--PAGE_BREAK--Спосіб демієлінізації. За матеріалами огляду літератури нами було встановлено, що для запланованого дослідження експериментальна демієлінізація корінця трійчастого нерва може бути відтворена шляхом аплікації 0,1 та 0,05% розчинів броміду етидію об’ємом 1 мкл на вказану ділянку нерва. При подальшому порівнянні патоморфологічних змін корінців трійчастих нервів у відповідь на застосування вказаних вище речовин встановлено, що ушкодження мієлінової оболонки в залежності від концентрації броміду етидію характеризувалося частковим (локальним) або поширеним розволокненням і порушенням впорядкованості ламел на тлі вогнищевого або поширеного міжламелярного набряку різного ступеню виразності, злипанням ламел з наступним гомогенним їх набуханням на певному відрізку, частковим розщепленням ламел з прийманням спотворених у порівнянні з контролем форм (хвилясті, спіралеподібні, везикулярні утворення), повним розщепленням та лізисом мієлінових оболонок на певному відрізку корінця. Виявлено деякі гліоцити, які беруть участь у фагоцитозі мієліну. Останній розміщується у їх цитоплазмі у вигляді спіралеподібних або кільцеподібних утворень. Патологічні зміни в аксонах виявляються в помірному зморщуванні осьового циліндра на тлі явищ периаксонального набряку, реактивно-деструктивних змінах ультраструктурних органел, зокрема, мітохондрій (фрагментації крист та вогнищевої їх вакуолізації) і частковому просвітленні аксоплазми внаслідок втрати окремих нейрофіламентів (таб. 1).
Таблиця 1
Ознаки демієлінізації під впливом броміду етидію на субмікроскопічному рівні
Ознака демієлінізації, ступінь значимості різниці між групами за критерієм Фішера-Ірвіна
Концентрація розчину броміду етидію
0.1% n=10
0.05% n=10
Поширене розволокнення і порушення впорядкованості ламел мієліну, p
+
—
Виражений міжламелярний набряк, р
+
—
Повне розщеплення та лізис мієлінових оболонок, р
+
—
Часткове просвітлення аксоплазми, p
+
—
Зморщення осьового циліндра на тлі явищ периаксонального набряку
+
+
Фрагментація та вогнищева вакуолізація крист мітохондрій
+
+
Дані, наведені в таб. 1, свідчать про залежність дегенеративних змін мієлінової оболонки від концентрації розчину броміду етидію. При цьому слід звернути увагу на те, що тільки 0,1% розчин вказаного гліотоксину викликає повне розщеплення та лізис мієлінових оболонок одночасно із збереженням структури осьових циліндрів. Це найбільш адекватно відтворює процес сегментарної демієлінізації зони входу корінця трійчастого нерва в ділянці стиснення артерією у хворих з невралгією, дозволяючи проводити експериментальні дослідження способів посилення ремієлінізації трійчастого нерва.
Хірургічний доступ до зони входу корінця трійчастого нерва. Для розробки мікрохірургічного доступу до корінця трійчастого нерва морської свинки було порівняно підходи до цієї структури через середню та задню черепні ямки. Порівнювались відстань від шкіри до тріґемінального корінця, наявність важливих для життєдіяльності тварини структур при виконанні доступу та простір для виконання маніпуляцій поблизу трійчастого корінця. Виявилось, що відстань від шкіри до корінця трійчастого нерва є меншою при доступі через середню черепну ямку. Доступ через задню черепну ямку передбачає маніпуляції із стовбуром мозку, каудальною групою черепно-мозкових нервів, сигмовидним синусом, що суттєво ускладнює хірургічну техніку втручання. Окрім вищевказаного, перевагою доступу через середню черепну ямку є більший об’єм простору для маніпуляцій поблизу тріґемінального корінця.
Було розроблено хірургічний доступ до зони входу вказаного нерва морської свинки, при якому трепанація черепа здійснювалась за допомогою мінідрелі та стоматологічних борів, використовувався операційний мікроскоп Carl Zeiss OPMI із збільшенням 14Ч та мікроінструментарій. Доступ передбачає трепанацію черепа експериментальної тварини в тім’яно-скроневій ділянці діаметром до 0,8 см. При цьому зручним орієнтиром є скронева лінія, як вентральна межа трепанаційного вікна. Розтин твердої мозкової оболони виконувався мікроскальпелем паралельно поперечному синусу. В субдуральному просторі цієї ділянки знаходиться невелика кількість ліквору. Після ретракції скронево-потиличної частки головного мозку морської свинки медіально добре видно поперечний синус із впадаючими в нього венами, тенторіум та мозочок. Водночас з’являється значна кількість церебро-спінальної рідини, аспірація якої давала змогу продовжувати ретракцію. На певному етапі візуалізувався трійчастий вузол та вирізка намету мозочка. Після розтину останнього значно збільшувався простір для маніпуляцій поруч з корінцем трійчастого нерва. Між наметом мозочка, стовбуром мозку та проксимальною частиною корінця трійчастого нерва за допомогою мікропінцета встановлювався матеріал з волокнистого тефлону.
В результаті розтину лабораторних тварин та макроскопічного дослідження їх головного мозку виявлено, що прокладка з волокнистого тефлону, яка була встановлена морським свинкам за допомогою розробленого доступу знаходиться навколо ділянки входу трійчастого нерва у стовбур мозку та щільно прилягає до його корінця. Тканина головного мозку морських свинок, яка оточувала тефлонову прокладку, звичайного кольору та консистенції, її судинний малюнок не змінений. Таким чином, запропонований мікрохірургічний доступ до корінця трійчастого нерва морських свинок забезпечує необхідний простір для виконання маніпуляцій у вказаній ділянці без пошкодження оточуючих мозкових структур.
Експериментальна модель токсичної демієлінізація корінця трійчастого нерва. Через 4 години після операції всі тварини ходили, вживали воду та твердий корм. У післяопераційному періоді протягом 13 діб вживання води не відрізнялось порівняно з контрольною групою, натомість споживання корму було меншим. Поведінкові реакції на подразнення (дотик до тварини) відновлювались повністю на другу добу після втручання. У всіх випадках корнеальний рефлекс був знижений на боці операції порівняно з протилежним боком (таб. 2).
Таблиця 2.
Результати спостереження за тваринами протягом 13 діб після операції
Споживання води
Споживання твердого корму
Реакції у відповідь на дотик (2 доба після операції)
Корнеальний рефлекс
Дослідна група
(20 тварин)
самки
~ 340 мл
менше 24 г
збережені
знижений на боці операції
самці
~ 340 мл
менше 24 г
збережені
знижений на боці операції
Контрольна група
(12 тварин)
самки
~ 340 мл
24 г
збережені
симе-тричний з обох боків
самці
~ 340 мл
24 г
збережені
симе-тричний з обох боків
Слід відзначити відсутність неприйнятного для проведення експерименту токсичного впливу броміду етидію на організм морської свинки у вищевказаних дозах.
Кількість броміду етидію, яка використовувалась для індукції демієлінізації у морської свинки, не викликає значимого для результатів експерименту загальнотоксичного впливу. У післяопераційному періоді спостерігався мінімальний неврологічний дефіцит, що підтверджує достовірність експериментальних досліджень та дає змогу використовувати експериментальну модель протягом тривалого часу.
На світлооптичному рівні ознаками сегментарної демієлінізації при фарбуванні оглядовими методиками (гематоксилінеозін, гематоксилін-пікрофуксин) були виражені дистрофічні зміни нерва у вигляді так званої вакуольної дистрофії. При застосуванні методу Кульчицького підтвердженням демієлінізації зі збереженням цілісності аксонів було порушення мієлоархітектоніки. Характерні для сегментарної демієлінізації зміни отримано при забарвленні суданом ІІІ за методом Горделадзе у вигляді порушення структури ліпідвмісних оболонок.
При електронномікроскопічному дослідженні корінців трійчастих нервів морських свинок підтверджено достовірну сегментарну демієлінізацію, тобто локальне руйнування мієлінової оболонки із збереженням осьового циліндру під впливом броміду етидію. При цьому слід відзначити своєрідну будову мієлінових оболонок з утворенням везикулярних структур. Загибель клітин Шванна на тлі ознак порушення мікроциркуляції відбувається переважно, зважаючи на структурні зміни ядра й характерний перерозподіл хроматину, по типу апоптозу.
При дослідженні фрагментів тканини стовбурових відділів мозку в ділянці входу волокон корінця трійчастого нерва, порівняно з контролем нами виявлено зменшення кількості олігодендроцитів і виразні дистрофічні зміни останніх. Цитоплазма таких клітин характеризується наявністю мітохондрій з різним ступенем деструкції крист: від часткової фрагментації до їх повної деструкції, що призводить до подальшої вакуолізації органели. Характерною патологічною зміною цитоплазми в частині клітин є наявність значної кількості пустотілих вакуолей різного походження (за рахунок вакуолізації мітохондрій, ендоплазматичного ретикулума (ЕПР) та комплексу Гольджі), що звичайно вказує на розпад і незворотні зміни структурних білків цитоплазми. Деякі олігодендрогліоцити беруть участь у фагоцитозі мієліну, останній розміщується у їх цитоплазмі у вигляді спіралеподібних або кільцеподібних утворень.
Ремієлінізація корінця трійчастого нерва. Було встановлено, що для дослідження ремієлінізації корінця трійчастого нерва морської свинки оптимальним є використання 2,5% розчину прогестерону об’ємом 0,1 мл (2,5 мг прогестерону). Вивчення впливу розчину прогестерону на ремієлінізацію корінця трійчастого нерва проводилось шляхом хронічного експерименту з використанням вищеописаної моделі локальної сегментарної демієлінізації. На 14 добу після встановлення прокладки з 0,1% розчином броміду етидію тварини були прооперовані повторно. Важливим завданням на цьому етапі дослідження була аплікація гормону саме на ділянку демієлінізації, а не на іншу ділянку нерва. Найкращим вирішенням цього завдання є ін’єкція розчину прогестерону в товщу тефлонового матеріалу, який був встановлений на першому етапі експерименту. Під час операції виявляли прокладку з волокнистого тефлону та ін’єкційно вводили у її товщу 2,5% розчин прогестерону об’ємом 0,1 мл (дослідна група) та нейтральну сезамову олію об’ємом 0,1 мл (контрольна група). Через 29 діб з моменту індукції демієлінізації (через 15 діб після аплікації прогестерону або сезамової олії) тварини дослідної і контрольної груп були виведені з експерименту. Препарати корінців трійчастих нервів разом з прилеглими ділянками стовбура мозку та тріґемінального вузла досліджені за допомогою морфологічних та імуногістохімічних методик.
У ділянці впливу на 29 добу після початку експерименту без додаткового впливу відзначено поновлення типової гістоархітектоніки корінця трійчастого нерва. Проте спостерігаються дистрофічно змінені аксони з вогнищевим порушенням цілості мієлінової оболонки, а також щільні мієлінові утворення, які у вигляді краплеподібних включень безладно розташовані в товщі нервового волокна. Визначаються великі осміофільні аксони з напливами нейроплазми, різко виражений інтерстиціальний та периваскулярний набряк, у частині судин спостерігаються пристінкові тромби. Відзначається збільшення діаметра осьових циліндрів, поряд із зменшенням діаметра мієлінової оболонки відносно норми. Нейролемоцити, в основному, проявляють ознаки морфофункціональної активності, про що свідчать поява в ядрі, заповненому еухроматином, одного великого щільного ядерця. Окрім того, при специфічній імуногістохімічній реакції для визначення проліферативної активності (виявлення клітин в усіх фазах мітотичного поділу) нами виявлено нерівномірне й незначне збільшення кількості таких клітин. ІМ Кі-67 шванівських клітини складав 0,8-1,4±0,7%. В цитоплазмі спостерігається збільшення кількості фіксованих та вільних рибосом, полісомних розеток, а також поява молодих форм мітохондрій. Проте, в нервових волокнах зберігаються ознаки деструктивних змін мієліну й виразні ознаки набряку пери- та ендоневрію. У тварин без додаткової корекції спостерігається нерівномірність набряку та утримання дистрофічних змін в тканині корінця. Поряд із ділянками, які містять численні клітини і судини, зустрічаються ділянки з невеликою кількістю клітин і капілярів, й пучками колагенових волокон. При імунофенотипуванні виявлена значна проліферативна активність клітин судинної стінки (з боку периневрального простору), проте судинний малюнок нерівномірний і визначаються безсудинні зони.
При дослідженні взірців нервової тканини після додаткового фармакологічного впливу на корінець трійчастого нерву, нами встановлено, що гістоархітектоніка нервових волокон набуває фізіологічних співвідношень або практично відновлена. Спостерігається значна гіперплазія клітин Шванна, які оточують осьові циліндри, значне дифузне збільшення їх кількості із вірогідним зростанням їх проліферативного потенціалу. ІМ Кі-67 шванівських клітини складав 4,2-5,1±0,05%. В осьових циліндрах спостерігається збільшення кількості мітохондрій з переважанням їх молодих форм. У периневральному просторі з’являється деяка кількість регенерованих безмієлінових волокон, включених по декілька в цитоплазму лемоцита.
На напівтонких зрізах визначається відновлення типової структури нервового корінця з незначним розширенням ендоневрального простору і помірним повнокров’ям судин. Епіневрій стає дещо потовщеним, з чисельними дрібними судинами. Нами встановлена достовірна рівномірна проліферація в усіх шарах судинної стінки у цій серії досліду. Саме це свідчить про функціонально повноцінне відновлення структури й забезпечення функції гематоневрального бар’єру, що доводить важливість цієї ланки нерва (його корінця) для можливості повноцінного відновлення та забезпечення функціонування. Стінки загальної маси мікросудин, розташованих в епіневрії, з ознаками функціонального відновлення.
У сполучній тканині спостерігається невелика кількість фібробластів та лаброцитів. У порівнянні з групою без додаткового впливу, суттєво збільшується кількість макрофагів, фібробластів. Більша частина фібробластів характеризується високою функційною активністю.
Порівняння найбільш характерних структурних змін корінця трійчастого нерва на 29 добу після застосування броміду етидію у різних дослідних групах наведено у таблиці 3.
Таким чином, аплікація прогестерону на попередньо демієлінізовану тканину корінця трійчастого нерва і стовбура мозку характеризується: зменшенням ступеню демієлінізації, покращенням морфо-функціонального стану елементів корінця та мозку, зокрема, за рахунок зменшення набряку внаслідок нормалізації проникності ГЕБ та гемато-неврального бар’єру та пристосувально-компенсаторних механізмів з боку клітинних елементів (підвищення білоксинтезуючих функцій) і, як наслідок, активною проліферацією клітин Шванна та клітин судинної стінки. Все це є свідченням посилення процесу ремієлінізації у вказаній ділянці корінця трійчастого нерва лабораторних тварин при місцевому застосуванні 2,5% розчину прогестерону.
Таблиця 3.
Вплив аплікації прогестерону на структурні зміни корінців трійчастих нервів
Якісні ознаки, різниця груп за критерієм Фішера-Ірвіна
Групи тварин
Дослідна група
(з прогестероном) n=10
Група порівняння
n=10
Набряк периаксональний, р
—
+
Набряк перивазальний, р
—
+
Набряк перицелюлярний, р
—
+
Розширення ендоневральних просторів, р
—
+
Звитість ходу аксонів, р
—
+
Наявність «хвилеподібних» структур, р
—
+
Наявність «колосовидних» структур, р
—
+
Кластери клітин Шванна, р
+
—
Вакуольна дистрофія мієлінових оболонок, р
—
+
Наявність стромальних фагоцитуючих клітин, р
—
+
За допомогою морфометричного дослідження засвідчено: активацію синтезуючої функції ОДГ, стимуляцію проліферації клітин Шванна, призупинення процесів деструкції та залучення процесів репаративно-регенераторного характеру в ресинтез мієлінових оболонок корінця.
продолжение
--PAGE_BREAK--