Рефератциклу робіт «Роль молекулярних структур клітин та мікроорганізмів в формуванні імунорезистентності організму в нормі та при патології», виконаного авторським колективомМаланчук О.М., Старовойтова С.О., Бабенко Л.П., Мокрозуб В.В.Вивчення молекулярних механізмів функціонування сигнальних шляхів клітин є актуальною проблемою сучасної молекулярної біології клітини та імунології, оскільки їхня координована взаємодія є запорукою нормального розвитку і життєдіяльності клітини та організму в цілому. На особливу увагу заслуговує вивчення регуляції ключових сигнальних молекул, наслідком порушення яких є розвиток низки імунологічних та фізіологічних патологій, зокрема неопластичної трансформації. Виходячи з цього найбільш перспективним є вивчення білкових продуктів пухлинно-супресорних генів туберозно-склерозного комплексу TSC1 (TSC1, гамартин) і TSC2 (TSC2, туберин), які формують фізичний та функціонально активний комплекс in vivo, залучений до контролю PI3К/Akt/mTOR-залежного сигнального шляху, а також використання тваринних моделей інфекційно-запальних захворювань бактеріальної та вірусної природи задля створення високоефективних препаратів мікробного походження, здатних до регуляції активності пухлинно-супресорних генів, а також підвищення імунорезистентності організму до збудників інфекційного процесу. Туберозний склероз (TSC) – генетично детерміноване захворювання, що належить до групи нейроектодермальних порушень та характеризується ураженням нервової системи, шкіри та наявністю доброякісних пухлин (гамартом) в широкому спектрі тканин та органів. Класичними проявами TSC є епілептичні напади, затримка розумового розвитку та ангіофіброміоми обличчя. Відомо, що розвиток туберозного склерозу визначається мутаціями в одному з двох генів, які локалізовані в ділянках 9-ї, 13-ї та 16-ї хромосоми. На користь того, що TSC1/2 є супресором пухлин, свідчать дані мутаційного аналізу, а саме: мутації в будь-якому з двох генів TSC1 (9q34) чи TSC2 (16р13) призводять до неконтрольованої проліферації клітин і є однією з причин розвитку туберозного склерозу. Серед цих важливих питань особливе місце посідає, з одного боку, детальне вивчення молекулярного механізму, що опосередковує функціонування комплексу TSC1/2 як супресора пухлин, а з іншого – вивчення механізмів регуляції активності комплексу TSC1/2. З огляду на вищевикладене, на сьогодні залишається актуальним пошук нових білкових партнерів комплексу TSC1/2 та з’ясування регуляторної ролі виявлених взаємодій. На сьогодні накопичено багато даних щодо взаємодії туберину з різними сигнальними молекулами, білками адгезії, адаптерними білками тощо, активність яких виявляється на різних етапах життєвого циклу клітини. Дані взаємодії вказують на важливу роль туберину в процесах життєдіяльності клітини. Водночас, ці дані є недостатніми для остаточного з’ясування механізму функціонування комплексу TSC1/2 в сигнальних шляхах. Все це свідчить на користь того, що білкові партнери комплексу TSC1/2 є перспективними мішенями для лікування спадкових синдромів та онкологічних захворювань, які супроводжуються зниженням імунорезистентності організму. У зв׳язку з цим в останні роки особливу увагу привертають механізми регуляції пухлинно-супресорного комплексу TSC1/2 та питання підвищення імунорезистентності організму шляхом використання сапрофітних бактерій, які можуть слугувати основою для цілеспрямованого створення пробіотичних препаратів. Сигнальні шляхи є інструментом, який дозволяє клітині адекватно реагувати на зовнішні та внутрішні фактори, без чого не можливе біологічне функціонування. Їх активність регулюється зовнішніми стимулами (гормони, цитокіни, фактори росту тощо), які взаємодіють з відповідними рецепторами на поверхні клітин з подальшою передачею імпульса від рецептора до відповідних сигнальних білків. В результаті відбувається стимуляція великої кількості сигнальних шляхів, що перехрещуються, та активація кіназних каскадів, в результаті чого імпульс передається до ядра клітини, де активуються фактори транскрипції відповідних генів. Одним із таких сигнальних шляхів є PI3-К/Akt/mTOR – залежний сигнальний ланцюг, відкритий ще у 80-ті роки. Відомо, що нормальне функціонування в клітині даного сигнального каскаду забезпечує регулювання життєдіяльності клітини, її розміру, росту, проліферації та апоптозу. Порушення різних ланок PI3-К/Akt/mTOR-залежного сигнального ланцюга призводить до трансформації клітин і розвитку злоякісних новоутворень, що свідчить про важливість цього каскаду в процесах трансформації клітин. Отримані нами дані є суттєвим внеском у розуміння загальної картини функціонування TSC1/2-опосередкованих сигнальних мереж, залучених до контролю фізіологічної активності клітин. Відкриття взаємодії TSC2 з РР5 дає можливість припустити існування ще одного шляху регуляції акивності TSC2 та комплексу TSC1/2 в цілому, який полягає у дефосфорилюванні супресора пухлин TSC2 протеїнфосфатазою 5 за потенційними сайтами фосфорилювання кінази АМРК. Це відкриває нові перспективи як у вивченні механізмів регуляції процесів росту клітин, проліферації, так і з’ясуванні причин їх порушення за умов патологій різного походження, зокрема, при розвитку злоякісних новоутворень. Дослідження, що були проведені на плодових мушках та клітинах ссавців показали, що пухлинно-супресорний комплекс TSC1/2 є антагоністом по відношенню до кінази mTOR в PI3K/Akt/mTOR-залежному сигнальному шляху, який відіграє центральну роль в регуляції клітинного росту, проліферації та апоптозу у відповідь на ростові фактори, зміну рівнів клітинної енергії та поживних речовин. Окремі компоненти PI3K/Akt/mTOR сигнального шляху, зокрема mTOR, є одними з перспективних мішеней онкотерапії. Однак, на сьогодні відомі не всі компоненти та гілки даного сигнального шляху. Тому пошук нових учасників передачі сигналу через PI3K/Akt/mTOR сигнальний шлях, а також вивчення взаємодії вже відомих його компонентів, представляє великий науковий інтерес, а також відкриває нові перспективи в ідентифікації нових фармакологічних мішеней з метою успішного лікування спадкових синдромів та пухлин. Взаємодія туберину з його білковими партнерами пояснює різноманітність функцій білка у процесах клітинної проліферації, білкової трансляції, клітинної міграції та регуляції транскрипції, а також його залучення у регулювання внутрішньоклітинного сигналінгу. Одним з перспективних підходів у вивченні функціонування сигнальних шляхів є застосування методу дріжджової двогібридної системи. Цей метод дозволив ідентифікувати ряд білкових партнерів вже відомих компонентів сигнальних шляхів. Використовуючи даний метод нами вперше було ідентифіковано взаємодію між TSC2 та протеїнфосфатазою 5. Ми припустили, що РР5 є потенційною фосфатазою для туберину. Для підтвердження виявленої взаємодії в клітинах вищих еукаріот та її характеристики були проведені адекватні експерименти. За допомогою методу ко-імунопреципітації транзієнтно трансфікованих, а також ендогенних білків з використанням специфічних антитіл було підтверджено, що TSC2 та протеїнфосфатаза 5 взаємодіють в умовах in vivo. Той факт, що дана взаємодія підсилюється в експоненціально ростучих клітинах та клітинах, що знаходились в умовах голодування і згодом були рестимульовані сироваткою, підтверджено визнаними фахівцями в різних наукових лабораторіях. Завдяки дослідженням останніх років досягнуто значний прогрес в розумінні механізмів контролю росту та показано значимість пухлинно-супресорного комплексу TSC1/2 в процесах клітинної трансдукції. На сьогодні незаперечним є той факт, що білки туберозно-склерозного комплексу інтегрують сигнали позитивної та негативної регуляції процесів клітинного росту, проходження клітинного циклу та апоптозу, і знаходяться вище у сигнальному каскаді над молекулою mTOR. Не дивлячись на це, все ще залишається не з'ясованим як саме здійснюється регуляція супресорів пухлин TSC1 та TSC2, які саме молекули задіяні у цьому процесі та як відбувається ця взаємодія. Тобто, одержані нами дані вказують на можливість існування додаткового механізму регуляції активності комплексу TSC1/2 шляхом РР5 опосередкованого дефосфорилювання TSC2, активність якої, в свою чергу, також знаходиться і під контролем mTOR. Однак ця гіпотеза потребує подальшого експериментального підтвердження. Крім того, ідентифікування декількох інших білків-партнерів TSC2 дає можливість подальшого дослідження механізмів регуляції комплексу TSC1/2 та створення у майбутньому нових високоефективних препаратів природного походження – регуляторів активності комплексу TSC1/2. Згідно з сучасними уявленнями генетичний апарат клітин доброякісних та злоякісних новоутворень характеризується накопиченням численних мутацій у генах двох груп: протоонкогенах та генах-супресорах, білкові продукти яких регулюють поділ клітин. Основна функція протоонкогенів полягає у стимуляції жорстко контрольованого процесу проліферації у нормальних клітинах. Зміна структури протоонкогенів може призводити до трансформації їх в онкогени, активація яких викликає нерегульований клітинний поділ. Відома здатність деяких сполук мікробного походження впливати на експрессію протоонкогенів та генів-супрессорів взято за основу при виконанні наступної частини роботи. Як відомо, в організмі мішенню для імуноіндукторів мікробного походження виступають фагоцитарні клітини. Під впливом цих препаратів підсилюються функціональні властивості фагоцитів (зростає фагоцитоз та внутрішньоклітинний кілінг чужорідних антигенів та поглинутих бактерій), зростає продукція прозапальних цитокінів, потрібних для ініціації клітинного та гуморального імунітету. Це призводить до збільшення продукції антитіл, активації системи інтерферону, клітин-кілерів та утворення антиген специфічних Т-лімфоцитів. Зовсім нещодавно було з’ясовано, що система вродженого імунітету сформована на декількох високо консервативних структурах мікроорганізмів, на відміну від адаптивної імунної системи, що тонко налаштовується на конкретний чужорідний антиген. Ці структури було названо патоген-асоційованими молекулярними образами (PAMP – pathogen associated molecular patterns), а відповідні їм рецептори вродженої імунної системи – образрозпізна- ючими рецепторами (PRR – pattern-recognition receptors). Останні дані стосовно механізмів функціонування адаптивного та вродже- ного імунітету дозволяють охарактеризувати імунотропні препарати мікробного походження, як комплексні PAMP-препарати, що впливають на вроджений імунітет через сигнальні PRR. Рецептори, що розпізнають PAMP за структурними характеристиками відносяться до декількох класів білкових молекул. По функції PRR розділяють сигнальні та ендоцитозні. Серед сигнальних рецепторів центральне місце займають так звані Toll-like (TLR) та NOD рецептори. У людини родина TLR на сьогодні нараховує 11 членів, 10 з яких розпізнають практично всі відомі PAMP грам-позитивних та грам-негативніх бактерій, вірусів, грибів. З чотирьох білків NOD-родини NOD-1 та NOD-2 відносяться до PRR. В якості PAMP для цих PRR виступають різні фрагменти пептидоглікана – основного компонента клітинної стінки всіх бактерій. На відміну від ендоцитозних, кінцевим результатом взаємодії сигнальних PRR з PAMP є індукція експресії великої кількості генів, і в першу чергу генів прозапальних цитокінів, що опосередковується через активацію транскрипційного фактору NF-KB. Сигнал з TLR та NOD-рецепторів ініціює синтез IL-1, -2, -6, -8, -12, фактору некрозу пухлин, та інтерферонів. Останні наукові повідомлення про механізми функціонування імунної системи, а саме про молекулярні механізми функціонування системи вродженого імунітету підтвердили перспективність даного напрямку для створення нових препаратів мікробного походження та пробіотиків з контрольованим механізмом дії та конкретними точками впливу, що надзвичайно важливо при лікуванні та профілактиці злоякісних новоутворень. На сьогодні головним критерієм онкоімунології майбутнього стає максимальна індивідуалізація. Перспективним стає використання імуномодуляторів не широкого спектру дії, що впливають на всі ланцюги системи імунітету, а так званої «точкової» дії. Останні дані експериментальних та клінічних досліджень в галузі профілактики злоякісних новоутворень дають підстави стверджувати, що лікування злоякісних пухлин та інших патологічних процесів (інфекцій, ендокринопатій і т.д.) вимагають комплексних заходів, що включають використання як етіопатогенетичних та симптоматичних лікарських препаратів і підходів, так і застосування імунотропних засобів для підтримки захисних сил організму. Особливо велику увагу останнім часом приділяють імунотропним препаратам мікробного походження, у зв’язку з їх нешкідливістю для макроорганізму. Імунотерапія цими препаратами пройшла довгий шлях її сприйняття та важливості, в першу чергу, для лікування злоякісних новоутворень і займає чинне місце в комплексній профілактиці та лікуванні цих патологій разом з іншими видами терапії. Раніше було виявлено оздоровче значення ряду продуктів, виготовлених із використанням лакто- та біфідобактерій, при лікуванні ряду захворювань. На основі молочнокислих бактерій і сьогодні отримують лікувально-дієтичні препарати (ацидофільне молоко, йогурт, йокалт та ін.), створюють пробіотичні препарати з антибактеріальною, протипухлинною та імуностимулюючою дією. Дослідження останніх 10-15 років суттєво розширили нашу уяву відносно оздоровчого потенціалу клітин різних родів мікроорганізмів і, перш за все, різних видів лактобацил та біфідобактерій, привернули до них увагу мікробіологів, систематиків, молекулярних біологів, генетиків, імунологів, онкологів, педіатрів та геронтологів, дієтологів, фармакологів, біотехнологів. Класично визнані властивості молочнокислих бактерій пригнічувати ріст патогенної флори, що створює потенційну небезпеку розвитку інфекційної патології та злоякісної трансформації клітин організму на тлі імуносупресії. Зазначені властивості знайшли практичну реалізацію у створенні харчових функціональних продуктів та ряду фармацевтичних препаратів – пробіотиків, введених у досить широку медичну практику. Нами встановлена здатність клітин різних видів мікроорганізмів, в тому числі лактобацил, впливати на стан імунної системи та стимулювати захисні сили організму. Продемонстрована їх можливість індукувати утворення деяких цитокінів – інтерферонів, інтерлейкінів, впливати на біосинтез різних типів антитіл, відігравати роль ад’ювантів, виявляти протипухлинну дію. Для ефективного використання про біотичних препаратів необхідне розуміння ме- ханізмів взаємодії між мікробними клітинами та макроорганізмом. Враховуючи все вищенаведене, безумовно, можна констатувати що в сучасних умовах пробіотики можуть стати важливим та необхідним інструментом оздоровлення людського організму взагалі і, в першу чергу, для захисту людини від інфекційно-запальних захворювань бактеріального та вірусного ґенезу, а також злоякісних трансформацій клітин організму. З метою пошуку оптимальної комбінації мікроорганізмів для створення пробіотичного препарату широкого спектру дії були досліджені музейні та виділені штами молочнокислих бактерій. Три нових штами бактерій роду Lactobacillus задепоновано в депозитарії Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, про що отримано відповідні свідоцтва: Lactobacillus acidophilus VK-3 IМВ В-7279, Lactobacillus casei VK-4 IМВ В-7280, Lactobacillus bulgaricus VK-5 IMB B-7281, ще два штами бактерій роду Bifidobacterium знаходяться в процесі депонування. Вивчені пробіотичні властивості молочнокислих бактерій родів Lactobacillus та Bifidobacterium, їх композицій та дериватів: антагоністична, адгезивна активності, продукція лізоциму, перекису водню, органічних кислот, здатність до сорбції іонів важких металів, імуномодулююча активність, а також гіпохолестеринемічна активність in vivo та in vitro. Дослідження впливу композиції лактобактерій на продукцію імунорегуляторних цитокінів інтерферону (ІФН) та фактору некрозу пухлин-α (ФНП) in vitro та in vivo, а також на функціональну активність макрофагів перитонеального ексудату (поглинальну здатність і бактерицидність) та цитотоксичну активність природних клітин кілерів (ПКК) показало, що дані культури є потенційними індукторами цитокінів імунної відповіді І типу (ІФН та ФНП) які здатні впливати на функціональну активність макрофагів та цитотоксичну активність ПКК. Стимуляція фагоцитарної системи дослідними препаратами корелювала з підвищенням цитотоксичної активності ПКК та їх впливом на продукцію імунорегуляторних цитокінів (ІФН та ФНП-α). Експериментально показано, що культури лакто- та біфідобактерій є неток- сичними для макроорганізму, мають широкий спектр антагоністичної активності проти патогенних та умовно-патогенних мікроорганізмів, а також дріжджів роду Candida. Показано відсутність антагоністичної активності між дослідженими штамами молочнокислих бактерій, що в перспективі дає можливість конструювати на їх основі комплексні пробіотики. Експериментальні дані показали, що здатність зв’язувати холестерин в різній мірі (5-62%) притаманна всім вивченим штамам. За проявом холестеразної активності культури можна помістити в такий ряд: Lactobacillus casei > Lactobacillus bulgaricus > Lactobacillus acidophilus > Bifidobacterium longum > Bifidobacterium bifidum. При вивченні холестеразної активності різних композицій штамів встановлено, що найбільш активними виявилися композиції: Lactobacillus casei: Lactobacillus bulgaricus–73% та Bifidobacterium longum: Bifidobacterium bifidum– 69%, для інших холестеразна активність залишалась у межах 38–57%. При визначенні противірусної активності композиції лактобактерій in vivo на моделі експериментального герпетичного менінгоенцефаліту з’ясувалося, що композиційний препарат лактобактерій мав виражену профілактичну дію та лікувальні властивості, оскільки індекс ефективності (ІЕ) – 30 та більше, є показником антигерпетичної активності in vivo. Шестиденний курс композиції лактобактерій дозволив на 20% попередити гибель тварин за профілактичною та на 33% за терапевтичною схемами застосування. Визначення антибактеріальної активності окремих штамів та композицій молочнокислих бактерій проводилося шляхом моделювання урогенітальної та генералізованої стафілококової інфекції на мишах різних генетичних ліній (ICR, BALB/c та SHK). Визначено вплив нових штамів лакто- та біфідобактерій на мікрофлору та показники імунореактивності організму при генералізованих захворюваннях стафілококового ґенезу шляхом дослідження їх антагоністичної та імуномодулюючої активності та впливу на антибіотикорезистентність патогенних штамів мікробів, збудників інфекційних хвороб. Визначено вплив патогенних мікроорганізмів, зокрема стафілококів, на формування мікробного спектру слизових урогенітального тракту, а також встановлена роль патогенпов’язаних молекулярних шаблонів мікроорганізмів в активації Toll-подібних рецепторів та продукції імунорегуляторних цитокінів у процесі розвитку імунної відповіді. Визначені механізми впливу нових штамів лакто- та біфідобактерій на склад мікрофлори урогенітального тракту та імунологічну резистентність за умов фізіологічної норми та при інфекційно-запальних захворюваннях. Розроблено нові науково обґрунтовані підходи до відбору пробіотичних штамів лакто- і біфідобактерій для створення пробіотичних препаратів з різноманітними терапевтичними властивостями для лікування та профілактики патологічних станів, з метою корекції мікрофлори та показників імунорезистентності організму, що полягають у проведенні комплексних досліджень біологічної активності штамів мікроорганізмів з обов’язковим визначенням продукції імунорегуляторних цитокінів різних опозиційних груп та кореляційних зв’язків між показниками, які досліджуються. Таким чином, розроблено нові підходи попередження злоякісних трансформацій на основі вивчення сигнальних шляхів та застосування пробіотичних препаратів на основі молочнокислих бактерій, здатних впливати на активацію імунорезистентності макроорганізму через їх сигнальні рецептори, а саме Toll-like та NOD рецептори. Підвищення імунорезистантності макроорганізму за допомогою пробіотиків є високоефективним, оскільки пробіотики є нешкідливими та активно індукують цитокіни – основні імунорегуляторні молекули вродженої імунної системи. За результатами виконаної роботи опубліковано 46 робіт, з яких статті у 21 вітчизняному та 9 міжнародних наукових журналах із загальним імпакт-фактором 9,3 та процитовані 10 разів, а також 16 тез доповідей, представлених на міжнародних та вітчизняних наукових конференціях.