С.Ю. Афонькин
Нашорганизм подобен государству, границы которого ежедневно штурмуют толпыиностранцев, въезд которых в страну нежелателен или даже строго запрещен. Черезшироко распахнутые входные ворота пищеварительной и дыхательной систем в негопроникают многочисленные микроскопические простейшие, споры грибов, пыльца, бактериии всевозможные вирусы. По счастью, большинство этих невольных иммигрантов непредставляют для нас потенциальной угрозы. Организм – государство с четкоработающей полицейской инфраструктурой, и прибывающие чужаки встречают болеечем суровый прием. Большинство из них гибнет еще на контрольно-пропускныхпунктах нашего тела – на влажных оболочках глаз, в гортани. Многие вязнут втрясине слизистых выделений носовых ходов и альвеол легких. «Зайцы», попадающиев организм вместе с пищей, перевариваются в желудке. Наконец, наиболее упорных,добравшихся до кровеносной системы, добивает иммунная система.
Основнуюмассу незванных микроскопических визитеров составляют безобидные дилетанты, вовсене вынашивающие коварных планов интервенции. Иначе ведут себя хорошо вышколенныепрофессиональные агенты – патогенные вирусы. Они способны нарушать границыклеточного государства нашего тела в самых труднодоступных для микроорганизмовместах, порой не без помощи человека. Именно так на острие нестерильной иглышприца в кровь проникают вирусы гепатита и СПИДа.
Некоторыевирусы устроены так, что им для активирования необходимо вмешательство защитныхсил организма. Так, например, ротавирусам, вызывающим у детей тяжелые кишечныезаболевания, необходима атака протеолитических ферментов пищеварительнойсистемы. При этом разрушаются защитные участки на поверхности вирусов иоголяются специальные белки, обеспечивающие связывание этих вирусов склетками-мишенями.
Поверхностныебелки позволяют вирусам безошибочно находить свои жертвы среди миллиардовклеток по специальным белкам-маркерам на их поверхности. Нередко несколькоразных типов клеток несут на своей поверхности одинаковые маркеры, чтосвидетельствует об их общем происхождении. Вирусы атакуют всех представителейодной клеточной «семьи». Вирус СПИДа, например, проникает не только в лимфоциты,но и в макрофаги, в некоторые костные клетки и даже в те клетки кожи, у которыхс клетками иммунной системы имеются общие предки.
Послетого как вирус проник в организм, его атака на клетки-мишени происходит поройтак быстро, что иммунная система просто не успевает организовать группу захвата– то есть выработать специфические антитела. С током крови вирусная частица засутки может попасть в любой участок тела. А первичный иммунный ответ развиваетсяминимум за неделю, да и то если вирусов много и они постоянно доступны для атакмакрофагов и лимфоцитов.
Вирусыже, атаковав свою жертву, часто «ложатся на дно»: не размножаются, а лишьвстраивают свой генетический материал в виде фрагмента ДНК в геномклетки-мишени. Именно так ведут себя вирусы СПИДа, относящиеся к групперетровирусов. К сожалению, в клетках нет механизма контроля за «чистотой»собственного генома, и встроенный фрагмент вирусной ДНК может копироватьсявместе с геномом клетки-хозяина годами, до поры до времени никак себя непроявляя. Поэтому от момента заражения, например вирусом СПИДа, до началасобственно заболевания могут пройти годы.
Напервый взгляд обнаружить специфическую вирусную ДНК в немногих зараженныхклетках так же трудно, как найти листик с шифровкой о диверсионных действиях, засунутыймежду страниц многотомного издания, хранящегося в обширной библиотеке. И тем неменее способ детекции существует. Он основан на уникальности фрагментов ДНК.Достаточно сказать, что отрезок длиной всего в 15 нуклеотидов может иметьмиллиард вариантов. Именно благодаря такому разнообразию любой уникальныйотрезок ДНК можно опознать по его небольшому фрагменту. Представьте себе, чтовам в руки попался маленький клочок бумаги с единственной строчкой: «Мой дядясамых честных правил...». Совершенно очевидно, что это отрывок из романа А.С.Пушкина «Евгений Онегин» и к творчеству Ф.М. Достоевского он отношения неимеет. Не вдаваясь в методические тонкости, достаточно упомянуть полимеразнуюцепную реакцию (ПЦР).
Чувствительностьмолекулярных методов детекции чужеродной ДНК методом ПЦР потрясает воображение– достаточно нескольких десятков молекул ДНК в 1 мл раствора. Таким образомможно, например, обнаружить один зараженный лимфоцит из многих сотен тысяч.Если же учесть, что лимфоциты составляют лишь несколько процентов от всехклеток крови, а единственная копия вирусной ДНК затеряна в клеточном ядре средисотен тысяч генов самого организма, то успех охоты за вирусом представляетсяпросто фантастическим! Правда, обнаружить вирус таким изощренным способом можнотолько с помощью дорогих реактивов в хорошо оснащенной биологическойлаборатории. К тому же необходимо соблюдать особую чистоту на всех этапахработы.
Делов том, что окружающий нас мир полон не только микробов и вирусов. Он насыщенмолекулами ДНК. Во-первых, каждый человек, включая исследователей, лаборантов, врачейи пациентов, разбрасывает вокруг себя сотни тысяч постоянно слущивающихсяклеток кожи. Все они содержат полный геном человека. Во-вторых, в лабораториях,где работают с ДНК, фрагменты этих молекул буквально носятся в воздухе. Попадиони в пробы для анализа, и в результате возможна ошибка.
Поэтомууверенная диагностика вирусных инфекций часто становится возможной только тогда,когда вирусы начинают творить свое черное дело – интенсивно размножаться.Делают это они, надо признать, виртуозно. Нередко при этом весьбиосинтетический аппарат клетки переключается на производство вирусных частиц.При полиомиелите, например, уже через несколько часов работы в таком режиме изодной лопнувшей клетки выходят сотни тысяч новых вирусных частиц.
Ивсе же, несмотря на такие темпы размножения, попытки поставить диагноз, непосредственнообнаружив разбойничающий вирус, часто обречены на провал. Ведь счет клеток ворганизме идет на миллиарды, а в поле зрения электронного микроскопа попадаютлишь единицы. Поиск вирусов под микроскопом можно уподобить проверке документову группы случайно задержанных лиц в надежде наткнуться на вражеского шпиона. Ктому же некоторые вирусы предпочитают обретаться в местах более чемтруднодоступных для взятия проб. К примеру, вирус бешенства в качестве своейштаб-квартиры облюбовал так называемые аммоновы рога – структуру головногомозга, к которой без трепанации черепа не доберешься.
Обычновирусную инфекцию обнаруживают совершенно иначе. Для того чтобы утверждать, чтов организме присутствуют те или иные вирусы, достаточно обнаружить его реакциюна них. Дело в том, что наш организм обеззараживает вирусы примерно так же, каксами вирусы находят клетки-мишени. Все сводится к взаимодействиюкомплементарных (взаимно соответствующих) поверхностей молекул – они образуюткомплекс по принципу «ключ-замок». Сначала иммунная система с помощьюмакрофагов и Т-лимфоцитов тщательно знакомится с особенностямипространственного устройства отдельных участков вирусных белков (иммунологиназывают их антигенами). Затем В-лимфоциты начинают вырабатывать специфическиеантитела – иммуноглобулины, взаимодействующие только с этими антигенами.Поскольку белки вирусов уникальны, то и образовавшиеся к ним антителавысокоспецифичны. Словно спущенная с цепи свора гончих, иммуноглобулины рыскаютпо кровеному руслу и протокам лимфатической системы, готовые в любую минутуопознать непрошенных гостей и «вцепиться» в них. Таким образом достаточнодоказать существование в организме определенного количества антител к искомомувирусу, и в его присутствии можно не сомневаться.
Напервый взгляд такая задача кажется почти неразрешимой. Число различныхвариантов антител оценивается специалистами в сотни миллионов, да к тому же всеантитела внешне похожи друг на друга. Решить эту проблему можно с помощьюспецифических взаимодействий антигенов и антител. Дело в том, что вирусныебелки реагируют только со специфическими, комплементарными им антителами, а всеостальные антитела им безразличны. Таким образом задача исследователя сводитсяк добавлению в образец плазмы крови своеобразной приманки – вирусных белков.Если комплексы образуются, значит, данный вирус уже успел поразбойничать ворганизме.
Успехохоты на вирус во многом зависит от качества приманки. Чтобы ее получить, вирусыкультивируют в лабораториях на специальных клеточных линиях, затем очищают, концентрируют,после чего лизируют вирусные частицы – «разбирают» их на отдельные части.Некоторые из белков, на которые реагирует иммунная система (обычно этоповерхностные белки вируса), тем или иным способом фиксируют на поверхностилунок, сделанных в специальных пластиковых планшетах. После добавления в лункиантител они прочно сядут на подготовленное для них ложе, если там есть вирусныебелки.
Приготовлениевирусных лизатов – процедура довольно хлопотная и опасная. Особенно когдаимеешь дело с таким безжалостным убийцей, как вирус СПИДа. Гораздо безопаснееработать с отдельными вирусными белками, которые можно получить с помощьюметодов биотехнологии. Для этого соответствующие вирусные гены вводят вкишечную палочку. Она послушно начинает работать «на заказ», синтезируя помимосвоих собственных белков некоторое количество вирусных. Кроме того, небольшиефрагменты вирусных белков удается синтезировать биохимическими методами.
Надо,впрочем, честно признаться, что оба этих способа не лишены своих недостатков.Например, трудно полностью отделить вирусные белки от белков кишечной палочки.А к последним в крови людей есть антитела, поэтому возможны ошибки притестировании. Короткие синтетические пептиды могут оказаться плохимииммуногенами. Ведь крупный белок подчас облепляется антителами словно ежикяблоками. Разные иммуноглобулины садятся на разные участки белка – отсюда имощный комплексный ответ иммунной системы на чужеродные белки. А на одну«иголочку» синтетического пептида много яблок не наколешь. В идеале следовалобы ловить антитела к вирусу на все его белки одновременно. Однако при такомспособе резко возрастает стоимость тестирования.
Предположим,полученные тем или иным способом вирусные белки все-таки связались скомплементарными к ним антителами. Как же теперь выявить эти комплексы всыворотке крови? Это стало возможно с начала 70-х гг. Именно тогда голландскиеисследователи Е.Энгвалл, П.Пельман, В.Ван-Вимен и А.Шуурс научилисьприсоединять к антителам молекулы ферментов. Ферменты подбирают таким образом, чтобылегче было регистрировать результат катализируемых ими реакций. Например, онидолжны заметно менять цвет реакционной смеси. Антитела человека для другихживотных являются чужеродными белками, т.е. антигенами. Если ввести их, например,кролику, то в его крови появятся антитела на человеческие антитела, которыеможно выделить. К полученным антителам животного «пришивают» соответствующийфермент. Получившийся комплекс, называемый конъюгатом, и используют длясвязывания с антителами человека.
Влунку с зафиксированными в ней вирусными антигенами (белками и их фрагментами)вносят каплю сыворотки крови пациента. Если антитела против вируса присутствуютв сыворотке, они прочно присоединятся к вирусным антигенам. Затем лункупромывают, удаляя все человеческие антитела, не имеющие отношения к данномувирусу. После промывки добавляют заранее полученный конъюгат. Если в лункеостались человеческие антитела, конъюгат к ним обязательно присоединится. Лункиснова промывают и добавляют субстрат для фермента. Если фермент в лунке остался,он изменит цвет реакционной смеси. Это и будет являться свидетельством того, чтоданный вирус в организм попал и иммунная система на такое вторжениеотреагировала!
Описаннуюсхему можно менять на все лады. Например, сажать на поверхность лунок невирусный антиген, а очищенные антитела к нему. Тогда мы будем искать всыворотке не антитела к вирусу, а сами вирусные частицы. Вместо кроличьихантител иногда используют белок А золотистого стафилококка, который великолепносвязывается с любыми человеческими антителами. Наконец, фермент можно заменитьрадиоактивной меткой или флуоресцирующей краской. В общем, как говорится, возможныварианты.
Вцелом же наиболее распространенный в медицинской практике принцип поискавирусов остается неизменным: на антиген сажают антитело, потом сверху еще одноантитело… Это похоже на приготовление бутерброда, не случайно поэтомуиммунологи называют такой прием сэндвич-методом. Существуют и другие, болееизощренные приемы. К сожалению, все они, включая дорогую диагностику чужероднойДНК с помощью ПЦР, пока позволяют лишь констатировать печальный факт наличиявирусной инфекции. Однако диагностика инфекций совершенно необходима при оценкеэффективности действия противовирусных препаратов, а также вакцин.
Список литературы
Дляподготовки данной работы были использованы материалы с сайта bio.1september.ru