Инкубация Agrobacterium tumefaciens

СОДЕРЖАНИЕ


стр.
Список сокращений

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Использование Ti-плазмид агробактерий в генетической инженерии

1.1.1. Краткая характеристика Agrobacterium tumefaciens

1.1.2. Cоздание векторов на основе Ti-плазмид

1.1.3. Процессинг тДНК в бактериальной клетке
и ее перенос в клетки растений

1.1.4. Разработка система трансформаций растений с
помощью Agrobacterium tumefaciens

1.1.5. Проблема сохранения чужеродных генов,
перенесенных в растение

1.1.6. Анализ экспрессии чужеродных генов в трансформированных растениях

1.2. Использование метода генетической
инженерии для трансформации однодольных растений

1.2.1. Краткие характеристики ряски

1.3. Сигнальные молекулы, их способность индуцировать процессинг тДНК

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Материалы

2.1.1. Оборудование

2.1.2. Бактериальные штаммы и плазмиды

2.1.3. Растения

2.1.4. Среды микробиологические для
культивирования растений

2.1.5. Другие растворы

2.1.6. Ферменты, используемые в генной инженерии

2.1.7. Антибиотики

2.2. Методы

2.2.1. Инкубация Agrobacterium tumefaciens с
экссудатами тканей растений

2.2.2. Выделение тотальной ДНК Agrobacterium tumefaciens

2.2.3. Блод-гибридизация тДНК по Саузерну

2.2.4. Трансформация клеток Esherichia coli

3. РЕЗУЛЬТАТЫ

4. ОБСУЖДЕНИЕ

5. ВЫВОДЫ

ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЕ


СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
НУК – нафтиуксусная кислота
БАП – бензиламинопурин
MS –
LB –
тДНК –
Ар – ампицилин
Cs – цефотоксин

ВВЕДЕНИЕ
Актуальность работы:
Свойство бактерий вида Agrobacterium tumefaciens вызывать у растений корончато-галловую болезнь связано с присутствием в их клетках крупных (95-156 мДа) конъюгированных Ti-плазмид (от англ. tumor-inducing – вызывающий опухоль). В процессе идентифицирования растений часть генетического материала Ti-плазмид – тДНК (от англ. transferred DNA – передаваемая) перемещается в растительные клетки и интегрируется в хромосомы, оставаясь частью наследственного материала. Гены тДНК экспрессируются в трансформарованных растительных клетках, нарушают их фитогормональный баланс и определяют синтез специфических ------- соединений.
Таким образом, агробактерии являются природными "генными инженерами", осуществляющий поразительный по филогенетической дальности перенос генетической информации. На основе агробактерий сконструированы эффективные векторные системы для генетической инженерии растений.
Агробактириальная трансформация происходит в результате сложного процесса взаимодействия между бактериальными и растительными клетками. В этом процессе одной из решающих стадий является рецепция агробактериями особых сигнальных молекул, присутствующих в экссудатах поврежденных тканей растений. Сигнальные молекулы индуцируют экспрессию генов области vir (агробактериальных Ti-плазмид), контролирующих вырезание тДНК и ее перенос в клетки растений. Агробактерильная трансформация наблюдается у широкого круга голосеменных и двудольных растений, однако, она отмечена лишь у весьма незначительного числа однодольных растений. Одной из причин ограничений агробактериальной трансформации однодольных считается присутствие в их клетках сигнальных молекул, индуцирующих процессинг и перенос тДНК.
Цель работы:
В настоящее время имеются противоречивые данные относительно наличия таких сигнальных молекул у однодольных растений. В связи с этим, целью данной работы был анализ ряски на присутствие у них сигнальных молекул, индуцирующих процессинг тДНК.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Использование Ti-плазмид агробактерий в генетической инженерии растений
1.1.1. Краткая характеристика Agrobacterium tumefaciens

За последнее десятилетие в области генетической инженерии растений достигнуты значительные успехи. Были разработаны разнообразные методы генетической трансформации и, в настоящее время осуществлена экспрессия чужеродных генов в растениях многих видов. Наиболее важным для развития генетической инженерии растений было открытие молекулярных основ опухолевых образований с помощью Agrobacterium tumefaciens [7].
Вирулентные штаммы Agrobacterium tumefaciens (сем. Rirobiaceae) характеризуются присутствием в клетках большой плазмиды, так называемой Ti-плазмиды, весом более 150 т.п.н. (см. Приложение) [9].
Агробактерии вызывают опухолевый рост у многих двудольных и голосеменных, а так же у некоторых однодольных растений [2,3]. Для инфицирования in vivo необходимо повреждение тканей растения [12].
После прикрепления к клеточной стенке растительной клетки агробактерии переносят часть Ti-плазмиды (так называемой тДНК) в ядро, где происходит ее стабильная интеграция в хромосому растения.
Доказано, что функция распознавания клеток и прикрепления к ним, а так же вырезание, перенос и, возможно, интеграция тДНК в растительный геном кодируется двумя хромосомными генами – Chva и Chvb [13] и рядом генов vir-области, находящихся на Ti-плазмиде [14].
После переноса в ядро растительной клетки, тДНК может интегрировать в геном в виде одной или нескольких копий [15]. Встроенная тДНК имеет свойства, характерные для ДНК эукариот, что показано в экспериментах по гиперчувствительности к ДНК-азе I (Schafer, 1984). В зависимости от типа Ti-плазмиды, в тДНК находится от семи до тринадцати генов, ответственных за опухолевый фенотип. Гены 1 и 2 кодируют ферменты, участвующие в синтезе ауксина, индолилуксусной кислоты, в то время, как ген 4 кодирует изопентенилтрансферазу, синтезирующую цитокинин изопентенила денозин 5'-монофосфат [16].
Одновременная транскрипция генов 1,2 и 4 приводит к повышению уровня фитогормонов внутри трансформированных клеток. Результатом этого является повышение митотической активности и образование опухоли. Другие гены тДНК кодируют синтез так называемых опинов, из которых наиболее изучены нопапин и октопин. Опины представляет собой производное аминокислот и сахаров, которые служат источником питания для агробактерий [14]. В целом, образование корончатого галла представляет собой хорошо охарактеризованный пример генетической инженерии растений в природе.
Мутации в вирулентных генах агробактерий. Наличие Ti-плазмид в клетках агробактерий является абсолютно необходимым условием патогенности микроорганизма. Излеченные от Ti-плазмид штаммы агробактерий авирулентны. На вирулентность Agrobacterium tumefaciens оказывают влияние различные мутации, картируемые как на опухолевых плазмидах, так и на хромосомах. Ранние этапы взаимодействия агробактерий с растениями, так же как хемотаксис, прикрепление к поверхности растительной клетки и специфическое связывание в центрах инфекции контролируются генами, имеющими хромосомную локализацию. В хромосоме расположены некоторые гены, регулирующие экспрессию vir-генов Ti-плазмид [19]. Присоединение агробактерий к клеткам растения является одним из первых этапов, определяющих эффективное взаимодействие. Этот этап у Agrobacterium tumefaciens контролируют два связанных между собой хромосомных локуса Chva и Chvb, размерами 1,5 kb и 5kb, соответственно [Дуглас и др, 1985]. Гены этих локусов экспрессируются конститутивно. В результате транспозонного мутагенеза этих областей получают авирулентные или дефекнтые по прикреплению агробактерии. Мутации в этих локусах сильно понижают или ингибируют вирулентность бактерии, но не для всех хозяев. Локус Chvb определяет синтез нейтрального циклического ?-D-гликана, который трансформируется в периплазматическое пространство клетки с помощью продукта гена Chva. Роль нейтрального ?-D-гликана в инфекционном процессе еще точно не установлена. Помимо циклического ?-D-гликана в прикреплении патогенных агробактерий к растительным клеткам принимают участие и другие полисахариды, в частности внеклеточные экзополисахариды.
Организация vir-генов Ti-плазмид. Вирулентные гены агробактерий на Ti- и Ri-плазмидах кластеризованы в области vir разметом около 30-35 kb, проявляющей в этих плазмидах значительную гомологию ДНК. Выявлена также гомология vir-генов Ti-плазмид Agrobacterium tumefaciens с tra-генами конъюгитивных плазмид. В ----- Ti-плазмидах в области vir локализовано шесть различных групп комплементации A, B, C, D, E и G, организованных в единый регулон [Stachel Nester, 1986]. Октопиновая Ti-плазмида Arh 5 имеет дополнительный локус vir F, расположенный справа от локуса vir E [Kooykaas et al., 1984]. Мутации в генах и --------- vir A, vir G, vir B и vir D придают агробактериям авирулентный фенотип, в отличие от большинства хромосомных мутаций, имеющих круг трансформируемых растений-хозяев.
Продукты генов vir-области контролируют процессинг тДНК в бактериальной клетке, ее перенос в растительную клетку и интеграцию в ядерный геном растения, причем эти процессы гены vir могут определять не только в цис, но и в транс положении по отношению к тДНК (то есть находясь в разных репликонах). Исходя из этого свойства области vir, сконструированы и успешно используются в практике удобные бинарные векторы для генетической инженерии растений [Дрейпер с соавт, 1991]. Для процессов "вырезания" тДНК из плазмиды (точнее, высвобождения в процессе репликативного синтеза) и ее переноса в растение необходимо фланкирование этой области особыми границами: несовершенными прямыми повторяющимися последовательностями ДНК размером 24 ---- , проявляющими значительную гомологию у всех изученных Ti- и Ri-плазмид. Границы тДНК гомологичны области oriT конъюгативных плазмид. В этой области сайт-специфические эндонуклеазы производят одноцепочечный разрыв, служащий началом репликации по типу разматывающегося рулона, происходящей в процессе транспорта плазмиды. Репликация обеспечивает сохранение плазмиды в материнской клетке и появление ее копии в дочерней.
Для нормального процессинга тДНК и ее переноса в растительную клетку особенно важна ее правая граница, которая одна может определять полярность переноса тДНК. Удаление правой границы из Ti-плазмид делает агробактерии полностью авирулентными. Замена ее на искусственно синтезированную, так же как и на левую, восстанавливает вирулентность микроорганизма.
На процессинг тДНК в клетках бактерий влияют мутации в генах vir D, vir C и vir E – оперонов, на транспорт т-комплекса в растительную клетку – мутации в генах vir B и vir D – оперонов.

1.1.2. Создание векторов на основе Ti-плазмид

В начале восьмидесятых годов были сделаны первые попытки перенести чужеродные последовательности ДНК в растительные клетки либо с помощью транспозонного мутагенеза [Uernals-teens et al., 1980], либо путем сайт-специфической миграции генов в тДНК и последующей двойной рекомбинацией с Ti-плазмидой дикого типа [Matrke et al., 1981; leemans et al., 1981]. Однако, эти ранние эксперименты, основанные на двойной рекомбинации, занимали много времени, были довольно сложны и трансформации проходили с очень низкой частотой. Необходимо было разработать более эффективные векторы, чтобы облегчить генетические манипуляции с бактериями и позволить селекцию и регенерацию трансформатов.
Сейчас используют две принципиально разные системы для введения чужеродных генов в растения с помощью Ti-плазмид:
1. ---- векторы
2. бинарные векторы.
В основе создания -------- векторов лежит тот факт, что гены тДНК не ------- для растительных клеток, и любая последовтельность ДНК, встроенная между границами тДНК, может интегрировать в хромосому растительной клетки и нормально там экспрессироваться [Zambryski et al., 1983]. В -------- векторых системах тДНК можно заменить, например, на последовательность pBR322, а чужеродную ДНК, которую предполагается перенести в растения, нужно проклонировать в этом же векторе.
Затем путем гомологичной рекомбинации эта чужеродная ДНК может быть перенесена на Ti-плазмиду реципиентного штамма агробактерии (рис. 2). Одним из первых таких векторов на основании Ti-плазмид авляется pGV3850 [Zambryski et al., 1983]. В нем все гены, ответственные за синтез фитогормонов, были заменены на последовательность pBR322.
ДНК pBR322 обеспечивала гомологию для ------- области тДНК pGV3850 с любыми производыми pBR, несущими клонированный ген.
Гены, кодирующие различные маркерные белки для быстрого отбора трансгенных растений, были встроены в pGV3850 [De Blocle, 1984]. Была разработана система трехродительного скрещивания для переноса любых производных pBR322 из E. coli в A. tumefaciens pGV3850 [Van Haute et al., 1983]. В настоящее время сконструированы и успешно используются и другие --- ---------- векторы на основе Ti-плазмид [Royers et al., 1988].

Рис. 2.
Схемы -------- (А) и бинарной (Б) векторных систем. VIR – область вирулентности. HOM – области гомологии, в пределах которых может происходить рекомбинация, приводящая к образованию коинтегратов. LB и RB – левая и правая границы тДНК. MCS - ----- сайт для клонирования. РТМ – маркет трансформации для растений. RES – маркер устойчивости к антибиотику для бактерий. OriT – начало переноса и bom-сайт для мобилизации векторов при конъюгации. Col E1 – начало репликации из плазмиды Col E1. RK2 – начало репликации из плазмиды широкого круга хозяев RK2.

Система бинарных векторов основана на том, что область тДНК и гены vir могут распологаться на разных плазмидах [Hockemu et al., 1983]. В таких системах обычно присутствуют два элемента:
1) Ti-плазмида-помощник, в которой тДНК польностью делетирована. Эта плазмида несет в своем составе гены vir, действующие in trans.
2) Плазмида широкого круга хозяев, имеющая сайты для клонирования и маркерные гены для селекции растений, ограниченные правой и левой фланкирующими последовательностями тДНК [An et al., 1988] рис
Обе описанные выше системы векторов предполагают --------- этапах сборку нужных конструкций в промежуточных векторах, например в pAP2034 [Veltena, Sehell., 1987] или pRT103 [Topter et al., 1983] а затем перенос из в готовом виде в рецепиентные штаммы агробактерий.

1.1.3. Процессинг тДНК в бактериальной клетке
и ее перенос в клетки растений
Формы процессированной тДНК. При культивировании Agrobacterium tumefaciens с механически поврежденными частями растений, регенерирующими протопластами или в присутствии --------- из клеток бактерий можно выделить различные молекулярные формы процессированной тДНК – одноцепочечные линейные, двуцепочечные линейные и двуцепочечные кольцевые, которые могут претендовать на роль посредника в переносе генетического материала в растительную клетку [-------, 1980]. Причем кольцевая форма, образующаяся за счет гомологичной рекомбинации между правой и левой границей тДНК с образованием одной гибридной границы, встречается в очень малых количествах. При ее образовании не происходит репликативного синтеза ДНК, в то время как в случае образования двух других форм, возможно прохождение репликации тДНК в бактериах в процессе ее транспотра в растения (к появлению одноцепочечных форм может приводить прерывание, ингибирование прерывистого синтеза запаздывающей цепи). Репликация призвана обеспечить сохранение тДНК в исходной Ti-плазмиде, если только не допустить возможность существования физического вырезания материала тДНК из Ti-плазмид за счет образования двухцепочечных разрывов в границах. Исчезновение тДНК из Ti-плазмид является главным недостатком отошедшей на второй план подобной "эксцезионной модели". Тем не менее, образование двуцепочечных разрывов внутри границ и появление детектируемых количеств линейной двуцепочечной формы тДНК при культивировании бактериальных клеток в присутствии ---------- исследователи наблюдали уже через 30 минут после добавления этого индуктора в среду. Так же в условиях индукции vir-генов --------- в клетках агробактерий обнаруживается линейная одноцепочечная форма процессированной тДНК [Stachel et al., 1986].
Появление этого интермедиата обнаруживается через восемь часов после добавления индуктора, и его количество накапливается на протяжении последующих 40 часов более, чем в два раза, а затем идет на убыль, показывая, что процесс лимитирован.
Какая из форм транслоцируется через бактериальную мембрану в бактериальную клетку до сих пор остается не выясненным из-за трудности определения относительного количества каждой из форм и выявления динамики их превращения. Возможно, процессинг и транспорт тДНК не разобщены во времени и идут сопряженно подобно конъюгационному переносу плазмид, происходящему в месте контакта мембран конъюгирующих клеток [Clark and Warren, 1979]. Тогда все обнаруживаемые интермедиаты могут быть аберрантными формами прерванного на каком-то этапе неделимого процесса (или неправильно завершенного). В случае индуцированной экспрессии vir-генов ------- отсутствует главный элемент взаимодействия – контакт бактериальной клетки и растительной клетки, и, поэтому, все обнаруживаемые в этом случае формы могут претендовать на роль посредника лишь с определенными допущениями. Достоверно известно, что в растительную клетку попадает только одна цепь тДНК и конвертируется в двуцепочечную уже в растительной клетке. Обсуждается, что в случае прохождения в клетке Agrobacterium tumefaciens -------- полуконсервативной репликации тДНК вторая цепь может в процессе переноса гидролизоваться, высвобождая энергию для транспорта переносимой цепи.

1.1.4. Разработка система трансформаций растений с
помощью Agrobacterium tumefaciens

Большинство первоначальных экспериметнов по генетической трансформации растений было предпринято с помощью заражения пораненных растительных клеток с помощью агробактерий с немодифицированными Ti-плазмидами. Для сохранения стерильности часто инфицировали эксплантаты in vitro вместо целых растений. Бактерии затем удаляли, добавляли в среду цефотоксин или карбенициллин. Трансформанты отбирали на безгормональной среде.
В дальнейшем по мере создания обезоруженных векторов и новых селективных маркеров, был разработан более эффективный метод, дающий большое число трансформантов: кокультивирование агробактерий с растительными протопластами либо с эксплантантами листьев. Было показано, что кокультивирование протопластов с агробактериями, либо с бактериальными --------, приводит к образованию опухоли [Marton et al., 1979, Wullems et al., 1981]. Затем подобный подход был успешно применен для трансформации растительных клеток агробактериями, несущими в составе тДНК химерные селективные маркеры [Fraley et al., 1983, Herrera-Estrella et al., 1983].
Этот метод был в дальнейшем улучшен использованием так называемых фидерных культур [Fraley et al., 1983]. Однако, все перечисленные методы пригодны только для трансформации растений, которые можно легко регенерировать из протопластов (например, табак и петуния). Эту проблему мрожно легко преодолеть кокультивируя агробактерии с листовыми дисками вместо протопластов [Horch et al., 1985; Rogers et al., 1986; Lloyd et al., 1986]. Стерильные листовые диски --------- с агробактериями, несущими в составе обезоруженного вектора какой-либо селективный маркер устойчивости к антибиотику. Затем кусочки листьев культивируют два дня на фидерных чашках со средой для образования побегов. После этого их переносят на среду с цефотоксином для уничтожения бактерий и с каким-либо антибиотиком (например, с ---------) для отбора трансформантов. Регенерировавшие побеги дают корни, после чего растения переносят в почву для проведения дальнейших экспериментов.
Поскольку метод трансформации листовых дисков представляет собой идеальное сочетание высокой частоты трансформации с легкой и быстрой ------- и регенерацией трансформантов, этот подход стали использовать во многих лабораториях мира. Кроме того были предложены некоторые модификации метода. Для повышения частоты трансформации листовых дисков Arabiodopsis было предложено обрабатывать агробактерии --------- [Sheikholeskam a. Week S, 1987], который является индуктором генов vir [Stachel et al., 1985]. Однако метод трансформации листовых дисков применим для трансформации только тех видов растений, которые могут регенерировать побеги из недифференцированных клеток в месте поранения.
Наряду с методом трансформации листовых дисков широко используются конъюгированные агробактерии со стеблевыми сегментами [An et al., 1986], клетками суспензированной культуры [Scott a. Draper, 1987], микрокаллусами [Pollock et al, 1985] и прорастающими семенами [Feldmam a. Markis, 1987]. Метод трансформации семян агробактериями был впервые применен для арабидопсиса и заслуживает особого внимания, так как не требует работы с культурой ткани.

1.1.5. Проблема сохранения чужеродных генов, перенесенных в растение

Чужеродные ДНК, перенесенные в растительные клетки с помощью различных методов, обычно встраиваются в ядерный геном и наследуются в соответствии с законами Менделя [De Block et al., 1984; Horsch et al., 1984]. Области ингерации, по видимому, распределены случайным образом по геному. Встраивание генов по определенным сайтам было ранее описано в системах животных клеток [Smithies et al., 1985; Maniatis, 1985] и недавно подобный подход был успешно применен для трансформации растений [Paszkowski et al., 1988].
В большинстве случаев последовательности чужеродной ДНК встраиваются в один локус либо в одной копии, либо в виде кластера тандемных вставок, что было показано с помощью гибридизации in situ [Mouras et al., 1986]. Однако, часто наблюдаются множественные вставки в два или более участков на разных хромосомах [De Block et al., 1984; Peerbolte et al., 1986a, b; Feldmann a. Marus, 1987]. В связи с этим во многих случах была получена контрансформация физически несцепленных генов, сегрегация некоторых проходила в поколении F1 [De Framond et al., 1986; Simpson et al., 1986].
Чужеродыне гены обычно передаются потомству с высокой степенью стабильности при мейозе [Muller et al., 1987]. Однако, иногда наблюдали случайную потерю трансформированного фенотипа после мейоза [Potrykus et al., 1989].
Возмножно, это происходило из-за активации чужеродного гена (например, при метилировании ДНК). Интеграция чужеродной ДНК во внеядерные геномы, например, в хлоропластную ДНК [De Block et al., 1980], так же происходит по неменделевскому типу наследования – по материнской линии.
Используя метод гибридизации по Саузерну [Southern, 1975] для анализа трансформантов и их потомства, многие исследователи показали, что часто наблюдается встраивание укороченных, тандемных или перестроенных копий чужеродных генов, особенно после прямого переноса ДНК в протопласты [Krens et al., 1985]. Появление тандемов, часто от 5 до 20 копий, можно объяснить рядом рекомбинаций перед интеграцией в геном [Szernilofsky et al., 1986; Wirtz et al., 1987]. Образование инвертированных повторов является основным типом перестроек чужеродной ДНК при применении векторов, содержащих тДНК ----- Ti-плазмиды [Jorgensen et al., 1987].
Итак, при проведении опытов по трансформации растений, необходимо принимать во внимание тот факт, что чужеродная ДНК может подвергаться различным модификациям перед встраиванием в геном хозяина. Однако, и после интеграции могут происходить различные ее перестройки, обычно во время мейоза [Czernilofsky et al., 1986]. В таких случаях только перекрестное опыление тщательно отобранных трансформантов с наиболее желаемым генотипом и фенотипом дает потомство с предсказуемыми призанаками.

1.1.6. Анализ экспрессии чужеродных генов в трансформированных растениях

Для качественного и количественного анализа экспрессии чужеродных генов в растениях используют множество методов, включая Нозери-анализ РНК [Nagy et al., 1988] и Вестери-анализ продуктов трансдукции [Burnette, 1981]. Кроме того, изучают фенотипические признаки такие как, устойчивость к антибиотикам и гербицидам. Для анализа экспрессии таких репортерных генов, как cat, npt II, гены октопин- и -------- разработаны чувствительные методы [Otten a. Schilperoort, 1987; Gorman et al., 1982].
Такого рода анализ может иметь большое значение, поскольку можно комбинировать кодирующие последовательности репортерных генов с подходящими регуляторными последовательностями растительных генов, либо создавать двойные гены, экспрессирующиеся с одного и того же промотора. Активность гена и промотора можно таким образом определить либо с помощью ферментативного анализа, либо гибридизацией растительной РНК с зондами, комплементарными репортерному гену.
Перечисленные выше разнообразные методики можно успешно применять для анализа экспрессии чужеродных генов в трансгенных растениях, в частности, генов устойчивости к гербицидам, насекомым, облучению, антибиотикам и др.

1.2. Использование метода генетической
инженерии для трансформации однодольных растений
1.2.1. Краткие характеристики ряски
Семейство рясковые, Lemnaceae включает 6 родов и 30 видов, встречающихся на всех континентах. Наиболее широко они распространены в Северной и Южной Америке, Африке, Австралии. Представители семейства рясковые являются самыми маленькими в мире цветковыми растениями, венчики которых редко превышают 1 см. В результате гидрофильной эволюции они достигли крайней степени редукции всех своих органов, поэтому и по простоте строения занимают первое место среди цветковых.
Рясковые – водные, свободноплавающие, большей частью многолетние травянистые растения. По своей природе рясковые являются неотеническими формами произошедшими от предков современного водоплавающего рода Пистия из семейства Ароидных. Рясковые служат кормом для диких и домашних уток, а так же других водоплавающих и болотных птиц, для рыб, особенно карпа, и ондатры. В сельском хозяйстве их используют в свежем и сушеном виде как ценный белковый корм для свиней и домашней птицы. Применяются рясковые и для очистки воды, так как извлекают из нее и запасают в своих листьях азот, фосфор, калий, а так же поглощиют углекислый газ и обогащают воду кислородом. Употребляются и человеком.
За последние 50 лет рясковые рассматриваются, как чрезвычайно ценный экспериментальный объект для морфогенетических, физиологических и биохимических исследований благодаря неприхотливости к среде, малым размерам, быстрому росту, что позволяет использовать всего один генетический клон на протяжении всего эксперимента.

1.3. Сигнальные молекулы, их способность индуцировать процессинг тДНК

Экспрессию генов vir-области индуцируют специфические сигнальные молекулы посредством позитивной регуляции системы в состав которой входят гены virA и virG [Melchers et al., 1986; Stackel, Zambryski, 1986].
Активаторами транскрипции vir-генов являются низкомолекулярные моноциклические фенольные соединения, синтезируемые в механически поврежденных тканях растений [Stuchel, 1985]. Примерами таких соединений являются ----------- и довольно широкий круг производных ------- биосинтетического пути метаболитов защитной природы или предшественников лигнина.
Сигнальные молекулы были впервые обнаружены в экссудатах корней и листьев двудольного растения Nicotiano tabacum, они были идентифицированы как ----- и -------. Эти соединения синтезировали метаболически активные поврежденные ткани растений. В настоящее время установлена сигнальная индуцирующая активность у большой группы ------- соединений растительной природы. Механическое повреждение тканей растений приводит к усилению синтеза таких сигнальных соединений. Известно, что ------------ и коричная кислоты, проявляющие сигнальную активность, обладают так же антимикробными свойствами и являются промежуточными метаболитами на пути синтеза -------. ---------- распознаются специфическими рецепторами агробактерий, являющимися трансмембранными хеморецептргыми белками с различной ------- к таким молекулам [Leroux, 1987]. Для оптимальной индукции экспрессии генов vir требуется присутствие в эксцудатах растений различных углеводов: глюкозы, глюкуроновой кислоты, галактозы, галактуроновой кислоты, арабинозы, маннозы, фукозы, целлобиозы и ксилозы, представляющих компоненты клеточной стенки растений. Такие углеводы связываются с периплазматическим доменом рецептора в виде предварительно обработанного комплекса с белком-продуктом хромосомного вирулентного гена Chv E, причем конечный результат индукции процессинга тДНК зависит от синергической активности сигнальных соединений и сахаров эксцудатов растений.
Структурная формула:

Позитивная регуляторная система vir A – vir G, контролирующая экспрессию генов vir -----, работает следующим образом. Экспрессируемый конститутивно ген vir A выполняет функцию рецепции сигнальных молекул растений и трансмиссии этого сигнала в бактериальную клетку. Этот мембранный хеморецептор после принятия внешнего сигнала активирует продукт гена vir G, который в свою очередь выступает в качетве позитивного регулятора собственной транскрипции и транскрипции остальных генов vir -----. Механизмы активации следующие.
Белок vir A, дважды пронизывающий мембрану бактерии, при появлении сигнальных молекул автофосфорилируется --------- на своем С-конце, переходя в активную форму. (В отсутствии индукции С-терминальный домен белки vir A взаимодействуют с W-терминальным доменом, ингибируя киназную активность).
Активированный белок vir A в свою очередь --------- внутренний клеточный белок – трансдуктор сигнала vir a по остатку аспарагина – 52 [Jin et al., 1990]. Фосфорилированный белок vir G связывается с промоторами остальных генов регулона и со своим собственным, выступая в качестве транскрипционного активатора. Индукция vir генов обратимая, и каскад реакций может быть прерван, что очень важно для патогена: в случае, если хозяин больной и нежизнеспособный организм, перенос тДНК в его клетки не осуществляется [Hess et al., 1991].
Кроме позитивной регуляторной системы vir A – vir G, локализованной на Ti-плазмиде, в регуляции экспрессии vir-генов принимают участие также хромосомные гены. Об этом свидетельствует обнаружение спонтанного хромосомного мутанта ros, у которого гены vir C и vir D – оперонов экспрессируются в отсутствие сигнальных молекул растений.

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Материалы
2.1.1. Оборудование

Копалка, термомиксер 5436, центрифуга "Эппиндорф", прибор для горизонтального электрофореза, источник питания 2197, термостат ТС–80 Мг.

2.1.2. Бактериальные штаммы и плазмиды

Штамм:
Escherichia coli
HB 101
Agrobacterium tumefaciens
C58C1
Плазмиды:
рGV3850
тДНК:
рBR322 маркер Ар, Тс

2.1.3. Растения

В качестве объектов исследования использовали двух–, трехмесячное однодольное растение ряски крошечной (Lemna perpusilla).
Растения выращивали в теплице в вегетационных сосудах при температуре 18–250 С и 12 часовом световом периоде. Относительную влажность воздуха в теплице поддерживали в пределах 65–70%. Для анализа брали стерильные ткани листьев. Стерилизацию проводили гипохлоридом натрия в течение 5–10 минут, а затем материал 3 раза промывали стерильной водой и использовали в экспериментах по индукции vir–генов Ti–плазмид. Для сравнения были взяты двудольные растения табака красного и льна долгунца.

2.1.4. Среды микробиологические для культивирования растений

В работе использовали среды:
1. Для микроорганизмов – LB (Лурия–Бертани)
NaCl
Дрожжевой экстракт
Бантотриптон
10 мг/л
5 г/л
5 г/л
рН 7,5
Температура 240 С
Длина светового дня 16 часов
На чашку Петри:
LB
штамм
10 мл
1 мл
2. Для культивирования растений – среда MS (Мурасиге–Скуча) приведена в таблице.

2.1.5. Другие растворы

Фосфатный буфер
ТЕ буфер (10 мМТрис–HCl (pH 8.0), 1 мМ ЭДТА)
Саркозилат Na
Проназы – 1,5 мг/мл
Фенол
Хлороформ
Агарозные гели
Фитогормоны:
БАП (6–бензиламинопурин) растворяли в растворе 0,1 – NaOH
HУК (2–нафтилуксусная кислота) растворяли в этаноле и разводили водой до 10 мг/мл. Стерилизовали фильтрованием через фильтры В 485.
Ацетосирингон растворяли в 70% спирте (этаноле) в концентрации 10 мг/мл. Добавляли в среду MS до конечной концентрации 100 мМ.

2.1.6. Ферменты, используемые в генной инженерии

Гидролиз ДНК проводили рестрикционными эндонуклеазами:
Hind III, Bam Hi, Sal I, Eco RI.

2.1.7. Антибиотики

Ампицилин 50, Н2О 50. Для селекции бактерий с определенными плазмидами.

2.2. Методы
2.2.1. Инкубация Agrobacterium tumefaciens с экссудатами тканей растений

Ночную культуру A. tumefaciens С58С1 (pGV3850), выращенную на ротационном шейкере (20 циклов/мин) при 290 С в жидкой среде LB, собирали центрифугированием и суспензировали в среде МС – 0,1 М фосфатном буфере (рН 5,5) до кислотности А600 – 0,05.
После 5 часов роста в бактериальную культуру добавляли мелконарезанные стерильные ткани растений (листья, стебли) в количестве 2 г на 10 мл среды и продолжали инкубацию в течение 48 часов.
В качетве положительного контроля использовали агробактериальную культуру с добавлением в качестве индуктора 100 мкМ ацетосирингона. В качестве отрицательного контроля использовали агробактериальные клетки, выращенные на среде без ацетосирингона и эксцудатов растений.
Эффективность индукции процессинга тДНК церез 48 часов инкубации агробактерий с тканями растений. Титр жизнеспособных бактерий после инкубации с эксцудатами растений проверяли путем их высева в различных разведениях на чашки Петри с агаризованной средой LB. Каждый вариант опытов проводили в трех повторностях.

2.2.2. Выделение тотальной ДНК Agrobacterium tumefaciens

ДНК выделяли по модифицированному методу Draper с соавт.Через 48 часов совместного культивирования агробактерий с тканями растений из пробирок удаляли растительную ткань, бактерии собирали, центруфугировали при 9000 g. Осадок, полученый из 10 мл инкубационной среды лизировали в течение 45 мин при 370 С в 500 мкл ТЕ буфера (10 мМ трисHCl (pH 8,0), 1 мМ ЭДТА), содержащего 1% сарколизата Na и 1,5 мг/мл проназы. Лизат дважды экстрагировали фенолом и дважды хлороформом. ДНК осаждали спиртом и растворяли в ТЕ–буфере.

2.2.3. Блод-гибридизация тДНК по Саузерну

В целях дополнительной проверки наличия индукции процессинга и присутствия в пробах pBR322 татальную ДНК агробактерий в количестве 5 мкг наносили в лунки 0,8% агарозного геля и проводили электрофорез при 25–100 В в течение 2 часов в буфере, содержащем: 40 мМ трис–ацетат (рН 8,0), 1 мМ ЭДТА и 5 мкг/мл бромистого этидия. В качестве маркеров молекулярного веса использовали ДНК фага ?, гидролизованную рестриктазной эндонуклеазой Hind III. Блод–гибридизацию проводили на ––––– фильтрах. В качестве зонда использвали ДНК плазмиды pBR322, меченную 32 –– с помощью ДНК–полимеразной системы.

2.2.4. Трансформация клеток Esherichia coli

Штаммы E. сoli HB101 выращивали в жидкой среде LB при 370 С до концентрации 5*107 клеток/мл (А600 = 0,45). Для количественного изучения процессинга тДНК использовали комплементарные клетки бесплазмидного штамма E. сoli HB101, которые трансформировали тотальной ДНК агробактерий, которая была выделена (М-2), претерпевших различную переработку. Трансформанты каждого варианта высевали на три чашки Петри с агаризированной средой LB, содержащей ампицилин (50 мкг/мл). Количество колоний подсчитывали. В контрольных экспериментах клетки трансформировали плазмидой pBR322, и другой контроль не был подвергнут трансформации и колоний обнаружено не было.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ

Для обнаружения процессинга агробактериальной тДНК, индуцированного экссудатами анализированных растений, в работе применяли метод "спасения плазмиды", предложенный Koukolikova-Nikola с соавт. Этот метод основан на использовании модифицированной Ti-плазмиды pGV385 [11], содержащей между правой и левой границами значительно делетированной исходной тДНК бактериальной плазмиды вектор pBR322. Таким образом, индуцирование процессинга тДНК в модифицированной Ti-плазмиде pGV3850 можно прослеживать по вырезанию из нее низкомолекулярного фрагмента ДНК, в состав которого входит плазмида pBR322. Этот процесс можно тестировать различными методами. Один из них – это трансформация клеток E. сoli тотальной агробактериальной ДНК и отбор трансформантов по селективным маркерным признакам плазмиды pBR322 – устойчивой к антибиотикам. Другим методом может быть блод-гибридизация – анализ тДНК с помощью плазмиды pBR322 в качестве гибридизационного зонда. Оба этих метода были использованы в настоящей работе. Сравнили эффективность индукции процессинга экссудатами различных растений проведено по отношению к активности 100 мкМ ацетосирингона. Известно, что это токсифенольное соединение, выделяемое некоторыми двудольными растениями, принадлежит к сигнальным молекулам, индуцирующим вырезание и перенос агробактериальной тДНК.
Результаты трансформации клеток E. сoli НВ101 тДНК подвергнутых воздействию экссудатов листьев различных растений представлены в таблице.
Таблица 3.1.
Факторы индукции
Количество трансформированных E. Coli
L. perpusilla (ряска)
L. perpusilla (ряска)
Ацетосирингон (контроль)
Лен долгунец
Nicotiana tabacum (табак)
Без ацетосирингона и трансформации
25 колоний
30 колоний
35 колоний
40 колоний
30 колоний
–

Экссудаты листьев ряски индуцировали вырезание тДНК, что является доказательством присутствия в их составе сигнальных соединений, специфических для индукции транскрипции генов vir агробактериальной Ti-плазмиды.
Прямой блод-гибридизационный анализ тДНК агробактерий свидетельствует о присутствии у ряски сигнальных молекул, индуцирующих образование тДНК [12].

4. ОБСУЖДЕНИЕ
Использованный подход позволяет регистрировать присутствие сигнальных молекул в экссудатах различных тканей растений по одному из важнейших результатов индукции генов области vir, а именно по вырезанию тДНК из агробактериальной Ti-плазмиды. В настоящей работе мы применили два метода детекции процессинга тДНК модифицированной агробактериальной Ti-плазмиды. PGV3850 [11].
Полученные результаты позволяют расширить список однодольных растений (на одно растение), синтезирующих сигнальные молекулы, индуцирующие процессинг агробактериальной тДНК. Примененный метод "спасения плазмиды" позволяет выявлять появление циклических форм модифицированной тДНК pBR322 и ее линейных форм [20].
Рассмотренный в работе метод позволяет учитывать присутствие в экссудатах растений веществ с бактериостатической активностью. Вещества такой природы могут существенно влиять на эффективность трансформации растений агробактериями.
Мы не анализировали химическую природу сигнальных молекул ряски. Не исключено, что сигнальные молекулы могут отличаться от сигнальных фенольных соединений двудольных растений. Специфический процесс взаимодействия между агробактериями и покрытосеменными растениями существовал, по-видимому, еще до их дивергенции на двудольные и однодольные [15].
Штаммы агробактерий обладают многими особенностями и именно рецепторы (продукты гена vir A), различающиеся по способности узнавать сигнальные молекулы различной природы.
Следует отметить, что растительные вещества с сигнальной функцией для агробактерий не является уникальным примером существования соединений, выполняющих эту важную роль во взаимодействии микроорганизмов с растенями [22].
Молекулярные сигналы растений играют важную роль в установлении паразитических и симбиотических взаимоотношений между бактериями и растениями, определяя при этом круг растений для определенного микроорганизма. Всесторонние структурно-функциональные исследования специфических молекулярных сигналов во взаимодействии между микроорганизмами и растениями должны ответить на многочисленные вопросы о молекулярно-генетических механизмах этих взаимоотношений и способствовать развитию эффективных методов генетической инженерии важнейших сельскохозяйственных и экологически-индикаторных культурах растений (как ряска).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
.

10.
Анализ генома. Методы. Под ред. Н. Дейвиса. – М.: Мир, 1990. – 247 с.
Великов В.А., Бурьянов Я.И. Образование делеционных производных Ti-плазмиды pGV3850 при конъюгационном переносе из Agrobacterium tumefaciens в Escherichia coli. // Генетика.1998. №8. т. 34. с. 1056-1062.
Великов В.А., Бурьянов Я.И. Изучение конъюгационного транспорта Ti-плазмиды pGV3850 из Agrobacterium tumefaciens в Escherichia coli. // Тезисы докладов III Пущинской конференции молодых ученых. Пущино, 27-30 апреля 1998 г, с. 49.
Генная инженерия растений. Лабораторное руководство. – М.: Мир, 1991. – 408 с.
Клонирование ДНК. Методы. Под ред. Д. Гловера. – М.: Мир, 1988. – 538 с.
Малиатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. Методы генетической инженерии. – М.:Мир, 1984. – 463 с.
Методы молекулярной генетики и генной инженерии. Под ред. А.И. ----. – Новосибирск: Наука, 1990. – 248 с.
Мобильность генома растений. Под ред. Б. Хол и Е.С. Делинс. – М.: Агропромиздат, 1990. – 272 с.
Плазмиды. Методы. Под ред. Д. Хорда. – М.: Агропромиздат, 1990. – 272 с.
Пехов А.П. Основы плазмидологии.- М.: 1996. – 231 с.
Сельскохозяйственная биотехнология. Векторные системы молекулярного клонирования. Под ред. Р.Л. Подреперс и Д.Т. Денхардт. – М.: Агропромиздат, 1991. – 535 с.
Солова Г.К., Кривопалов Ю.В., Великов В.А., Чумаков М.И. Прикрепление Agrobacterium к корням пшеницы. // Микробиология. 1995. т. 64. №4, с. 526-530.
Захарченко Н.С., Комиви М.А., Бурьянов Я.И. Индуцирование процессинга тДНК. // Физиология растений. 1999. т. 46. № 2, - с. 282-291.
Baker R.F., Idler I.B. and al. Nucleotide sequence of the tDNA region from Agrobacterium tumefaciens Ti plasmid pTi / 5955. Plant Mol. Biol., 1983, V.2, pp. 335-350.
Douglas C.J and al. Identification and genetic analisys of an Agrobacterium tumefaciens chromosomal virulence rigion. J. Bacteriol., 1985, v. 161, pp. 850-860.
Holster S.M., Villaroel and al. An analisys of the boundaries of the octopine TL – DNA intumors induced by Agrobacterium tumefacies. Mol. Gen. Genet., 1983, v. 190, pp. 35-38.
Howord E.A., Zupan J.R. and al. The vir Dr protein of A. Tumefaciens contaen sal-terminal bipartite nuclear localization sygnal: implication for nuclear uptake of DNA in plant cells. Cell, 1992, v. 68, pp. 109-119.
Janssens A., Engler., Zambryski P. The nopaline c58 tDNA region is teansribed in Agrobacterium tumefaciens., Mol. Gen. Genet., 1984, v. 195, pp. 341-350.
Melchers L.S., Hooykaas P.J.J., virulence in Agrobacterium tumefaciens. Oxford Surv. Plant Mol. Cell Biol., 1987. № 4. pp. 167-170.
Stachel S.E., Nester E.W. The genetic and transcriptional organization of the vir regulon of the A6 Ti plasmid of Agrobacterium tumefaciens. EMBO J., v. 5, pp. 1145-1454.
Zambryski P., Joos N., Genetello G., Leemans. Ti plasmid veefof for the introduction of DNA in to plant cells without alteration of their normal regeneration Capacity. EMBO J., 1983. v. 2, pp. 2143-2150.