На правах рукописиОЛИНААнна АлександровнаНЕСПЕЦИФИЧЕСКИЕ ИНФЕКЦИОННЫЕ ЗАБОЛЕВАНИЯ ВЛАГАЛИЩА (МЕДИКО-СОЦИАЛЬНЫЕ, ЭТИОЛОГИЧЕСКИЕ, КЛИНИКО-ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ) 14.00.01 – акушерство и гинекологияАВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук Пермь 2009Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Пермская государственная медицинская академия имени академика Е.А. Вагнера Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»Научные консультанты: доктор медицинских наук, профессор ^ Падруль Михаил Михайлович доктор биологических наук, профессор Карпунина Тамара Исаковна Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор ^ Назаренко Татьяна Алексеевна доктор медицинских наук, профессор Обоскалова Татьяна Анатольевна доктор медицинских наук, профессор ^ Дворянский Сергей Афанасьевич Ведущая организация:Российский университет дружбы народов, г. МоскваЗащита диссертации состоится «__»____2009 года в _10_ час. на заседании диссертационного совета Д 208.067.04 при ГОУ ВПО «Пермская государственная медицинская академия имени академика Е.А. Вагнера Росздрава» по адресу: 614990, г. Пермь, ул. Куйбышева, 39.С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Пермская государственная медицинская академия имени академика Е.А. Вагнера Росздрава» по адресу: 614000, г. Пермь, ул. Коммунистическая, 26.Автореферат разослан «___» ____________2009 г.Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор Сандакова Е.А.^ ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫАктуальность проблемыВ Российской Федерации с начала 90-х годов ХХ в. на фоне социально-экономического кризиса происходило ухудшение здоровья населения, уменьшение его численности за счет выраженного снижения показателей рождаемости (О.Г. Фролова, 2005; Д.А. Халтурина, 2006; Е.Е. Григорьева, 2007; В.Е. Радзинский, 2007). В сложившейся демографической ситуации охрана репродуктивного здоровья является одним из приоритетных медико-социальных направлений. По мнению экспертов Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), ситуация, связанная с заболеваниями, приводящими к этой патологии, является следствием недостаточной научной разработанности вопроса, а также различий в методологических подходах (Ю.А. Соловьева, 2009). В связи с этим ВОЗ предложена программа научных исследований ''Репродукция человека'', основным направлением которой является изучение факторов, негативно влияющих на репродуктивное здоровье и вызывающих бесплодие (World Health Organisation, 1995).Многочисленными исследованиями последних лет показано, что инфекционно-воспалительные процессы, в частности во влагалище, участвуют в развитии акушерско-гинекологической патологии, определяющей не только здоровье матери, но и плода (В.Л. Титюнник, 2003; А.С. Анкирская, 2006; Г.Р. Байрамова, 2007; J.C. Carey, J. Haut, 2000; M.F. Cotch, 2000). В клинике заболеваний прослеживаются две тенденции: во-первых, несоответствие тяжести внешних проявлений и уровня патологических изменений в репродуктивной сфере, во-вторых, невысокая эффективность проводимого лечения, ведущая к фульминантному течению с летальным исходом либо к хронизации процессов. Их причины и механизмы формирования еще предстоит расшифровать (Хмельницкий О.К., 2000; А.Н. Никонов, О.Р. Асцатурова, 2006; В.Н. Прилепская, 2007; А.Л. Тихомиров, 2007). Этиологическая структура возбудителей инфекционных процессов в последнее десятилетие существенно изменилась, что связано с постоянной эволюцией бактерий и вовлечением в патологические процессы условно патогенных микроорганизмов (Е.Б. Рудакова, 2004; А.С. Анкирская, 2006; M. Kretschmar, A. Hem, 2000; C.S. Bradshaw, S.N. Tabrizi, 2006). В связи с двойственной природой последних – условно-патогенные микроорганизмы (УПМ) в качестве комменсалов присутствуют в составе нормальной микрофлоры здоровых людей, а также регистрируются как этиопатогены при различных местных и генерализованных процессах – у клиницистов нередко возникают сложности при оценке результатов обследования, определении целесообразности назначаемого лечения и выборе лекарственных препаратов (Побединский Н.М., О.А. Аксенова, 2006; А.Л. Тихомиров, 2007; Ю.Э. Доброхотова, 2008; J.E. Leigh, K. Shetty, 2004; J.R. Schwebke, R.A. Desmond, 2007). В диагностике неспецифических инфекций до последнего времени решающее значение при определении этиологической значимости придавалось численности обнаруженных микроорганизмов в пораженном органе, а в случае микстинфекции – установлению количественных соотношений между ассоциантами. Однако многими исследователями (А.А. Евсеев, 2007; J.R. Naglik at al., 2003 и др.) в подобных ситуациях зачастую более существенным признается определение у выделенных культур факторов патогенности. Ценность этого критерия повышается при выявлении не одного, а нескольких факторов вирулентности, и особенно в патогенетически значимой дозе и/или уровне активности. Решение вопроса об этиологической роли УПМ в очаге поражения облегчается при выяснении ответной реакции макроорганизма в зоне первичной колонизации, поскольку степень реактивности и динамические изменения показателей локальных факторов неспецифической защиты в существенной мере отражают «поведение» условного патогена как комменсала или возбудителя инфекционного процесса. Комплексный подход, учитывающий как биологические особенности УПМ, так и специфику локальной ответной реакции макроорганизма, разработка новых информативных и доступных для практики критериев, позволяющих определить роль изолируемых штаммов в патологическом процессе при неспецифических инфекционных заболеваниях влагалища (НИЗВ), представляется актуальной и насущной проблемой. ^ Цель исследования совершенствование оказания гинекологической помощи женщинам репродуктивного возраста с учетом социальных, клинико-микробиологических и диагностических особенностей неспецифических инфекционных заболеваний влагалища.^ Задачи исследованияПроанализировать медико-демографические показатели здоровья, основные тенденции и закономерности репродуктивного поведения и развития заболеваний репродуктивной сферы женщин фертильного возраста.Провести анализ состояния организации учета и оказания медицинской помощи при неспецифических инфекционных заболеваниях влагалища и обосновать необходимость их оптимизацииИзучить особенности клинических проявлений и характера течения патологических процессов, ассоциированных с неспецифическими инфекционными заболеваниями влагалища и установить взаимосвязь со спецификой микробного фактора.По результатам клинического и микробиологического исследования выделить основные клинико-микробиологические варианты неспецифических заболеваний влагалища.Усовершенствовать и разработать новые критерии оценки состояния вагинального биотопа по микробному фактору.Оценить состояние клеточного и гуморального звена иммунитета с учетом состояния микробиоты влагалища.Разработать методические подходы к диагностике и интерпретации результатов анализа при обследовании на неспецифические инфекционные заболевания влагалища.^ Научная новизна и теоретическая значимость работы Впервые на основании анализа многолетних данных официальной статистики, оригинальных форм учета заболеваемости, разработанных и апробированных на базе крупного акушерско-гинекологического комплекса, раскрыты основные механизмы мобилизации резервов репродуктивного здоровья и обоснованы подходы к их реализации. Впервые на основе комплексного клинико-лабораторного и экспериментального исследования сформулирована гипотеза о преимущественном формировании кандидоносительства при присоединении кандидозной инфекции к бактериальному вагинозу (БВ) и «истинного» вульвовагинального кандидоза (ВВК) при сочетании с неспецифическим вульвовагинитом. Впервые проведена оценка состояния вагинального биоценоза с использованием экологического подхода на основе индексов, характеризующих микробное разнообразие с учетом долевого участия облигатных и транзиторных видов микроорганизмов. Это позволило предложить классификацию видов микроорганизмов в вагинальном биотопе: доминантные, субдоминантные, малозначимые. На основании интегральной оценки состояния микробиоценоза влагалища определены характерные дефекты противоинфекционной защиты, показано преимущественное нарушение локальных механизмов колонизационной резистентности и установлены особенности взаимодействия основных звеньев местного иммунитета при различных формах НИЗВ. Показано, что на этапе скрининга для идентификации выделенного штамма в качестве возбудителя инфекции, наряду с определением степени обсемененности анализируемого образца, целесообразно изучение патогенных свойств выделенных микроорганизмов, которые различны у соименных видов, вызывающих заболевание и входящих в норме в состав представителей транзиторной или облигатной микрофлоры организма-хозяина (Патент на изобретение №2280866 «Способ диагностики вагинального кандидоза». Зарегистрировано в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 27 июля 2006 г.). Впервые для дифференциальной диагностики НИЗВ предложен метод исследования кристаллограмм вагинального секрета, характеризующий изменение влагалищной жидкости, как интегрального показателя реакции макроорганизма на инфекционный процесс различной этиологии (Патент на изобретение №2351931 «Способ дифференциальной диагностики бактериального вагиноза и неспецифического вагинита». Зарегистрировано в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 10 апреля 2009 г.). Впервые показано, что эффективность терапии НИЗВ зависит как от особенностей фармакокинетики используемых препаратов, так и от состояния вагинальной среды, в частности, рН влагалищной жидкости. ^ Практическая значимость работы На основании анализа существующих статистических форм рекомендована регистрация БВ и неспецифического вульвовагинита (НВВ) как самостоятельных нозологических форм и предложены шифры, которые могут быть использованы для статистического учета данных заболеваний. Предложена оригинальная схема учета НИЗВ, в том числе при различных сочетаниях, как со специфическими, так и неспецифическими инфекциями. Обоснован новый подход к дифференциальной диагностике состояний, ассоциированных с кандидозной инфекцией влагалища. Характеристика изолированных штаммов с использованием предложенного оригинального коэффициента вирулентности может служить одним из достоверных критериев при решении вопроса: является ли выделенная культура C. albicans этиопатогеном или комменсалом в составе микрофлоры влагалища. Такой подход позволит рационализировать выбор этиотропной терапии, исключая необоснованное использование антимикотиков при кандидоносительстве (Патент на изобретение №2280866 «Способ диагностики вагинального кандидоза». Зарегистрировано в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 27 июля 2006 г.). Показано, что компьютерные технологии при оценке этиологической значимости УПМ придают применяемым методикам экспрессность и повышают их объективность. Использование методов компьютерной морфометрии позволяет не только производить измерения в автоматическом режиме, но и систематизировать, подвергать статистической обработке, архивировать аналитические данные, что в значительной степени облегчает микробиологический мониторинг инфекций, ассоциированных с условно патогенными микроорганизмами.Использование кристаллографии влагалищной жидкости является не только простой в исполнении и обоснованной с экономической точки зрения, но и дает возможность документировать полученные результаты и сопоставлять изображения образцов при повторных исследованиях, что позволит оценить динамику инфекционного процесса и эффективность проводимого лечения. Выявленная в работе специфика репродуктивного здоровья и поведения женщин фертильного возраста позволит выработать на региональном уровне стратегию оказания профилактической и лечебно-диагностической помощи женскому населению, ориентированную на разные возрастные группы.^ Положения, выносимые на защиту В современных условиях процессы репродукции реализуются на фоне депопуляции и увеличения удельного веса женщин позднего фертильного возраста. При этом неспецифические инфекционные заболевания влагалища представляют один из ведущих факторов риска в формировании региональной типологии репродуктивного здоровья.Возникновение неспецифических инфекционных заболеваний влагалища обусловлено состоянием макроорганизма (предшествующей генитальной и экстрагенитальной патологией) и сексуальным поведением, а особенности развития (течения) инфекционного процесса - видом доминирующего микроорганизма, компонентным составом микробных ассоциаций, обусловливающим эффекты синергизма-антагонизма в формирующемся биоценозе. При различных неспецифических инфекционных заболеваниях влагалища изменения клеточного и гуморального звена иммунитета, регистрируемые на системном уровне, не отличаются специфичностью и достоверно незначимы. Своеобразие клинических проявлений связано с особенностями локальной иммунологической реактивности, обеспечивающей колонизационную резистентность во влагалищном биотопе. В дифференциальной диагностике неспецифических инфекционных заболеваний влагалища, при назначении медикаментозной терапии и верификации излеченности, а также определении этиологической значимости изолированных условно-патогенных микроорганизмов целесообразна комплексная оценка их функциональной активности, состояния среды вагинального биотопа и фармакокинетики назначаемых препаратов.^ Внедрение результатов исследования в практикуРезультаты исследований использованы при разработке методических рекомендаций регионального уровня «Микробиологическая диагностика вульвовагинального кандидоза» (2006) и учебного пособия «Иммунотерапия инфекций, передаваемых половым путем» (УМО, 2006). Основные положения, изложенные в диссертации, внедрены в учебный процесс кафедр микробиологии и вирусологии, эпидемиологии, акушерства и гинекологии ГОУ ВПО ПГМА им. ак. Е.А. Вагнера Росздрава, а также кафедры акушерства и гинекологии ГОУ ВПО «Кировская ГМА Росздрава». Результаты исследования внедрены в практическую деятельность лечебно-профилактических учреждений города Перми и Пермского края, центра планирования семьи (г. Екатеринбург), ГЛПУ «Кировский областной клинический перинатальный центр» (г. Киров). ^ Апробация работы и публикации Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на: городской конференции акушеров-гинекологов (Пермь, 26 марта 2009); XIV Международной выставке «Медицина и здоровье-2008» (Пермь, 12–15 ноября 2008); Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные проблемы клинической и экспериментальной медицины» (Чита, 1-2 октября 2008); Всероссийской научно-практической конференции «Современные представления об иммунокоррекции» (Пенза, 2-3 октября 2008); Межрегиональной научно-практической конференции «Актуальные вопросы акушерства, гинекологии и перинатологии в постдипломном образовании врачей» (Омск, 17 сентября 2008); 12-ой Поволжской научно-практической конференции акушеров-гинекологов «Пути сохранения репродуктивного здоровья женщин» (Волгоград, 30-1 июля 2008); Междисциплинарной научно-практической конференции (Пермь, 21 марта 2008); научной сессии Пермской государственной медицинской академии им. ак. Е.А. Вагнера (Пермь, 22 апреля 2008); Всероссийской научно-практической конференции «Проблемы репродуктивного здоровья и безопасное материнство» (Пермь, 15-16 мая 2007); Всероссийской конференции молодых ученых, посвященной памяти профессора Н.Н. Кеворкова «Иммунитет и аллергия: от эксперимента к клинике» (Пермь, 4-7 декабря 2006); II конференции иммунологов Урала (9-12 сентября 2002). Всего по материалам диссертации сделано 11 докладов, в том числе 1 – международного и 4 – федерального уровня.Диссертационная работа апробирована на заседании научного координационного совета по акушерству и гинекологии ГОУ ВПО ПГМА им. ак. Е.А. Вагнера Росздрава.По материалам диссертации опубликовано 44 печатных работы, в том числе: 11 – в изданиях, рекомендованных экспертным советом ВАК по медицине для опубликования результатов исследований по докторским диссертациям. Патенты на изобретения – 3. ^ Объем и структура работыДиссертация изложена на 353 страницах машинописного текста, иллюстрирована 67 рисунками и 86 таблицами; состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, четырех глав собственных наблюдений, заключения, выводов, списка литературы и приложений. Список литературы включает 321 работу отечественных и 220 работ зарубежных авторов. ^ Личный вклад Сбор информации, ретроспективный анализ демографических и эпидемиологических показателей выполнены лично автором. Все клинические исследования, включая их планирование, проведение, анализ, обобщение и обработку полученных результатов, внедрение рекомендаций с оценкой их эффективности, проведены автором в полном объеме. Все бактериологические исследования и значительная часть иммунологических исследований, с последующим анализом их результатов и статистической обработкой, проводились автором и сотрудниками подведомственной лабораторной базы. В работу вошли результаты исследований, проведенных совместно с Н.В. Чемурзиевой, Д.Ю. Сосниным, Ю.Л. Касаткиной, Н.С. Авдеевой, М.Г. Машуровым, Е.В. Трухиной, Е.В. Бабушкиной.^ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследованийРабота выполнена на базе кафедр акушерства и гинекологии педиатрического факультета, микробиологии и вирусологии ГОУ ВПО ПГМА им. ак. Е.А. Вагнера Росздрава, а также МУЗ МСЧ №9 им. М.А. Тверье г. Пермь. Исследования проведены в 2002–2008 гг.^ Ретроспективный анализ демографических показателей проводили на основании данных официальной статистики отдела переписи населения и демографической статистики РОСТАТа Территориального органа Федеральной государственной службы государственной статистики по Пермскому краю (ПЕРМЬСТАТ) за период с 1990 по 2007 г. Изучена многолетняя динамика численности населения, рождаемости и смертности, естественный прирост (убыль), гендерная и возрастная структура населения. Для анализа уровня, структуры абортов, послеабортных осложнений и показателей применения эффективных методов контрацепции использовали официальную статистическую форму 13 «Сведения о прерывании беременности (в сроке до 28 недель)», а также формы отчетности, принятые Управлением здравоохранения г. Перми (2000 – 2008 гг.). Гинекологическую заболеваемость оценивали по данным, содержащимся в форме 12 «Сведения о числе заболеваний, зарегистрированных у больных, проживающих в районе обслуживания лечебного учреждения» (2003-2008 гг.).С целью оценки распространенности НИЗВ изучали сведения, представленные в талонах амбулаторного пациента по данным одной из женских консультаций г. Перми за 2007 г. Учитывали шифры, которые могут относиться к НИЗВ. Шифровка заболеваний проводилась в соответствии с МКБ десятого пересмотра.Для детального анализа инфекционных заболеваний репродуктивной сферы была разработана собственная форма учета, в которой выделены смешанные формы инфекции различной этиологии (вирусно-бактериальные, бактериально-грибковые и др.). В условиях Городского консультативно-диагностического центра пренатальной диагностики и планирования семьи МУЗ МСЧ №9 им. М.А. Тверье (ГКДЦ) было обследовано 173 155 женщин, которые обратились к акушерам гинекологам, из них были выделены женщины в возрасте 20-45 лет - 95 977 чел. В этой группе проведено комплексное клинико-лабораторное обследование: клиническое обследование, кольпоскопия, УЗИ органов малого таза, анализ крови на ВИЧ, RW, бактериоскопическое исследование вагинального отделяемого, выявление ДНК M. gentalium, C. traсhomatis, ЦМВ, ВПГ, ВПЧ (16 и 18 тип) в соскобе из цервикального канала, бактериологическое исследование для определения качественного и количественного состава микрофлоры влагалища. Патология репродуктивной сферы впервые выявлена у 40 355 чел., в том числе инфекционные заболевания влагалища и шейки матки различной этиологии у 42,3% (10 410 чел.). В результате выделены две группы: I - пациентки, у которых обнаружено одно инфекционное заболевание (4645 человек), II - больные со смешанными инфекциями (5 765 человек). После оформления согласия на медицинское вмешательство и в соответствии с критериями включения и исключения были сформированы профильные группы. Критерии включения: - возраст обследуемых от 20 до 45 лет; - жалобы на патологические выделения из половых путей; - установление диагноза ВВК, БВ, НВВ или смешанных бактериально-грибковых или аэробно-анаэробных бактериальных инфекций влагалища; - пациентки, обследованные лично автором.Критерии исключения: - применение гормональной или внутриматочной контрацепции; - наличие эктопии шейки матки, острого или обострения хронического экстрагенитального или гинекологического заболевания; - положительный тест на ВИЧ, сифилис; - положительные тесты на ^ M. gentalium, C. trachomatis, ВПЧ, ВПГ, ЦМВ, Neisseria gonorrhoeae, Trichomonas vaginalis.В результате было выделено 9 профильных групп: I – условно здоровые (42 чел.), II – кандидоносительство (45 чел.), III – бактериальный вагиноз (112 чел.), IV – неспецифический вульвовагинит (107 чел.), V – острый вульвовагинальный кандидоз (61 чел.), VI – хронический вульвовагинальный кандидоз (76 чел.), VII – бактериальный вагиноз + кандидозная инфекция (71 чел.), VIII – неспецифический вульвовагинит + кандидозная инфекция (84 чел.), IX – бактериальный вагиноз + неспецифический вульвовагинит (63 чел.).После распределения пациенток по группам проведены углубленные иммунологические, экспериментальные исследования.^ Клиническое обследование включало традиционный сбор анамнеза. При этом обращали внимание на характер менструальной функции, исход предшествующих беременностей, перенесенные гинекологические, экстрагенитальные заболевания.При объективном обследовании оценивали общее состояние, выполняли традиционные гинекологические и специальные исследования. Проводили аминотест и рН-метрию влагалищного содержимого с помощью бумажных полосок с ценой деления шкалы 0,5 (фирма «Lachema»). Клиническая часть исследований также предусматривала отбор проб вагинального секрета для микробиологического, иммунологического анализа. Для стандартизации условий иммунологических исследований забор материала (кровь и вагинальный секрет) проводили преимущественно в позднюю лютеиновую фазу. ^ Цитологическое и бактериоскопическое исследование вагинального секрета проводили традиционными методами (Р.В. Федоров и др., 1995, Интерпретация результатов цитологического исследования при урогенитальных инфекциях: Метод. рекомендаци. – Пермь, 1998). Состояние микробиоценоза влагалища оценивали по следующим критериям: общая микробная обсемененность, доминирующие морфотипы, наличие дрожжевых клеток, бластоспор, нитей псевдомицелия, эпителиальных и «ключевых» клеток, лейкоцитов. В качестве дополнительных, были предложены следующие тесты: определение суммарного количества лейкоцитов и эпителиальных клеток (СК); определение цитологического коэффициента (ЦК) по соотношению числа лейкоцитов к эпителиальным клеткам (Е.В. Трухина, 2005).^ Бактериологическое исследование вагинального секрета. Для выделения и идентификации микробных культур использовали соответствующие питательные среды производства Дагестанского института питательных сред г. Махачкала и НПО «Биомед» г. Пермь, а также хромогенные среды (HiMedia Laboratories Pvt. Limited, Индия). Исследования проводили согласно методике Р.В. Федорова, Е.Р. Федоровой, Н.Ю. Матюхиной, 1995. Грибы рода Candida выделяли на среде Сабуро, HiCrome Candida Agar; молочнокислые бактерии (лактобациллы и стрептококки) - на среде МРС; энтерококки - при посеве на среду Калины; стафилококки выделяли на желточно-солевом агаре и HiCrome Aureus Agar Base; энтеробактерии определяли при высеве на среду Эндо и HiCrome ЕСС Agar; анаэробы – на обогащенной среде для контроля стерильности, разлитой «высоким столбом» по пробиркам; для выявления клостридиальных форм посев проводили уколом в столбик висмут-сульфит агара. Выделенные бактериальные культуры идентифицировали на основании изучения морфологических, тинкториальных, биохимических свойств. Применяли также наборы стандартных энтеро-, стафило- и стрептотестов (производство «Лахема», Чехия). Вагинальный кандидоз подтверждали на основании присутствия грибов рода Candida в количестве более 104 КОЕ/мл. При кандидоносительстве грибы высевали в концентрации, не превышающей 104 КОЕ/мл. При смешанной бактериально-грибковой инфекции влагалища определяли в диагностически значимых титрах грибы рода Candida и другие условно-патогенные микроорганизмы. Для индикации ^ U. urealyticum использовали жидкую дифференциально-диагностическую среду производства ООО "Научно-производственная фирма "Диагност-мед" г. Омск, которая обеспечивает рост уреаплазм с изменением цвета среды за счет специфической ферментативной активности искомых микроорганизмов. Исследуемый материал засевали в среду, предварительно разлитую по 2 мл в стерильные бактериологические пробирки с ватно-марлевыми пробками. Пробирки помещали в термостат и инкубировали при температуре 370 С в течение 48 часов. Рост уреаплазм сопровождался изменением цвета среды от желтого до зеленого без помутнений. В ряде случаев для диагностики использовали тест-системы для качественного и полуколичественного определения урогенитальных микоплазм НИИЭМ им. Л.Пастера, г. С.-Петербург, и наборы для идентификации и дифференциального титрования урогенитальных микоплазм "Mykoplasma DUO", Франция, в соответствии с прилагаемыми к ним инструкциями. Для оценки состояния вагинального биотопа использовали микроэкологические критерии: индекс доминированияd = Pi x 100%, где Pi – доля вида, определяется как ni/N, ni – количество особей данного вида, N – общее количество особей в данной пробе; индекс СимпсонаС = (ni/N)2Определение фосфолипазной активности Candida albicans проводили на яично-желточной плотной среде и желточно-буферной смеси. Для исключения продукции клетками C. albicans других видов липаз были проведены специальные тесты. Объектом биохимических исследований являлась культуральная жидкость, полученная при накоплении биомассы Candida. Активность липазы определяли ферментативным колориметрическим методом (метилресоруфиновым методом) с использованием набора реактивов фирмы “Chronolab” (Кат. No. 101-0410).^ Морфометрические характеристики клеток и колоний получали с помощью компьютерной микроскопии с использованием установки OLYMPUS (производство Япония) при увеличениях 100х1,36х10 и 4х0,85х10 соответственно. Колонии для этого выращивали на стандартной плотной среде Сабуро и плотной яично-желточной среде Сабуро. Из выросших культур Candida готовили мазки-препараты и окрашивали их по Граму. ^ Определение активности мураминидазы (лизоцима) в сыворотке крови и влагалищном отделяемом Активность лизоцима исследовали фотонефелометрическим методом с учетом рекомендаций И.О. Каграмановой (1974). Забор крови и других биологических жидкостей производили одновременно. Поскольку в процессе собственных исследований мы пришли к выводу, что абсолютные величины, характеризующие активность факторов неспецифической резистентности, строго индивидуальны и сами по себе малоинформативны, при сравнительном динамическом анализе мы пользовались условными единицами (УЕ), характеризующими падение оптической плотности в единицу времени (1 час).^ Иммунологические исследования были выполнены с учетом фазы менструального цикла – в лютеиновую фазу.Определение функциональной активности лейкоцитов периферической крови и влагалищного отделяемого проводили с использованием формалинизированных эритроцитов барана. Рассчитывали процент фагоцитоза (ФП), фагоцитарное число (ФЧ), фагоцитарный индекс (ФИ). ^ Исследование показателей клеточного звена иммунитета включало определение CD3+, CD4+, СD8+, CD16+, CD20+ лимфоцитов и соотношения CD4+/CD8+, которое выполняли иммуноцитохимическим методом (стрептавидин-биотиновый), использованы реагенты «DakoCytomation», фирмы «Dako», Дания.^ Определение уровня иммуноглобулинов периферической крови и влагалищного отделяемого проводили методом радиальной иммунодиффузии в геле по Манчини. Определяли уровень иммуноглобулинов IgG, IgA, IgM в крови и влагалищном отделяемом. Для построения калибровочной кривой использовали наборы стандартных моноспецифических сывороток против иммуноглобулинов человека (IgG, IgA, IgM) производства Н. Новгородского НИИ вакцин и сывороток.Исследование уровня специфических антител (IgG) к условно-патогенным бактериям и тканевым антигенам выполняли с помощью твердофазного иммуноферментного анализа. Определяли антитела к бактериальным антигенам (S. aureus, S. epidermidis, Streptococcus sp., E. coli, P. vulgaris, P. mirabilis) и тканевым антигенам (эластин, коллаген, антигены почек, печени, гипофиза, надпочечников, щитовидной железы). Для исследования были использованы тест системы (г. Москва), содержащие сорбированный индивидуальный препарат бактериальных антигенов, выделенных из клеток, и тканевые антигены. ^ Определение уровня цитокинов периферической крови и влагалищной жидкости проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа в соответствии с инструкцией. Для исследования использовали наборы реагентов ProCon ILβ-1, IL-2, IL-6, IL-4, TNF-α, IFN-γ фирмы «Протеиновый контур», С.-Петербург.^ Кристаллографическое исследование влагалищной жидкости Фации влагалищной жидкости (ВЖ) получали методом клиновидной дегидратации (Шабалин В.Н., Шатохина С.Н., 1998 г.). Для фотоизображений использовали бинокулярную лупу МБС-9 и цифровую фотокамеру OLYMPUS. Анализ проводили с применением программы IMAGE-PRO+ (1995г.), оценивали разделение фации влагалищной жидкости на центральную, промежуточную и периферическую зоны, их ширину, однородность, расположение и форму кристаллов. ^ Экспериментальное моделирование инфекционного процесса на животных В качестве модели были выбраны лабораторные кролики беспородные самки в возрасте 7-9 месяцев, живой массой 2-3 кг, которые не допускались к спариванию (18 особей). Первичное обследование включало осмотр, бактериоскопическое и бактериологическое исследование вагинального отделяемого. Затем животных разделили на три группы (по 6 особей): I – введены во влагалище St. аureus, II – E. сoli, III – C. albicans (инокулюм содержал порядка 1,5х108 КОЕ/мл, что соответствует 5 ЕД стандарта мутности). Повторно осмотр и забор материала проводили через 5 и 10 дней после заражения. На десятый день было забито по 2 кролика из I и II групп. Для гистологического исследования взят материал стенки влагалища и периферические лимфатические узлы. Затем животным I (3 кролика) и II (2 кролика) групп на 10 день эксперимента были дополнительно введены во влагалище C. albicans. Контрольное обследование выполняли через 5 и 10 дней после повторного заражения. Для морфологических исследований материал разрезали на кусочки и фиксировали в жидкости Карнуа, далее проводили “заливку” в парафиновые блоки по общепринятой методике. С помощью санного микротома готовили срезы толщиной 4-5 мкм. Для выявления общей гистологической картины органа срезы окрашивали гематоксилином и эозином. Цифровой материал, полученный в результате исследований, обрабатывали методом вариационной статистики на компьютере Pentium с использованием программы «Microsoft Excel» (пакет анализа данных). Проводили линейную корреляцию, вычисляя коэффициент корреляции Pearson (r) Разницу считали достоверной при уровне значимости p Для оценки статистической значимости различий между выборками использовали однофакторный дисперсионный анализ, критерий Ньюмена-Кейлса, критерий . Разницу считали достоверной при уровне значимости p С целью установки связи между двумя величинами использовали уравнение регрессии. Результаты статистической обработки данных визуализировали с помощью таблиц, графиков и диаграмм. Статистический анализ показателей полученных при компьютерной микроскопии, проведен с использованием программ Image-Pro (версия Demo).^ результаты работы и их обсуждение На основании проведенных исследований сформулированы и представлены к защите четыре основных положения. За последнее десятилетие в России произошли значительные социальные и экономические изменения, сопровождающиеся ростом безработицы, проституции, наркомании, появилось большое число мигрантов, что неблагоприятно повлияло на медико-демографическую ситуацию (С.О. Аран, 2001; Е.Р. Аравийская, Е.В. Соколовский, А.Ф. Карапетян и соавт. 2003; Э.А. Баткаев, Ю.А. Галлямова, Г.М. Енгоянц и соавт., 2003). В этой связи проблема охраны репродуктивного здоровья населения приобрела особую значимость. Улучшение демографической ситуации и укрепление репродуктивного потенциала зависят от ряда факторов: здоровья подростков, соматического и репродуктивного здоровья женщин фертильного возраста, течения и исходов беременности, уровня репродуктивных потерь (Е.Е. Григорьева, 2007). Учитывая, что проблема репродуктивного здоровья вышла далеко за рамки медицинских аспектов и до настоящего времени отсутствует единая государственная межведомственная стратегия по его охране, создание интегрированной системы оказания помощи женщинам фертильного возраста в условиях крупного города является актуальной задачей, эффективное решение которой в значительной степени определяется спецификой конкретных территорий. Современную демографическую ситуацию в г. Перми, как и в целом по России, скорее можно охарактеризовать как кризисную. Это проявляется отрицательным естественным приростом населения, который наблюдается еще с 1990 г. За анализируемый период (1990-2007 гг.) женское население уменьшилось на 32 534 (рис. 1), несмотря на это их доля в гендерной структуре растет (1990 г. - 53,2%, а в 2007 г. – 55,2%). Выявленное снижение численности девочек от 0 до 14 лет (-61596) и девушек подростков от 15 до 18 лет (-10 220), увеличение группы позднего репродуктивного возраста на 10 831 чел. отражает устойчивую тенденцию старения женщин фертильного возраста (рис.2). Рис. 1. Прямолинейная тенденция Рис. 2 Многолетняя динамика многолетней динамики численности численности женщин фертильного женского населения возраста ПермиВОЗ более 50 лет назад была разработана и принята концепция планирования семьи. Несмотря на создание и в нашей стране специальной службы планирования семьи, искусственный аборт остается в России основным методом регуляции рождаемости. Большое число прерываний беременности и низкий процент использования эффективных средств контрацепции являются отрицательным фактором для воспроизводства населения. Кроме того, аборт является одной из основных и значимых непосредственных причин материнской смертности. На изучаемой территории в течение последних 7 лет отмечается снижение абсолютных и относительных показателей: количество абортов на 1000 женщин фертильного возраста в 2000 году составило 55,6, а в 2008 – 35,2 (рис. 3). Особенно важно, что такая же тенденция наблюдается и в группе 15-19 лет. Наблюдается снижение показателей перинатальной (2000 г. – 10,8, 2008 г. - 7,4 на 1000 родившихся живыми и мертвыми) и ма