ЗМІСТ
ВСТУП
1. ОСНОВНІ ТЕОРЕТИЧНІВІДОМОСТІ ПРО ЕРГОСТЕРИН
1.1 Ергостерин
1.2 Продуценти ергостерину
1.3 Біосинтез ергостерину
1.4 Умови утворенняергостерину дріжджами
2. ТЕХНОЛОГІЯ БІОСИНТЕЗУЕРГОСТЕРИНУ
2.1 Технологічні аспектиотримання ергостерину
2.2 Накопичення біомасидріжджів
2.3 Виробництво концентратувітамінів групи В
2.4 Виробництво концентратупровітаміна D2 та технологія його трансформації у вітамін D2
3. РОЗРАХУНОК ФЕРМЕНТЕРАМАРКИ Б-50
3.1 Розрахунок габаритнихрозмірів ферментера
3.2 Розрахунок товщини стінкиферментера
ВИСНОВКИ
СПИСОК ВИКОРИСТАНОЇЛІТЕРАТУРИ
Вступ
У 1912 р. дляпозначення додаткових харчових факторів, що у малих кількостях ефективні длялікування ряду захворювань, К. Функ ввів термін вітамін. Тоді виділяли лише 2вітаміни — А (жиророзчинний), В (водорозчинний), сьогодні їх кількість сягаєдесятків.
Вітаміни — цебіологічно активні низькомолекулярні природні, органічні сполуки, різноїхімічної структури, учасники обміну речовин і беруть участь в перетворенніенергії, переважно як компоненти ферментів.
Існування ізначення вітамінів відкрив російський лікар М. Лунін у кінці ХІХ ст… Польськийхімік К. Функ назвав біологічно активну речовину вітаміном, бо вона містила усвоїй молекулі аміногрупу. Вітаміни мають надзвичайно велике значення длянормального обміну речовин і життєдіяльності, перебуваючи у дуже малихкількостях в продуктах харчування. За нормального раціону і зорового способужиття потреба у вітамінах задовольняється природним шляхом.
За нестачівітамінів групи D, у дітей переважно перших трьох років життя з'являютьсяознаки рахіту. В дорослих (особливо у вагітних жінок), які мало перебувають насонці, не вживають достатньо повноцінної їжі, кісткова тканина втрачає кальційі кістки розм'якшуються. В цих випадках таке явище називають остеопорозом.Недостатність вітамінів групи D може розвинутись і у дітей старших трьох років,особливо в періоди інтенсивного росту, якщо їх білкове харчування єнедостатнім, а також має місце різка зміна кліматичних умов. Крім того, дорозвитку D-вітамінної недостатності ведуть хронічна ниркова недостатність,хвороби печінки, тривалий прийом протисудомних препаратів, синдроммальабсорбції (порушеного всмоктування в кишечнику) різного генезу.
Тому важливезначення має пошук нових безпечних джерел надходження вітамінів у організм. Увипадку із вітаміном D2, використання препаратів мікробіологічного синтезу маєзначні переваги перед синтетичними аналогами, і з точки зору сприйнятливостіорганізмом, і з точки зору економії енергоресурсів, затрачених на процессинтезу. Використання провітаміну D2 (ергостерину) також є більш доцільним, аніж використанняготового препарату D2, оскільки організм людиниздатний самостійно перетворювати провітамін у вітамінну форму, за умовидостатньої кількості субстрату та сонячного світла.
На сьогоднішнійдень перспективним є пошук нових, більш ефективних продуцентів, а також новихтехнологічних схем виділення та очистки кінцевого продукту.
1. Основні теоретичні відомості про ергостерин
1.1 Ергостерин
Природні джерелавітаміну D досить обмежені. Відомо, щовітамін D зустрічається лише в деякихтваринних та рибних продуктах (риб’ячий жир, печінка риб, вершкове масло,молоко, ікра), а також в яєчному жовтку. Рослини, як правило, не містятьвітамінів групи D, протесеред стеринів рослинних жирів виявлено провітамін D – ергостерин.
Багаті на вітамінD лише печінкові жири риб.Деякі з них, наприклад печінковий жир тунця, містить в 1 г від 40 до 60 од.вітаміну D2.
В молоці,вершковому маслі і яйцях вміст вітаміну D2 обмежений. Наприклад, в 100 г молокаміститься лише 1 од. D2, у вершковому маслі – 40 – 320 од.
Незначний вміствітаміну D2 в природніх продуктах змушує шукатибагаті природні джерела провітаміну D2 – ергостерину.
В 30-х роках ХХст. рядом дослідників було виявлено, що хлібопекарські дріжджі являютьсябагатим джерелом ергостерину. Пізніше було встановлено, що деякі мікроорганізмиможуть слугувати джерелом вітаміну D [2].
Ергостерин –ергоста-5,7,22-трієн-3β-ол – вихідний продукт виробництва жиророзчинноговітаміну D2 і кормових препаратів, збагаченихвітаміном D2. В групу вітамінів Dоб’єднують спорідненісполуки, найважливішими з яких є вітаміни D2 і D3, що мають антирахітичну дію. ВітамінD2 (ергокальциферол) утворюється під часопромінення ультрафіолетовим випромінюванням ергостерину, вітамін D3 (холекальциферол) утворюється із7-дегідрохолестерину. В організмі людини і тварин ці сполуки регулюютьзасвоєння кальцію та фосфору із їжі і відкладання їх в кістковій тканині [1].
/>
Для прикладноїмедицини найбільше значення мають вітаміни D2 та D3. Нестача вітаміну D2 погіршує абсорбцію кальцію вкишківнику, у зв’язку з чим його вміст в крові також зменшується. Це викликаєпідвищену активність паращитовидних залоз, завдяки чому рівень кальцію в кровіутримується на невисокому рівні за рахунок мобілізації його із запасіворганізму. Одночасно спостерігається підвищене виділення нирками фосфору,оскільки гіперпродукція паратиреоїдного гормону знижує реабсорбція фосфору вниркових каналах. Таким чином вітамін D2 відграє важливу роль в забезпеченні організму кальцієм, першза все, за рахунок регуляції його засвоєння з їжі. Загальновідомо, що нестачавітаміну D2 в організмі відбувається порушеннямінералізації в процесі кісткоутворення, що призводить до серйозних змін вкістковому скелеті.
В основіструктури ергостерину і вітаміну Dлежать чотири вуглецевих цикла (A, B, C, D). В молекулі вітаміну Dкільце В розімкнуте. Вуглеводнева структура ергостерину тавітаміну Dвизначають їхні ліпофільнівластивості [1].
1.2 Продуценти ергостерину
Джереломергостерину є фітопланктон, бурі і зелені водорості, але особливо багаті наергостерин дріжджі та плісняві гриби, які слугують сировиною для йогопромислового виробництва. Ергостерин – основний стерин дріжджів, на якийприпадає 60 – 90 % від інших стеринів: вміст ергостерину складає 0,2 – 0,5 %,але в деяких випадках досягає 10 % від сухої біомаси.
Культурні расидріжджів завжди містять більше стеринів, ніж дикі. Найбільшу кількість стеринівмістять пекарські та пивні дріжджі. У відношенні ергостеролсинтезуючоїздатності (% ергостеролу в абсолютно сухих дріжджах) дріжджі під часповерхневого культивування розташовуються в наступному порядку: Saccharomycescarlsbergensis (0,49 – 4,3), S. ellipsoideus (1,2 – 1,5), Rhodotorulaglutinis (0,7 – 0,9), Candidautilis (0,4 – 0,6), C. tropicalis(0,2 – 0,3). В міцелії грибів Aspergillusі Penicilliumвміст стеринів може досягати 1,2 –1,4 % (P. westlingii близько 2,2 %) в розрахункуна сухий міцелій.
Бактерії, якправило, синтезують дуже малі кількості стеринів. Зазвичай, вміст стеринів вїхніх клітинах складає 0,001 – 0,1 мг/г сухої біомаси. Стерини виявлено в Lactobacillus arabinosus, L. pentosus, Escherichiacoli, Azotobacter chroococcum, Micromonospora sp., Streptomycesgriseus, Sphaerotillis natans, Rhodospirillum rubrum. Але відомо два представникабактерій: Halobacteriumcutirubrum іMethylococcuscapsulatus,що синтезують високі кількості сквалену (1,0 і 5,5 мг відповідно на грам сухихклітин). Сквален і його чотири гідроформи виділені із метанутворюючої бактерії Methanobacilluskuzneceovii [1].
1.3 Біосинтез ергостерину
Стерини,каротиноїди, сполуки груп Q-коферментів належать до терпенів і мають спільний шлях біосинтезу за«ізопреновим правилом». У відповідності до цього правила, каротиноїди(політерпени), стерини (тритерпени), а також убіхінони і гіберелінова кислотасинтезуються із ізопренових одиниць в результаті проходження чотирьох стадій:1) утворення мевалонату із ацетил-КоА або лейцину; 2) дегідратація ідекарбоксилювання мевалонілпірофосфату з утворенням «активного ізопрену» — ізопентенілпірофосфату і конденсація ізопренових ланок з утворенням ациклічнихтерпенів різної довжини; 3) циклювання ациклічних структур; 4) подальшамодифікація циклічної структури.
Інтермедіатамисинтезу стеринів є ацетат, мевалонова кислота, сквален, ланостерин. Сквален –загальний попередник стеринів рослинного і тваринного походження, накопичуєтьсяв дріжджах і під час аерування перетворюється в стерин.
Стартовоюсполукою в біосинтезі стеринів є ацетат. Дві молекули ацетил-КоА конденсуютьсяіз утворенням ацетоацетил-КоА, який в свою чергу конденсується з ще одноюмолекулою ацетил-КоА, утворюючи β-гідрокси-β-метилглутарил-КоА. Підчас відновлення даної сполуки утворюється мевалонова кислота (МВК), котра занаявності АТФ фосфорилюється із утворенням пірофосфату МВК. За наявності АТФшляхом декарбоксилювання і дегідрування пірофосфат МВК перетворюється в5-вуглеводневу ізопренову одиницю – ізопентенілпірофосфат.Ізопентенілпірофосфат (ІПФ) ізомерується до стадії деметилалілпірофосфату(ДМАПФ). Потім відбувається конденсація ІПФ і ДМАПФ з утвореннямгеранілпірофосфату. Ці сполуки, що містять 10 атомів вуглецю, конденсуються зІПФ з утворенням фарнезілпірофосфату
/>
Фарнезілпірофосфатдалі димеризується із утворенням сквалену С15 + С15 = С30:
/>
Під часциклювання і відщіплення протону утворюється ланостерин, попередник холестеринуі ергостерину:
/>
Перетворенняланостерину в ергостерин відбувається в результаті наступних стадій:
1) деметилювання ланостерину;
2) трансалкілуванняз утворенням 24(28)-метиленової групи і одночасним відновленням С-24(25)подвійного зв’язку;
3) десатураціябічного ланцюга з утворенням С-22(23) подвійного зв’язку;
4) ізомеризація ∆8∆7;
5) дегідрування зутворенням ∆5;
6) відновлення24(28) метиленової групи до метильної [1].
1.4 Умови утворення ергостерину дріжджами
Найбільш високукількість стеринів синтезують штами Saccharomycescarlsbergensis. Їх біомаса може міститибільш ніж 10 % ергостерину.
Важливою умовоюсинтезу ергостерину дріжджами є достатнє аерування. В анаеробних умовах вклітинах дріжджів накопичується попередник ергостерину – сквален. Доведено, щокисень індукує синтез стеринів, надаючи активуючу дію на епоксидазу сквалену –перший фермент біосинтетичного шляху. Індукція синтезу ергостерину починаєтьсяза 0,03 %-го вмісту кисню в газовій фазі і досягає максимуму за 2 %-ї концентрації.
Для біосинтезустеринів є важливим, щоб середовище містило великий надлишок вуглеводів і малоазоту. Дріжджі багаті на білок, як правило, містять мало стеринів. Ці дані,головним чином, стосуються пекарських дріжджів. У випадку дріжджів роду Candida високе співвідношення C/N в середовищі призводить донакопичення ліпідів, а не ергостерину.
Н-алкани, якщо вони можутьспоживатись дріжджами, являються найкращим джерелом вуглецю для синтезуергостерину, аніж вуглеводи. Можливо, це пов’язано з утворенням із алканівацетату (попередника ергостерину) в результаті β-окиснення алканів. Дляпекарських дріжджів ацетат також являється гарним джерелом вуглецю в біосинтезістеринів.
Стимулюючу дію наутворення стеринів дріжджами спричиняють інгібітори гліколізу та роз’єднувачіокисного фосфорилювання і дихання, а також забезпеченість дріжджів вітамінамиі, перш за все, пантотеновою кислотою, яка у складі КоА бере участь у побудовімолекули ергостерину.
Під час дії надріжджі рентгенівського випромінювання вміст ергостерину збільшується в 2 – 3рази, що пояснюється пригніченням процесу амінування, який супроводжуєтьсяпідвищеним синтезом ліпідів. Подібно до іонізуючого випромінювання діютьрадіоміметричні речовини, порушуючи метаболізм клітини і стимулюючи ліпіднийобмін. Наприклад, під час комбінованої дії на клітини дріжджів радіоміметричноїречовини (ембіхіну) і рентгенівського випромінювання вихід стеринів Sacch. cerevisiae збільшується на 109 % повідношенню до контролю.
Полієновіантибіотики ністатин і філіпін, взаємодіючи з мембраною дріжджів, підвищуєрівень стеринів на 50 – 60 % по відношенню до контролю.
Синтез стеринівне пов’язаний із ростом дріжджів. Вміст стеринів підвищується по мірі старіннякультури і стериноутворення продовжуються після зупинки росту дріжджів.
Роль стеринів вметаболізмі продуцентів не зовсім зрозуміла. Спостерігається зв’язок міждихальною активністю дріжджів і утворенням ергостерину. В анаеробних умовахдріжджі містять багато сквалену і мало ергостерину. Роль ергостерину, як структурногокомпоненту мембран, пов’язують із проникністю клітинних мембран дріжджів.
Найбільшзбагачена стеринами у дріжджів фракція мітохондрій. Вірогідно, що мітохондріїберуть участь у біосинтезі стеринів, а стерини, в свою чергу, приймають участьв утворенні мітохондріальних структур і впливають на їхню функціональнуактивність.
Стерини містять вмолекулі ОН-групу і в клітині значною мірою присутні як ефіри жирних кислот.Тому існує твердження, що утворення стеринів – це реакція детоксикації, щозахищає організм від надлишкової продукції жирних кислот. Стеринивикористовуються для транспорту ненасичених кислот і, можливо, інших сполук вклітині. Мікоплазми включають стерини клітинні мембрани. Дріжджі Sacch. cerevisiae в умовах низького вмістурозчиненого кисню в середовищі поглинають екзогенні стерини, при цьому частинаїх піддається трансформуванню із утворенням комерційно вигідних стероїдів.Наприклад, десмостерин дріжджі перетворюють в 24 β-метилхолестерин, а24,25-дигідроланостерин – в 7-дегідрохолестерин, який є інтермедіатом під чассинтезу вітаміну D3 [1].
2. Технологія біосинтезу ергостерину
2.1 Технологічні аспекти отримання ергостерину
В промисловостіергостерин отримують, використовуючи дріжджі Sacch. cerevisiae, Sacch. carlsbergensis, а також міцеліальні гриби.Засів проводять великою кількістю інокуляту. Культивування проводять за високоїтемператури і сильного аерування середовища, що містить великий надлишок джерелвуглецю по відношенню до джерела азоту.
Максимумпоглинання ергостерину знаходиться за довжини хвилі світла 280 нм. Саме цевипромінювання збуджує окремі зв’язки кілець А і В в молекулі ергостерину івикликає його перетворення у вітамін D2. Опромінення проводять ультрафіолетовими лампами із довжиноюхвилі 280 – 300 нм. Опромінюють або сухі дріжджі, або тонкий шар їхньої 5 %-їсуспензії. Під впливом більш коротко- або довгохвильових випромінюваньзбільшується вихід інших сполук стеринової природи.
На вихід вітамінуD2 (і утворення інших сполук) впливають тривалістьопромінення, температура, наявність домішок. Тому опромінення ергостерину, щовикористовується в якості харчових добавок, проводять з більшою обережністю.
Провітамін D2 отримують із маси, що залишаєтьсяпісля фільтрування культуральної рідини. Біомасу промивають, висушують,розмелюють і двічі оброблюють за 78 °С трикратним об’ємом спирту.
Спиртовіекстракти згущують до 70 %-го вмісту сухих речовин. Таким чином отримуютьліпідний концентрат. Його омилюють розчином гідроксиду натрію, стеринизалишаються в неомиленій фракції. Кристали ергостерину випадають із розчину за0 °С. Очищення кристалів проводять шляхом перекристалізації, послідовнимпромиванням 69 %-м етиловим спиртом, сумішшю етилового спирту і бензолу (4:1) іповторним перекристалізуванням. Отримані кристали ергостерину висушують,розчиняють в ефірі і опромінюють, Після цього ефір випаровують, а розчинвітаміну концентрують і кристалізують.
Для отриманняолійного концентрату розчин вітаміну після фільтрування розводять олією достандартного рівня.
Джерелом отриманняергостерину також може слугувати міцелій грибів, що залишається як відхідантибіотичної промисловості і виробництва лимонної кислоти [1].
Крім провітаміну D (ергостерину) в дріжджах містятьсявітаміни групи В: В3, В6, Н, Вс, холін, інозит,р-амінобензойна кислота. За виключенням ергостерину, що розчинний в жирах, всіінші вітаміни, що містяться в дріжджах розчиняються у воді. В дріжджах такожмістяться фосфоліпіди, ферменти і нуклеїнові кислоти. Відповідно, раціональнатехнологічна схема переробки дріжджів повинна базуватися на процесах, щозабезпечують повну екстракція вітамінів, що містяться у дріжджах, та збереженнядріжджового білку.
Проте,екстрагування із дріжджів ергостерину та водорозчинних вітамінів пов’язано іззначними складнощами, оскільки вітаміни міцно зв’язані із білковою частиноюдріжджової клітини. Тож для вилучення вітамінів необхідно руйнувати білковікомплекси клітин, що може здійснюватися різними методами, зокрема гідролізом абоавтолізом дріжджової біомаси.
Гідроліз білкуможе здійснюватись шляхом нагрівання і кип’ятіння дріжджів, розведених іпідкислених молочною або соляною кислотою до рН 5, під невеликим тиском вавтоклаві. За допомогою цього методу можливим є комплексне використаннядріжджів з отриманням концентрату вітамінів групи В, кристалічного ергостеринуі білкової кормової сировини.
За методомферментативного гідролізу дріжджову біомасу піддають автолізу за температури 45°С. В процесі автолізу фермент, що міститься в дріжджах, руйнує білковіречовини протоплазми, звільнюючи вітаміни, що входять в їх склад.
Автолізовані абогідролізовані дріжджі обробляють спиртом для вилучення вітамінів групи В і длязабезпечення належної здатності до фільтрації. Спиртом або іншим розчинникомекстрагують стерини, а дріжджовий шріт після вилучення спирту використовують яккормовий продукт.
Для зневодненнядріжджових клітин та коагуляції білку біомасу обробляють спиртом. Дріжджовіклітини стають щільними, легко осідають на дно і добре фільтруються.
Тож, длямаксимального вилучення вітамінів і використання цінних поживних властивостейдріжджового шроту, технологічну схему варто будувати наступним чином:
1. Для вилученнявітамінів, міцно зв’язаних із білково-ферментними комплексами, і збільшеннятаким чином їхнього виходу, необхідно піддавати дріжджі гідролізу і автолізу.
2. Длязабезпечення належної консистенції необхідно автолізовану (гідролізовану)дріжджову масу піддавати обробці спиртом з екстракцією водорозчинних вітамінівгрупи В.
3. Для вилученнястеринів і фосфоліпідів висушений дріжджовий шріт варто піддавати додатковійобробці спиртом або іншим розчинником.
4. Отриманийпісля екстракції стеринів та видалення спирту білково-дріжджовий шріт можнавикористовувати для харчових або кормових цілей, а також для отриманнянуклеїнових кислот [2].
2.2 Накопичення біомаси дріжджів
Приготування поживного середовища. Середовище повинневідповідати певним вимогам:
а) забезпечувати максимальний приріст біомаси;
б) складатися з відносно дешевих компонентів;
в) мати гарну фільтруючу здатність;
Найбільш оптимальнимсубстратом для накопичення біомаси дріжджів у процесі отримання ергостерину є н-алкани,оскільки вони сприяють максимальному виходу цільового продукту. Під часвикористання н-алканів проблема складу поживного середовища являєтьсяособливо актуальною, оскільки макро- та мікроелементи відсутні у вихіднійсировині. За загальноприйнятою схемою в розчин макроелементів вносять наступнісолі: сульфат амонію (~1,5 кг/м3) та хлорид натрію (~0,9 кг/м3).Розчин мікроелементів готується окремо і складається із ряду сульфатів, щоявляються джерелом таких речовин, як магній, манган, залізо, цинк, мідь,натрій. Крім того, для підтримки постійного значення рН, що знижується впроцесі культивування, в ферментер подається аміачна вода, яка одночасно єдодатковим джерелом азоту [3].
Компонентипоживних середовищ для основного процесу біосинтезу та приготування посівногоматеріалу подаються у змішувачі 3 та 3а відповідно (див. схему у додатку 1).Підготовлена вода подається у змішувачі із резервуарів 1 та 1а через мірники 2та 2а відповідно. Приготовані поживні середовища подаються для подальшогопроведення стерилізації.
Стерилізація поживного середовища.Використовується безперервний методстерилізації. Приготовлені середовища із буферних збірників 4 та 4а подаються встерилізаційну колону 5 та 5а, через які пропускають гостру пару (тиск париблизько 505 Па). Пару подають зверху по внутрішній трубі, що має щілиноподібніпрорізи, завдяки чому він надходить у середовище, швидко її нагріваючи.Середовище в колону подається знизу й рухається по спіралі навколо внутрішньоїтруби.
Безперервний метод стерилізації має ряд переваг: можливість автоматичногорегулювання процесу, швидке й рівномірне нагрівання середовища, забезпеченнябільш повної стерильності середовища й ін.
Середовища, нагріті в колоні до необхідної для стерилізації температури(~130 °С), надходять у витримувачі 6 та 6а, де вони витримуються певний час за температури125 – 130 °С. Час витримки залежить від складу середовища й триває 5 – 10хвилин. Звідси стерильні середовища надходять спочатку утеплообмінники-рекуператори 7 та 7а, а потім у пластинчасті теплообмінники 8 та8а, де вони охолоджуються до 30 – 35 °С (на виході) [4].
Поживне середовище для отримання посівного матеріалу подається вінокулятор 10.
Процесбіосинтезу. Умови культивування дріжджів загалом визначені наявністю в даномувипадку чотирьохфазної системи: газ – вода – рідкі парафіни – клітини дріжджів.
Вивченнярозподілу клітин в рідких фазах показало, що 1/3 клітин росте у водній фазі,споживаючи краплі алкану діаметром менше 3 мкм, а близько 2/3 клітинадсорбується на поверхні парафінових крапель діаметром від 3 до 5 мкм.Адсорбція на краплях великого діаметру незначна, тому диспергування н-алканіву водній фазі має велике значення в процесі культивуванні. Окрім перемішуванняна ефективність диспергування впливає поверхневий натяг, тому внесення ПАРзнижує поверхневий натяг і підвищує питому швидкість росту дріжджів.
Оскількивуглеводневі субстрати можуть засвоюватись дріжджами тільки в аеробних умовах,то на ефективність процесу великою мірою впливає аерація середовища. Наокиснення н-алканів потребується в 2,6 – 2,8 разів більше кисню, ніж наокиснення вуглеводів, що викликає значне тепловиділення під час процесукультивування. Таким чином, одночасно з проблемою підвищення інтенсивностіаерації виникає проблема забезпечення ефективного тепловідведення.
Великий вплив наріст і розвиток клітин дріжджів чинить рН середовища, значення якого в процесіферментації підтримується на рівні 4,0 – 4,5. Проте, в якості проміжногопродукту окиснення н-алканів виділяються жирні кислоти, що знижує рНводної фази в процесі вирощування і потребує постійної подачі лужного агенту вферментер. Одним із головних параметрів процесу культивування являєтьсятемпература середовища, яка не повинна підтримуватись на рівні 32 – 34 °С.Вирощування за більш високих температур (більше 36 °С) призводить до зменшенняшвидкості росту клітин, зменшення активності біосинтезу білкових речовин, і якрезультат, зниження економічного коефіцієнта засвоювання субстрату. Перебігпроцесу за занадто низьких температур (нижче 28 °С) також призводить дозниження швидкості росту, тобто відбувається зниження продуктивностіферментеру.
Всі секціїпослідовно сполучені між собою. Для подачі повітря і перемішуваннякультуральної рідини в кожній секції змонтований ежектор, який обертається віддвигуна, встановленого на кришці ферментера. Ежектор є двоярусною конструкцієюз нижньою та верхньою горловинами для входу та виходу рідини. Повітрязасмоктується ежектором і рухається по трубі, яка герметично сполучена зтурбіною. Для створення необхідної циркуляції культуральної рідини в кожнійсекції змонтовані дифузори, перегородки, конічні вставки. На дифузорахзмонтовані змійовики-теплообмінники для охолодження культуральної рідини [5].
Суспензія клітинпослідовно проходить через усі секції апарату. Із останньої секції виходитьсуспензія із мінімальним вмістом н-парафінів і максимальною концентрацієюбіомаси. Це досягається наявністю в ферментері Б-50 двохступеневогокультивування: в секціях 1 – 9 – відбувається активний ріст і розвитокдріжджових клітин, а в 10 – 12 – процес «дозрівання» біомаси. Цей процеспередбачає витримування біомаси в секціях, до яких припинена подача субстрату (н-алканів)та поживних речовин. Життєдіяльність клітин відбувається за рахунок ендогеннихджерел живлення із одночасним використанням залишкових вуглеводнів. Стадія«дозрівання» (голодування) дріжджів спрощує їх виділення та виключаєнеобхідність екстрактивної очистки біомаси від залишкових вуглеводнів.
Встановлений вкожній секції ежекційний щілинний перемішувально-аеруючий пристрій забезпечуєдостатнє перемішування та інтенсивне змішування повітря із рідиною, насичуючиїї киснем.
Для відведеннятепловиділень із ферментера, що складає близько 34 – 40 МДж/кг, в кожну секціювбудовані змійовики з теплообмінною поверхнею 3000 м2.
Час вирощуваннядріжджів складає 8 – 8,5 год. Витрата повітря на одиницю робочого об’єму 113 м3/м3∙год.
Засів проводятьвеликою кількістю інокуляту. Культивування проводять за високої температури ісильної аерації середовища, що містить великий надлишок джерел вуглецю повідношенню до джерела азоту [3].
Отриманнябіомаси дріжджів. Культуральну рідину із ферментера 9 перекачують удвохступеневий флотатор 11, де відбувається початкове концентрування дріжджовихклітин у їх суспензії. Із флотатора суспензія перекачується через деаератор 12,де відбувається відділення розчинених у суспензії газів. Підготовлена такимчином суспензія проходить дві стадії сепарування на сепараторах 13.Концентрована суспензія дріжджових клітин подається у буферний резервуар 14, зякого вона вже безпосередньо потрапляє на розпилювальну сушарку 15. Далі сухабіомаса дріжджових клітин надходить на стадії отримання ергостерину (провітаміну D2) [2].
2.3 Виробництво концентрату вітамінів групи В
Біомаса дріжджівподрібнюють в шнековому пресі 1 (додаток 2) і подають в автоклав 2, де вонапіддається кислотному гідролізу за температури 110 °С протягом 20 – 30 хв. До100 кг обробленої біомаси додають 20 л води і 10 мл соляної кислоти (густина1190 кг/м3). Кислотний гідроліз підвищує вихід ергостерину зарахунок вивільнення його частки, що перебуває у зв’язаному із білками стані. Ізавтоклаву дріжджі потрапляють у коагулятор 3 із зворотнім холодильником 4, кудина кожні 100 кг обробленої біомаси вводять 85 л етилового спирту із доведенням йогооб’ємної частки в розчині до 50 %. В коагуляторі масу витримують 40 – 50 хв заінтенсивного перемішування та температури 75 – 78 °С. Відбувається коагуляція білковихречовин, що полегшує подальший процес фільтрування та екстрагуванняводорозчинних вітамінів. Після цього оброблену масу подають в охолоджувач 5, деїї охолоджують до 10 °С і потім фільтрують через барабанний вакуум-фільтр 6.Фільтрат подається в збірник 7, а із нього – у вакуум-випарювальний апарат 8 зповерхневим конденсатором 9. Конденсат спирту подають в збірникспирту-дистиляту 10, після чого подається на ректифікацію. Після відгонкиспирту і частини води у вакуум-прегонному апараті залишається рідкий концентратвітамінів групи В із вмістом сухих речовин 50 %. Концентрат подають у збірник11, після чого, в залежності від призначення кінцевого препарату вітамінів,його подають на стадії додаткової очистки та розфасовки.
Білковий залишокз вакуум-фільтра 6 подається в дистиляційний апарат 12 для відгонки спирту.
Після відгонкиспирту білковий залишок подають в бункер 13, а із нього у вальцьову сушарку 14,де вміст вологи в ньому зменшують до 2 %.
Отримані висушеніпластівці подрібнюють в дробарці 15 до борошна, яке подається на подальшуобробку [2].
2.4 Виробництво концентрату провітаміна D2 татехнологія його трансформації у вітамін D2
Отриманняергостерину-сирця.В екстракторі 16 із зворотнім холодильником дріжджове борошно обробляютьтрикратним об’ємом спирту-ректифікату за температури 78 °С. Потім дріжджі відфільтровуютьв друк-фільтрі 17. Перший екстракт подають в збірник 18, а осад – у другийекстрактор 19, де його знову обробляють трикратним об’ємом спирту. Білковийосад відфільтровують на друк-фільтрі 20. Другий екстракт також подають у збірник18. Із збірника 18 отриманий екстракт подається у вакуум-перегонний апарат 21,де спирт випаровують під вакуумом. Спирт після відгонки потрапляє в збірник 22,звідки він потім подається на ректифікацію. Фільтрат після відгонки спиртувипарюють до вмісту сухих речовин 70 %. Із 100 кг сухих дріжджів отримується 20– 25 кг ліпідного концентрату.
У вакуум-апаратвносять 45 %-й розчин гідроксиду натрію з розрахунку 6 кг на 100 кг отриманогоборошна. Відбувається омилення жирів. Омилений розчин ергостерину кристалізуютьза температури 0 °С в кристалізаторі 23. Отримані кристали ергостерину-сирцявідфільтровують на нутч-фільтрі 24 і подають на перекристалізацію.Міжкристальний спиртовий розчин подають у вакуум-перегонний апарат 25 длявідгонки спирту. Лужний розчин, що залишається в перегонному апараті подаєтьсяна утилізацію. Спирт-конденсат із конденсатора 26 подають в збірник 27, звідкипотім потрапляє на ректифікацію. Білкову масу із друк-фільтра 20 направляють вдистилятор 28, де її розводять водою, кількість якої дорівнює подвійній масіосаду. Випарений з дистилятора 28 спирт направляють в збірник 29. Білкова масаіз дистилятора після нейтралізації подається в бункер 30, а потім у вальцьовусушарку 31, дробарку 32 і далі на розфасовку.
Перекристалізаціяергостерину-сирця. Ергостерин-сирець піддають афінації в апараті 33 спиртом (65% мас.) в кількості 10 кг на 1 кг сирця. Афіновану масу подають на друк-фільтр34. Відфільтровані афіновані кристали ергостерину направляють на перекристалізаціюв апарат 35 в спирто-бензольному розчині (4:1). Маточний розчин, отриманий підчас афінації, подається в збірник 36, а потім в перегонний апарат 37 длявідгонки спирту. Із перегонного апарату спирт потрапляє в збірник 38, із якогоподається в збірник 63а і ректифікаційну колону 62. Розчин ергостерину вспирто-бензольній суміші із апарату 35 подають в кристалізатор 39 і нутч-фільтр40. Кристали ергостерину І після промивання висушуються у вакуум-сушильномуапараті 41 (температура плавлення кристалів не повинна бути менше ніж 160 °С).Маточник кристалізації І потрапляє в збірник 42, а потім у вакуум-перегоннийапарат 43 для відгонки спирто-бензольного розчинника, який збирають в приймачі44.
Згущений маточникпіддають кристалізації в апараті 45. Кристали ергостерину ІІ відділяють від маточникаІІ на нутч-фільтрі 46.
Ергостерин ІІподають на афінацію разом із ергостерином-сирцем. Маточник ІІ із нутч-фільтра46 подається в збірник 47, а із нього у вакуум-випарний апарат 48. Випаренийспирт подають в збірник 49, звідки він через збірник 44а подається на повторневикористання.
Опроміненняергостерину і отримання концентрату вітаміну D2. Рядом досліджень булодоведено, що в ефірному розчині процес активації ергостерину протікає не такінтенсивно, як в спирті. Якщо в спирті максимум активації досягається через 30– 40 хв, то в середовищі ефіра через 150 – 200 хв, що дозволяє уникнутипереопромінення розчину. Це особливо важливо у разі виробництва кристалічногоергокальциферолу, оскільки продукти переопромінення ергостерину утримуютьергокальциферол в розчині, перешкоджаючи його кристалізації. Сухий ергостерин Іопромінюють в розчині сірчаного ефіру. Вважають, що ергостерин спочаткуізомерується в прекальциферол, який під час нагрівання переходить вергокальциферол і частково в люмістерин. В реактор 50 із сушарки подають ергостерина,а із збірника 51 – ефір. Отриманий розчин фільтрують через друк-фільтр 52,фільтрат через мірник 53 подають в збірник 54, звідки він безперервно протікаєчерез опромінювач 55. Опромінений розчин потрапляє в збірник 56, потім вперегонний апарат 57 для відгонки ефіру і виділення непрореагованогоергостерину, який відфільтровують в друк-фільтрі 58 і подають наперекристалізацію. Фільтрат стандартизується по активності олією в змішувачі 59,фільтрується через нутч-фільтр 60 в збірник 61, звідки подається на розфасовку [2].
3. РозрахунокФерментера марки Б-50
3.1 Розрахунок габаритних розмірів ферментера
Продуктивністьферментера: P= 200 кг/год (за вологою біомасою);
Коефіцієнтзаповнення ферментера: 0,7;
Концентраціядріжджових клітин в культуральній рідині: C= 20 кг/м3 (за вологоюбіомасою);
Тривалістьодного циклу культивування: Т = 12 год;
Кількістьсекцій ферментера: n= 12.
Культивуванняпроводиться в два етапи: ріст біомаси та витримка біомаси, т.з. «голодування»,протягом якого дріжджами споживаються залишки вуглеводнів, отриманих ізпоживного середовища. Етап росту триває 9 год, витримка біомаси триває 3 год.Процес розраховано таким чином, що в секціях 1 – 9 відбувається ріст біомаси, ав секціях 10 – 12 – дозрівання. Тож тривалість одного циклу в кожній секціїстановить 1 год.
Запуск ферментеравідбувається із заповненням секції 1 поживним середовищем та внесеннямпосівного матеріалу. По завершенню 1-го циклу (1 год) вміст секції 1перекачується в секцію 2, а секція 1 знову заповнюється поживним середовищем таінокулятом. Через 12 год після початку процесу, із секції 12 відбираєтьсякультуральна рідина і направляється на виділення біомаси, а в звільнену секцію1 знову подається свіже поживне середовище та вноситься культура продуцента.Тож продуктивність ферментера кількісно дорівнюватиме об’єму культуральноїрідини, яка зливається із секції 12. Оскільки продуктивність ферментера намвідома – P = 200 кг/год (за вологою біомасою), аконцентрація дріжджових клітин в культуральній рідині становить C = 20 кг/м3, то об’ємкультуральної рідини в одній секції становитиме:
/> м3,
де t – тривалість одного циклукультивування, год.
Об’єм однієїсекції, враховуючи коефіцієнт заповнення 0,7, становитиме:
/> м3,
Габаритні розміриферментера являють собою висоту секцій (h), зовнішній (R) та внутрішній (r) радіуси тороїда. Висота, при чому,дорівнює різниці зовнішнього та внутрішнього радіусів (R – r).
Об’єм однієїсекції становитиме:
/>.
Значеннязовнішнього та внутрішнього радіусів R та r визначаютьсяіз розрахункової таблиці (див. додаток 3) за відомим значенням об’ємуферментера V`S.
У додатку 3найближче значення об’єму секції ферментера (14,33 м3) лежить наперетині значень зовнішнього та внутрішнього радіусів 4,4 м та 1,3 м,відповідно. Тож для конструювання даного ферментера приймемо наступні габаритнірозміри:
3.2 Розрахунок товщини стінки ферментера
Розрахунокпроводять за формулою:
/>
де δ –товщина стінки, м;
р – розрахунковийтиск, МПа (стерилізація ведеться за тиску гострої пари 0,3039 МПа);
D – діаметр апарата, м. В даному випадку,коли розрахунок товщини стінки ведеться для однієї секції, неможливо виділитизначення діаметру, оскільки основа секції має форму трапеції. Тому, замістьдіаметру використаємо розрахунковий розмір А, що чисельно дорівнює середньомуарифметичному висоти та середньої лінії трапеції. За габаритних розмірівтороїда (див. п. 3.1.) R = 4,4 м та r = 1,3 м,значення А становитиме:
/>, м.
φ –коефіцієнт міцності зварних швів, який становить 0,7 – 1 (приймемо 0,85);
σДод. –напруга, що допускається, МПа (для неіржавіючої сталі за температури 132,9 °С,тобто за температури насиченої пари і стерилізації, σДод. =140МПа);
С – додаток дорозрахункової товщини для компенсації корозії, м; С = Пτа, де П– корозійна проникність, м/рік (приймемо, що П = 10-4 м/рік), τа– амортизаційний термін служби апарата, років (приймемо 10 років);
С1 –додаток на заокруглення до цілого числа міліметрів.
/>м.
— товщина стінкиферментера δ = 4 мм [5].
Висновки
1. Процеснакопичення біомаси, збагаченої провітаміном D2 (ергостерином), найкраще проводити на поживному середовищі, щомістить н-алкани, як найоптимальніший субстрат для отримання цільовогопродукту.
2. Для отриманнябіомаси продуцента на середовищі, збагаченому н-алканами, рекомендовановикористовувати 12-секційний тороїдний біореактор марки Б-50. Даний ферментерзабезпечує специфічні особливості кінетики накопичення біомаси та умовиперемішування і аерації.
3. Для вилученнявітамінів, міцно зв’язаних із білково-ферментними комплексами, і збільшеннятаким чином їхнього виходу, необхідно піддавати дріжджі гідролізу і автолізу.
4. Длязабезпечення належної консистенції необхідно автолізовану (гідролізовану)дріжджову масу піддавати обробці спиртом з екстракцією водорозчинних вітамінівгрупи В.
5. Для вилученнястеринів і фосфоліпідів висушений дріжджовий шріт варто піддавати додатковійобробці спиртом або іншим розчинником.
6. Отриманийпісля екстракції стеринів та видалення спирту білково-дріжджовий шріт можнавикористовувати для харчових або кормових цілей, а також для отриманнянуклеїнових кислот.
7. Дляконструювання ферментера марки Б-50 продуктивністю 200 кг вологої біомаси нагодину приймемо наступні габаритні розміри:
— зовнішнійрадіус тороїда R=4,4 м;
— внутрішнійрадіус тороїда r=1,3 м;
— висота секції h= R– r= 4,4 – 1,3 = 3,1 м.
— товщина стінкиферментера δ = 4 мм.
Список використаної літератури
ергостеринвітамін ферментер синтез
1. Под ред.Н.С. Егорова. Промышленная микробиология: Учеб. пособие для вузов по спец.«Микробиология» и «Биология». – М.: Высш. шк., 1989. – 688 с.: ил.
2. ШнайдманЛ.О. Производство витаминов. – М.: издательство «Пищевая промышленность», 1973. – 444 с.
3. Под ред.Егорова Н.С. Биотехнология т. 5: Производство белковых веществ – М.: Высш. шк.,1986. – 142 с.: ил.
4. ТимощенкоЛ.В., Чубик М.В.Основы микробиологии и биотехнологии: Учебное пособие. – Томск: Изд-воТомского политехнического университета, 2009. – 194 с.
5. СидоровЮ.І., Влязло Р.Й., Новіков В.П… Процеси і апарати мікробіологічноїпромисловості. Технологічні розрахунки. Приклади і задачі. Основи проектуваннявиробництв. У 3 ч. – Ч. І. Ферментація. – Львів: Видавництво Національногоуніверситету «Львівська політехніка», 2004. – 240 с.
6. БекерМ.Е. Введение в биотехнологию. Пер. с латышского. – М.: издательство «Пищевая промышленность», 1978. – 228 с.
7. КасаткинА.Г. Основные процессы и аппараты химической технологии. Издание седьмое. – М.:Государственное научно-технологическое издательство химической литературы,1961. – 831 с.
8. Под ред.К.А. Калунянца. Оборудование микробиологических производств. – М.:Агропромиздат, 1987. – 389 с.