Характеристика возбудителя лептоспироза

МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА РФ
ФГОУ ВПО
ОРЛОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АГРАРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ
 
Кафедра микробиологии и вирусологии
 
 
 
 
К У Р С О В А Я   РАБОТА
по дисциплине «Микробиология»
 
специализация «Ветеринарно-санитарная экспертиза продуктов»
 
на тему: «Характеристика возбудителя лептоспироза»
 
 
 
 
       Выполнил: студент 2 года обучения
                         ф-та «Биотехнологии и веет. медицины»
                         Должикова О. А.
                                                               Руководитель: ст. преподаватель Михеева Е. А., к.б.н.
/>/>           «       »
            Дата проверки работы
 
 
 
Орёл 2007
Содержание:
Оглавление
Введение. 3
1 Краткая характеристика болезни. 4
2 Характеристика возбудителя. 4
2. 1 Материал для исследования. 4
2. 2 Морфология. 4
2. 3 Культуральные свойства микроорганизма. 4
2. 4 Биохимические свойства. 4
2. 5 Антигенная структура. 4
2. 6 Токсинообразование. 4
2. 7 Устойчивость. 4
3 Биопрепараты и иммунитет. 4
Заключение. 4
Список литературы… 4
Приложение. 4
 Введение
 
Лептоспироз — инфекционная природно-очаговая болезнь жи­вотных и человека, характеризующаяся кратковременной лихо­радкой, анемией, желтухой, гемоглобинурией, геморрагическим диатезом, некрозом слизистых оболочек и кожи, атонией органов пищеварения, абортами. Болезнь может протекать бессимптомно.
Впервые болезнь описали в Германии Weil (1886) и в России Н. П. Васильев (1888). Возбудителя болезни открыли в Японии Inodo и со-авт. в 1914 г. Им удалось изолировать спирохет из печени морских свинок, заражен­ных кровью больных «инфекционной желтухой» людей. В 1935 г. С. Н. Никольский и сотр. описали на Северном Кавказе остропротекающую болезнь крупного рогатого скота, названную иктерогемоглобинурйей. Роль лептоспир в этиологии иктерогемог-лобинурии доказали В. И. Терских (1939) и М. В. Земсков (1940).
По актуальности,эпидемиологической значимости и экономическому ущербу лептоспироз стоит в одном ряду с туберкулезом и бруцеллезом впереди пастереллеза, сибирской язвы, листериоза, эмкара и др
Именно поэтому проблема, рассмотренная в данной работе, является актуальной.
Объектом данной работы является возбудитель лептоспироза, предметом – характеристика болезни; характеристика возбудителя; биопрепараты и иммунитет.
Целью данной работы является изучение болезни, которую вызывает возбудитель, рассмотрение его свойств и изучение средств специфической профилактики.
Для достижения цели мы изучили механизм развития и клинические признаки болезни. Подробно рассмотрели морфологию, культуральные свойства, биохимические свойства, антигенную структуру, токсинообразование и устойчивость возбудителя. Проанализировали целесообразность применения биопрепаратов и формирование иммунитета.
Данная работа написана на основе теоретических, методических и публицестических материалов.
 
 
 
 
 
 
 
 1 Краткая характеристика болезни
 
Патогенность.К лептоспирозу наиболее восприимчивы круп­ный рогатый скот (серогруппы L. Pomona и L. Hebdomadis), свиньи (серогруппы L.Pomona и L. Tarassovi), овцы, лисицы, песцы, ме­нее—лошади, козы, буйволы, верблюды, олени, ослы, собаки, кошки, куры. Болеет и человек. Основные носители лептоспир в природных очагах: серые и водяные полевки, ондатры, серые кры­сы, домовые мыши, землеройки.[приложение 1]
К экспериментальному заражению наиболее чувствительны зо­лотистые хомяки, крольчата-сосуны и молодые морские свинки.
Эпидемиология. Лептоспироз — широко распространенный зооноз, встречается во всех частях света. Существуют природные очаги лептоспироза — преимущественно в лесах, заболоченных местностях, реках. Источником инфекции в них являются дикие животные — грызуны, лисы, песцы и др. Моча животных попа­дает в воду, загрязняет почву, растительность. Заболеваемость ха­рактеризуется строгой сезонностью (июнь — сентябрь) и связа­на с сельскохозяйственными работами (покос лугов, уборка сена), а также сбором грибов, ягод, охотой, рыбалкой. В сельс­кой местности источником инфекции могут быть домашние животные: свиньи, крупный рогатый скот, собаки. Заражение может происходить пищевым путем, например при употребле­нии молока. Возможен также контактно-бытовой путь передачи — при уходе за больными животными. Однако основной путь пе­редачи инфекции — водный. Нередко в сельской местности при купании людей в загрязненных мочой больных животных водо­емах возникают «купальные» вспышки. Возможны случаи лептос­пироза также в портовых городах, где много крыс.[3]
Патогенез.Входными воротами возбудителя являются повреж­денные кожа и слизистые оболочки. Патогенные лептоспиры бла­годаря активной подвижности преодолевают защитные барьеры организма и быстро проникают в кровь. Через 12 ч после зараже­ния их обнаруживают в печени. Затем наступает генерализация инфекции (бактеремия), размножение и накопление лептоспир в печени, почках, надпочечниках, селезенке, легких, появляется ли­хорадка. К этому времени образуются антитела. Они инактивиру­ют лептоспиры, и происходит их элиминация из крови и паренхи­матозных органов. В почечных же клубочках и канальцах лептос­пиры недоступны воздействию антител, где они активно размно­жаются и выделяются с мочой.[8]
Лизис лептоспир сопровождается накоплением токсических веществ, под действием которых повышается проницаемость со­судов, лизируются эритроциты, происходят кровоизлияния, раз­виваются гематурия и желтуха, поражается нервная система. Ток­сикоз может привести к гибели животного.[приложение 2]
Клиническая картина. Инкубационный период обычно продол­жается 7—10 дней, заболевание — 5—6 нед. Болезнь, как пра­вило, начинается остро, температура тела повышается до 39— 40 «С, появляются головная боль, резкие боли в мышцах, осо­бенно в икроножных. В зависимости от поражения тех или иных органов появляются симптомы их повреждения: почечная недо­статочность, желтуха и др. Характерна волнообразная лихорадка. Клинические формы лептоспироза различны — от легких до тяжелейших, приводящих к смерти.2 Характеристика возбудителя2. 1 Материал для исследования
 
Материалом для исследования слу­жат: кровь (лучше брать на 3...5 сутки болезни при повышенной температуре тела), моча, кусочки паренхиматозных органов, поч­ка, транссудат из грудной и брюшной полостей, мочевой пузырь с содержимым, абортированный плод. Патологический материал отбирают не позже 2 ч после гибели животного. Мочу собирают при естественном мочеиспускании; в летнее время исследуется не позднее 3 ч после взятия.
Микроскопия. Исследуют мочу, цитратную кровъ, тка­невую суспензию из коркового слоя почки, печени, у плода —из всех органов. Микроскопию проводят в раздавленной капле с конденсором «темного поля». Типичные лептоспиры активно подвижны и имеют форму прямой или S-образной с загнутыми в виде крючков концами серебристо-белой нити. Лептоспир также можно обнаружить в срезах из органов после импрегнации сереб­ром по методу Левадити.[5]
Выделение культур. Материал засевают по 1...3 кап­ли в 3...5 пробирок со специальной питательной средой и инкуби­руют при 28...30°С в течение З мес. Лептоспиры начинают раз­множаться через 7...20 сут, иногда через 1...2 и очень редко — 3 мес. Наличие роста определяют темнопольной микроскопией раздавленных капель на 3, 5, 7, 10-е сутки и далее через каждые 5 сут. При обнаружении размножения лептоспир делают пересев в 3...5 пробирок со свежей средой. Выделить культуры лептоспир удается не всегда.[4]
Биологическая проба. Метод более чувствительный, чем культуральный; проводится с целью выделения и очистки культур лептоспир, определения их вирулентности и дифферен­циации от сапрофитов.
Заражают 20...30-суточных золотистых хомяков и крольчат-со­сунов в возрасте 10...20 сут. Каждую пробу испытывают на двух животных; на 4...5-е сутки убивают первого, на 14… 16-е сутки — второго, если оно не погибло раньше. Из сердца, печени и почек убитых или павших животных проводят посевы. Сыворотку крови убитого через 14… 16 сут животного исследуют в реакции микроаг­глютинации (РМА) с лептоспирами 13 серогрупп. Положительная РМА в разведении 1:10 и выше указывает на наличие лептоспир в исследуемом материале.
Серологическое исследование. Для серологи­ческой диагностики лептоспироза используют РМА и реакцию аг­глютинации (РА). Пробы крови берут на 5...7-е сутки болезни и при необходимости повторно через 7… 10 сут. Следует учитывать, что антитела в крови у выздоровевших животных могут сохранять­ся до двух лет и более.
РМА ставят в лунках полистироловых пластин. В качестве ан­тигенов используют живые 5,..15-суточные культуры лептоспир 13… 16-й серогрупп. Сыворотку исследуют с антигенами каждой серогруппы в разведениях 1:5, 1: 10 и т.д. до титра. В лунки вно­сят по 0,1 мл разведенной сыворотки и 0,1 мл антигена. Контро­лем служит антиген с физиологическим раствором (по 0,1мл). Пластины выдерживают при 30 °С в течение 1 ч; результаты учи­тывают в препаратах раздавленной капли в микроскопе с конден­сором темного поля. Агглютинация проявляется в склеивании лептоспир и образовании «паучков», состоящих из нескольких де­сятков или сотен бактерий. Свободные концы лептоспир сохраня­ют подвижность. Оценивают реакции в крестах по 4-балльной си­стеме: положительная — не менее чем два креста в разведении сы­воротки 1: 50 и выше, при отсутствии агглютинации в контроле.
РА ставят на стеклянной пластинке, на которую наносят каплю разведенной 1:100 исследуемой сыворотки и добавляют равное ко­личество антигена. Лептоспирозные антигены для РА выпускают шести серогрупп (для каждой отдельно), представляющие собой концентрированную взвесь лептоспир в альбуминовой питатель­ной среде. При наличии в сыворотке специфических антител на­ступает агглютинация. Оценка результатов производится в крестах по 4-балльной системе. Положительной считают реакцию два кре­ста и выше, сомнительной — один крест. Для выявления лепто­спир в крови, моче, паренхиматозных органах, в тканях абортированного плода, в воде и почве предложен иммунофлюоресцент-ный метод.[9]
 
2. 2 Морфология
 
Лептоспиры — спиралевидные бактерии диамет­ром 0,1...0,25 мкм и длиной от 6...15 до З0 мкм, образующие около 20 мелких, тесно расположенных первичных завитков и 1...2 вто­ричных, придающих клетке форму букв Г, S, С. Осевая нить со­стоит из двух фибрилл. В темном поле они имеют вид тонких се­ребристых нитей с утолщенными и загнутыми в виде крючков концами [приложение 3]. У клеток некоторых штаммов концы прямые (бескрючковые лептоспиры).
Для лептоспир характерна активная подвижность, наиболее ча­стый тип движения — вращательно-поступательный. Спор не об­разуют. Грамотрицательные, плохо окрашиваются анилиновыми красителями, по Романовскому—Гимзе — в красный цвет, фиксация мазка существенно изменяет их мор­фологию; используют также метод имп­регнации серебром по Левадити.[1]
 2. 3 Культуральные свойства микроорганизма
 
Лептоспиры — хемоорганотрофные факультативно-анаэроб­ные бактерии. Культивируют их в аэроб­ных условиях при 28...30°С на специаль­ных средах, содержащих 5...10 % сыворот­ки крови кролика или овцы, дистиллиро­ванную, водопроводную, колодезную во­ду или фосфатный буфер (рН 7,2...7,6): среды Уленгута, Терских, Ферворта—Воль­фа, Любашенко и др. Рост лептоспир обыч­но проявляется через 7...20сут, иногда 1...2 мес. Среда при этом не изменяется.
Среда Уленгута. Готовят ее из водопроводной воды (рН 7,2— 7,3), стерилизуют дробно текучим паром. К 10 объемным частям во­ды добавляют 1 часть стерильной сыворотки крови лошади или кро­лика, смешивают, разливают асептически в пробирки по 3 мл и за­ливают 1 мл стерильного жидкого парафина.[6]
Среда Ферворта — Вольфа (модификация С. И. Тарасова)
900 см3 дистиллированной воды смешивают с 0,5 г натрия хло­рида, 1 г пептона Дифко или Витте, 100 см3 концентрированного раствора фосфатного буфера (рН 7,2). Смесь в колбе автоклавиру-ют при 105 ± 1 0С в течение 30 мин. На следующий день ее дважды фильтруют через бумажный фильтр, разливают в пробирки по 5 см3 и снова автоклавируют 30 мин при 120 ± 1 0С. В пробирки с прозрачной средой добавляют по 0,5 см3 кроличьей сыворотки и прогревают на водянойбане при 56—58 °С в течение 30 мин.
Для проверки на стерильность пробирки со средой выдержива­ют в термостате 3—5 сут при 37 °С.[3]
Среда Любашенко. Фильтрованную через бумажный фильтр нехлорированную водопроводную воду (или колодезную, речную) стерилизуют в автоклаве при 1 атм 30 мин, охлаждают, устанавли­вают рН 7,3—7,4, добавляют 5 % сыворотки крови кролика или барана, прогретой при 56 °С в течение Iч. Затем среду пропускают через фильтрующие пластины СФ в фильтре Зейтца и асептически (в боксе) разливают в пробирки. Для контроля стерильности среды пробирки помещают в термостат при 370 С на 48 ч.
На плотных средах (Кокса, ВГНКИ) образуют колонии S-, О- и R-форм. S-форма — типичная для патогенных штаммов, ее коло­нии прозрачные, в виде диска с ровным краем.
 
 
2. 4 Биохимические свойства
 
 Изучены недостаточно. Способность ферментировать углеводы отсутствует; образуют каталазу, оксидазу, липазу и другие ферменты.[2]
 
2. 5 Антигенная структура
 
 Лептоспиры обладают белковым сомати­ческим антигеном, определяющим их видовую специфичность. Поверхностные полисахаридные антигены служат критериями групповой и серовариантной дифференциации. Антигенные свой­ства лептоспир изучают в реакции микроагглютинации и методом иммуноадсорбционного анализа.
 
2. 6 Токсинообразование
 
 Истинный экзотоксин лептоспиры не синтезируют. Они образуют эндотоксин и патогенные ферменты: гемолизин, фибринолизин, плазмокоагулазы, гиалуронидазы, ли­пазы, лецитиназу, которые выделяются в результате лизиса леп­тоспир. Патогенностью обладают свежевыделенные штаммы леп­тоспир; при культивировании на питательных средах это свойство относительно быстро теряется.
 2. 7 Устойчивость
 
Резистентность лептоспир к физическим и химическим средствам соответствует устойчивости вегетативных форм бактерий.Лептоспиры — типичные гидробионты. В воде рек и озер сохраняются до 200 дней, в сточных водах — до 10 дней, в навозной жиже — 24 ч, во влажной почве с нейтральной или слабощелочной реакцией — до 279 дней, но быстро (0,5-2,5 ч) погибают в сухой почве.
В моче крупного рогатого скота, свиней и грызунов они сохраняются от 4 ч до 6-7 дней в мышечной ткани – 48 ч; в свежем молоке — 8...24 ч; в почках убойных животных при 0...4 °С — до 28 сут; в замороженном мясе погибают через 10 сут. Чувствительны к действию поваренной соли: в засоленном (4,8 % NaCl) мясе крупного рогатого скота погибают через 10 сут; в гипертоническом растворе поваренной соли (2,8 %) — через 15 мин.[7]
При кипячении погибают моментально, при 56...580С — в те­чение 25...30 мин. Быстро гибнут при высушивании и под воздей­ствием прямого солнечного света. Низкие температуры консервируют лептоспир. Растворы (0,1%-й соляной кис­лоты, 0,5%-й фенола) инактивируют лептоспиры за 20 мин. Лептоспиры чувствительны также к некоторым антибиотикам и химиотерапевтическим препаратам.
 
 3 Биопрепараты и иммунитет
 
После переболевания у животных формируется длительный и напряженны