КУРСОВАЯ РАБОТА
«Методы выделения и анализа кумаринов в ЛРС».
Оглавление
Введение
1.Основная часть
1. Общая характеристика кумаринов
2. Классификация производных кумарина
3. Краткая характеристика методов выделения и анализа
4. Методы выделения кумаринов
5. Методы анализа кумаринов
Заключение
Литература
Условныеобозначения
ЛВ –лекарственное вещество
ЛФ –лекарственная форма
ЛРС –лекарственное растительное сырьё
ТСХ –хроматография в тонком слое сорбента
УФ область– ультрафиолетовая область
ГЖХ –газожидкостная хроматография
ВЭЖХ– высокоэффективная жидкостная хроматография
Введение
Физиологическаяроль кумаринов до конца не установлена. Известно, что они участвуют в регуляциироста растений, являясь антагонистами ауксинов; поглощают ультрафиолетовыелучи, защищая молодые растения от чрезмерного солнечного облучения;предохраняют растения от вирусных заболеваний.
Однимиз характерных фармакологических свойств производных кумарина является антикоагулирующеедействие, также известны коронарорасширяющие, бэта-блокирующие и желчегонныесвойства кумаринов. Многие фурокумарины обладают фотосенсибилизирующейспособностью и спазмолитической активностью. Ряд кумаринов и фурокумариновпроявляют бактериостатические и антимитозные свойства. У куместрола иродственных ему соединений отмечено выраженное эстрогенное действие. Имеютсялитературные данные об анти-ВИЧ активности некоторых синтетических и природныхпроизводных кумарина.(6)
Собственнокумарин (лактон цисо-гидроксикоричной кислоты) широко применяется в парфюмернойпромышленности. Установлена его эффективность при некоторых видах лимфедемы,почечной карциноме и меланоме. Однако известно, что в экспериментах на печеникрыс кумарин проявляет гепатотоксичность, а при длительном применении в высокихдозах сам является канцерогеном.
Кчислу растительных объектов, содержащих кумарин, следует отнести донниклекарственный (Melilotus officinalis (L.) Pall.).Проводимыми исследованиями установлено наличие у травы донника лекарственногоантигипоксической, антиишемической и других видов кардиотропной активности, чтоявилось основанием для разработки технологии и методов стандартизации сухогоэкстракта, таблеток, мази и суппозиториев на его основе, а также жидкогоэкстракта травы донника лекарственного и препарата «Флокрамел».Однако все предложенные методы оценки качества разработанных преператов(УФ-спектрофотометрия, ВЭЖХ, ТСХ) требуют наличия стандартного образца веществкласса кумаринов.(11)
Приизучении НД на стандартные образцы, применяемые для оценки качествалекарственного растительного сырья (ЛРС) и фитопрепаратов, установлено, чтостандартные образцы на производные собственно кумарина отсутствуют.Существующие стандартные образцы фурокумаринов псоралена, ксантотоксина,фловерина (сумма пиранокумаринов — дигидросамидина и виснадина) неприемлемы дляоценки качества лекарственного растительного сырья, содержащего лактон цисо-гидроксикоричнойкислоты и его замещенные аналоги.
Всвязи с этим представляет интерес обзор возможных методов выделения, а такжесинтеза и последующего анализа данного класса природных веществ с цельюразработки адекватных методов получения стандартного образца и использованияего для оценки качества ЛРС, фитосубстанций и препаратов, содержащих экстрактытравы донника лекарственного. (7)
Основнаячасть
1. Общаяхарактеристика кумаринов
Кумарины– природные кислородсодержащие гетероциклические соединения, в основе структурыкоторых лежит бензо-а-пирон (лактон цис-орто-гидроксикоричной кислоты).
Кумариныпредставляют собой производные 2Н-1-бензопиран-2-она. Они наиболее широкораспространены в семействах Apiaceae Lindl., Rutaceae Juss., Fabaceae Lindl., Hippocastanaceae DC, при этом место их локализации различно: плоды, подземныеорганы, кора, листья, стебли и т.д. Количественное содержание кумаринов врастениях колеблется от 0,5 до 2 %, нередко достигая 5 — 6 %. Кумариныпредставляют собой бесцветные или окрашенные в желтый цвет кристаллическиевещества, хорошо растворимые в органических растворителях — хлороформе,диэтиловом эфире, этиловом спирте, а также в жирах и жирных маслах. Принагревании до 100° С возгоняются.(1,2)
2. Классификацияпроизводных кумарина:
1. Незамещенныекумарины:
/>
кумарин
2.Гидрокси-, метокси(алкокси)- и метилендигидроксикумарины и их гликозиды:
2.1.С гидроксильными или алкоксильными группами в бензольном кольце;
/>
R1 = Н, R2 = ОН умбеллиферон
R1, R2 = ОН эскулетин
R1 = ОСН3 R2 = ОН скополетин
2.2.С гидроксильными или алкоксильными группами в пироновом кольце (галфордин);
2.3. Алкилированныев бензольном или пироновом кольце гидрокси- или метоксикумарины.
3.Фурокумарины:
3.1.Производные псоралена:
/>
R1 = Н R2 = Н псорален
R1 = Н R2 = ОСНз ксантотоксин
R1 – OCH3 R2 = Н бергаптен
R1 – ОСН3 R2 = ОСН3 изопимпинеллин
3.2.Производные ангелицина:
/>
ангелицин
4.Пиранокумарины:
/>
/>
/>
виснадин
/>
5.3,4-бензокумарины:
эллаговаякислота
6.Куместаны: куместрол и др.
7.Другие более сложные соединения, в состав которых входит кумариновая система(новобиоцин, афлатоксин и др.) (2,7)
3. Краткаяхарактеристика методов выделения и анализа
Экстракция– метод разделения, основанный на использовании экстрагента, не смешивающегосяс исходной фазой и легко отделяющегося от неё и от экстрагируемых компонентов. Взависимости от исходной фазы различают эстракцию из твёрдого твёрдого веществаи экстракцию из раствора (жидкостную). По количеству операций экстракция можетбыть однократной и многократной.
Хроматографическиеметоды разделения веществ основаны на их распределении между двумя фазами:подвижной и неподвижной. Подвижная фаза – жидкость или газ; неподвижная –твёрдое вещество или жидкость, адсорбированная на твёрдом носителе.Относительная скорость перемещения частиц вдоль пути разделения зависит от ихвзаимодействия с неподвижной фазой. Поэтому каждое вещество проходит наносителе определенный путь. Отношение пути перемещения вещества к путиперемещения растворителя есть величина постоянная, обозначаемая Rf. Она является константой для данныхусловий разделения и используется для идентификации ЛФ.
Хроматографияна бумаге. Носителем неподвижной фазы (например, воды) служит специальнаяхроматографическая бумага. Распределение происходит между водой, находящейся наповерхности бумаги, и подвижной фазой, которая представляет собой систему изнескольких растворителей. Проводят испытания. Для подтверждения подлинности одновременнохроматографируют испытуемое вещество и стандартный образец. Если они идентичны,то пятна на хроматограммах будут иметь одинаковый вид и равные значения Rf.Хроматографию используют прииспытании на чистоту.
Хроматографияв тонком слое сорбента (ТСХ) отличается от хроматографии на бумаге тем, чтопроцесс хроматографирования происходит на носителе (сорбенте), нанесенномтонким слоем на инертную поверхность. Твердый сорбент может быть закрепленнымили незакрепленным на этой поверхности. Сорбентом служит силикагель или оксидалюминия. Для закрепления добавляют небольшие количества крахмала или сульфатакальция, Используют также пластинки промышленного изготовления типа «СилуфолУФ-254», «Сорбфил» и др.
ПреимуществамиТСХ является простота приемов и оборудования, более высокая чувствительность,чем у бумажной хроматографии, устойчивость пластинок к температурным ихимическим воздействиям, значительно большие возможности процессов разделения,детектирования, элюировання, меньшая продолжительность выполнения испытания.Все это создает широкие возможности в использовании ТСХ для выполненияиспытаний на подлинность, на чистоту, для количественного определения ЛВ в ЛФ.
Двумерноехроматографирование отличается повторным (после высушивания) пропусканием тойже или иной подвижной фазы, но в перпендикулярном по отношению кпервоначальному направлению. При этом используют квадратные пластины или листыбумаги.
Вфармацевтическом анализе широко применяют сочетание ТСХ с физико-химическимиметодами анализа. Такие комбинированные методы, как хромато-спектрофотометрия,хромато-флуориметрия, хромато-масс-спектроскопия, особенно эффективны в анализеЛРС и препаратов, содержащих большое число сопутствующих компонентов.
Гравиметрическийметод – основан на измерении массы вещества. Сущность определения состоит впоследовательном выполнении реакций осаждения, отделения, высушивании ивзвешивании осадка.
Перманганатометрияоснована на использовании окислительных свойств титранта – перманганата калия вкислой среде.(2)
Колориметрическийметод основан на способности веществ вступать во взаимодействие с солямидиазония. В качестве реагентов применяют диазотированный п-нитроанилин,сульфаниловую кислоту, сульфаниламид.
Спектрофотонетрияв УФ- и видимой областях—один из наиболее широко используемых физико-химическихметодов в фармацевтическом анализе.
АнализируемыеЛВ должны иметь в структуре молекулы хромофорные группы (сопряженные связи,ароматическое ядро и др.), обуславливающие различные электронные переходы вмолекулах и поглощение электромагнитного излучения.
Криваязависимости интенсивности светопоглощения от длины волны (нм) называетсяспектром поглощения вещества и является его специфической характеристикой.Измерение спектров поглощения растворов анализируемых веществ вультрафиолетовой (190-380 нм) и видимой (380-780 мм) областях производят спомощью спектрофотометров различных марок (СФ-26, СФ-46 и др.). В качестверастворителей используют свободные от примесей воду, растворы кислот и щелочей,этанол, хлороформ и другие органические растворители.
Слектрофотометрическойконстантой является удельный показатель поглощении (Е1см1%), который рассчитывают по формуле:
(1) Е1см1%= А/С * l
Удельныйпоказатель поглощения E1см1% представляет собой величинуоптической плотности раствора, содержащего 1,0 г вещества в 100 мл раствора,измеренную в кювете с рабочей длиной 1 см. Установив по стандартному образцувеличину Е1см1% и преобразовав эту формулу, можнорассчитать концентрацию анализируемого вещества с относительной погрешностью до±2%.
ИдентификациюЛВ можно провести по Е1см1%, характеру спектральныхкривых в различных растворителях, положению максимума и минимумасветопоглощения или их отношению (при различных длинах волн). Для количественногоспектрофотометрического анализа важен выбор аналитической полосы поглощения.Последняя должна быть свободна от наложения полос поглощения других компонентовсмеси и иметь достаточно высокий удельный показатель поглощения анализируемоговещества.(2)
Фотоколориметрияотличается от спектрофотометрического анализа тем, что анализируемое вещество спомощью какого-либо реагента переводят (количественно) в окрашенное соединение.Вначале получают окрашенные растворы, используя растворы стандартных образцов(ГСО или РСО). Измерение оптической плотности производят на фотоколориметрах.Затем строят калибровочный график зависимости интенсивности поглощенияокрашенных растворов от концентрации, по которому рассчитывают содержание ЛВ виспытуемых образцах ЛВ или ЛФ.
Флуоресцентныеметоды основаны на способности веществ флуоресцировать в УФ-свете,обусловленной либо химической структурой самих органических веществ, либопродуктов их диссоциации, сольволиза, других превращений. Способностьюфлуоресцировать обладают обычно органические соединения с симметричнойструктурой молекул, в которых имеются сопряженные связи (нитро-, нитрозо-,азо-, амидные, карбонильные или карбоксильные группы).
Полярография— метод, основанный на измерении силы тока, возникающего на микроэлектроде, приэлектровосстановлении анализируемого вещества в растворе. Растворителем служитвода, или органические и смешанные растворители. Электролиз проводят вполярографической ячейке, состоящей из электролизера и двух микроэлектродов:ртутного капающего и внешнего насыщенного каломельного. При соблюденииидентичных условий измерений для идентификации используют величину потенциалаполуволны, а для количественного определения — высоту волны (измерениепредельного диффузного тока). Количественный анализ выполняют методамикалибровочных кривых с использованием стандартных растворов и методом добавок.(1,2)
Газожидкостнаяхроматография (ГЖХ) основана на распределении компонентов смеси между газовой ижидкой или твердой фазами. Распределение происходит в результате многократныхактов сорбции и десорбции анализируемых веществ, которые вводятся в потокгаза-носителя, испаряются и в парообразном состоянии проходят через колонку ссорбентом. Поэтому метод ГЖХ применим для анализа летучих веществ или веществ,которые могут быть переведены в газообразное состояние. Разделенные веществаэлюируются из колонки потоком газа-носителя, регистрируются детектором ификсируются на хроматограмме в виде пиков, по которым можно идентифицироватьили определять содержание каждого компонента смеси.
Газовыйхроматограф включает в себя систему измерения и регулирования скорости потокагаза-носителя, систему ввода пробы испытуемого образца, газохроматографическуюколонку, систему термостатирования и контроля температуры в различных узлахприбора и систему детектирования, регистрации и обработки информации,полученной на приборе.
ПодлинностьЛВ методом ГЖХ можно подтвердить либо с помошью свидетелей, либо методомотносительных удерживаний, В первом случае доказательством идентичности служитсовпадение времени удерживания вешества-свидетеля и одного из компонентов смесиЛВ при хроматографировании каждого в отдельности в одинаковых условиях. Вовтором случае вещество-свидетель добавляют к пробе, затем анализируют порекомендуемой методике. Рассчитывают по формуле величину относительногоудерживания, которая является постоянной для ЛВ в конкретных условиях.Количественный анализ выполняют в тех же условиях, используя для расчетов такиепараметры, как площадь или высота пиков ЛВ. Площадь пиков устанавливают нахроматограмме с помощью планиметра, интегратора или умножением высоты пика наего полуширину.
Высокоэффективнаяжидкостная хроматография (ВЭЖХ) отличается от ГЖХ тем, что подвижной фазойслужит не газ, а жидкость, причем она проходит через колонку, наполненнуюсорбентом, с большой скоростью за счет значительного давления. Поэтому ВЭЖХпозволяет разделять многокомпонентные смеси на индивидуальные вещества высокойстепени чистоты. ВЭЖХ отличается высокой чувствительностью {до 10 6 г). На разделение10-15 компонентов затрачивается 20-30 мин.
Жидкостныйхроматограф включает такие узлы, как дозатор, насос высокого давления,высокоэффективная колонка, детектор с регистрирующим устройством. Колонкиизготавливают из нержавеющей стали, они имеют длину 10-25 см, внутреннийдиаметр 0,3-0,8 см и плотно набиваются адсорбентом с размером частиц 5-10 мкм.В качестве элюента используют различные углеводороды в сочетании с этанолом.Детектором обычно служит спектрофотометр с переменной длиной волны (190-900 нм),но существуют также флуориметрические. электрохимические и другие детекторы.
Подлинностьиспытуемых ЛВ подтверждают по времени выхода каждого компонента смеси изколонки, которое будет стабильно при одинаковых условиях проведенияэксперимента. Количественное содержание рассчитывается по площади пика, котораяпропорциональна количеству ЛВ в пробе.(2)
4. Методы выделения кумаринов
Длявыделения кумаринов из растений обычно применяются различные растворители:этанол, метанол, бензол, хлороформ, диэтиловый и петролейный эфиры или ихкомбинации.
4.1.Наиболее полная экстракция кумаринов (в свободной форме и в форме гликозидов)достигается при использовании спирта этилового различных концентраций, как нахолоду, так и при нагревании. Для очистки суммы кумаринов от сопутствующихвеществ густой экстракт, полученный после отгонки экстрагента, обрабатываютхлороформом, диэтиловым или петролейным эфиром. При использовании в качествеэкстрагента петролейного эфира хорошо извлекается смесь фурокумаринов, которые послеконцентрирования экстракта можно выделить в кристаллическом состоянии. В рядеслучаев дополнительно проводится обработка экстракта активированным углем,кипящей водой с последующим сгущением и дальнейшим извлечением гидроксилированныхи метоксилированных кумаринов хлороформом, этилацетатом и бутанолом,непосредственная обработка сухого остатка смесью хлороформа — этиловый спирт(97:3) (для выделения аналогичных производных) или же используется самоспиртовое извлечение. Например, для извлечения суммы 7-гидроксилированныхкумаринов из корней Helianthus annum L. предложено проводить последовательную экстракцию ацетоном,смесью ацетон — метанол (1:1) с последующим освобождением от пигментов вделительной воронке смесью гексан — эфир (6:4). Иногда целесообразнорастительный материал обрабатывать петролейным эфиром, а затем исчерпывающеэкстрагировать хлороформом или метанолом. Для выделения пеуцеданина применяютэкстракцию метанолом в аппарате Сокслета, аналогичным способом с использованиемпоследовательной экстракции семян Angelica archangelica L. н-гексаном, дихлорметаном иметанолом и последующей препаративной ТСХ были выделены шесть производныхфурокумарина. Эти же экстрагенты позволяют получить сумму кумаринов ифурокумаринов из растения Metrodorea flavida. Длявыделения гидрокси-, алкоксикумаринов и их гликозидов из семян Aesculus hippocastanum L. применяется экстракция 80 % этиловым спиртом с последующейобработкой горячей водой, фильтрованием и многократным извлечением веществхлороформом, этилацетатом и бутанолом. Эскулин и фраксин из коры каштанаполучали путем экстракции из метанола. В гексановых и метанольных извлеченияхиз побегов Kielmeyera reticulata Saad., полученных последовательно, обнаружены4-фенилкумарины и 4-н-пропилкумарины.
4.2. Дляочистки кумаринов от сопутствующих веществ возможно использование методаомыления. Для выделения кумаринов проводят:
1. ЭкстракциюЛРС органическим растворителем (эфиром) получают сумму кумаринов и балластныхвеществ.
2. Эфирныйслой отделяют, отработанное сырьё выбрасывают.
3.Полученное эфирное извлечение обрабатывают 0,5% водным раствором КОН дляочистки от фенолов и кислот.
4.Затем это же извлечение обрабатывают 10% спиртовым раствором КОН. Происходитразрыв лактонного кольца и образуются кумарины, которые переходят в водныйслой. А в органическом растворителе остаются балластные вещества (смолы,стерины, спирты), органическую фазу выбрасывают.
5.Водно-щелочной слой подкисляют разбавленной НСl. Происходит замыкание лактонного кольца, образуютсякумарины, которые экстрагируют органическим растворителем.
6.Органический слой отгоняют — получают сумму кумаринов, которую разделяютхроматографически.
Существенныминедостатками этого метода являются возможность образования вторичных продуктовраспада кумаринов, дегидратации и изомеризации некоторых оксикумаринов.
Дальнейшиеоперации, как правило, направлены на разделение суммы кумаринов и выделениеиндивидуальных соединений. В ранних исследованиях использовалиськристаллизация, фракционная перегонка или сублимация в высоком вакууме. Однакомногие кумарины обладают сходной растворимостью в органических растворителях,поэтому даже многократная перекристаллизация не позволяет достичь надежногорезультата.
Поэтомудальнейшее развитие химии кумаринов привело к использованию для этих целейразличных видов хроматографии, лишенных вышеуказанных недостатков.(6,7)
4.3 Хроматографическоеопределение:
Дляобнаружения кумаринов в растениях и сырье используются лактоновые свойствакумаринов, их способность флуоресцировать при ультрафиолетовом освещении идавать окрашенные растворы со специальными реактивами, микросублимацию ихроматографический анализ экстрактов сырья.(1):
/>
Напластинку «Силуфол» или хроматографическую бумагу наносят исследуемыеэкстракты и помещают в хроматографическую камеру с системой, указанной в НД наисследуемое сырье. Хроматограммы после высушивания просматривают в УФ-свете.Флуоресцирующие пятна кумаринов отмечают простым карандашом и хроматограммыобрабатывают щелочью. После этого их высушивают в сушильном шкафу при t=120°C и вновь просматривают в УФ-свете. Затем хроматограммуобрабатывают диазотированным сульфаниламидом, от действия которого кумарины взависимости от структуры окрашиваются в оранжевый, красно-оранжевый, фиолетовыйцвета.
Внекоторых случаях после просматривания хроматограммы в УФ-свете ее обрабатываютреактивом Драгендорфа (Bil3 вKI) или парами иода. Кумариныпроявляются в виде пятен, окрашенных в коричневый цвет.
Впервую очередь, проводят колоночную хроматографию с использованием различныхсорбентов и систем растворителей.(5)
Так,для разделения гидрокси- и алкоксикумаринов, замещенных в бензольном цикле,предлагается применять колонку, заполненную силикагелем, и проводитьпоследовательное элюирование гексаном, смесью гексан — хлороформ (с увеличениемконцентрации хлороформа), смесью хлороформ — метанол (9:1; 8:2; 7:3) или смесьюхлороформ — этанол (97:3). В других случаях для этих же целей берут оксид алюминияи смесь этилацетат — бензол (2:1) или бензол, силикагель и системы: хлороформ —бензол (1:1), хлороформ, хлороформ — этанол (98:2; 99:1; и т.д. до 90:10),бензол — бутанол (4:1; 3:1). Для разделения 4-фенил, 4-н-пропилкумаринов и4-н-пропил-пиранокумаринов используют силикагель и элюируют последовательносистемами гексан — этилацетат (градиент), метанол — вода — дихлорэтан, гексан —ацетон.
Фурокумариныфракционируют на оксиде алюминия (III степень активности) при помощи петролейного эфира, смеси петролейныйэфир — хлороформ (2:1), хлороформа, смеси хлороформ — этанол (9:1, 4:1, 2:1), атакже на силикагеле — смеси гексан — хлороформ и хлороформ — этанол спостепенным увеличением содержания более гидрофильного компонента.
Оприсутствии кумаринов свидетельствует характерная флуоресценция в УФ-светеотдельных зон сорбента, содержащих эти соединения, или же положительный эффектхимических реакций, проводимых с элюатами.
Прислабом сродстве вещества к сорбенту необходимо использовать активные слои ислабополярные растворители, а при сильном — малоактивные слои и сильнополярныерастворители. В частности, кумарины с фенольными или спиртовыми гидроксиламиактивнее сорбируются на окиси алюминия и элюируются большими объемами полярныхрастворителей (этанол), иногда с добавлением 0,5 % уксусной илихлористоводородной кислоты; метилированные производные и пиранокумарины слабееудерживаются на сорбенте. В процессе элюирования целесообразно постепеннозаменять гидрофобные растворители гидрофильными.
Дляразделения суммы кумаринов, в том числе при их сочетании с другиминизкомолекулярными БАВ, их очистки и анализа в настоящее время предложенаколоночная хроматография с использованием сорбентов аффинного типа на основефенольных и полифенольных лигандов. Рекомендованы эпоксиактивированные сорбентыс матрицей HW-35, содержащей резорциновые икатехиновые лиганды. В качестве подвижной фазы используются вода, водныерастворы этанола, минеральных кислот, нейтральных солей и различных ихсочетаний. Установлено, что при использовании данных типов сорбентов результатызначительно превосходят те, которые были получены при использованииклассических кремнеземных, полиамидных и декстрановых сорбентов.
Контрольза эффективностью колоночной хроматографии осуществляется с использованиембумажной (БХ), а чаще — тонкослойной (ТСХ) хроматографии, что позволяет быстроустанавливать однородность исследуемых веществ и обнаруживать даженезначительные их количества. Для ТСХ наиболее часто применяются пластинкиСилуфол или Сорбфил, иногда используется оксид алюминия II степени активности, силикагель, а в качестве системрастворителей — смеси бензола и ацетона (1:2), бензола, метанола и ацетона(8:2:10), гексана и хлороформа, толуола и н-бутанола (гидрокси- иметоксикумарины), спирта этилового и хлороформа (5,5:4,5), хлороформа иформамида (скополетин), этилацетата и бензола (1:2), диэтилового и петролейногоэфира (фурокумарины) и другие.
Наилучшимсорбентом для разделения суммы кумаринов методом ТСХ считается оксид алюминия,при этом в качестве элюентов используют смеси: петролейный эфир — этилацетат(2:1), петролейный эфир — хлороформ, циклогексан — этилацетат (3:1), бензол —этилацетат в различных соотношениях и бензол.
Вбумажной хроматографии используются различные марки бумаги. Следует отметить,что ввиду избирательной растворимости кумаринов в водных и неполярныхрастворителях, применяется метод импрегнирования хроматографической бумаги 20 %водными растворами этиленгликоля или пропиленгликоля, раствором формамида (илидиметилформамида) в метаноле или ацетоне, растворами бората или фосфата натрия.В первом случае гидроксилсодержащие кумарины остаются на линии старта, поэтомуиспользуется пропитывание бумаги другими растворами или проводитсяхроматографирование в системе БУВ без импрегнирования бумаги .
Детекциякумаринов на хроматограммах чаще всего проводится по флуоресценции в УФ-светепри характерных длинах волн до и после обработки хроматограммы водно-спиртовымирастворами гидроксида калия, парами аммиака, а также по другим цветнымреакциям. Цвет флуоресценции не позволяет с достаточной степенью точностиопределить структуру кумаринов, но в ряде случаев по нему можно судить оналичии и примерном расположении функциональных группировок.
Индивидуальныевещества выделяют с использованием препаративной ТСХ. Идентичность выделенноговещества устанавливают по таким характеристикам, как температура плавления,ИК-, ЯМР- и масс-спектры. ИК-спектры кумаринов имеют характерные полосы поглощенияпри 1750-1700 см -1 (-С=О группы) и при 1620- 1470 см -1(для –С=С- ароматического кольца). При исследовании кристаллической структурысинтетических веществ данного класса возможно использованиекристаллографического анализа с применением программного обеспечения SHELXL97. В качестве характеристикикумаринов с боковой цепью, содержащей асимметрические атомы углерода, хиральныхатомов углерода фуранового цикла замещенного дигидроангелицина и пирановогоцикла замещенного келлактона может использоваться величина удельного вращения.
Дляподтверждения структуры выделенных из растений кумаринов возможно использованиевстречного синтеза. Среди методов синтеза следует отметить конденсацию Перкина(из салицилового альдегида и уксусного ангидрида), реакции Пехмана (из фенола ияблочной кислоты или Р-кетоэфиров), реакцию Кневе-нагеля (конденсацияо-гидроксибензальдегидов с эфирами малоновой и других кислот).(7)
5. Методыанализа кумаринов
5.1 Титриметрическийметод количественного определения производных кумарина основан на способностиа-пиронового кольца раскрываться под действием щелочи, но в настоящее время онпрактически не используется. Избыток щелочи затем оттитровывают хлороводороднойили серной кислотой. В связи с получением заниженных результатов быларазработана модифицированная методика с использованием оксида ртути, котораяисключает преждевременное замыкание лактонного кольца. Существеннымдостоинством титриметрического метода является отсутствие потребности встандартных образцах кумаринов, недостатком — низкая специфичность итоксичность соединений ртути. Тем не менее, эта методика использовалась внормативной документации на псорален и его лекарственные формы.
5.2. Однимиз вариантов применения лактонной пробы является гравиметрический метод.Несмотря на несомненное достоинство — высокую точность, сравнимую со спектрофотометрическимопределением, — он не получил широкого применения из-за трудоемкости идлительности.
5.3. Имеютсялитературные данные о применении перманганатометрии при количественномопределении кумарина, однако этот метод дает недостаточно точные результаты.
5.4. Кислотныесвойства природных гидроксикумаринов были изучены при помощи метода потенциометрическоготитрования в воде и некоторых неводных растворителях. Влияние строениякумаринов на характер кривых потенциометрического титрования позволяетиспользовать последние для установления структуры соединений наряду соспектрами их поглощения.
5.5. Колориметрическиеметоды количественного определения кумаринов.
Кспиртовому извлечению прибавляют 10% спиртовой раствор КОН, нагревают – растворжелтеет, прибавляют свежеприготовленный диазореактив (смесь равных объёмовпара-нитроанилина и раствора нитрита натрияв концентрированной НСl) при наличии кумаринов растворприобретает окраску от коричневой до вишнёвой. Данный метод был применен дляанализа кумаринов Heracleum sp., бергаптена в плодах Pastinaca sativa L., псоралена в субстанции и лекарственных препаратах,атамантина в корнях Peucedanum oreoselinum L. (Moench.),ксантотоксина и бергаптена в плодах Ammi majus L. и в препарате «Аммифурин».(11)(2):
/>
5.6 Имеютсяданные о применении фотоколориметрического метода для количественногоопределения синтетического антикоагулянта синкумара. Однако необходимоотметить, что реакция азосочетания не является специфичной для кумаринов и ихпроизводных (сходные эффекты способны давать фенолы, ароматические амины ифлавоноиды). Перед проведением фотоколориметрии необходима тщательная очисткаот сопутствующих веществ. Кроме того, диазопроизводные кумаринов имеют различияв спектрах поглощения, обусловленные спецификой строения исходного вещества.
5.7 Спектрофотометрическийметод основан на способности кумаринов к поглощению в УФ-области спектра.Показано, что основные полосы поглощения в спектрах кумаринов и фурокумариновобусловлены переходами 7г-электронов со связанных молекулярных орбиталей наразрыхляющие. Наличие нескольких характерных полос высокой интенсивности вдиапазоне 220 — 350 нм позволяет использовать УФ-спектрофотометрию дляколичественного определения содержания кумаринов. Характерные максимумыпоглощения приведены, в частности, в работах отечественных исследователей.
Изгрупповых методов анализа кумаринов УФ-спектрофотометрический метод являетсянаиболее перспективным, т.к. позволяет проводить компонентный анализ на основеразличий спектров поглощения, не требует предварительного разделения иотносительно прост в аппаратурном оформлении. Однако при его применениижелательно наличие стандартных образцов, позволяющих более точно, чем в случаеиспользования калибровочных графиков и удельных показателей поглощения,устанавливать содержание целевых компонентов.
МетодомУФ-спектрофотометрии установлено, что в спектрах поглощения синтетическихантикоагулянтов — дикумарина, фепромарона и синкумара — наблюдаются двехарактерные полосы в области 280 и 306 нм, первая из которых имеетколебательную природу, а вторая соответствует р-п-сопряжению бензольного ипиронового циклов.
5.8 Прямаяспектрофотометрия при длине волны 352 нм с использованием рабочего стандартногообразца ксантотоксина была предложена для оценки качества препарата«Аммифурин». Совместное применение ТСХ и спектрофотометрии делаетметодику более точной. Возможно использование ТСХ на силикагеле КСК254 5/40 всистеме петролейный эфир — этилацетат (1:1), после элюирования пятен этиловымспиртом определяется оптическая плотность. Применим аналогичный метод сиспользованием бумажной хроматографии на бумаге, импрегнированной метанольнымраствором формамида в системе растворителей гептан — бензол (4:1). В работе рассмотренавозможность проведения количественного определения пеуцеданина в растительномсырье и препарате с использованием ТСХ на пластинке с незакрепленнымсиликагелем в системе петролейный эфир — диэтиловый эфир (1:2). Элюирование пятеносуществляют этанолом. При длине волны 298 нм проводят определение удельногопоказателя поглощения вещества, который используют для расчета его содержания.Существенным преимуществом применения спектрофотометрии в данном случае сталавозможность определения примеси ореозелона, поглощающего при 345 нм.Количественное содержание птериксина в корнях Libanotis densiflora и в препарате «Либоверин»предложено определять по следующей методике: ТСХ на силикагеле КСК в системен-гексан — бензол — метанол (5:4:1), элюирование пятен этиловым спиртом иизмерение оптической плотности элюата при длине волны 322 нм. Расчет проводятпо удельному показателю поглощения птериксина.
5.9 Хроматоспектрофотометрическиеметодики разработаны также для определения количественного содержания псораленаи суммы фурокумаринов в плодах Psoralea drupaceaBge. с использованием стандартныхобразцов псоралена и ангелицина. С использованием удельного показателяпоглощения ксантотоксина возможен и спектрофотометрический метод оценкикачества плодов Pastinaca sativa L..
Псоралени бергаптен в препарате «Фурален» можно определить количественно, безразделения суммы кумаринов, при длине волны 297,5 нм, либо при двух длинахволн. Последний принцип положен в основу анализа листьев Ficus carica L., субстанции псоберана и его препаратов. Предложенный методоснован на модификации хроматоспектрофотометрического метода: при 298 нмопределяется сумма фурокумаринов, а при 246 и 268 нм, где наблюдаетсянаибольшая разность в интенсивности поглощения — содержание псоралена.Количество бергаптена определяется по разности. В качестве стандартного образцаиспользуется псорален.
Припомощи УФ-спектрофотометрии возможно также определение молекулярной массы кумаринови фурокумаринов. УФ-спектры могут быть использованы как один из методовидентификации выделенных из растения кумаринов, а также при исследовании ихфизиологической роли. Описано использование данного метода для оценки биодоступностидикумарола.
5.10 Полярографическийметод применяется для анализа готовых лекарственных форм фурокумаринов иобусловлен их восстановлением на ртутно-капельном электроде в а-пироновомкольце по двойной связи в положении 3,4. На основании изученияфизико-химических свойств природных кумаринов предложены методикикачественного, количественного и функционального анализа, которые вошли вфармакопейные статьи на келлин, псорален, виснадин, пастинацин, некоторые видылекарственного растительного сырья и лекарственные формы. В частности, дляконтроля качества плодов Pastinaca sativa L. были использованы полярографическийи хроматополярографический методы с использованием стандартного образцаксантотоксина. При сочетании полярографии и хроматографии изучался химическийсостав кумаринов ряда растений и природных продуктов. Имеются литературныеданные о методике количественного определения кумарина и коричной кислоты,применяемых в качестве стабилизаторов в инъекционном растворе ФиБС. Несомненнымдостоинством метода является возможность быстро и точно анализировать суммукумаринов без предварительного выделения отдельных компонентов, однако следуетучитывать, что из-за высокой чувствительности к электрохимически активнымпримесям требуется тщательная предварительная подготовка.
Внастоящее время для анализа кумаринов метод полярографии практически неиспользуется.
5.11 Флуоресцентныйанализ
Многиекумарины и фурокумарины проявляют характерную (желтую, зеленую, голубую илифиолетовую) флуоресценцию при УФ-возбуждении в нейтральных спиртовых растворах,в растворах щелочей и концентрированной серной кислоте в видимой иультрафиолетовой областях спектра. Флуоресценция усиливается в щелочной средеза счет образования хиноидной структуры, в кислой среде флуоресценция менеевыражена. По величине стоксового сдвига и максимуму флуоресценции предлагаетсяпроводить идентификацию фитохимических препаратов. Для кумаринов ифурокумаринов получены спектры флуоресценции и установлена линейная зависимостьее интенсивности от концентрации, что позволило применить методфлуороденситометрии для количественного определения фурокумаринов псоралена иангелицина в препарате псорален. Образование флуоресцирующих соединенийкомпонентов препаратов «Аммифурин», «Бероксан» и«Пастинацин» с насыщенным раствором брома в щелочной среде позволилоидентифицировать их на основании одинаковых максимумов возбуждения (380 нм) ифлуоресценции (480 нм).
Предложенфлуориметрический метод определения количественного содержания фурокумаринов вплодах Pastinaca sativa L. при длине волны возбуждения 350 нм и флуоресценции 470 нм.Аналогичная методика приведена и для близкого структурного аналога кумаринов,келлина, в плодах Ammi visnaga L. (Lam.).
Такжепредложен селективный способ количественного определения неодикумарина путемпоследовательной обработки анализируемой пробы в диметилформамиде растворомаммиака и насыщенным раствором магния хлорида в этом же растворителе.
Флуоресценцияпроизводных кумарина зависит от концентрации водородных ионов, поэтому данныеоб изменении окраски и интенсивности флуоресценции в различных пределах рН, атакже в зависимости от строения кумаринов могут оказаться необходимыми прииспользовании флуориметрических методов. Количественный анализ с использованиемданного метода не получил широкого распространения из-за не всегдапроявляющейся линейной зависимости интенсивности флуоресценции от концентрации.
Влитературе имеются данные об использовании 7-(2-бромэтокси) кумарина в качествефлуоресцентной метки для количественного флуориметрического анализалекарственных препаратов, содержащих третичный атом азота.
Возможноприменение флуоресцентной микроскопии для локализации и определения количествагидроксилированных производных кумарина, выполняющих роль фотопротекторов, взеленых водорослях Da-sycladis vermicularis (Scopoli) Krasser.
Интереспредставляет флуоресцентный экспресс-метод обнаружения кумарина в топливе,основанный на реакции его щелочного гидролиза с образованием о-кумаринат-ионови последующим их превращением в о-кумарат-ионы, обладающие интенсивнойфлуоресценцией.
5.12 Бумажнаяхроматография чаще всего сочетается с другими физико-химическими методами.Например, после разделения суммы кумаринов на бумаге (петролейный эфир; ДМФА вацетоне) возможно полярографическое определение суммы фурокумаринов в плодах Pastinaca sativa L. и в препарате «Бероксан». Сочетание бумажнойхроматографии с фотоколориметрическим определением на основе реакции с диазотированнойсульфаниловой кислотой используют для анализа фурокумаринов Psoralea drupacea Bge., псоралена и бергаптена в листьях Ficus carica L… Этот же метод использован для определения фурокумаринов внекоторых видах зонтичных. К существенным недостаткам БХ относятся длительностьпроведения анализа и необходимость концентрирования вытяжки из-за малойсорбционной емкости бумаги.
5.13 Методтонкослойной хроматографии в значительной степени лишен указанных недостатков,т.к. позволяет относительно быстро производить разделение компонентов смеси.Как и БХ, его можно использовать для идентификации кумаринов в исследуемыхпрепаратах.
Имеютсяданные о колориметрических методах количественного определения пеуцеданина вкорнях Ре-ucedanum morrissonii Bess., основанных на реакции азосочетания, с разделениемна тонком слое оксида алюминия в системе гексан — бензол — метанол (5:4:1), идля анализа бероксана, пастинацина и псоралена. Также описано колориметрическоеопределение ксантотоксина, императорина и бергаптена в Ammi majus L. после хроматографирования на си-ликагеле, импрегнированномформамидом, в системе дибутилового эфира. Предложена методика определенияпсоралена и суммы псоралена и бергаптена, по отдельности, в листьях Ficus carica L… При этом очищенный от балластных веществ экстракт хроматографируютв тонком слое оксида алюминия в диэти-ловом эфире, а затем при помощиУФ-спектрофотометрии устанавливают содержание кумаринов. Имеются литературныеданные о возможности использования двумерной хроматографии в слое силикагелядля определения бергаптена в системах гексан — четыреххлористый углерод — трет-бутиламин(180:12:9) и гексан — толуол — этилацетат — уксусная кислота (100:10:10:0,5) всочетании со спектрофлуориметрией.
Последнеедесятилетие характеризуется широким использованием ГЖХ и ВЭЖХ для решениязадач, связанных с разделением и оценкой качества различных соединений классакумаринов.
5.14 Газожидкостнаяхроматография (ГЖХ) применяется в основном для идентификации и количественногоанализа фурокумаринов в препаратах и растительном сырье. Установлено различиево временах удерживания для замещенных фурокумаринов. Из общих закономерностейследует упомянуть следующие: при переходе от гидрокси- к метоксикумаринам времяудерживания уменьшается (снижается возможность сорбции за счет водородныхсвязей), а фурокумарины с О-алкильным заместителем при С5 регистрируются позже,чем 8-гидроксиизомеры. Кроме того, отмечено, что величина десятичного логарифмаотносительного времени удерживания линейно зависит от молекулярной массывещества. Полученные данные могут быть использованы при определении структурыили времени удерживания сходных кумаринов.
Описанотакже определение псоберана в субстанции методом ГЖХ.
Дляанализа корней Phlojodicarpus sibiricus и фловерина предлагается ГЖХ методомабсолютной калибровки после экстракции кумаринов хлороформом в сравнении состандартным образцом фловерина. При этом дигидросамидин и виснадин выходят однимсимметричным пиком. Сравнение проводят со стандартным образцом фловерина.Раздельное определение виснадина и дигидросамидина возможно послепредварительного переведения солей, образовавшихся при щелочном гидролизе, всвободные кислоты. Кислоты экстрагируют эфиром и хроматографируют. Аналогичныйметод применяют для анализа аммифурина и плодов Ammi majus L. после экстракции их этиловым спиртом. В качествевнутреннего стандарта используют стандартный образец ксантотоксина.
Методгазовой хроматографии также применяется для обнаружения кумарина и егометаболитов в печени животных и человека.
5.15 Широкоераспространение в анализе производных кумарина и фурокумарина в настоящее времяполучила высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ). Описано одновременноеколичественное определение методом ВЭЖХ действующих веществ семян Coronilla varia L. (кумаринов — скополетина, дафноретина и умбеллиферона и кардио-тоническихгликозидов). Влияние метоксалена (ксантотоксина) на метаболизм никотина такжепроводилось при помощи этого метода.
Имеютсяданные об исследовании содержания кумарина в зависимости от времени заготовкиюжноамериканского растения Mikania laevigata,применяемого метода экстракции и экстрагента. Предложено использовать ВЭЖХ визократическом режиме для разделения, одновременного качественного иколичественного анализа кумаринов коры Aesculus hyppocasta-пит L. без предварительной очистки, для количественной оценкикумарина в листьях Mikaniaglomera-ta Spreng. Известна методика определения кумаринов с помощью ВЭЖХ вградиентном режиме (флуоресцентный детектор) при изучении биохимических функцийкумаринов в корнях подсолнечника (Heliant-hus annum L.).
Весьмаперспективным методом является сочетание ВЭЖХ и масс-спектрометрии. Предложенысоответствующие методики определения антикоагулянтов непрямого действия иродентицидов кумаринового ряда (производные 4-гидроксикумарина) в плазме кровив практике токсикологического анализа. Определенный интерес представляетиспользование хроматомасс-спетрометрии для определения наличия кумарина втабачной продукции.(7)
Заключение
Длявыделения суммы кумаринов из ЛРС было предложено использовать экстракциюэтиловым спиртом различных концентраций с последующей очисткой хлороформом.Изучение качественного состава кумаринов проводили с использованием различныхметодов хроматографии — бумажной, тонкослойной и ВЭЖХ.
Качественныйанализ производных кумарина, содержащихся как в экстракте, так и влекарственных формах можно проводить, используя для этих целей как химические,так и физико-химические методы.
Вкачестве химических методов идентификации кумаринов используется общепринятаяреакция азосочетания, лактонная проба, а также другие цветные реакции. Этиспособы могут быть использованы в методах ТСХ и БХ, а также непосредственнопутем проведения химических реакций с извлечением.
Качественноеопределение суммы кумаринов предложено проводить методом ТСХ на пластинках Сорбфилв системе бензол — этилацетат (1:2) с последующей обработкой раствора спиртовымраствором щелочи. Пятна идентифицируют по величине Rf и желтой окраске. Однако как уже было отмечено, реакция сдиазореактивами неспецифична для кумаринов, к тому же значения Rf не всегда воспроизводимы, поэтомуцелесообразно применение ТСХ со стандартным образцом преобладающих соединенийданного класса.
Прииспользовании УФ-спектрофотометрии идентификацию кумаринов проводят по наличиюполос поглощения при определенных длинах волн. ВЭЖХ предполагает нахождениепараметров удерживания.
Дляколичественного определения суммы кумаринов в ЛРС были предложены такие методы,как титриметрия, гравиметрия, фотоколориметрия, УФ-спектрофотометрия и ВЭЖХ.(5,7)
Литература
1. Арзамасцев, А.П.Фармацевтическая химия – М.: Гэотар-мед,2004.-635 с.
2. Беликов, В.Г.Фармацевтическая химия – Пятигорск, 2003. – 715 с.
3. Государственнаяфармакопея СССР XI издание / 1 и 2т. – М.: Медицина,1987. – 334 с., 1990. – 398 с.
4.Кемертелидзе, Э.П.Физико – химические методы анализа некоторых биологически активных веществрастительного происхождения – Тбилиси, 1976. – 198 с.
5. Коноплёва, М.М.Фармакогнозия: Природные биологически активные вещества – Витебск 2007. – 272с.
6. Кузнецова, Г.А.Природные кумарины и фурокумарины – Л., 1967, 28 с.
7. Ложкин, А.В. Природныекумарины: методы выделения и анализа /А.В. Ложкин, Е.И. Сакалян // Хим. – фарм.журн. – т.40, №6 – 2006 – с 47 — 57
8. Машковский, М.Д.Лекарственные средства – Москва 2005
9. Справочник Видаль.Лекарственные препараты в России. – М.: АстраФармСервис, 1995 — 2007
10. Фармакопея РБ, 1т.
11. Шелюто, В.Л.Фармакогнозия – Витебск,2003 – 490 с.