www.diplomrus.ru ® Авторское выполнение научных работ любой сложности – грамотно и в срок Содержание ОГЛАВЛЕНИЕ СтрВВЕДЕНИЕ...51. ВЗАИМОСВЯЗЬ СТРУКТУРЫ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ G-КЛАССА ИИХ ПРОТЕКТИВНОИ АКТИВНОСТИ (обзор литературы)...91.1. Структура иммуноглобулинов G-класса...101.1.1. Fab фрагмент...111.1.2. Fc фрагмент...131.1.3. Шарнирный регион...141.1.4. Пространственная структура...151.1.5. Подклассы IgG человека...181.2. Эффекторные функции иммуноглобулинов...201.2.1. Активация системы комплемента...211.2.2. Индукция опсонизации...211.2.3. Лигандсвязывающие участки Fc фрагмента...231.3. Механизмы функционирования иммуноглобулинов...281.3.1. Модель изменения конформации...291.3.2. Аллостерическая модель...351.4. Свободные остатки цистеина и их возможное участие в функционированииантител...41^ 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ...462.1. Материалы...462.2. Методы...472.2.1. Выделение IgGl...472.2.2. Анализ белковых и пептидных фракций...492.2.2.1. Определение концентрации белка...492.2.2.2. Гель-электрофорез...492.2.2.3. Электроблоттинг...502.2.2.4. Определение класса и подкласса иммуноглобулинов...502.2.2.5. Определение агглютинирующей способности...502.2.2.6. Аминокислотный анализ...512.2.2.1. Анализ N-концевой аминокислотной последовательности...512.2.2.8. Определение N-концевого аминокислотного остатка...522.2.3. Методы определения SH-групп и дисульфидных связей...522.2.3.1. Предварительная подготовка белка...522.2.3.2. Меркаптидирование...522.2.3.3. Алкилирование...532.2.3.4. Тиол-дисульфидный обмен...562.2.4. Получение Fab и Fc фрагментов иммуноглобулина G1...562.2.5. Определение С-концевой аминокислотной последовательности алкилированного Fab фрагмента...572.2.6. Выделение флуоресцентномеченых пептидов из гидролизата...Fab фрагмента IgGl...592.2.7. Выделение флуоресцентномеченых пептидов из гидролизата IgGl...602.2.8. Определение агглютинирующей способности модифицированного IgGl...622.2.9. Определение местоположения легкодоступного остатка цистеина...632.2.10. Методы статистической обработки данных...63^ 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ...653.1. Получение гомогенного препарата IgGl человека...663.2. Определение числа свободных остатков цистеина в IgGl человека...703.2.1. Легкодоступные остатки цистеина...713.2.2. Маскированные остатки цистеина...713.3. Локализация четырех свободных остатков цистеина в IgGl...763.3.1. Поиск свободных остатков цистеина в Fab и Fc фрагментах...763.3.2. Анализ С-концевой последовательности Fab фрагмента...803.3.3. Выделение и анализ флуоресцентных цистеинсодержащих пептидов Fab фрагмента IgGl...853.3.4. Выделение и анализ флуоресцентных цистеинсодержащих пептидов IgGl...9533.4. Определение значимости легкодоступного остатка цистеина для функционирования IgGl...953.5. Локализация легкодоступного остатка цистеина в IgGl...97ВЫВОДЫ...103^ СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ...105СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ...128ПРИЛОЖЕНИЕ Акты внедрения...129Введение ВВЕДЕНИЕАнтитела являются мощным фактором приобретенного иммунитета, обеспечивающего устойчивость организма к вирусам, бактериям, токсинам и другим патогенам. Именно они в первую очередь взаимодействуют с поступающими в организм этиотропными агентами и вовлекают в иммунный ответ молекулярные и клеточные механизмы защиты, которые без участия антител лишены возможности селективно действовать на патогены.На основании многочисленных исследований с применением методов физико-химического, белкового и иммунохимического анализов установлено, что молекула IgG состоит из двух тяжелых (Н) и двух легких (L) цепей, включающих 12 доменов, сходных по способу укладки полипептидной цепи и наличию одной дисульфидной связи в гидрофобном ядре каждого домена. Четыре полипептидные цепи сложены таким образом, что в результате образуются три большие субструктуры - две идентичные Fab области, содержащие антигенсвязывающий центр, и Fc область, осуществляющая эффекторные функции. В состав Fab фрагмента входит вся легкая цепь и N-концевая половина тяжелой цепи, в состав Fc фрагмента — С-концевые половины двух тяжелых цепей. Fab фрагменты соединены с Fc фрагментом константными участками тяжелых цепей, именуемыми шарнирным регионом [1,2].Несмотря на большой объем накопленных данных по структуре и функциям антител, до настоящего времени остается невыясненным, почему при высокой секреции специфических антител в процессе иммунного ответа последние часто не оказывают протективный эффект. Неизвестно также, за счет каких молекулярных механизмов обеспечивается динамичность молекулы IgG, необходимая для поливалентного связывания с антигеном и осуществления аллостерических структурных изменений, происходящих во второй фазе реакции антиген-антитело [3]. Предполагается, что сегментная гибкость и передача сигналов от центров связывания с антигеном Fab области к эффекторным доменам Fc области в5основном осуществляется шарнирным участком антитела [4, 5]. Отличительной особенностью этой области является высокая обогащенность остатками пролина и цистеина, которые с одной стороны придают структуре гибкость, а с другой - стабильность за счет межцепочечных дисульфидных связей [6, 7]. Таким образом, сложилось представление, что остатки цистеина в молекуле IgG выполняют исключительно каркасную функцию, обеспечивая целостность четвертичной структуры молекулы.В то же время в литературе стали появляться единичные сообщения об обнаружении свободных SH-групп в препаратах IgG [8 - 13]. Несмотря на то, что работы по определению SH-групп носят фрагментарный характер, и феномен их появления не объясняется совсем или же интерпретируется как результат разрыва лабильной межцепочечной дисульфидной связи [13, 14], эти данные заслуживают внимания, поскольку поднимают вопрос о возможном существовании, наряду с ковалентно связанными, свободных остатков цистеина, потенциально способных, в силу своей реактивности, участвовать в процессе функционирования антител.Отсутствие единой точки зрения относительно наличия в IgG свободных остатков цистеина, а также то, что в моноклональных, миеломных и генноинженерных антителах свободные остатки цистеина не обнаруживаются или выявляются в следовых количествах [11, 12], тогда как в некоторых препаратах IgG, выделенных из сывороток крови, определяется от 0.3 до 1.5 SH-групп и наблюдается уменьшение их числа при патологии [15- 17], делает актуальным проведение исследований по выяснению наличия или отсутствия свободных остатков цистеина в IgG в норме и при патологии.Целью работы явилось выяснение истинного числа свободных остатков цистеина в IgGl человека в норме, определение их локализации в полипептидных цепях и роли в функционировании антител.Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:- выделить из сыворотки крови гомогенный препарат IgGl с сохранением нативной четвертичной структуры;- разработать способ глубокой денатурации белка для тестирования всех имеющихся SH-групп IgGl с дифференциацией их по степени доступности к тиоловым реагентам;- для идентификации местоположения свободных остатков цистеина в полипептидной цепи белка разработать оптимальные условия химической модификации SH-групп с учетом степени сродства к тиоловым реагентам в отсутствие восстановителя и способ контроля эффективности алкилирования молекулы IgGl;- разработать алгоритм поиска меченых остатков цистеина, выделить индивидуальные пептиды, содержащие модифицированные остатки цистеина, и провести анализ их аминокислотной последовательности;- исследовать влияние химической модификации IgGl по остаткам цистеина на функциональную активность антител.Научная новизна работы. Впервые установлено, что наряду с четырнадцатью дисульфидными связями в IgGl человека присутствуют четыре свободных остатка цистеина. Определено, что только один из них является легкодоступным и реакционноспособным, а остальные три - в различной степени маскированы и выявляются на разных стадиях денатурации белка. Показано, что свободные остатки цистеина расположены в двух L цепях в положении 214 и двух Н цепях в положении 220. Это свидетельствует об отсутствии ковалентной связи между Н и L цепями в Fab фрагменте молекулы. Установлено, что реакционноспособный остаток цистеина расположен в Н цепи и необходим для функционирования антител; его химическая модификация приводит к потере способности антитела к поливалентному связыванию с эпитопами антигена.Полученные данные о наличии четырех свободных остатков цистеина открывают принципиально новые возможности для тестирования конформационных и функциональных состояний молекулы при действии различных физических, химических и биологических факторов.Практическая значимость работы. Результаты исследования были использованы при разработке эталона конформационного состояния молекулы IgGl в норме, применяемого в качестве контроля в тест-системах для: дифференциации антител по функциональной активности, экспресс-диагностики доклинических и клинически выраженных форм вторичной иммунологической недостаточности у больных с аллергическими, атопическими и инфекционными заболеваниями, оценки эффективности фотоиммуномодулирующей терапии; а также при разработке оптимальных параметров и режимов воздействия фотоматричных терапевтических систем на биообъект. Практическая ценность работы подтверждена актами внедрения (см. приложения).Основные результаты работы были представлены на 18th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology «Beyond the genom: Understanding and exploiting molecules and cells in the 3 rd Millennium» (Birmingham, 2000); International Symposium on Biomedical Optics (San Jose, 2000); V чтениях, посвященных памяти академика Ю.А.Овчинникова «Биоорганика-2000» (Москва, 2000); Международной конференции и дискуссионном научном клубе «Новые информационные технологии в медицине и экологии» (Гурзуф, 1998, 1999, 2001); XIII Международной научно-технической конференции «Лазеры в науке, технике, медицине» (Сочи, 2002); Международной конференции по физико-химической биологии, посвященной 70-летию со дня рождения академика Ю.А.Овчинникова (Москва, 2004).По материалам диссертации опубликовано 13 работ, в том числе 4 статьи в реферируемых журналах.1. ВЗАИМОСВЯЗЬ СТРУКТУРЫ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ G-КЛАССА И ИХ ПРОТЕКТИВНОЙ АКТИВНОСТИ (обзор литературы)Одной из центральных проблем иммунохимии является установление связи между структурой антител и их способностью к реализации двух функций - селективному распознаванию эпитопов на поверхности антигена и подключению в иммунный ответ молекулярных и клеточно-опосредованных механизмов защиты, ведущих к разрушению антигенов и патогенов и элиминации их из организма.Структура иммуноглобулинов G-класса на данный момент хорошо изучена - получены рентгеноструктурные данные не только о пространственной организации отдельных фрагментов молекулы [18 - 20] или об IgG, лишенном шарнирного региона [21, 22], но и о строении иммуноглобулина в целом [23- 25]. Несмотря на это, до сих пор не удалось получить окончательный ответ на вопрос, за счет каких механизмов происходит эффективное связывание иммуноглобулинов G-класса с Clq компонентом системы комплемента и Fey рецепторами клеток, а также за счет каких особенностей в структурной организации одни иммуноглобулины характеризуются высокой, а другие - низкой способностью активировать эффекторные функции.В настоящем обзоре приводятся данные о доменной организации молекулы IgG, структуре ее основных элементов - Fab и Fc фрагментов, шарнирного участка, их пространственном расположении и подвижности. Сравнивается структура и функциональная активность различных подклассов IgG человека. Обсуждаются эффекторные функции иммуноглобулинов, строение и местоположение лигандсвязывающих участков, роль углеводной компоненты. Рассматриваются различные механизмы функционирования антител, а также возможность существования свободных остатков цистеина и их участия в конформационных перестройках молекулы.1.1. Структура иммуноглобулинов G-классаОсновные представления о структуре иммуноглобулинов были получены еще в шестидесятые годы прошлого столетия, когда Porter [26] расщепил папаином молекулу иммуноглобулина на три фрагмента, a Edelman с соавт. [27] разделили у-глобулин человека на полипептидные цепи. В результате дальнейших исследований [28 - 30] было установлено, что молекула иммуноглобулина состоит из двух идентичных легких (около 23 к Да) и двух идентичных тяжелых (около 55 кДа) полипептидных цепей. Многочисленные работы по структуре антител показали, что в результате определенного расположения полипептидной цепи образуются домены, соединенные между собой короткими линейными участками (рис. 1.1).FabFcместорасщепления трипсиномшарнирный участок •cm-¦легкая (L) цепь тяжелая (Н) цепьCys-214 L цепи Cys-220 H цепи Cys-226 H цепи Cys-229 И цепиРис. 1.1. Структура молекулы иммуноглобулина G1 человека, по [31].10Все домены иммуноглобулинов представляют собой компактную глобулярную структуру с характерной упаковкой полипептидной цепи, названной «иммуноглобулиновой укладкой» [32]. Каждый домен состоит из стабильно расположенных, гидрофобно связанных, антипараллельных [3-складчатых слоев, формирующих бислойную структуру. В вариабельных доменах такая структура сформирована девятью отрезками, в константных -семью. Две Н и две L цепи формируют молекулу, объединяющую три субструктуры - два идентичных Fab фрагмента, отвечающих за связывание с антигеном, и один Fc фрагмент, обеспечивающий эффекторные функции антител. Fab фрагменты соединены с Fc фрагментом шарнирным регионом, представляющим собой константный участок тяжелой цепи, богатый остатками цистеина и пролина (рис. 1.1). Рассмотрим структуру составляющих IgG фрагментов подробнее.1.1.1. Fab фрагментПри исследовании структуры Fab фрагмента [33] было обнаружено, что он состоит из двух дискретных глобулярных участков, названных V — от «вариабельный» и С — от «константный». Каждый такой участок образован парой гомологичных доменов VH-VL и CH-CL, соответственно (рис. 1.1). Было также выявлено, что обе глобулярные области представляют собой непрерывные и независимые сгустки электронной плотности вытянутой формы, соединенные коротким отрезком полипептидной цепи.В результате анализа более 60 структур Fab фрагментов человека и мыши, полученных методом кристаллографии с разрешением от 4 до 1.85А было показано, что как вариабельные (VL и VH) так и константные (CL и СН1) домены образуют компактные модули с поверхностью контакта в среднем 1420А2 и 17ЮА2, соответственно [2]. Эта величина незначительно варьирует для разных антител и не зависит от наличия или отсутствия межцепочечной дисульфидной связи. Так, в результате алкилирования остатков цистеина, которые, образуют ковалентную связь между Н и L цепями IgG человека, размер Fab фрагмента молекулы не менялся. Этот факт,11по-видимому, объясняется прочными междоменными взаимодействиями, которые обеспечиваются большим количеством гидрофобных аминокислот, расположенных на внутренней поверхности субъединиц [34].Относительное положение вариабельного и константного модулей описывается углом между плоскостями VL-VH и CL-CH1, называемым «углом изгиба» или «локтевым углом». Эта величина характеризует форму Fab фрагмента и подвижность составляющих его доменов. Среднее значение локтевого угла Fab фрагмента варьирует у разных IgG человека от 129.9° (в белке New [35]), до 174.9° (в иммуноглобулине 3D6 [36]). Замечено также, что величина локтевого угла может быть различной для двух Fab фрагментов одной молекулы, что, вероятно, является результатом различной упаковки полипептидной цепи в кристалле и вносит определенный вклад в асимметрию молекулы. Так, в IgG2a 231 угол изгиба одного Fab фрагмента составляет 143°, а другого - 159° [37, 38]. Аналогичное явление замечено и в кристаллах Fab фрагментов других молекул [39-41].Fv фрагмент молекулы иммуноглобулина. Вариабельные домены Fab фрагмента VL и VH расположены очень близко друг к другу, образованный ими модуль - Fv остается в собранном виде даже будучи синтезированным отдельно от всей молекулы, что подтверждает представления о прочности нековалентных междоменных связей [42]. Отрезки полипептидных цепей, формирующие VL и VH домены, состоят из гипервариабельных и константных участков. Гипервариабельные участки, ответственные за комплементарное связывание с антигеном, располагаются обычно в виде трех петель (по 5-10 аминокислот в каждой) на N-концевой части Fv фрагмента, где они формируют площадку размером около 2800 А2. Форма и размер такой площадки полностью зависит от природы и количества образующих ее аминокислот: она может быть выпуклой или вогнутой [43], содержать карманы [44] и расщелины [45].Кристаллографические исследования структуры антител (как изолированных, так и в комплексе с лигандом) показали, что структура вариабельного участка меняется в результате связывания с антигеном [46 -1249]. Следовательно структура антигенсвязывающих участков не является жесткой, скорее наоборот, она пластична и может принимать различные конформации в зависимости от внешних воздействий.Таким образом, нековалентные связи Fab фрагмента с одной стороны позволяют удерживать полипептидые цепи, а с другой - не ограничивают их подвижность, необходимую для функционирования молекулы.1.1.2. Fc фрагментFc фрагмент иммуноглобулина состоит из двух пар константных доменов СН2 и СНЗ (рис. 1.1). Домены СНЗ расположены рядом и формируют компактную глобулу, напоминающую по своей структуре доменные пары Fab фрагмента. Взаимодействие между СНЗ доменами прочное, оно обеспечивается более чем 20 парами аминокислотных остатков; площадь контакта составляет около 2000А2 [2]. СНЗ домены, синтезированные отдельно, образуют прочный нековалентно связанный димер [50]. Методом электронной микроскопии установлено, что в результате восстановления и алкилирования единственной дисульфидной связи шарнирного региона иммунгоглобулина кролика, молекула остается тетрамером исключительно за счет взаимодействия СНЗ доменов [51].По сравнению с другими доменами молекулы иммуноглобулина, СН2 домены уникальны по своей организации, что обеспечивается двумя ветвями углеводных цепей, расположенными между полипептидными цепями. Олигосахариды, связанные с консервативными аминокислотными остатками аспарагина (Asn-297), стабилизируют и разделяют домены, не имеющие между собой нековалентных связей [52]. Благодаря этому СН2 домены оказываются подвижными, характеризуются более низким кристаллографическим разрешением, чем расположенные рядом СНЗ домены [38, 53, 54], и являются более лабильными при изменении рН [55]. Предполагается, что такая подвижность СН2 доменов может вносить вклад в асимметрию, заметную в структуре Fc фрагмента и молекулы IgG в целом [53, 56, 57].13Локтевой угол Fc фрагмента образован пересечением плоскостей доменов СН2 и СНЗ. В IgGl человека, не связанном с лигандом этот угол близок к развернутому и в среднем равен 177° [13, 53].1.1.3. Шарнирный регионШарнирный регион молекулы иммуноглобулина обычно разделяют на три структурно различных участка, обозначаемых как верхний, средний и нижний шарнирные участки [1,4].Табл. 1.1.Аминокислотные последовательности шарнирного участка иммуноглобулинов G-класса человека [58]Шарнирный участокверхний средний нижний21* 231IgGl EPKSCDKTHT СРРСР APEILGGPIgG2 ERK CCVECPPCP APPVA GPIgG3 FXKTPLGDTTHT CPRCP APELLGGP(EPKSCDTPPPCPRCP)x-,IgG4 ESKYGPP CPSCP ' APEFLGGPВерхним шарнирным участком называют пептидную область, находящуюся между С-концом СН1 домена и первым остатком цистеина шарнирного региона, образующего дисульфидную связь между тяжелыми цепями иммуноглобулина [1] (табл. 1.1). Последовательность аминокислотных остатков с 221 по 225 представляет собой открытый участок полипептидной цепи [13], является доступной для растворителей и характеризуется пониженной структурной стабильностью. Благодаря этим свойствам верхний шарнирный участок обеспечивает гибкость Fab областей иммуноглобулина [59, 60]. Исследования IgG2a мыши, проведенные методом ядерного магнитного резонанса, показали, что гибкость верхнего шарнирного региона имеет "мозаичный" характер [61].14Средний шарнирный участок располагается между С-концом верхнего шарнирного региона и остатком аланина (А1а-231). В зависимости от подкласса иммуноглобулина в этой области находится различное количество остатков цистеина, образующих дисульфидные связи между тяжелыми цепями, что придает жесткость этому участку. Средний шарнирный участок IgGl человека содержит две пары аминокислотных остатков цистеина, которые могут образовывать две дисульфидные связи. Однако, только одна межцепочечная дисульфидная связь была обнаружена в структуре рекомбинантного IgGl Ь12 - первого иммуноглобулина человека, молекула которого была закристаллизована и расшифрована полностью [13]. Остатки Cys-226 этой молекулы ковалентно связаны между собой, а остатки Cys-229 разделены. Авторы отмечают, что такое состояние цистеинов может являться как особенностью структуры конкретной молекулы, так и результатом возможной ошибки в ходе кристаллизации или расшифровки структуры. Остатки цистеина в среднем шарнирном участке окружены большим количеством остатков пролина, образующих полипролиновую спираль [59, 60, 62]. Верхний и средний шарнирные участки кодируются отдельным экзоном и называются "генетическим шарнирным участком".Нижний шарнирный участок кодируется в СН2 экзоне. Исследования структуры IgG методом ядерно-магнитного резонанса показали, что именно нижний шарнирный регион обеспечивает высокую подвижность Fc фрагмента [5]. Впервые структура этого участка была показана сравнительно недавно в результате рентгеноструктурного исследования Fc фрагмента IgGl человека, связанного с FcgRIII рецептором [56]: установлено, что нижний шарнирный участок представляет собой вытянутую структуру с различиями в торзионных углах между двумя цепями.1.1.4. Пространственная структураНа сегодняшний день проведено более 200 структурных исследований различных участков иммуноглобулинов (в основном Fab фрагментов) однако целиком удалось закристаллизовать лишь десять антител: Dob [63], Meg [64],15Kol [65], Zie [66], mAb 231 [37, 38], mAb 4B7 [67], mAb 24-404.1 [68], mAb 61.1.3 [24], IDEC 151 [69] и IgGl bl2 [25]. При этом полный или частичный анализ структуры был проведен лишь для семи из них. Структура не была определена для антител mAb 4B7, mAb 24-404.1, IDEC 151.Антитела Dob и Meg представляют собой миеломные белки человека подкласса IgGl, с дилецией в шарнирном участке молекулы и дисульфидной связью между легкими цепями иммуноглобулина. Такое антитело имеет ограниченную конформационную подвижность и практически не проявляет эффекторные функции [21, 70]. Анализ кристаллической структуры показал, что молекулы Dob и Meg компактны, симметричны и имеют Т-образную форму [21, 71].Антитела Kol и Zie также представляют собой IgGl человека. Эти молекулы обладают шарнирным участком, но для них удалось расшифровать лишь структуру Fab фрагментов, а также верхнего и среднего шарнирных участков, в то время как область, соответствующая нижнему шарнирному участку и Fc фрагменту, характеризовалась низкой плотностью [60, 65, 66, 72].Фактически, анализ кристаллической структуры целой молекулы иммуноглобулина с полноразмерным шарнирным участком был проведен лишь для трех антител:mAb 231 - моноклональный IgG2a мыши, полученный против неизвестного антигена на поверхности клеток лимфомы собак [37, 38];mAb 61.1.3 - моноклональный IgGl мыши, полученный против молекулы фенобарбитала [24];IgGl Ь12 - генноинженерный IgGl человека, полученный против белка HIV-1 gpl20 [13, 25, 73] является пока единственным целым иммуноглобулином человека, где карта электронной плотности читается одинаково хорошо для всех доменов молекулы.Несмотря на то, что кристаллические структуры молекул IgG различаются между собой (рис. 1.2), они позволяют получить представление о широком спектре конформаций, возможных для антител, и проследить16*некоторые структурные закономерности. Так, в трех молекулах иммуноглобулина человека (Kol, Meg и Ь12) легкая цепь расположена в нижней части Fab фрагмента, ближе к Fc участку, тогда как в обеих молекулах иммуноглобулинов мыши легкая цепь находится вверху, дальше от Fc фрагмента (рис. 1.2). Указанные различия могут быть следствием случайного варьирования или же могут отражать особенности Fab фрагментов антител разных видов, полученных из разных источников.mAb 231mAb 61.1.3Рис. 1.2. Сравнение структур пяти молекул иммуноглобулинов G-класса [13]. Синим цветом обозначена тяжелая цепь IgG, красным - легкая цепь.*Важно отметить, что все три молекулы, закристаллизованные полностью, оказались асимметричными. Таким образом, несмотря на то, что две легкие и две тяжелые цепи иммуноглобулинов идентичны по аминокислотной последовательности, они не одинаковы по четвертичной структуре. До настоящего момента убедительное объяснение этому факту найдено не было.17Список литературы