На правах рукописи ЖАХУР Наталия Александровна ДИФФЕРЕНЦИРОВАННЫЕ ПОДХОДЫ В ВЕДЕНИИ БОЛЬНЫХ С ПРЕЖДЕВРЕМЕННОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТЬЮ ЯИЧНИКОВ14.01.01 – акушерство и гинекологияАВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наукМосква – 2011Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации в отделении гинекологической эндокринологии^ Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор Марченко Лариса Андреевна доктор биологических наук, профессор Курило Любовь ФедоровнаОфициальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор ^ Уварова Елена Витальевна доктор медицинских наук, профессор Журков Вячеслав СерафимовичВедущее учреждение: Московский областной научно-исследовательский институт акушерства и гинекологииЗащита диссертации состоится « 17 » мая 2011 г. в 13.00 ч. на заседании диссертационного совета Д 208.125.01 при ФГУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. В.И. Кулакова» Минздравсоцразвития России Адрес: 117997, Москва, ул. Академика Опарина, д. 4.С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. В.И. Кулакова» Минздравсоцразвития России Автореферат разослан «16 » апреля 2011 г.Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук Калинина Елена Анатольевна^ ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫАктуальность проблемы Преждевременная недостаточность яичников (ПНЯ) – это патологическое состояние, характеризующееся аменореей, бесплодием, симптомами гипоэстрогении и повышенным уровнем гонадотропинов (ФСГ, ЛГ) в крови у женщин в возрасте до 40 лет [Сметник, 1997]. Встречаемость данной патологии составляет 1-3% и достигает 10% в структуре аменорей [Anasti, 1998]. По современным представлениям ПНЯ развивается вследствие недостаточной закладки фолликулов во время внутриутробного развития, нарушения их созревания фолликулов или процесса ускоренной их атрезии. Анализ причин ПНЯ показал, что численные и структурные аномалии хромосомы Х встречаются в 4,2-5,6% случаев, генные нарушения – в 13,9-30%, аутоиммунная форма заболевания – в 10-15,2% и ятрогенная – в 2-3% [Woad, 2006; Табеева, 2009]. Однако, несмотря на современные диагностические возможности, в большинстве случаев точно выявить этиологию данного заболевания крайне сложно, в связи с чем идиопатическая форма в структуре ПНЯ продолжает составлять более 50% [van Kasteren, 1999; Goswami, 2007]. В то же время встречаемость семейных форм заболевания примерно у каждой 3-4 пациентки приводит к выводу о бóльшей значимости генетических факторов в генезе преждевременного истощения фолликулярного пула. Известно, что патогенез как первичной, так и вторичной яичниковой недостаточности сводится к несоответствию скорости атрезии фолликулов в гонадах некой физиологической норме, в результате чего к возрасту менархе количество фолликулов оказывается меньше нормального или они полностью отсутствуют. Общность патогенеза этих двух состояний приводит к заключению о наличии аналогичных причин, запускающих этот патологический процесс. В последние годы появились работы, доказывающие наличие ограниченного мозаицизма 45,Х/46,ХХ в гонадах у пациенток с дисгенезией гонад и нормальным женским (46,ХХ) кариотипом в лимфоцитах [Röpke, 2004]. Хорошо известно, что для больных с ПНЯ наиболее сложной проблемой является поиск лечебных подходов в преодолении бесплодия. В литературе описаны случаи спонтанных беременностей на фоне длительного периода вторичной гипергонадотропной аменореи, однако частота их наступления крайне невысока и не преодолевает 10% барьер [Тагиева, 2005; Nelson, 2009]. Таким образом, на сегодняшний день программа ЭКО с использованием донорских ооцитов рассматривается у этой категории больных как единственный высокоэффективный метод лечения бесплодия. Однако, многие пациентки с истощенным фолликулярным резервом по социальным, религиозным или личностным мотивам настаивают на достижении беременности за счет собственной яйцеклетки. С 1990 года появились работы, свидетельствующие о возможности наступления беременности у больных с ПНЯ на фоне стимуляции овуляции при применении различных препаратов и схем, включая оральные контрацептивы, глюкокортикостероиды, гонадотропины, эстрогены, агонисты гонадотропин-рилизинг гормона (аГнРг), дегидроэпиандростерон и др. [van Kasteren, 1999; Tartagni, 2007; Mamas, 2009]. Однако особый интерес ученых всегда был направлен на два принципиальных подхода к терапии бесплодия у больных с ПНЯ. Во-первых, индукция фолликулогенеза с использованием гонадотропинов после предварительной супрессии гипофиза препаратами аГнРг, что диктуется существующей гипотезой о возможности развития резистентности яичников к экзогенным гонадотропинам при высоких уровнях эндогенного ФСГ [van Kasteren, 1999; Santoro, 2003], и, во-вторых, стимуляция овуляции на фоне дополнительной терапии эстрогенами, которые, помимо подавления повышенного уровня ФСГ, по некоторым данным, могут повышать чувствительность гранулезных клеток к действию экзогенных гонадотропинов за счет восстановления нормальной функции рецепторного аппарата [Tartagni, 2007]. В 2007 году в литературе появились обнадеживающие результаты плацебо контролируемого исследования Tartagni M. с соавт., в котором авторы провели стимуляцию овуляции гонадотропинами с предварительной терапией высокими дозами этинилэстрадиола (ЕЕ2) у больных с ПНЯ и достигли овуляции у 32% и беременности у 16% больных. Несмотря на возможность овуляции у половины больных на сегодняшний день не определена наиболее эффективная схема стимуляции яичников и не выделены клинико-лабораторные показатели, которые могли бы прогнозировать ее успешность у данной категории больных. Цель исследования: на системном и тканевом уровнях изучить патогенетические факторы развития ПНЯ, а также оценить эффективность стимуляции фолликулогенеза и разработать критерии ее успеха при данной патологии. Задачи исследования: Оценить частоту различных этиопатогенетических форм ПНЯ, используя современные клинико-диагностические и молекулярно-генетические методы обследования; Изучить половые хромосомы в интерфазных ядрах клеток из биоптатов яичниковой ткани с помощью флуоресцентной in situ гибридизации и проанализировать клинико-лабораторные особенности ПНЯ при наличии гонадного мозаицизма по половым хромосомам; Оценить возможность фолликуло- и оогенеза в ответ на стимуляцию яичников и провести сравнительный анализ эффективности и безопасности терапии гонадотропинами с предварительным подавлением гонадотропной функции гипофиза препаратами агонистов ГнРг или высокими дозами этинилэстрадиола у больных с ПНЯ; Разработать совокупность клинико-лабораторных и молекулярно-генетических факторов эффективности стимуляции яичников у больных с ПНЯ; Оценить частоту наступления беременности в программе ЭКО с использованием донорских ооцитов у больных с преждевременной недостаточностью яичников.Научная новизна Впервые проведен анализ половых хромосом непосредственно в яичниковой ткани у больных с вторичной гипергонадотропной аменореей. Показано, что для больных с ПНЯ и нормальным кариотипом в лимфоцитах крови с высокой значимостью характерны различные виды численных нарушений половых хромосом в гонадах, а в 3,4% случаев могут присутствовать клетки с хромосомой Y, которые не обнаруживаются при исследовании лимфоцитов даже с помощью FISH-анализа. Полученные результаты доказывают связь ПНЯ с наличием ограниченного гонадного мозаицизма по половым хромосомам и позволяют утверждать, что одним из возможных механизмов преждевременного истощения фолликулярного пула у данной категории больных может быть ускоренный апоптоз половых клеток, сопряженный с анеуплоидией половых хромосом в яичнике. Впервые проведен сравнительный анализ традиционной схемы стимуляции овуляции по «длинному» протоколу с предварительной десенситизацией гипофиза препаратами аГнРг и модификации инновационной схемы стимуляции яичников с применением высоких доз (0,15 мг/сут) ЕЕ2 у больных с ПНЯ. Показано, что обе схемы стимуляции имеют одинаковую эффективность в достижении овуляции, однако только использование ЕЕ2 способствует синхронизации процессов созревания фолликулов и адекватного роста эндометрия. При этом, в ответ на проводимую терапию рост фолликулов более 10 мм наблюдается у одной трети больных и у 11,1%-23,5% происходит овуляция. Впервые выделены клинико-лабораторные показатели, которые могут прогнозировать успех индукции овуляции у больных с ПНЯ. Практическая значимость Выявленная анеуплоидия половых хромосом в гонадах у больных с ПНЯ характерна для соматических клеток яичника (строма). Таким образом, наличие на тканевом уровне данной патологии не увеличивает вероятность рождения ребенка с нарушениями кариотипа и не является противопоказанием для проведения стимуляции овуляции у данной категории больных. Обнаружение у 3,4% пациенток с ПНЯ материала хромосомы Y в яичниковой ткани ставит вопрос о необходимости постоянного динамического наблюдения за данной категорией больных в связи с существующим риском развития гонадобластомы. Разработан алгоритм лечения бесплодия у больных с ПНЯ. Показано, что пациентки с поздним дебютом и семейной формой заболевания, а также с нормальной концентрацией в крови тестостерона и наличием фолликулов в обоих яичниках по данным УЗИ имеют бóльшую вероятность наступления индуцированной овуляции, в то время как любая сопутствующая аутоиммунная патология, а также выявление неслучайной инактивации хромосомы Х и периоофорита являются неблагоприятными прогностическими факторами достижения овуляции.Положения, выносимые на защиту 1. Для больных с ПНЯ характерны различные виды численных нарушений половых хромосом в гонадной ткани, при этом межтканевые различия по хромосомной конституции лимфоцитов и соматических клеток яичника выявляются у 72,4% больных. Среди вариантов анеуплоидии в гонадах преобладает моносомия Х, крайне редко (3,4%) возможно обнаружение хромосомы Y. Все выше представленное позволяет предположить, что одним из ведущих механизмов преждевременного истощения овариального пула при ПНЯ может являться ускоренный апоптоз ооцитов, идентичный таковому при типичной форме дисгенезии гонад. 2. Эффективность стимуляции яичников у больных с вторичной гипергонадотропной аменореей не зависит от используемой схемы, при этом в ответ на терапию активация фолликулогенеза наблюдается у одной трети больных, которая у 11,1-23,4% пациенток заканчивается овуляцией. Только использование этинилэстрадиола в схемах индукции овуляции у больных с ПНЯ способствует синхронизации процессов роста фолликулов и эндометрия. 3. Совокупность клинико-лабораторных показателей, включающая поздний дебют и семейную форму заболевания, а также наличие в обоих яичниках фолликулов, способных к физиологической продукции тестостерона являются благоприятными факторами индуцированной овуляции. Выявление сопутствующей аутоиммунной патологии, воспалительных изменений в яичниках и наличие неслучайной инактивации хромосомы Х относятся к неблагоприятным признакам. С наибольшей эффективностью преодолеть бесплодие у больных с ПНЯ на сегодняшний день удается только с помощью методов вспомогательных репродуктивных технологий с использованием донорских ооцитов.^ Апробация материалов диссертации Основные результаты работы доложены и обсуждены на VIII Европейском Конгрессе по Менопаузе (EMAS) (Лондон, 2009), на IV Международном Конгрессе по репродуктивной медицине (Москва, 2010) и в виде постерного доклада на XIVВсемирном Конгрессе по гинекологической эндокринологии (ISGE) (Флоренция, 2010). По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ. Обсуждение диссертации состоялось на межклинической конференции в отделении гинекологической эндокринологии ФГУ «НЦ АГиП им. В.И. Кулакова» Минздравсоцразвития России (22.10.2010) и на заседании апробационной комиссии ФГУ «НЦ АГиП им. В.И. Кулакова» Минздравсоцразвития России (15.11.2010г.).Внедрение результатов исследования в практику Комплексное обследование и принципы лечения у пациенток с ПНЯ внедрены в клиническую практику ФГУ «НЦ АГиП им. В.И. Кулакова» Минздравсоцразвития России. Материалы диссертации используются при чтении лекций по гинекологической эндокринологии.^ Структура и объём диссертации Работа имеет 6 глав, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, глав, отражающих полученные данные, обсуждение полученных результатов, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, изложена на 235 страницах компьютерного текста, иллюстрирована 31 таблицей и 30 рисунками. Список литературы включает 306 источника (36 на русском и 270 на иностранных языках).^ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫМатериалы и методыОсновная группа: 143 пациентки с ПНЯ Группа сравнения: 3 женщины с различными формами дисгенезии гонад в возрасте от 20 до 39 лет (средний возраст – 27,0±10,4 года) для определения плоидности половых хромосом в ткани гонад. ^ Группы контроля: 1) 15 здоровых фертильных женщин репродуктивного возраста для оценки гормональных параметров; 2) 15 женщин со своевременной менопаузой для оценки антиовариальных антител; 3) 10 образцов яичниковой ткани женщин, погибших при чрезвычайных обстоятельствах, в возрасте до 40 лет (в среднем – 28,4±6,3 года) для определения половых хромосом в ткани яичника.^ Критерии включения в основную группу: возраст от 18 до 40 лет, отсутствие самостоятельных менструаций 6 и более месяцев, уровень ФСГ 40 МЕ/л в двух измерениях.^ Критерии исключения из основной группы: первичная гипергонадотропная аменорея, ятрогенные причины ПНЯ (операции на яичниках, химиотерапия, лучевая терапия в анамнезе), тяжелые наследственные заболевания (галактоземия, блефарофимоз). Пациенток обследовали с использованием комплекса современных и наиболее информативных методов исследования. Общеклиническое обследование проводили по стандартной схеме, используемой в ФГУ НЦ АГиП им. В.И.Кулакова Минздравсоцразвития России, предусматривающей тщательное изучение семейного анамнеза, объективное гинекологическое исследование. Уровни гормонов (ФСГ, ЛГ, ТТГ, эстрадиола (Е2), общего тестостерона (Тобщ), ТЭСГ, кортизола, дегидроэпиандростерона сульфата, 17-оксипрогестерона, Т4св) определяли методом ИФА с помощью соответствующих тест-систем на автоматическом анализаторе «Cobar Core II». Определение в плазме антимюллерова гормона (АМГ) проводили методом ИФА с помощью коммерческих наборов DSL (США). Аутоантитела к антигенам яичника определяли методом непрямого иммуноферментного анализа (ELISA), к антигенам щитовидной железы – методом ИФА по стандартной методике. Трансвагинальное ультразвуковое исследование органов малого таза проводили на аппарате Aloka SSD 1200, 2000 Toshiba SSA-240 (Япония). УЗИ щитовидной выполняли на том же аппарате при помощи мультичастотного линейного датчика (8-10 МГц). Лапароскопию c биопсией яичников проводили с использованием инструментальной техники фирмы «Karl Storz». Морфологическое исследование биоптатов тканей яичников проводили по общепринятой методике. Кариотип в лимфоцитах периферической крови исследовали с помощью стандартной цитогенетической методики (G-окраска). Длину CAG-повтора 1 экзона гена AR и неслучайную инактивацию хромосомы Х (SXCI) определяли с помощью метилчувствительной количественной флуоресцентной ПЦР. Для определения полиморфизма гена FMR1 (премутация FRAXA) использовали изучение длины CGG-повтора методом метил-специфической ПЦР. Исследование половых хромосом в интерфазных ядрах клеток яичников, эндометрия и лимфоцитов осуществляли с помощью флуоресцентной in situ гибридизации (FISH) с центромерными пробами на хромосомы Х, Y и контрольную пробу на хромосому 18 (Abbot-Vysis, США). После проведения полного обследования нами было отобрано 35 пациенток с ПНЯ с нормальным кариотипом в лимфоцитах периферической крови, не имеющих противопоказаний к стимуляции овуляции и желающих наступления беременности. Пациентки были разделены случайным (рандомизированным) образом на 2 группы: 1-ой группе больных (n=18) была проведена традиционная схема стимуляции яичников с помощью фоллитропина альфа (αФСГ, Гонал Ф) после предварительной десенситизации гипофиза препаратом агонистов гонадотропин-рилизинг гормона (Трипторелин) («длинный» протокол); 2-ой группе (n=17) была проведена инновационная схема стимуляции овуляции также αФСГ, но на фоне приема высоких доз этинилэстрадиола, по модифицированной схеме Tartagni M. с соавт. (2007). Исследование было одобрено Комитетом по этике биомедицинских исследований при ФГУ НЦ АГиП им.В.И.Кулакова Минздравсоцразвития России.Результаты исследования и их обсуждениеНа первом этапе работы проведено клинико-лабораторное обследование 143 пациенток с ПНЯ (средний возраст 33,05±5,9 года). Семейная форма заболевания обнаружена у 29,4% (42/143) пациенток. Большинство женщин 121/143 (84,6%) до развития заболевания имели регулярный ритм менструаций, однако у 14,7% (21/143) пациенток нарушения менструального цикла были отмечены уже с менархе в виде олигоменореи. К моменту обращения в Центр и обследования длительность заболевания колебалась от 7 месяцев до 14 лет и в среднем составила – 3,5±4,3 года. Клинически начало заболевания в 80,4% (115/143) случаев проявлялось олигоменореей, в 9,1% (13/143) внезапной аменореей и в 10,5% (15/143) отмечались маточные кровотечения. Продолжительность регулярного менструального цикла имела большой разброс (от 4 месяцев до 27 лет) и в среднем составила 12,6±8,9 лет. Нарушения менструального цикла в среднем отмечены в возрасте 27,5±8,1 года, тогда как средний возраст наступления аменореи составил 29,8±7,4 года. До развития заболевания беременности имели место у 51,7% женщин (74/143). Всего у наших пациенток было 198 беременностей, из которых 115 (58,1%) закончились искусственными абортами, 14 (7,1%) – неразвивающимися беременностями или самопроизвольными выкидышами, 2 (1,0%) – преждевременными родами в 27-28 недель беременности (дети погибли), 1 (0,5%) – интранатальной гибелью плода, 1 (0,5%) – своевременными родами ребенком с множественными пороками развития и врожденным слабоумием. Только 65 (32,8%) беременностей закончились своевременными родами здоровым ребенком. Таким образом, репродуктивная функция до выключения функции яичников успешно была реализована (хотя бы одни роды здоровым ребенком) только у 35,7% (51/143) больных. При гормональном обследовании у больных из основной группы было установлено повышение уровней ФСГ и ЛГ (в среднем 105,71±35,96 МЕ/л и 66,0±41,73 МЕ/л, соответственно) и снижение концентрации Е2 (79,11±54,99 пмоль/л), что подтверждало наличие у них преждевременной недостаточности яичников. Уровень АМГ в сыворотке крови был исследован у 58 пациенток с ПНЯ и оказался ниже чувствительности метода у 79,3% (46/58) больных, а у остальных в среднем составил 0,26±0,2 нг/мл, что было значимо ниже, чем в контрольной группе фертильных женщин (2,72±0,67 нг/мл) (р Средние объемы яичников по данным УЗИ составили: правый – 2,4±1,6см3, левый – 2,4±1,8 см3, при этом у 48,3% (69/143) пациенток объем правого, а у 58,0% (83/143) женщин объем левого яичника не превышал 2 см3. В правом яичнике фолликулы выявлялись в 53,1% (76/143) случаев и в левом яичнике – в 49,7% (71/143) случаев. При этом только в одном яичнике фолликулы визуализировались у 25,2% (36/143) пациенток, в двух яичниках – у 39,1% (56/143), афолликулярный тип яичников выявлен у 35,7% (51/143). Лапароскопия была произведена 49,7% (71/143) пациенткам с ПНЯ. Согласно последующему гистологическому исследованию биоптатов яичников, несмотря на стойкую гипергонадотропную аменорею, примордиальные фолликулы были сохранены у 36,6% (26/71) больных. В результате исследования кариотипа в лимфоцитах периферической крови с помощью стандартной G-окраски его аномалии у больных с ПНЯ были выявлены в 7,7% (11/143) случаев. У 3 больных (2,1%) обнаружены численные нарушения половых хромосом – в виде моносомии хромосомы Х у 2-х больных (1,4%) и кариотипа 47,XXY у одной пациентки (0,7%). У 1,4% (2/143) пациенток были выявлены структурные аномалии хромосом – у одной в виде инверсии, затрагивающей хромосому 7 46,ХХ,inv(7)(p12;q11) и у второй в виде образования производной хромосомы Х – 46,Х,der(X). Еще у 6-ти пациенток (4,2%) имел место хромосомный мозаицизм. У одной из них 83,3% клеток содержали одну и 16,7% клеток – две хромосомы Х, одна из которых, однако была изодицентрической [45,Х/46,Х,idic(X)(p22.1)]. У трех других пациенток имел место низкий уровень мозаицизма с наличием Х моносомной клеточной линии в 10-55% клеток (45,Х/46,ХХХ) и у двух пациенток кариотип характеризовался наличием трех клеточных линий – нормальной, Х моносомной и Х трисомной (45,Х/47,ХХХ/46,ХХ). Исследование полиморфизма ^ FMR1 гена было проведено 69,2% (99/143) больным. Гетерозиготное носительство премутации гена FMR1 обнаружено в 2 случаях, что составило 2,0%. Одна из этих больных с аллельным вариантом гена FMR1 45/56 CGG-повторов страдала семейной формой ПНЯ, а другая больная имела 34/60 CGG-повторов в гене FMR1 и страдала спорадической формой ПНЯ. Увеличение числа CGG-повторов в пределах «серой зоны» (от 41 до 50) нами выявлено примерно у каждой десятой больной (11,1%, 11/99). Исследование полиморфизма гена AR и SXCI было проведено на 114 образцах крови больных с ПНЯ (79,7%), из которых информативным (гетерозиготы по гену AR) оказался 101 образец. Неслучайная инактивация хромосомы Х, косвенно указывающая на возможные нарушения в хромосоме Х, при пороговом уровне ≥80% была выявлена у 21% (21/101) больных с ПНЯ. Средние значения длин аллелей в гене AR у наших больных с ПНЯ составили 21,26±1,92 CAG-повторов в аллели 1 и 24,19±2,58 CAG-повторов в аллели 2. Показатель SBM (simple biallelic mean – cредняя длина аллелей) составил 23,05±1,85 CAG, а XWBM (X weighted biallelic mean – средняя длина аллелей, связанная с XCI), характеризующий как длину CAG-повтора, так и инактивацию несущей его аллели – 23,06±1,90 CAG.Особый интерес представляет исследование половых хромосом в интерфазных ядрах гонадных клеток с помощью FISH, которое было проведено на 31 (21,7%, 31/143) образце яичниковой ткани больных с ПНЯ, среди которых 29 имели нормальный кариотип в лимфоцитах периферической крови (46,ХХ), 1 больная имела кариотип 47,ХХY и у 1 больной выявлен мозаицизм 45,Х[30]/46,ХХ[6]. Дополнительно мы исследовали половые хромосомы у 3-х пациенток с первичной гипергонадотропной аменореей, среди которых 2 имели нормальный кариотип (46,ХХ) в лимфоцитах и одна – регулярную форму моносомии Х. В качестве контроля было исследовано 10 аутопсийных образцов яичниковой ткани, полученных от молодых женщин в возрасте 21-35 лет (средний возраст 29,1±5,6 года), погибших при чрезвычайных обстоятельствах. Выделенная группа больных с ПНЯ для исследования гонадного мозаицизма по половым хромосомам значимо не отличалась от всех обследованных больных с ПНЯ и, следовательно, изучаемые группы были репрезентативны. В результате исследования половых хромосом в ткани яичников у 29 больных с ПНЯ и нормальным кариотипом в лимфоцитах у 72,4% пациенток (21/29) обнаружены различные виды гонадного мозаицизма. Из них у 51,7% (15/29) больных имела место одна анеуплоидная клеточная линия, представленная в 31% (9/29) случаев моносомией Х и в 20,7% (6/29) случаев трисомией хромосомы Х, при этом анеуплоидия была обнаружена в 2-10% и 1-10% проанализированных клеток, соответственно. У 20,7% (6/29) оставшихся пациенток был обнаружен мозаицизм с наличием нескольких различных клеточных линий с аномальным хромосомным набором (сложный мозаицизм). У 10,3% (3/29) пациенток было выявлено наличие двух аномальных клеточных линий – в двух случаях сочетание моносомии с трисомией Х в 13% клеток и в одном случае сочетание трисомии с тетрасомией хромосомы Х в 11% клеток яичника. У 10,3% (3/29) других пациенток нами были обнаружены три клона клеток с анеуплоидией половых хромосом. Две из них имели сочетание моно-, три- и тетрасомии Х, встречающихся в 16-26% клеток. У третьей пациентки выявлено сочетание моносомии Х в 38% клеток, трисомии Х в 3% клеток и наличие в 30% клеток яичников хромосомы Y (Рис.1). У пациентки с ПНЯ и кариотипом 47,ХХY в лимфоцитах в гонадах мозаицизма обнаружено не было – все проанализированные гонадные клетки содержали две Х и одну Y хромосому (Рис.2). У другой пациентки с ПНЯ и мозаичным кариотипом 45,X/46,XX в лимфоцитах в клетках гонад также был обнаружен мозаицизм, однако доля распределения и состав клеточных клонов значительно различались. У трех из 8 (27,6%) пациенток с ПНЯ, нормальным кариотипом в лимфоцитах и высоким уровнем гонадного мозаицизма по половым хромосомам (от 10% клеток и выше), мы дополнительно исследовали половые хромосомы в ткани эндометрия, полученной при ЦУГе эндометрия. В результате исследования у всех трех больных было выявлено не более 2% эндометриальных клеток с моносомией Х, остальные исследованные клетки содержали две хромосомы Х. У пациентки с ПНЯ и наличием хромосомы Y в 30% клеток яичника, в эндометрии ни одной клетки с хромосомой Y обнаружено не было. У всех 3-х пациенток (100%) с первичной аменореей (группа сравнения) в яичниковой ткани были выявлены клеточные линии с различным набором половых хромосом. У двух пациенток с нормальным кариотипом в лимфоцитах крови в гонадах имел место мозаицизм – в одном случае простой, с наличием Х моносомного клона, а в другом случае сложный, с наличием клеток с моно- и трисомией Х, а также в 2% клеток была обнаружена хромосома Y. У пациентки с регулярной формой моносомии Х в лимфоцитах периферической крови в гонадах выявлено 28% клеток с двумя хромосомами Х, 2% клеток с тремя хромосомами Х и 50% клеток в комплексе половых хромосом имели хромосому Y. Таким образом, у одной пациентки с ПНЯ (3,4%) у 2-х больных с дисгенезией гонад в ткани гонад FISH методом были обнаружены клетки с хромосомой Y. Исходя из этого, у двух пациенток с высокой долей клеток с хромосомой Y (30 и 50%) в яичниковой ткани мы провели дополнительное исследование половых хромосом в лимфоцитах крови также FISH методом. Результаты исследования показали, что в лимфоцитах у этих больных имеет место лишь низкий уровень мозаицизма по анеуплоидии хромосомы Х (от 2 до 2,8%) и отсутствует хромосома Y.А.Б.В.Г.Д.Е. Рисунок 1. Варианты гонадного мозаицизма у больных с ПНЯ. FISH-анализ с центромерными пробами на X (СEP X, Abbot-Vysis, Spectrum Green),Y (СEP Y, Abbot-Vysis, Spectrum Orange) и 18 пару аутосом (СEP X, Abbot-Vysis, Spectrum Blue), ув. х 1000. ^ А: простой мозаицизм с наличием моносомии хромосомы Х. Б: простой мозаицизм с наличием трисомии хромосомы Х. В: сложный мозаицизм с наличием моносомии и трисомии хромосомы Х. Г: сложный мозаицизм с наличием трисомии и тетрасомии хромосомы Х. Д: сложный мозаицизм с наличием моносомии, трисомии и тетрасомии хромосомы Х. Е: сложный мозаицизм с наличием ядер с двумя хромосомами Х, с моносомией Х и ядер с одной хромосомой Х и одной хромосомой Y.^ Рисунок 2. Выделенные ядра гонадных клеток у больной с ПНЯ и 47,ХХY кариотипом в лимфоцитах. FISH-анализ с центромерными пробами на хромосому X (СEP X, Abbot-Vysis, Spectrum Green),Y-хромосому (СEP Y, Abbot-Vysis, Spectrum Orange) и 18 хромосому (СEP X, Abbot-Vysis, Spectrum Aqua), ув. х 1000. Проведение FISH-анализа половых хромосом в ткани яичников контрольной группы показало, что в 80% случаях (8/10) все клетки содержали две хромосомы Х. В двух случаях (20%) обнаружен тканевой мозаицизм: в одном случае присутствовала клеточная линия с моносомией хромосомы Х (в 39% клеток атрезирующегося фолликула) и в другом случае – с трисомией хромосомы Х в 9% клеток яичника. Анализ частоты выявления мозаицизма в ткани яичников у больных с ПНЯ и нормальным кариотипом в лимфоцитах периферической крови (72,4%, 21/29) и у больных с дисгенезией гонад (100%, 3/3) относительно контрольной группы (20%, 2/10) с высокой степенью статистической значимости (р Сравнительный анализ клинико-лабораторных характеристик больных с ПНЯ с наличием или отсутствием мозаицизма половых хромосом в яичниковой ткани показал, что ни один показатель, характеризующий анамнез и клинический статус наших пациенток, у больных с найденным мозаицизмом половых хромосом в яичниках не отличаются от аналогичных показателей пациенток без такового.Вторым этапом исследования стало проведение стимуляции овуляции гонадотропинами по двум схемам у 35 пациенток с ПНЯ. У 18 пациенток была использована схема стимуляции гонадотропинами в максимальной дозе 450 МЕ/сут с предварительной десенситизацией гипофиза аГнРг (1 группа). У 17 пациенток была применена модифицированная схема Tartagni M. с соавт. (2007) с помощью средних доз гонадотропинов (225-300 МЕ/сут) на фоне предварительной терапии этинилэстрадиолом (ЕЕ2) 0,15 мг/сут, продолжающейся весь период введения гонадотропинов (2 группа) (Рис.3). А. Б.^ Рис. 3. Схемы стимуляции овуляции в 1 группе (А) и во 2 группе (Б). Пациентки были случайным (рандомизированным) образом распределены в ту или иную группу и, как показал последующий анализ, не отличались между собой по возрасту (32,6±5,5 и 32,8±4,7 лет, p>0,05) и длительности аменореи (3,9±3,4 и 5,3±4,8 лет, p>0,05). Несмотря на использование различных по механизму действия препаратов для подавления гонадотропной функции гипофиза концентрация сывороточного ФСГ достоверно снизилась в обеих группах (с 75,9±26,2 до 14,7±8,3 МЕ/л в 1 гр., р^ Таблица 1. Сравнительный анализ двух протоколов стимуляции яичников Показатель Группа 1(n=18) Группа 2(n=17) Р* ФСГ после аГнРг или ЕЕ2 (МЕ/л) 14,7±8,3 14,0±8,8 >0,05 ^ ЛГ после аГнРг или ЕЕ2 (МЕ/л) 14,1±6,5 25,5±2,2 0,009 Е2 на фоне овуляции (пмоль/л) 724,5±108,2 1160,8±134,9 0,016 Толщина эндометрия на фоне стимуляции овуляции (макс.) (см) 0,9±0,26 1,1±0,23 0,030 Число растущих фолликулов 1,0±0 1,25±0,4 >0,05 ^ Среднесуточная доза αФСГ (МЕ/сут) 328,5±79,5 264,0±21,1 0,003 Продолжительность стимуляции (дни) 11,2±2,3 13,8±3,9 0,020 Суммарная доза αФСГ (МЕ) 3613,9±233,0 3889,7±281,5 >0,05 ^ Побочные реакции 5,6% (1/18) 76,5%(13/17) р* - критерий χ2, критерий Стьюдента.При сравнительном анализе эффективности двух протоколов стимуляции овуляции оказалось, что, несмотря на то, что в группе с использованием ЕЕ2 овуляция наступила у 23,5% (4/17) больных, а в группе с применением аГнРг только у 11,1% (2/18), статистически значимой разницы в преимуществе протокола с ЕЕ2 выявлено не было (р>0,05). Ни одной беременности не наступило. Число женщин без активации фолликулогенеза в обеих группах не отличалось (66,7%, 12/18 в гр.1 и 64,7%, 11/17 в гр.2, р>0,05), однако у оставшейся одной трети больных наблюдался рост фолликулов (Рис.4).Группа 1Группа 2 ^ Рис 4. Результаты стимуляции овуляции у больных с ПНЯПри сравнительной оценке динамики роста концентрации Е2 в двух группах были выявлены статистически значимо более низкие средние значения Е2 у пациенток в 1 гр. (Рис. 5), несмотря на дополнительную терапию натуральными эстрогенами у 77,8% (14/18) больных. При этом, известно, что на фоне приема натуральных эстрогенов, в отличие от ЕЕ2, их концентрация определяется при лабораторном исследовании, тем самым повышая реальный уровень эндогенного Е2 [Taylor, 1996]. У пациенток с зафиксированной овуляцией максимальная концентрация Е2 оказалась в среднем в 1,5 раза выше у пациенток из 2 гр., чем из 1 гр. (1160,8±134,9 и 724,5±108,2 пмоль/л, соответственно, р=0,016).******* pГруппа 1Группа 2Рис 5. Динамика концентрации эстрадиола у пациенток с ПНЯ в процессе проведения стимуляции овуляции.Корреляционый анализ показал «сильную» зависимость между диаметром максимального фолликула и максимальной концентрацией Е2 в крови (R=0,61), что подтверждает эндогенный генез высоких уровней Е2 и свидетельствует о нормальной функции преовуляторных фолликулов. Несмотря на то, что до начала протоколов толщина эндометрия в двух группах больных не отличалась (0,34±0,14 и 0,30±0,09 см, р>0,05), учитывая двухнедельный прием высоких доз ЕЕ2, продолжающийся в процессе стимуляции яичников, толщина М-эхо по данным УЗИ стала значимо больше у пациенток во 2 гр., чем в 1 гр., уже после подавления гонадотропной функции гипофиза (Рис. 6).* pсмГруппа 1Группа 2 ^ Рис 6. Динамика толщины эндометрияпо данным УЗИИспользуемая в 1 гр. среднесуточная доза α-ФСГ была в 1,5 раза выше, чем во 2 гр. (328,5±79,5 и 264,0±21,1 МЕ/сут, соответственно, p=0,003), однако в среднем меньшее число дней стимуляции в 1 гр. (11,2±2,3 и 13,8±3,9 дней, p=0,020) привело в итоге к одинаковой курсовой дозе препарата (3613,9±988,7 и 3889,7±1160,8 МЕ, p>0,05) на цикл стимуляции. При сравнении длительности стимуляции и суммарной дозы αФСГ у пациенток с овуляцией и без таковой достоверных различий выявлено не было. Применение протокола стимуляции яичников на фоне ЕЕ2 с высокой степенью статистической значимости приводило к бóльшему числу побочных реакций, чем использование традиционного «длинного» протокола. В 1 гр. побочные реакции были зафиксированы лишь у одной пациентки (5,6%) (в виде подъемов артериального давления), а во 2 гр. – у 13 (76,5%) больных (в виде повышения аппетита в 5,6%, тошноты в 17,7%, увеличения уровня печеночных ферментов в крови в 23,5% и гиперкоагуляции в 70,6% случаев). Для профилактики тромбоэмболических осложнений это потребовало дополнительного назначения пациенткам антиагрегантов – ацетилсалициловой кислоты (Тромбо-АСС, Lannacher Heilmittel, Австрия) и/или антикоагулянтов – надропарина кальция (Фраксипарин, GlaxoSmithKline, Франция). Однако, ни одного осложнения, в том числе со стороны сосудистой системы, выявлено не было. Проведенные протоколы стимуляции овуляции у больных с ПНЯ показали, что, несмотря на небольшое число успешных циклов стимуляции (11,1%, 2/18 при применении аГнРг и 23,5%, 4/17 при использовании ЕЕ2), данный контингент больных способен к восстановлению яичниковой функции в ответ на экзогенную стимуляцию фолликулогенеза. Несмотря на высокую частоту побочных реакций, в протоколе с ЕЕ2 мы наблюдали более адекватное, согласно уровням эстрадиола, развитие фолликулов и положительный эффект у бóльшего числа пациенток, что, однако, учитывая небольшую выборку, не подтвердилось статистически. Все выше представленное свидетельствует о необходимости проведения бóльшего числа циклов стимуляции у каждой пациентки, более тщательному отбору больных для уменьшения частоты побочных реакций и разработки прогностических критериев успешной индукции овуляции у больных с ПНЯ для улучшения эффективности проводимых схем стимуляции и увеличения вероятности наступления беременности. Исходя из этого, после завершения протоколов, независимо от используемой схемы стимуляции, пациентки были разделены соответственно ответу на проведенное лечение на 3 группы: группа А – пациентки без активации фолликулогенеза (23/35), группа Б – пациентки с ростом фолликулов более 10 мм, но последующей их атрезией (6/35) и группа В – больные с зафиксированной овуляцией (6/35) для проведения сравнительного анализа их клинико-лабораторных показателей. Проведенный анализ показал, что несмотря на имеющую место тенденцию к меньшей средней длительности аменореи у больных с овуляцией относительно пациенток с неэффективной стимуляцией (2,83±1,2 лет в гр. В против 5,41±1,0 лет в гр. А), статистически значимой разницы между выделенны