БЕЛОРУССКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТВыпускная работа по«Основам информационных технологий»Магистрантки биологического факультета кафедры биохимии Долгодилиной Елены Викторовны Руководители: доцент Кукулянская Татьяна Александровна старший преподаватель Шешко Сергей МихайловичМинск – 2009 гОГЛАВЛЕНИЕ ОГЛАВЛЕНИЕ 3 ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ К ВЫПУСКНОЙ РАБОТЕ 5 РЕФЕРАТ НА ТЕМУ «ПРИМЕНЕНИЕ ИНФОРМАЦИОННЫХ ТЕХНОЛОГИЙ В БИОХИМИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ» 6 ОГЛАВЛЕНИЕ 6 ВВЕДЕНИЕ 7^ ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 9 1. Особенности структурной организации белков 9 2. Принципы предсказания и моделирования белковых структур 13 2.1 Предсказание вторичной структуры 14 2.2 Моделирование по гомологии 21 1. Автоматическое моделирование подходит в тех случаях, когда имеется достаточно высокая степень сходства между исследуемым белком и белком, выступающим в роли матрицы (образца для сравнения). Как правило, если целевой белок и матрица имеют более 50 % идентичности в последовательностях, то автоматические «выравнивания» последовательностей являются достаточно надежными [12]. 23 2.3 Распознавание фолда 29 1. Белковые структуры, хорошо соответствующие собственным профилям на родственных белках, дают высокий вес сопоставления самих структур этих белков между собой. Профиль является абстрактным свойством семейства, а не только индивидуально белка. 31 2. Когда родственная последовательность плохо соответствует профилю, полученному из экспериментальной структуры этой последовательности, то, по-видимому, в структуре есть ошибка. Позиции, где профиль не соответствует последовательности, могут указывать на область, где находится ошибка [1]. 31 1. Метод для оценки моделей, позволяющий выбрать одну. 32 2. Метод калибровки весов, чтобы можно было понять, на сколько выбранная модель хороша [1]. 32^ ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 37 ЗАКЛЮЧЕНИЕ 39 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ К РЕФЕРАТУ 39 ПРЕДМЕТНЫЙ УКАЗАТЕЛЬ К РЕФЕРАТУ 41 ИНТЕРНЕТ-РЕСУРСЫ В ПРЕДМЕТНОЙ ОБЛАСТИ 42^ ДЕЙСТВУЮЩИЙ ЛИЧНЫЙ САЙТ В WWW 47 ГРАФ (КРУГ) НАУЧНЫХ ИНТЕРЕСОВ 48 ПРЕЗЕНТАЦИЯ МАГИСТЕРСКОЙ ДИССЕРТАЦИИ 49 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ К ВЫПУСКНОЙ РАБОТЕ 52 ПРИЛОЖЕНИЕ 54 1. Как обозначается селектор класса? 54 2. Какая программа предназначена для обработки изображений гелей, фото планшеток, результатов блоттинга ? 54 ^ ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ К ВЫПУСКНОЙ РАБОТЕ CASP Critical Assessment of Structure Prediction - критическая оценка структурного прогноза) ЕVА EVAluation of automatic protein structure prediction servers (серверы по оценки автоматически предсказанных белковых структур) ExPDB SWISS MODEL Template library (библиотека матриц SWISS MODEL) ID PDB Идентификационный номер в PDB ID(id) Идентификационный номер ID Chain Идентификационный номер цепи NMR Nuclear magnetic resonance PDB Protein Data Base (база данных белков) ^ РЕФЕРАТ НА ТЕМУ «ПРИМЕНЕНИЕ ИНФОРМАЦИОННЫХ ТЕХНОЛОГИЙ В БИОХИМИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ»ОГЛАВЛЕНИЕ ОГЛАВЛЕНИЕ 3^ ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ К ВЫПУСКНОЙ РАБОТЕ 5 РЕФЕРАТ НА ТЕМУ «ПРИМЕНЕНИЕ ИНФОРМАЦИОННЫХ ТЕХНОЛОГИЙ В БИОХИМИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ» 6 ОГЛАВЛЕНИЕ 6 ВВЕДЕНИЕ 7^ ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 9 1. Особенности структурной организации белков 9 2. Принципы предсказания и моделирования белковых структур 13 2.1 Предсказание вторичной структуры 14 2.2 Моделирование по гомологии 21 1. Автоматическое моделирование подходит в тех случаях, когда имеется достаточно высокая степень сходства между исследуемым белком и белком, выступающим в роли матрицы (образца для сравнения). Как правило, если целевой белок и матрица имеют более 50 % идентичности в последовательностях, то автоматические «выравнивания» последовательностей являются достаточно надежными [12]. 23 2.3 Распознавание фолда 29 1. Белковые структуры, хорошо соответствующие собственным профилям на родственных белках, дают высокий вес сопоставления самих структур этих белков между собой. Профиль является абстрактным свойством семейства, а не только индивидуально белка. 31 2. Когда родственная последовательность плохо соответствует профилю, полученному из экспериментальной структуры этой последовательности, то, по-видимому, в структуре есть ошибка. Позиции, где профиль не соответствует последовательности, могут указывать на область, где находится ошибка [1]. 31 1. Метод для оценки моделей, позволяющий выбрать одну. 32 2. Метод калибровки весов, чтобы можно было понять, на сколько выбранная модель хороша [1]. 32^ ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 37 ЗАКЛЮЧЕНИЕ 39 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ К РЕФЕРАТУ 39 ПРЕДМЕТНЫЙ УКАЗАТЕЛЬ К РЕФЕРАТУ 41 ИНТЕРНЕТ-РЕСУРСЫ В ПРЕДМЕТНОЙ ОБЛАСТИ 42^ ДЕЙСТВУЮЩИЙ ЛИЧНЫЙ САЙТ В WWW 47 ГРАФ (КРУГ) НАУЧНЫХ ИНТЕРЕСОВ 48 ПРЕЗЕНТАЦИЯ МАГИСТЕРСКОЙ ДИССЕРТАЦИИ 49 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ К ВЫПУСКНОЙ РАБОТЕ 52 ПРИЛОЖЕНИЕ 54 1. Как обозначается селектор класса? 54 2. Какая программа предназначена для обработки изображений гелей, фото планшеток, результатов блоттинга ? 54 ВВЕДЕНИЕ Одним из основных объектов исследований в современной биохимии, как и прежде, являются белки. И это неслучайно, поскольку белки выполняют целый ряд важных функций в живых организмах: каталитическую (ферменты); структурную (например, белки цитоскелета, белки межклеточного вещества); защитную (например, белки, участвующие в процессах свёртываемости крови – фибриногены и тромбины, или антитела и белки системы комплимента крови); регуляторную (белки, контролирующие транскрипцию, трансляцию, сплайсинг); сигнальную (например, гормоны, цитокины, факторы роста); транспортную (гемоглобин); запасную (например, белок молока – казеин); информационную (например, фоторецепторы); двигательную (например, динеин, миозин). Белки представляют собой достаточно крупные молекулы. В большинстве случаев лишь малая часть их структуры – функциональный центр – несёт какую-либо функцию, остальная часть существует лишь для того, чтобы создавать и фиксировать пространственные связи между остатками активных центров. Эволюция белков происходит благодаря изменениям в аминокислотной последовательности. В настоящее время в биохимии, как впрочем, в современной биологии в целом, большое значение приобретают исследования, связанные именно со способностью предсказывать функции не природных, а синтетических белков на основе закономерностей связи между структурой и свойствами белков. Если ранее молекулярные биологи были похожи на астрономов – могли наблюдать объекты получаемые, но не модифицировать их. Сейчас ситуация меняется коренным образом. В лаборатории можно модифицировать нуклеиновые кислоты и белки по желанию, можно изучать их, создавая мутации и наблюдая изменения функций, можно старым белкам придать новые функции, можно пытаться создавать новые белки. Большинство правил о белковой структуре было выведено благодаря наблюдению за природными белками. У природных белков характеристики подчиняются основным принципам физической химии и механизмам белковой эволюции. Синтетические же белки должны подчиняться законам физической химии, но не должны ограничиваться правилами эволюции. Таким образом, происходит становление нового научного направления – белковой инженерии, основной задачей которой является синтез белков с заданными свойствами и функциями на основе обширных накопленных знаний [1]. На данный момент известно более 15000 структур белков. Большинство было получено с помощью методов рентгеновской кристаллографии и ЯМР (NMR). Отсюда пришло понимание отдельных функций индивидуальных белков – например, химическое объяснение каталитической активности ферментов – и главных принципов структурного строения белковых молекул и их формы (укладки белковой цепи) [1]. Целью данной работы является анализ современных информационных технологий, позволяющих предсказать свойства целевых белков на основе особенностей их строения. Задачи:охарактеризовать подходы, используемые на данном этапе для предсказания структуры белков на основе данных об их аминокислотном составе и некоторых других особенностях строения; рассмотреть программное обеспечение и Internet-серверы, применяемые для моделирования структуры белков;изучить проекты, используемые для сравнения результатов, полученных при применении различного программного обеспечения для предсказания структуры белков;^ ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ1. Особенности структурной организации белков Прежде чем перейти непосредственно к рассмотрению программ, предназначенных для предсказания и моделирования белковых структур необходимо остановиться на особенностях структурной организации самих белков. Выделяют четыре уровня структуры белка:Первичная структура — последовательность аминокислот в полипептидной цепи. Важными особенностями первичной структуры являются консервативные мотивы — сочетания аминокислот, важных для функции белка. Консервативные мотивы сохраняются в процессе эволюции видов, по ним часто удаётся предсказать функцию неизвестного белка [5].Вторичная структура — локальное упорядочивание фрагмента полипептидной цепи, стабилизированное водородными связями и гидрофобными взаимодействиями. Ниже приведены некоторые распространённые типы вторичной структуры белков:α-спирали — плотные витки вокруг длинной оси молекулы, один виток составляют 3,6 аминокислотных остатка, и шаг спирали составляет 0,54 нм (так что на один аминокислотный остаток приходится 0,15 нм), спираль стабилизирована водородными связями между H и O пептидных групп, отстоящих друг от друга на 4 звена. Спираль построена исключительно из одного типа стереоизомеров аминокислот (L). Хотя она может быть как левозакрученной, так и правозакрученной, в белках преобладает правозакрученная. Спираль нарушают электростатические взаимодействия глутаминовой кислоты, лизина, аргинина. Расположенные близко друг к другу остатки аспарагина, серина, треонина и лейцина могут стерически мешать образованию спирали, остатки пролина вызывают изгиб цепи и также нарушают α-спирали.β-листы (складчатые слои) — несколько зигзагообразных полипептидных цепей, в которых водородные связи образуются между относительно удалёнными друг от друга (0,347 нм на аминокислотный остаток) в первичной структуре аминокислотами или разными цепями белка, а не близко расположенными, как имеет место в α-спирали. Эти цепи обычно направлены N-концами в противоположные стороны (антипараллельная ориентация). Для образования β-листов важны небольшие размеры боковых групп аминокислот, преобладают обычно глицин и аланин [5].π-спирали;310-спирали;неупорядоченные фрагменты;Третичная структура — пространственное строение полипептидной цепи; взаимное расположение элементов вторичной структуры, стабилизированное различными типами взаимодействий. В стабилизации третичной структуры принимают участие:ковалентные связи (между двумя остатками цистеина — дисульфидные мостики);ионные связи между противоположно заряженными боковыми группами аминокислотных остатков;водородные связи;гидрофильно-гидрофобные взаимодействия; при взаимодействии с окружающими молекулами воды белковая молекула "стремится" свернуться так, чтобы неполярные боковые группы аминокислот оказались изолированы от водного раствора, а на поверхности молекулы оказываются полярные гидрофильные боковые группы. Белки разделяют на группы согласно их трёхмерной структуре. Большинство белков относятся к глобулярным: общая форма из молекулы более или менее сферическая. Меньшая часть белков относится к фибриллярным: их молекулы (обычно и надмолекулярные комплексы) в работающем состоянии представляют собой сильно вытянутые волокна. К фибриллярным белкам относятся, например, кератин и коллаген. Среди глобулярных и фибриллярных белков выделяют подгруппы. Например, глобулярный белок триозофосфатизомераза, состоит из восьми α-спиралей, расположенных на внешней поверхности структуры и восьми параллельных β-слоёв внутри структуры. Белки с подобным трёхмерным строением называются αβ-баррелами (от англ. barrel — бочка) [5].Четверичная структура — взаимное расположение нескольких полипептидных цепей в составе единого белкового комплекса. Белковые молекулы, входящие в состав белка с четвертичной структурой, образуются на рибосомах по отдельности и лишь после окончания синтеза образуют общую надмолекулярную структуру (можно считать её и молекулой, если между разными полипептидными цепями, как это нередко бывает, образуются дисульфидные мостики). В состав белка с четвертичной структурой могут входить как идентичные, так и различающиеся полипептидные цепочки. В стабилизации четвертичной структуры принимают участие те же типы взаимодействий, что и в стабилизации третичной [1, 5]. Надмолекулярные белковые комплексы могут состоять из десятков молекул, многие из них сравнимы по размеру с рибосомами и в последние годы часто описываются как органоиды (например, протеасома). Нередко в их состав входят молекулы РНК (например, сплайсосома) [1]. Было доказано, что помимо четырех уровней структурной организации, приведённых выше, удобно использовать и следующие дополнительные уровни:Супервторичные структуры. В белках показана повторяемость взаимодействий между листами и спиралями; супервторичные структуры включают α- спиральные шпильки, β-шпильки и β-α-β-единицу [1].Домены. Многие белки включают несколько компактных единиц в одной цепи, которые могут существовать независимо стабильно. Они называются доменами. В иерархии структур, домены располагаются между супервторичными и третичными структурами белка [1].Модульные белки – многодоменные белки, которые часто содержат много копий близкородственных доменов. Эти домены появляются в различных структурных контекстах, так что различные модульные белки представляют собой мозаику таких доменов [1, 5]. Таким образом, на данный момент уже известны многие, хотя и не все возможные способы укладки белков с известной структурой. Среди белков со сходной укладкой представлены семейства, имеющие достаточно большое количество деталей структур, последовательностей и функций, обусловленное эволюционными взаимоотношениями. Однако и неродственные белки зачастую имеют похожие способы укладки. И именно классификация белковых структур, занимающая одно из центральных мест в современной биоинформатике, является своеобразным мостом между последовательностью и функцией данных макромолекул.2. Принципы предсказания и моделирования белковых структур Наблюдение, что каждый белок сворачивается спонтанно в уникальную трехмерную нативную конформацию, приводит к мысли, что Природа имеет некий алгоритм для предсказания пространственной структуры белка из аминокислотной последовательности. Предпринимались некоторые попытки понять этот алгоритм с целью создания эффективной компьютерной программы, которая была бы направлена на решение указанной выше весьма важной и одновременно сложной проблемы [1]. Одни из этих попыток основывались на общих физических принципах. В данном случае реализовывалась попытка воспроизвести межатомные взаимодействия в белках, чтобы вычислить энергию каждой конформации. С вычислительной точки зрения проблема предсказания структуры белка сводится к поиску глобального минимума конформационной энергии. Это подход до сих пор не привел к успеху отчасти потому, что методы минимизации находят локальные минимумы [1,5]. Другие попытки для решения фундаментальной проблемы - предсказания структуры белков по его аминокислотной последовательности - были основаны на упрощениях задачи путем выделения существенных особенностей [1]:Предсказание вторичной структуры белка без укладки ее в пространственную структуру. В результате получается список сегментов аминокислотной последовательности, для которых предсказано, что они формируют α-спирали или тяжи β-листов.Распознавание фолда: в данной библиотеке известных структур определить, какие из них могут быть наиболее похожими на структуру нового белка. Если белок не соответствует ни одному из фолдов библиотеки, то метод также должен это распознать. Результатом является отнесение нашего белка к одному из известных фолдов или утверждение, что такого фолда в библиотеке нет. Моделирование по гомологии: предсказание трехмерной структуры белка на основе известной структуры одного или нескольких гомологичных белков. В результате получается полный список всех координат всех атомов, как главной цепи, так и боковых радикалов. Полнота и качество результатов зависят, прежде всего, от схожести последовательностей. Считается, что если последовательности двух родственных белков имеют 50% или более идентичных остатков в «выравнивании», то они, вероятно, обладают аналогичной конформацией пространственной структуры с вероятностью не менее, чем 90%. Этот метод оказывается весьма продуктивным, а точность предсказания сравнима с экспериментальной структурой, полученной методами малого разрешения. Предсказание новых фолдов, в том числе и с помощью априорных методов, основанных на знании. В результате получается полный набор координат атомов как минимум для основной цепи и, иногда, для боковых цепей. Модель стремится предсказать способ укладки, но при этом не ожидается, что ее предсказание количественно сравнимо с экспериментальными результатами. Д. Джонс (D. Jones) сравнил различие между априорным моделированием и распознаванием фолда с различием между сочинением и тестированием - выбором ответов из заданного списка на экзамене.2.1 Предсказание вторичной структуры Кажется очевидным, что вторичную структуру легче предсказать, чем третичную, и что наиболее точный способ предсказания третичной структуры состоит в нахождении спиралей и листов, с последующим объединением их в фолд (укладку). Независимо от того, верны эти предположения или нет, многие доверяют и следуют им. По аминокислотной последовательности белка с неизвестной структурой делаются предсказания вторичной структуры — отнесение участков последовательности к спиралям или тяжам листов [1]. Так с помощью программы PROF (В. Rost) были достигнуты хорошие результаты в предсказании структуры домена белка репарации MutS из ^ Thermus aquaticus. Для оценки качества предсказания аминокислотные остатки экспериментально расшифрованной трехмерной структуры были отнесены к трем категориям (спираль = Н, тяж = Е и другие не были обозначены никакими буквами). Процент остатков, предсказанных правильно, был обозначен как QЗ. Для предсказания Б. Роста величина QЗ составила 81% [1, 7].Рисунок 1. Результаты предсказания вторичной структуры белка репарации MutS из Thermus aquaticus с использованием программы PROF с сервера РredictProtein. AA – target protein (целевой белок); Н – спираль (helix), Е – тяжи (strand), отсутствие букв - иная структура. Аналогичные результаты были получены для этого же белка и с помощью программы PSIPRED [8].Рисунок 2. Результаты предсказания вторичной структуры белка репарации MutS из Thermus aquaticus с использованием программы PSIPRED с сервера РredictProtein. AA – target protein (целевой белок), Н – спираль (helix), Е – тяжи (strand), С – иная структура (coiled structure)Как было установлено позднее при сравнении полученных результатов с экспериментальной структурой, за исключением короткой З10-спирали и незначительных расхождений в позициях начала и конца, элементы вторичной структуры были предсказаны правильно. (Иные схемы оценки, которые осуществляют проверку участков совпадения, менее чувствительны к концевым эффектам.) Качество этого результата очень высоко, но такой результат не редкость. В настоящее время РROF работает в среднем с точностью Q3≈77% [1]. Другие методы предсказания вторичной структуры работают также сравнительно хорошо. Наиболее мощные методы предсказания вторичной структуры основаны на нейронных сетях. Нейронные сети — это класс общих вычислительных структур, которые моделируют анатомию и физиологию биологических нервных систем. Они с успехом применяются к широкому спектру задач распознавания образов, классификации и задачам принятия решений [1]. Тип нейронной сети, которая может быть применена к распознаванию вторичной структуры, показан на рисунке 3.Рисунок 3. Нейронная сеть для предсказания вторичной структуры белка из трёх областей Входная область анализирует фрагмент последовательности размером 15 букв. Предсказание относится к центральному остатку (наверху, отмечен стрелкой). Затем окно сдвигается на одну позицию вправо по последовательности и делается следующее предсказание. Каждой из 15 позиций в окне соответствует 20 нейронов, один из которых активен. Скрытая область содержит ≈100 нейронов, соединенных с вводом и выводом. Каждый нейрон в скрытой области соединен с каждым нейроном областей ввода и вывода (показаны не все связи). Область вывода состоит только из трех нейронов, которые просто фиксируют предсказание — спираль, лист, или ни то ни другое.Важной информацией, которая может быть использована при предсказании вторичной структуры, является эволюционная информация. «Множественное выравнивание» содержит в себе гораздо больше информации, чем одна последовательность. Сохранение вторичной структуры в родственных белках означает наличие связи последовательность — структура, и это позволяет делать более строгие предсказания. Большинство методов предсказания вторичных структур, основанных на нейронных сетях, имеют на входном слое не только информацию о степени консервативности позиции, но и профильные веса [1]. Показано также, что использование двух тандемных нейронных сетей позволяет учитывать корреляцию конформаций соседних остатков. Предсказания состояний нескольких последовательно идущих остатков с помощью сети, аналогичной показанной на рисунке 3, комбинируются с помощью еще одной сети, которая формирует окончательный результат. Тест на зрелость методов предсказания может быть проведен полностью автоматически. Некоторые вычислительные методы продуцируют только предварительное грубое предсказание структуры и требуют вмешательства человека для формирования окончательного результата. Другие методы полностью автоматические. Есть множество Web-ресурсов, которые принимают последовательность и возвращают предсказание структур и функций белков. PredictProtein — одна из таких систем, использовавшихся для предсказания вторичной структуры белка MutS. Пользователи предоставляют первичные последовательности белков, их субъединиц или даже участков на данный сервер, на основе чего PredictProtein с использованием большого пакета различных программ производит полный анализ первичной последовательности данного белка, позволяет установить в её пределах функциональные мотивы (PROSITE), регионы низкой и высокой сложности (SEG), сигналы ядерной локализации, регионы, лишенные регулярной структуры (NORS), а также предоставляет возможную вторичную структуру, даёт информацию о доступности растворителя к различных областям белковой молекулы, о глобулярных областях, трансмембранных спиралях, биспиральных (coiled-coil) регионах, структурных switch областях, дисульфидных связях, субклеточной локализации и возможных функциях [7]. По запросу также дополнительно можно осуществить распознавание фолда методом «трединга», установить предназначение CHOP доменов в данном конкретном случае, предсказать контакты между трансмембранными участками и между остатками [7]. Ниже приведён список программ, которые используются на ресурсе PredictProtein, и их краткое описание:PROSITE – база данных функциональных мотивов;ScanPROSITE обнаруживает все функциональные мотивы в задаваемой последовательности, которые аннотированы в базе данных ProSite db; SEG подразделяет задаваемые последовательности на области высокой и низкой сложности;ProDom является базой данной предполагаемых белковых доменов; при помощи BLAST осуществляется поиск в пределах этой базы данных тех доменов, которые соответствуют белку исследователя;MaxHom – это программа динамических «множественных выровненных» последовательностей; она позволяет найти в имеющейся базе данных последовательности, которые соответствуют последовательностям такого же характера анализируемого белка;^ MView позволяет превратить «множественные выровненные» последовательности в «разукрашенные» выходные данные в формате HTML;PHD подходящая программа для прогнозирования 1D структуры (вторичной структуры, доступности растворителю) на основе «множественных выровненных» последовательностей PHDsec прогнозирует вторичной структуру на основе «множественных выровненных» последовательностейPHDacc подходящая программа для прогнозирования доступности каждого аминокислотного остатка по отношению к растворителю на основе «множественных выровненных» последовательностей;PHDhtm предсказывает положение и топологию трансмембранных спиралей на основе «множественных выровненных» последовательностей. PROF - подходящая программа для предсказания 1D структуры (вторичной структуры, доступности растворителю) на основе «множественных выровненных» последовательностей. PROFsec прогнозирует вторичной структуру на основе «множественных выровненных» последовательностей.PROFACC предсказывает доступность каждого аминокислотного остатка по отношению к растворителю на основе «множественных выровненных» последовательностей.GLOBE осуществляет предсказание глобулярности белка DISULFIND предсказывает наличие в белковой структуре дисульфидных мостиков, основываясь на двухэтапный процессASP обнаруживает области, в которых наиболее вероятно осуществляются конформационные переходы [7]; Таким образом, алгоритм действий при моделировании структуры белков в случае использования PROF ресурса следующий [7]:Необходимо предоставить запрос на сайт www.predictprotein.org в виде аминокислотной последовательности, которую можно получить в любой базе данных, например, PDB.Далее результаты выполненной по запросу работы отправляются либо по электронной почте пользователю, или предоставляются в интерактивном режиме непосредственно на сайте.2.2 Моделирование по гомологии Построение модели по гомологии — полезный метод для предсказания структуры белка по известной последовательности, когда исследуемый белок состоит в родстве хотя бы с одним белком, для которого известны и последовательность, и структура. Если белки являются близкими родственниками, то известные белковые структуры (называемые родительскими) могут служить основой для модели исследуемого белка. И хотя качество модели зависит от степени сходства последовательностей, оценить это качество возможно до экспериментальной проверки. Поэтому знание того, какое качество модели требуется приложением, для которого она предназначена, позволяет с высокой долей вероятности предсказать успешность выполнения задачи [1]. Шаги моделирования по гомологии следующие:«Выровнять» аминокислотные последовательности исследуемого белка и белка (белков) с известной структурой. В большинстве случаев вставки и делеции будут наблюдаться в петлях между α-спиралями и β-тяжами.Определить сегменты основной цепи, содержащие вставки или делеции. Сшивание этих участков с основной цепью известного белка (матрицы) создает модель основной цепи исследуемого белка.Заменить боковые цепи мутировавших остатков. Для немутировавших остатков сохранить конформацию боковых цепей. Мутировавшие остатки склонны сохранять конформацию боковой цепи, и это можно использовать при моделировании. При этом сейчас также доступны вычислительные методы поиска подходящей конформации боковой цепи среди возможных комбинаций.Проверить модель (и визуально, и с помощью программ), чтобы выявить значительные наложения атомов. Насколько возможно, устранить подобные наложения вручную.Уточнить модель методом ограниченной минимизации энергии. Роль этого шага — установить точное геометрическое расположение в тех местах, где были соединены участки главной цепи, и позволить боковым цепям слегка перемещаться, чтобы занять удобное положение. На самом деле эффект этой процедуры только косметический: минимизация энергии не устранит серьезных ошибок в такой модели [1]. По сути, модель нового белка строится путем внесения минимальных изменений в доступную структуру матрицы. К сожалению, существенно улучшить такую модель непросто. Эмпирическое правило гласит, что если две последовательности идентичны хотя бы на 40-50%, описанная процедура дает модель, достаточно точную для использования во многих приложениях. Если же сходство ниже, то ни описанная процедура, ни какой-либо другой доступный на данный момент алгоритм, не дадут детально точной модели, исходя из доступных структур родственных белков [1]. Структуры большинства белковых семейств содержат как относительно постоянные, так и более вариабельные участки. Ядро структуры семейства сохраняет топологию укладки, хотя и может быть искажено, периферия же может быть целиком сложена заново. Располагая единственной прародительской структурой, можно относительно достоверно моделировать консервативную часть исследуемого белка, но построить модель вариабельной части уже не удастся. Более того, непросто предсказать, какие участки являются вариабельными, а какие — консервативными. Более предпочтительна ситуация, когда несколько родственных белков с известной структурой могут выступать в качестве родителей для моделирования по гомологии. Они выявляют внутри семейства участки с консервативной и вариабельной структурой. Наблюдаемое распределение структурной вариабельности среди родительских структур диктует подходящее распределение ограничений применительно к моделированию [1]. Развитое программное обеспечение для моделирования по гомологии доступно. SWISS-MODEL — это Web-сайт, который принимает на входе аминокислотную последовательность исследуемого белка, определяет, существует ли подходящая для моделирования по гомологии родительская структура (структуры), и, если существует, выдает на выходе набор координат исследуемого белка. SWISS-MODEL разработали Т. Schwede, М. С. Peitsch и N. Guex в Женевском институте биомедицинских исследований [1, 2, 12]. В зависимости от сложности задачи, которую необходимо решить при моделировании пространственной структуры белка, интересующего исследователя, на сайте SWISS-MODEL может быть использован один из трёх возможных алгоритмов действия: автоматическое моделирование, «способ выравнивания» и «проектный способ». Эти способы отличаются по степени участия пользователя в процессе [2, 12]. Автоматическое моделирование подходит в тех случаях, когда имеется достаточно высокая степень сходства между исследуемым белком и белком, выступающим в роли матрицы (образца для сравнения). Как правило, если целевой белок и матрица имеют более 50 % идентичности в последовательностях, то автоматические «выравнивания» последовательностей являются достаточно надежными [12]. Для подачи запроса требуется только наличие аминокислотной последовательности целевого белка или кода доступа (если последовательность данного белка хранится в базе UniProt) в качестве вводимых данных. Программный пакет сервера автоматически выберет подходящие матрицы, используя предел величины Е (E-value limit) из Blast, экспериментальные данные, данные о связываемых молекулах субстратов или различные конформационные состояния белка-матрицы [12]. В зависимости от того, как планируется применять получаемую модель, обязательно нужно выбрать белок-матрицу в правильной конформации. Для чёткого определения структуры белка-матрицы пользователь может предоставить id из ExPDB), например, 1akeA, где PDB-ID - 1ake, Chain ID – А [12]. Примером автоматического предсказания с помощью SWISS-MODEL является предсказание структуры трансмембранной протеазы 3 человека (TMPRSS3), представленное на рисунке 4.Рисунок 4. Графический результат моделирования белковой структуры, осуществленный в рамках «рабочего места» на SWISS-MODEL. Типичные этапы эксперимента по моделированию: (a) Представление в «ленточной» форме трёх доменов, смоделированных для целевого белка – трансмембранной протеазы 3 человека (TMPRSS3): I, LDL рецепторный домен и II, рецептор – связывающий домен в комплексе с протеазным доменом. (b) программа IprScan последовательности целевого белка позволила обнаружить три домена в целевом белке. (c) поиск, основанный на аминокислотной последовательности, в библиотеке матриц показал наличие двух сегментов с подходящими матричными структурами (d) Представлены вторичная структура и предсказание неупорядоченности целевого белка (e) на графике представлена величина «anolea», позволяющая оценить качество окончательной модели. «Способ выравнивания» позволяет пользователю проверить несколько альтернативных выравниваний и оценить качество полученных моделей для достижения оптимального результата. «Способ множественных выравниваний» последовательности является общим средством во многих молекулярно-биологических исследованиях. Если трехмерная структура известна, по крайней мере, хотя бы для одного из родственных белков, то это выравнивание может быть использовано в качестве исходной точки для сравнительного моделирования на основе «способа выравнивания» [12]. Для облегчения использования «способа выравнивания» в различных форматах, подача данных осуществляется как трехэтапный процесс: Подготовка множественного выравнивания последовательности:Запрос должен содержать, по крайней мере, целевую последовательность и последовательность белка-матрицыНужно использовать любое из возможных средств выравнивания, например, T_COFFEE (Cedric Notredame)Убедиться в том, что у последовательностей "разумное" названияНеобходимо предоставить «выравнивание» на «рабочее место», где также указывается использованный «способ выравнивания».Возможные форматы: FASTA, MSF, CLUSTALW (рисунок 5), PFAM and SELEXМожно либо загрузить файлы, либо скопировать и вставить последовательностиОбязательно нужно правильно указать формат выравнивания, Рисунок 5. «Выровненная» последовательность белка с использованием программы CLUSTALW.Выбрать целевой белок и белок-матрицу Выравнивание (в той форме, какой оно было интерпретировано сервером) должно отражаться в нижней части страницыСценарий программы самостоятельно попытается определить правильные названия, основываясь на данных, предоставленных пользователем;Выбрать название той последовательности, которая является целевой (target template)Выбрать название последовательности, которая будет являться матрицей (template sequence, например, 1crnA), при этом совсем не обязательно в качестве названий использовать ID из PDB, можно использовать названия, которые нравятся пользователю.Необходимо определить структуру матрицы, которой принадлежит эта последовательность. Эта матрица обязательно должна быть частью библиотеки матриц ExPDB, поэтому необходимо воспользоваться библиотекой матриц SWISS-MODELТакже необходимо указать правильное название ID цепи белка-матрицы, необходимо отметить, что названия цепей должны быть указаны заглавными буквами.^ Рисунок 6. Правильно заполненная форма запроса. Сверху указано название целевой белковой последовательности, внизу последовательности-матрицы, далее располагается PDB ID белка-матрицы (1 crn в данном случае), в приведен