лихорадящих заболеваниях[9].
В народной медицине ягоды брусники применяют при анацидных гастритах, диабете, поносах, подагре и ревматизме[4].
Настой листьев употребляют при воспалениях почек и мочевого пузыря. Листья брусники заваривают вместо чая как средство, снимающее усталость[4].
Лекарственные формы. Настой.Столовая ложка листьев настаивают 30 минут в стакане кипятка, охлаждают и пьют по столовой ложке 3-4 раза в день[9].
Отвар. 2-3 чайные ложки кипятят в стакане воды 15 минут, выпивают в течение дня[9].
Сбор, обработка, сушка. Листья собирает до цветения (при более позднем сборе они при сушке чернеют), в том числе ранней весной- перезимовавшие под снегом; сушат в сухом теплом помещении или на чердаках, разложив тонким слоем (3-5 см) на бумаге или ткани, часто перемешивая. Выход сухого сырья 20-22%. Сухие листья упаковывают в мешки весом по 20-25 кги хранят в сухих, хорошо проветриваемых помещениях на стеллажах. Срок хранения не установлен[10].
Ягоды собирают в стадии полной зрелости руками или специальными граблистыми совками в небольшие корзины. Очещенная от примесей, недозрелых и поврежденных ягод брусника затаривается в осиновые, липовые или еловые 50-100- литровые бочки с вложенными внутрь бочки полиэтиленовыми мешками. После заполнения ягод мешок завязывается льняным шпагатом [10].
8.2 Толокнянка обыкновенная(
Arctostaphylos
uva
ursi
, сем.-
Ericaceae
)
Вечнозеленый распростертый кустарничек с ползучими и приподнимающимися побегами, длиной 20-50 см. Листья кожистые, короткочерешковые, сверху более темно-, снизу- более светло- зеленые, блестящие. К основанию листья клиновидно сужены, обратнояйцевидной формы, твердые и ломкие. Цветки собраны с малоцветковые кисти и расположены на верхушках веток. Венчик кувшинчатый, розовый или белый, с 5 изогнутыми наружу зубчиками. Плод сферическая красная ягода с 6 семенами. Цветет с мая по июль[10].
Встречается на сухихи каменистых местах и лесных полянах в хвойных лесах. Встечается почти по всей Европе ( без крайних южных районов)[10].
Химический состав. В сырье содержатся фенольные гликозиды- арбутин и метиларбутин (в среднем около 10%). В этой смеси из гликозидов, в зависимости от происхождения, метиларбутин
Рисунок 10 — Толокнянка варьирует от 5 до 45%. Содержание арбутина в листьях не должно быть меньше 6%. Некоторое сырье содержит только арбутина около 9%, небольшие количества свободного гидрохинона, дубильные вещества ( галлолинины) около 20%, флавоноидные вещества, урсоловую кислоту и др[1, 2].
Установлено, что осенью содержание арбутина в листьях толокнянки выше, чем весной[2].
Сотрудниками Санкт-Петербургского химико–терапевтического института разработана технология получения жидкого концентрата из листьев толокнянки с содержанием арбутина 14-15% (для экстракции использовали 20% водно- спиртовую смесь)[2].
Фармакологические свойства. В опытах invitroводно- спиртовые и этилацетатные экстракты листа толокнянки угнетают рост золотистого стафилококка (Staphylococcusaureus), энтерококка (Enterococcusfaecalis), сенной палочки (Bacillussubtilis), энтеробактерий (Escherichiacoli, Enterobacteraerogenes, Salmonellatyphimurium, Proteusmirabilis, Proteusvulgaris) и синегнойной палочки (Pseudomonasaeruginosa). Тем не менее 95% этанольный и хлороформный эктсракты растения противомикробными свойствами не обладают. Водный экстракт листа толокнянки угнетает также рост кариогенногоStreptococcusmutansOMZ176 (NambaT. Etc.,1981). Кроме того, он проявляет противовирусную активность – в концентрации 10% угнетает репродукцию вирусов простого герпеса типа 2, гриппа А2 (штамм Mannheim57) и оспенной вакцины в культуре клеток[5].
Уроантисептическое действие обусловлено наличием в листьях фенольных гликозидов- арбутина (арбутозида) и метиларбутина[2].
Доказано слабое антибактериальное действие отвара из листьев толокнянки на туберкулезные микобактерии. Сырье обладает также и слабым диуретическим эффектом, обусловленным влиянием на канальцевый эпителий почек [5].
Применение. Листья толокнянки широко применяют в виде отвара, настоя, экстракта ка дезинфицирующее и мочегонное средство. Применять листья толокнянки как антисептик для лечения хронического цистита и пиелита можно только при щелочной реакции мочи. Имеются данные и о хорошем эфекте при лечении поносов и гематурии, а также выжущем действии[5, 9].
Лекарственная форма. Столовую ложку нарезанных мелких листьев залить 2 стаканами холодной воды, оставить на ночь и процедить. Получают суточную дозу, которую следует пить по192 столовых ложки 3-4 раза в день. Некоторые авторы рекомендуют применять в виде отвара[4, 5, 9].
Лекарственное сырье представляет собой листья растения, собранные во время цветения и высушенные при обыкновенной температуре[10].
8.3 Ива
Известно примерно 50 выдов ив. Медицинское применение имеют ива белая (ветла), ива козья, ива ломкая и другие[9, 10].
Все ивы- многолетние, деревянистые растения, деревья ( ива белая, ива ломкая) или кустарники ( ива серая, ива сибирская и т.д.) с прстыми листьями с прилистниками на черешках, сверху зелеными, снизу часто белоопушенными. Цветки без околоцветников, однополые, собраны в сережки. Цветут до появления листьев или во время олиствения[10].
Ивы обычно растут по берегам и ручьев, под пологом леса, нередко у дорог, в садах, на болотых повсеместно[10].
Химический состав. Кора ивы белой содержит значительный арсенал биологически активных веществ, среди которых наиболее важными являются фенольный гликозид- салицин, производные салициловой кислоты и флавоноиды[1, 2]. Сотрудник Фармацевтического института Университета им.Карла Маркса г.Лейпцига в Германии Y. Tiemeв 60-ых годах с помощью хроматографических и спектральных методов анализа в коре разных видов ивы идентифицировал гликозиды салициловой кислоты, среди которых определены такие вещества, как салицин, гликозид, расщепляющийся при ферментативном гидролизе на спирт салигенол, который в дальнейшем гидролизуется на салициловый альдегид и салициловую кислоту.Поэтому в коре ивы также имеется и свободная салициловая кислота. Кроме салициловой кислоты в коре и листьях разных видов ивы помещаются другие гликозиды салициловой кислоты, в частности салидрозид, саликозид, салирепозид, фрагалин, саликортин, триандрин, вималин, тремулоидин и другие соединения [2].
О. Dytkowska(1964) при разработке хромато — спектрофотометрического метода количественного определения салициловых гликозидов выяснила, что наибольшее количество гликозидов в перерасчете на салицин помещается в коре ивы ушастой — до 0.367%. В коре ивы белой количество фенолгликозидов в пересчете на салицин составляет 0.106% [4].
Кроме гликозидов производных салициловой кислоты, в коре и листьях разных видов ивы насчитывается до 5% флавоноидов, среди которых выявлены антоцианы и их гликозиды, в частности пурпуринидин, 3-глюкозид цианидина, 3- глюкозид дельфинидина, катехины, эпикатехин, галлокатехин, флавоноиды [1].
Проводились исследования содержания фенолгликозидов и флавоноидов в листьях ивы рода Salix, произрастающих в РБ(ВГМУ) [18]. Материалом для исследования являлись образцы листьев ив 13 видов, заготовленных в окрестностях г.Витебска: SalixrosmarinifoliaL(Ива розмаринолистная), S. CinereaL. (Ива пепельная ), S.purpureaL. (Ива пурпурная), S. triandraL. (Ива трехтычинковая), S. auritaL. (Ива ушастая), S. pentandraL.(Ива пятитычинковая), S. capreaL. (Ива козья), S. daycladosWimm. (Ива шерстистопобеговая), S. wiminalisL.(Ива корзиночная, ива прутьевидная), S.albaL. (Ива белая), S. myrsinifoliaL. (Ива чернеющая), S.acutifoliaWilld. (Ива остролистная), S. fragilisL. (Ива ломкая). Сушка воздушно- теневая.
Количественная определение фенолгликозидов в пересчете на салидрозид проводили по методике ГФ XIна сырье родиолы розовой.
Содержание фенолгликозидов в листьях большинства изученных видов не превышает 1%. Максимальное содержание группы фенолгликозидов было отмечено у ивы прутьевидной и ивы розмаринолистной, 2.49% и 2.29% соответственно. Виды ив, относящиеся к одной секции, показывали сходное содержание флавоноидов. Связи накопления фенолгликозидов с таксономическим положением не выявлено.
Зависимость содержания флавоноидов и фенолгликозидов в листьях ив от их потребности в аэрации почв выражается сложной кривой с двумя максимумами. Наиболее интересным фактом является как бы зеркальное расположение пиков накопления фенолгликозидов по отношению к накоплению флавоноидов: максимуму содержания фенолгликозидов соответствует минимум содержания флавоноидов. Это может быть связано с конкуркнтными путями биосинтеза данных классов соединений. Наиболее перпективным видом ив из числа произрастающих в РБ для создания препаратов с адаптогенным действием является ива прутьевидная.
Фармакологические свойства и применение. В медицине отвар коры ивы употребляют при поносах, жаропонижающее при остром ревматизме, малярии и т.д. Используется для полосканий при воспалении слизистых оболочек и как обеззараживающее средство для очищения воды от бактерий. Кора входит в состав потогонных чаев [4, 5, 9].
В народной медицине отвар коры употребляют в основном при лихорадочном состоянии (вместо хинина), ревматизме, как вяжущее и противовоспалительное при хронических поносах, как желчегонное, при катарах желудка, заболеваниях селезенки [4].
Отвар мужских соцветий ивы козьей пьют при воспалении почек. Иногда оказывает глистогонное действие [4].
Кору собирают ранней весной, до цветения и развертывания листьев сушат в тени. Мужские сережки собирают в пору цветения, сушат в тени, рассыпаны тонким слоем [10].
продолжение
--PAGE_BREAK--