А.Б.Рубин, О.Р.Кольс, Т.Е.Кренделева и др.
Однойиз важнейших фундаментальных проблем биофизики является расшифровка механизмовпервичных процессов действия света на разные биологические системы. Светявляется одним из ключевых факторов среды обитания большинства организмов.Рецепция света и трансформация его энергии лежит в основе зрения, фотосинтеза иряда фоторегуляторных процессов у растений, в инициации которых участвуютспециализированные фоторецепторы, например, родопсин, хлорофилл, фитохром, фототропин,криптохром. Поглощая свет определенного спектрального диапазона, фоторецепторывступают в фотохимические реакции с образованием первичных фотопродуктов.Последние участвуют в биохимических процессах клеточной регуляции, что приводитк развитию конечных фотобиологических эффектов. В то же время свет индуцируетпротекание в клеточных структурах различных деструктивных фотохимическихреакций, природа и эффективность которых зависит от длины волны и интенсивностиизлучения, наличия соответствующих фотоактивных хромофоров и их внутриклеточнойлокализации, а также способности клеток к фотозащите и репарациифотоповреждений. Наиболее эффективно деструктивные реакции индуцируютсявысокоэнергетическим ультрафиолетовым (УФ) излучением (‹290 нм). Экологическимикомпонентами оптического излучения солнца яаляются средневолновый УФ (СУФ, 290—320нм), длинноволновый УФ (ДУФ, 320—400 нм) и видимый свет (400—700 нм).Уменьшение концентрации стратосферного озона ведет к повышению интенсивностиСУФ, который за счет прямого поглощения нуклеиновыми кислотами и белкамивызывает образование в них повреждений, обусловливающих цитотоксические, мутагенныеи канцерогенные эффекты. ДУФ и видимый свет, которые макромолекуламинепосредственно не поглощаются, могут индуцировать деструктивные реакции засчет фотосенсибилизации с участием эндогенных и экзогенных сенсибилизаторов(хромофоров), способных в фотовозбужденном состоянии реагировать сбиосубстратами с образованием реакционноспособных радикалов или генерироватьактивные формы кислорода, вызывающие окислительный стресс.
Молекулярная фотобиология
Исследованияв этой области связаны с изучением фундаментальных механизмов воздействия светана клетки дрожжей и бактерий. Основная проблема состоит в выявлениифотоиндуцированных реакций и изучении природы светочувствительности живойклетки при воздействии оптического излучения. В центре внимания —экспериментальное решение следующих вопросов:
какиепотенциально фотоактивные хромофоры (сенсибилизаторы) могут вступать вфотохимические реакции в клетке, не содержащей специализированныефоторецепторные системы;
каковаприрода первичных фотопродуктов, ответственных за развитие конечногофотобиологического эффекта;
какоезначение для протекания фотореакций и проявления эффекта имеют внутриклеточнаялокализация фотоактивного хромофора и его молекулярное микроокружение;
какиемеханизмы могут лежать в основе фотоиндуцированной модификации цитотоксическихэффектов оптического излучения, которая наблюдается при комбинированныхвоздействиях света разной длины волны и интенсивности.
Исследования,проведенные на клетках дрожжей, позволили обнаружить, что низкоинтенсивныймонохроматический свет в диапазоне 290—380 нм индуцирует два различныхфотобиологических эффекта в зависимости от дозы облучения: фотозащиту отУФ-инактивации и фотостимуляцию размножения клеток. Оба эффекта основаны на фотомодуляцииактивности фермента, катализирующего синтез серотонина — метаболита, у которогобыли обнаружены ранее не известные функции — протектора ДНК от УФ-повреждений ирегулятора клеточного деления. При более высоких интенсивностях и дозах ДУФ-излучение вызывает летальный эффект, в основе которого лежат фотодинамическиереакции. Показано, что функцию эндогенного сенсибилизатора выполняетлокализованный в ядре клетки НАДН. Установлена способность НАДНфотогенерировать супероксидный анион-радикал кислорода с последующимобразованием перекиси водорода и гидроксильного радикала, которыйнепосредственно участвует в формировании одноцепочечных разрывов ДНК.Кратковременное воздействие видимого света в малых дозах (максимумэффективности в красной области спектра при 680 нм) индуцирует защитный эффектв условиях инактивирующего облучения клеток СУФ и ДУФ. Установленоцитотоксическое действие видимого света, опосредованное эндогеннымсенсибилизатором протопорфирином. В условиях индуцированного накопления в митохондрияхклетки высокого уровня сенсибилизатора и последующей его релокализации вплазматическую мембрану и ядро наблюдается многократное увеличение летальногоэффекта вследствие взаимодействия деструктивных процессов, протекающих в этихструктурах.
Вкачестве первоочередной задачи при изучении молекулярного механизмаобнаруженного фотозащитного эффекта, индуцированного красным светом, необходимаидентификация фоторецептора, опосредующего этот эффект. Полученные ранее данныедают основания предполагать, что фоторецептором в дрожжевой клетке можетслужить хромопротеид, аналогичный фитохрому — универсальному фоторегуляторномупигменту растений. У микроорганизмов функциональная роль фитохрома пока неопределена, хотя гены, кодирующие апофитохром, недавно найдены у некоторыхбактерий и грибов. Другая задача связана с изучением молекулярных основфотосенсибилизирующей активности и фотолабильности эндогенного протопорфирина, участвующегов фотодинамической инактивации дрожжевых клеток, в зависимости от молекулярногомикроокружения.
Молекулярные механизмы фотосинтеза
Важнейшейфундаментальной проблемой биофизики является изучение фотосинтеза — процессапреобразования световой энергии солнца в химическую энергию тканейфотосинтезирующих организмов. В первичной (световой) стадии энергия поглощенныхквантов света используется для разрыва химических связей восстановителя (вслучае высших растений — для фотолиза воды), а часть ее, в конечном счете, запасаетсяв новых химических связях. В последующей (темновой) стадии фотосинтезазапасенная энергия используется для восстановления углекислоты до сахаров ввосстановительном пентозофосфатном цикле, осуществлящем создание органическоговещества из неорганического. Первичные процессы фотосинтеза включают несколькоэтапов: поглощение света хлорофиллом антенного комплекса, миграцию энергиипоглощенных квантов к реакционным центрам (РЦ) фотосистем, фотохимическоеразделение зарядов, перенос электронов по фотосинтетическойэлектрон-транспортной цепи, сопряженный с запасанием энергии в виде химическихсвязей конечного восстановленного продукта — восстановленного НАДФ, а такжеАТФ.
Посколькуразные этапы первичных процессов фотосинтеза протекают в разных компартментахфотосинтетической мембраны и характеризуются различными временами, дляпонимания механизма процесса фотосинтеза необходимы исследования, проводимыеспециалистами разного профиля и использованием объектов разной сложности — отизолированных макромолекулярных белковых и пигмент-белковых комплексов, различныхсубхлоропластных частиц, хлоропластов, фотосинтезирующих клеток водорослей донативных растений. Это требует сотрудничества фотофизиков, биохимиков ифизиологов растений. Кроме того необходима лабораторная техника, позволяющаяисследовать процессы в разном временнóм диапазоне.
Ключевойэнергопреобразующей структурой в фотосинтезирующих организмах являютсяреакционные центры фотосистем, встроенные в фотосинтетические мембраныпигмент-белковые комплексы, выполняющие за счет энергии света высокоэффективный(квантовый выход — до 100 %) и очень быстрый (менее 1 нс) трансмембранныйперенос электронов против направления термодинамического потенциала, врезультате чего, в конечном итоге, и запасается солнечная энергия.
Впроводимых исследованиях используются различные современные методы кинетическойабсорбционной и люминесцентной спектрофотометрии широкого временного диапазонарегистрации, ЭПР, ЯМР, ядерный гамма-резонанс, современные подходытеоретического анализа получаемых результатов и построения адекватныхфизических моделей процессов. Имеется биохимическая база для получениявысокочистых активных фотосинтетических препаратов различного состава, включаяизолированные мембранные белково-пигментные комплексы разного уровняорганизации. Основными методами изучения механизмов преобразования световойэнергии в первичных стадиях фотосинтеза являются:
измерениекинетик затухания флуоресценции (импульсная флуориметрия) с временнымразрешением до 10 —12 с;
лазернаяабсорбционная спектроскопия фемто-, пико- и наносекундного (10 —14 — 10 —8 с)диапазона, позволяющая исследовать последовательность и скорости реакцийпреобразования энергии кванта света в энергию электрохимического потенциала;
спектроскопиякомбинационного рассеяния света, позволяющая изучать природу химических связейсинтезированных под действием света соединений;
широкийспектр традиционных методов оптической спектроскопии, спектроскопии переходныхпроцессов, компьютерного моделирования и радиоспектроскопии.
Методамиимпульсной флуорометрии и абсорбционной спектроскопии высокого (10 —14 — 10 —8с) временного разрешения исследуются процессы миграции энергии электронноговозбуждения в антенных пигмент-белковых комплексах, захвата возбужденияфотоактивным пигментом РЦ — первичным донором электрона, и темновые реакцииразделения зарядов и переноса электрона в акцепторной цепи электронноготранспорта. Показано, что белки, содержащие пигменты антенны и кофакторы, завремена менее 10 —12 с способны осуществлять тонкую подстройку начальных иконечных состояний донора и акцептора энергии (электрона). В самый начальныймомент времени возникает неравновесное начальное состояние донора энергии(электрона). В результате процесса сольватации с участием водородных связейпроисходит понижение уровня энергии донора и формирование наиболее выгоднойконфигурации потенциальной поверхности для реактантов. Как следствие, вероятностьобратных (бесполезных) реакций падает, а эффективность прямых энергетическивыгодных реакций существенно возрастает.
Наноразмерные синтетические энергопреобразующиесистемы
Базовыепринципы высокоэффективного преобразования световой энергии при фотосинтезелегли в основу создания синтетических энергопреобразующих структур на основепорфиринов. Сконструированы различные химические структуры, способные к 1%межмолекулярному (диады) и внутримолекулярному (димеры) переносу энергииэлектронного возбуждения от донора к акцептору. В этих синтетическихтрехкомпонентных системах (безметалльный порфирин — Zn порфирин — хинон)осуществлена последовательность событий, реализуемых в фотосинтезирующихорганизмах: поглощение света → миграция энергии → разделениезарядов. Такие синтетические структуры могут стать прообразом искусственныхэнергопреобразующих устройств будущего.
Перспективы(как в фундаментальном, так и в прикладном аспекте) связаны с возможностьюсоздания гибридных наноразмерных биоэнергетических и биосенсорных устройств.Фотосинтетический реакционный центр является природным наноструктурнымобразованием. Именно специфика протекания фотофизических и фотохимических процессовв наноразмерных структурах объясняет уникальные энергопреобразующие свойствафотосинтетических РЦ. Гибридные устройства типа: РЦ — нанотрубка илимолекулярный провод — электрод — внешняя электрическая цепь могут статьпрообразом биоэлектрических генераторов энергии.
Бактериородопсин
Эволюционнонаиболее ранним фотопреобразующим комплексом является белок бактериородопсин, осуществляющийсветоиндуцированный трансмембранный перенос протонов, создающих «движущую силу»для последующего синтеза АТФ. Этот белок, выполняющий в настоящее время функциютак называемого «бесхлорофильного» фотосинтеза у некоторых видов архебактерий, чрезвычайноустойчив к различным воздействиям. Физические механизмы функционированияданного фотопреобразующего комплекса привлекают самое пристальное вниманиеисследователей в течение последних десятилетий.
Впроводимых на кафедре биофизики работах было показано, что конформационнаяподвижность фототрансформирующих белков, как и в случае классических ферментов,играет ключевую роль в их функционировании. Ее роль проявляется, начиная спикосекундных стадий переноса электрона, в которых микроконформационнаядинамика обеспечивает быстрые релаксационные процессы, сопровождающиеэффективную временную стабилизацию первичного разделения заряда. Гораздо болеемедленные конформационные изменения, приводящие к формированию выделенныхструктурных состояний макромолекулярного комплекса, контролируют направленностьи скорость дальнейшего переноса зарядов. Была показана важнейшая роль состояниявнутримолекулярных водородных связей в указанных процессах.
Детальноеизучение влияния температурного фактора на первичные фотофизические процессыпревращения световой энергии позволило сформулировать концепциюфотоконформационного перехода как эффективного механизма регуляции скоростипереноса электронов в фоточувствительной макромолекулярной структуре.
Иммобилизацияэтих белков в полимерных матрицах, формирование на их основе тонкихориентированных пленочных структур, включение полупроводниковых и других электропроводящихкомпонентов в создаваемые конструкции открывает широкие возможности изученияпрактического применения белков РЦ и бактериородопсина. Имеется приборная базадля формирования и изучения свойств упорядоченных моно- и мультислойныхмногокомпонентных пленочных конструкций с участием фоточувствительных белков(техника Ленгмюра- Блоджетт, атомно-силовая и туннельная микроскопия, электрохимическийанализатор).
Кислород-выделяющий комплекс хлоропластов (КВК)
Фотохимическоеразделение зарядов в РЦ фотосистем индуцирует транспорт электронов в ЭТЦфотосинтеза. У высших растений и водорослей донором электронов является вода.Побочный продукт окисления воды, кислород, выбрасывается в атмосферу, егонакопление в атмосфере привело к ее радикальной трансформации и послужилофундаментом для развития многочисленных форм животных. Процесс, сопровождающийсяфотоокислением воды с выделением кислорода, называется оксигенным фотосинтезом,и начальные его стадии (окисление воды) осуществляются в пигмент-белковом комплексефотосистемы II. Поглощение света ФС II сопряжено с работой каталитическогоцентра — кислород выделяющего комплекса. КВК состоит из 4 катионов марганца и 1катиона кальция. Фундаментальная роль данного металлофермента вфункционировании биосферы определяет высокую интенсивность исследованиймеханизмов работы КВК и ФС II. Однако, несмотря на значительные успехи впонимании основ функционирования ФС II, работа ее ключевого звена, КВК, все ещеостается неясной.
Впроводимых в настоящее время исследованиях ФС II широко используются новейшиеметоды, применяемые в передовых областях биофизики, биохимии, молекулярнойбиологии, нанотехнологии для изучения каталитических центров металлоферментов, механизмоввнутри- и межмолекулярного переноса электрона, структурной организации ифункционирования наноструктур. К ним можно отнести различные методы регистрациифлуоресценции, рентгеноструктурный анализ, точечный мутагенез, компьютерноемоделирование структуры, рентгеновскую спектроскопию, ЭПР, инфракраснуюспектроскопию с Фурье разложением и т.д. Исследования КВК, проводимые накафедре биофизики, направлены на выяснение структурной организации КВК сиспользованием разработанного метода замещения катионов марганца на катионыжелеза, а также роли кофакторов КВК — катионов кальция и анионов хлора — вокислении воды.
Проблемы регуляции первичных процессов фотосинтеза
Фотосинтетическийаппарат имеет сложную многоуровневую систему регуляции, которая должнаобеспечивать эффективное использование энергии света, а также сопряжениесветовых и темновых процессов фотосинтеза. Существует целая иерархиярегуляционных механизмов, зависящих от физиологического состояния и измененийсреды, которые условно можно разделить на «медленные» и «быстрые». «Медленные»предполагают перестройку и изменение структуры хлоропласта и его компонентов, ихдействие связано с включением генетического аппарата и синтезом новых белков, длячего требуется определенное время (минуты, часы). Эти процессы зависят отработы регуляторных белков, которые активируются под действием света.
Механизмы«быстрой» регуляции, ответственные за динамические изменения в функционированииотдельных участков фотосинтетической цепи, с синтезом белка не связаны. Ониоснованы на изменениях констант взаимодействия переносчиков, например, вследствиеизменения их конформации, и направлены на недопущение перевосстановленности ЭТЦпри высоких освещенностях. Из результатов исследований последних лет, проводимыхна кафедре биофизики, можно предполагать, что следствием наличия гибкой системырегуляции является защита от окислительных повреждений, а целью быстройрегуляции электронтранспортных процессов фотосинтеза — создание оптимальногосостояния ЭТЦ, когда нет избытка или недостатка электронов на определенных ееучастках, что позволяет защитить фотосинтетические мембраны от фотодеструкции.
Наличиебольшого числа акцепторов электронов открывает дополнительные возможности длярегуляции электронного потока и систем ассимиляции СО2 и азота, что необходимодля обеспечения процессов синтеза белка в хлоропласте. Кроме того, существованиеальтернативных путей сброса электронов препятствует «перевосстановлению»компонентов, поддерживая их в определенном редокс-состоянии.
Существуетнесколько механизмов, защищающих фотосинтетические мембраны от фотоповреждения.Важную роль играет нефотохимическое тушение возбужденных состояний хлорофилла, этотмеханизм связан с образованием трансмембранного ΔрН, а также работойвиолоксантинового цикла. Вся не использованная в фотосинтезе энергияпоглощенных квантов света рассеивается в виде тепла или излучается в видефлуоресценции. Увеличение рассеивания энергии в виде тепла уменьшает количествоактов разделения зарядов в РЦ и, соответственно, приводит к уменьшению потокаэлектронов в ЭТЦ. Подавляющая часть флуоресценции, наблюдаемой при изучениилистьев высших растений или суспензий зеленых водорослей, генерируется в ФС II.В настоящее время параметры флуоресценции широко используются в фундаментальныхи прикладных исследованиях как показатель состояния и эффективностифункционирования фотосинтетического аппарата. Основная идея состоит в том, чтоуменьшение эффективности запасания света в фотосинтезе приводит к увеличениюинтенсивности флуоресценции. Изменения состояния фотосинтетического аппаратасопровождаются изменением вероятности тушения энергии электронного возбуждениямолекул хлорофилла, что и проявляется в изменении квантового выхода и временизатухания флуоресценции.
Фотоиндуцированное выделение водорода
Перспективнымнаправлением исследований является фотоиндуцированное выделение водородаэукариотическими микроводорослями — еще один механизм регуляции первичныхпроцессов фотосинтеза. Этот удивительный процесс был открыт более 60 лет назади активно используется в биотехнологических целях, однако в пониманиимолекулярных механизмов и принципов регуляции процесса есть еще много белыхпятен. Водород выделяется гидрогеназой — ферментом, восстанавливающим протоныдо молекулярного водорода. Непосредственными донорами электронов вгидрогеназной реакции являются ферредоксин или НАДФ. Таким образом, фотоиндуцированноевыделение водорода тесно связано с работой фотосинтетической ЭТЦ, нонепременным условием этого процесса является отсутствие кислорода, которыйингибирует активность фермента даже при очень низких концентрациях.
Какбиотехнологический прием для разделения во времени процессов фотосинтетическоговыделения О2 и светозависимого выделения Н2 можно использовать серное голоданиекультуры водорослей. Изучение влияния серного голодания на клетки Chlamydomonasreinhardtii в аэробных условиях (когда гидрогеназа неактивна) показало, что принедостатке серы происходит инактивация катализируемого ФС II выделения О2. Взамкнутом культиваторе культура микроводоросли на свету в отсутствие серы всреде проходит несколько последовательных стадий. Сначала идет активноевыделение O2, затем активность ЭТЦ фотосинтеза снижается, и процессы дыханияначинают преобладать над процессами фотосинтеза. Когда скоростьфотосинтетического образования O2 становится ниже скорости дыхания, культурапереходит в анаэробные условия, и через некоторое время начинается выделениеH2.
Отом, что происходит с фотосинтетическим аппаратом при прохождении всех этихстадий, можно судить по параметрам флуоресценции хлорофилла. Изучение динамикиактивности ФС II Chlamydomonas reinhardtii в культиваторе показало, что переходв анаэробиоз сопровождается резким падением активности ФС II, по временисовпадающим с началом выделения водорода. Активацию гидрогеназы в анаэробныхусловиях можно рассматривать как адаптивный механизм, который увеличивает оттокэлектронов на водород, что снижает степень восстановленности пула хинонов иреактивирует часть центров ФС II. Это способствует частичному сохранениюфотосинтетического электронного транспорта в голодающих клетках и обеспечиваетих некоторым количеством кислорода, что позволяет некоторое время оставатьсяжизнеспособными в условиях стресса. Временное частичное повышение скоростиэлектронного транспорта вызывает реокисление пула хинонов, что видно поизменению индукционной кривой флуоресценции. Эти результаты показывают, чтоизменение редокс-состояния пула хинонов — способ регуляции ЭТЦ при сменеусловий.
Весьмаперспективным при прояснении вопроса о роли фотосистемы II в процессахвыделения водорода является использование мутантов с сайт-специфичнымиповреждением в ФС II. Были использованы мутанты водоросли C. reinhardtii, обладающиеразличной кислород-выделяющей активностью. Представлялось, что частичная потерякислородвыделяющей активности будет иметь следствием ускорение перехода ванаэробные условия, но не должна отрицательно сказаться на скорости продукцииН2. Однако оказалось, что, чем больше повреждена способность ФС II к выделениюО2, тем сильнее снижена способность к выделению водорода. Изучение динамикинакопления и расхода метаболитов (крахмала, формата и ацетата) в разныхмутантах в ходе серного голодания показало, что образование водорода в большей,чем ожидалось, степени коррелирует с активностью ФС II. Эти исследования могутбыть основой для разработки биотехнологических приемов для увеличения выхода Н2.
Список литературы
Дляподготовки данной работы были использованы материалы с сайта bio-cat.ru/