Аденилатциклазный сигнальный механизм

АДЕНИЛАТЦИКЛАЗНЫЙ СИГНАЛЬНЫЙ МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ ПЕПТИДОВ ИНСУЛИНОВОГО СУПЕРСЕМЕЙСТВА У ПОЗВОНОЧНЫХ И БЕСПОЗВОНОЧНЫХ Актуальность проблемы Изучение гормональных сигнальных систем, участвующих в регуляции жизненно важных для организма клеточных процессов, является одной из актуальных проблем современной молекулярной эндокринологии и биохимии. К числу систем, осуществляющих реализацию регуляторного действия веществ гормональной и

негормональной природы, относится аденилатциклазная сигнальная система АЦС , которая представлена в клетке сложным трансмембранным комплексом, состоящим, по крайней мере, из трех молекулярных блоков. Необходимыми компонентами АЦС являются рецепторы, способные воспринимать внеклеточные сигналы, гетеротримерные ГТФ-связывающие белки G-белки стимулирующего Gs или ингибирующего

Gi типа, состоящие из трех субъединиц - б г и обеспечивающие сопряжение между рецептором и третьим компонентом системы - ферментом аденилатциклазой АЦ , катализирующей образование универсального внутриклеточного посредника - циклического аденозинмонофосфата цАМФ . При его участии осуществляется реализация целого ряда регуляторных эффектов в клетке пролиферация, дифференцировка, апоптоз, синтез белка и др К настоящему времени в литературе накоплен значительный

объем данных, свидетельствующих об участии АЦС и цАМФ в трансдукции сигналов группы гормонов не пептидной природы серотонин, адреналин, норадреналин и др осуществляющих свой эффект на клетку через рецепторы серпантинного типа, семь раз пронизывающие мембрану. В рамках настоящего исследования мы предприняли попытку выяснить возможность участия АЦС в реализации действия пептидов инсулинового суперсемейства, обладающих рецепторами тирозинкиназного

типа, один раз пронизывающими мембрану клетки. До исследований, проведенных нами, участие системы АЦС-цАМФ в реализации действия гормонов инсулиновой природы практически отрицалось. В литературе имелись лишь отдельные сведения о влиянии инсулина, бомбиксина, релаксина на активность АЦ Pertseva et al 2003 Patel, 2004 . Несмотря на успехи, достигнутые за последние десятилетия в изучении молекулярных механизмов действия инсулина и инсулиноподобных пептидов, многие аспекты плейотропного

действия этого гормона и родственных ему пептидов до сих пор остаются невыясненными Pertseva et al 2003 Телкова, 2005 . В связи с этим изучение ранее неизвестных молекулярных механизмов действия пептидов инсулинового суперсемейства, насчитывающего в настоящее время около 50 представителей, относится к числу актуальных проблем современной эндокринологии. Согласно современным представлениям, инсулин и родственные ему пептиды играют ключевую роль в регуляции

ряда клеточных процессов - клеточный рост, апоптоз, метаболизм. Эти пептиды имеют общее эволюционное происхождение, так как возникли в ходе эволюции из общего анцестрального гена в результате дупликации и последующей дивергенции образовавшихся генетических линий, сохранив при этом структурное и функциональное сходство Murray-Rust et al 1992 Chan et al 1992 . К изучению участия АЦС в реализации действия гормонов и ростовых факторов инсулиновой

природы лаборатория приступила в начале 90-х годов. Отправной точкой послужили данные, впервые полученные нами, о способности инсулина и родственных пептидов активировать ГТФ-зависимым образом АЦ в мышечных тканях млекопитающих и моллюсков Plesneva et al 1994 . Мы использовали эволюционный подход, предложенный Л.А.Орбели 1958 применительно к эволюционной биохимии, который включал исследования в филогенезе, онтогенезе

и при патологии. Было изучено 1 влияние на АЦС инсулина, инсулиноподобного фактора роста 1 ИФР-1 позвоночных и инсулиноподобного пептида ИПП беспозвоночных моллюск Anodonta cygnea 2 влияние на АЦС пептидов в тканях-мишенях животных разного филогенетического уровня позвоночные - крысы, птицы и беспозвоночные - моллюски 3 действие пептидов инсулинового суперсемейства на АЦС в онтогенезе в тканях куриных эмбрионов разного возраста и у цыплят 4 действие пептидов инсулинового

суперсемейства на АЦС при экспериментальном диабете у позвоночных и беспозвоночных. Цель работы. Доказать участие аденилатциклазной сигнальной системы в реализации регуляторных эффектов инсулина, ИФР-1, ИПП моллюска в клетке и расшифровать структурно-функциональную организацию АЦ сигнального механизма их действия в тканях позвоночных и беспозвоночных, а также установить роль АЦ сигнального механизма в регуляции фундаментальных клеточных процессов - клеточный рост, апоптоз.

Задачи исследования 1. Исследовать действие инсулина, ИФР-1 и ИПП, выделенного из висцеральных органов моллюска Anodonta cygnea Русаков и др 1991 , на АЦС в мышечных тканях позвоночных и беспозвоночных. Охарактеризовать зависимость эффекта от времени и концентрации исследуемых пептидов, а также от присутствия гуаниновых нуклеотидов для подтверждения вовлеченности в

АЦ сигнальный механизм гетеротримерных G-белков. 2. Исследовать структурно-функциональную организацию АЦ сигнального механизма, опосредующего эффекты пептидов инсулинового суперсемейства у позвоночных и беспозвоночных и выяснить последовательность этапов передачи регуляторных сигналов этих пептидов на АЦС. С этой целью а установить тип рецепторов и G-белков, вовлеченных в АЦ сигнальный механизм действия пептидов, используя ингибиторы рецепторных тирозинкиназ

и метод АДФ-рибозилирования бактериальными токсинами б выявить участие фосфатидилинозитол-3 киназы ФИ-3-К , используя специфичный ингибитор вортманнин в идентифицировать изоформу протеинкиназы С ПКС используя ингибиторы ПКС и моноклональные антитела к изоформам ПКС. 3. Исследовать участие АЦ сигнального механизма действия инсулина и ИФР-1 в регуляции процессов клеточного роста и апоптоза, исходя из гипотезы о важной роли цАМФ в регуляции

фундаментальных процессов в клетке Перцева, 2000 . 4. Исследовать функциональные нарушения в АЦ сигнальном механизме действия пептидов инсулинового суперсемейства при эндокринной патологии - сахарный диабет 1-го и 2-го типов. Научная новизна Впервые обнаружено стимулирующее действие инсулина, ИФР-1 и ИПП моллюска A.cygnea на активность АЦ. Показано участие рецепторной тирозинкиназы и установлена

вовлеченность G-белков Gi и Gs типа в реализацию активирующего действия этих пептидов на АЦ. Впервые показано, что в проявлении АЦ стимулирующих эффектов инсулина и ИФР-1 участвуют ФИ-3-К и изоформы ПКС - ПКС и возможно ПКСе. В мышечных тканях позвоночных и беспозвоночных животных обнаружен ранее неизвестный АЦ сигнальный механизм действия инсулина и ИФР-1 и установлена его структурно-функциональная организация,

представленная в клетке следующей сигнальной цепью рецептор тирозинкиназного типа Gi-белок г-димер ФИ-3-К ПКС позвоночные или ПКСе беспозвоночные Gs-белок АЦ цАМФ протеинкиназа А ПКА эффекторные системы. Этот механизм отличается по числу сигнальных блоков от известного АЦ сигнального механизма действия гормонов, обладающих рецепторами серпантинного типа, представленного

в клетке следующей цепью рецептор серпантинного типа G-белок Gi или Gs АЦ цАМФ ПКА эффекторные системы. Следует отметить, что действие пептидов инсулиновой природы на АЦ в мышечной ткани моллюска осуществляется через АЦ сигнальный механизм, сходный с таковым позвоночных, но имеющий на пострецепторных этапах трансдукции гормонального сигнала отличие на уровне

ПКС. Исходя из результатов нашего исследования, в АЦ сигнальном механизме действия пептидов инсулинового суперсемейства у позвоночных принимает участие ПКСж, а у беспозвоночных моллюски , как предполагается ПКСе. Экспериментально подтверждена, выдвинутая нами гипотеза, о важной роли АЦ-цАМФ в реализации регуляторного действия инсулина и ИФР-1 на фундаментальные процессы в клетке. Показано участие

АЦ-цАМФ системы в способности ИФР-1 и инсулина стимулировать клеточный рост и ингибировать апоптоз в культурах фибробластоподобных клеток. Обнаружены нарушения в АЦ сигнальном механизме действия инсулина при патологии сахарный диабет 1-го и 2-го типов . Теоретическое и практическое значение работы Теоретическое и практическое значение работы определяется важной ролью инсулина и других пептидов инсулинового суперсемейства в организме высших и низших животных.

Обнаружение новых сигнальных механизмов действия пептидов этой группы, в частности инсулина и ИФР-1, расширяет современные представления о спектре сигнальных систем, участвующих в регуляторном действии пептидов инсулинового суперсемейства. Применение эволюционного подхода изучение ряда эволюционно-родственных пептидов и использование представителей позвоночных и беспозвоночных позволило выявить консервативность обнаруженного АЦ сигнального механизма действия пептидов инсулиновой природы.

Данные, полученные на беспозвоночных, могут быть полезны для понимания сигнальных механизмов действия пептидов инсулинового суперсемейства у позвоночных и для разработки моделей эндокринной патологии у человека сахарный диабет в рамках нового направления - эволюционная биомедицина Перцева, 2006 . Полученные данные о молекулярных механизмах действия инсулина и ИФР-1 имеют фундаментальное значение и могут применяться при чтении курса лекций в университетах и медицинских

ВУЗах как в России, так и за рубежом. Результаты исследования имеют важное практическое значение в плане выявления молекулярных основ этиологии и патогенеза сахарного диабета, а также в создании новых подходов для диагностики этого заболевания. Обнаруженный нами АЦ сигнальный механизм действия инсулина, может служить основой для разработки биохимического теста, позволяющего проводить диагностику нарушения отдельных звеньев в молекулярном механизме действия инсулина.

Положения, выносимые на защиту 1. Впервые установлено, что пептиды инсулинового суперсемейства инсулин, ИФР-1 и ИПП моллюска Anodonta cygnea ГТФ-зависимым образом активируют АЦ в тканях позвоночных млекопитающие, птицы и беспозвоночных моллюски животных. 2. Реализация АЦ активирующего действия пептидов инсулиновой природы осуществляется через обнаруженный нами АЦ сигнальный механизм, включающий следующую сигнальную цепь рецептор-тирозинкиназа

Gi-белок вг-димер ФИ-3-К ПКС Gs-белок АЦ. 3. С участием АЦ сигнального механизма, генерирующего цАМФ, осуществляется регуляторное действие пептидов инсулиновой природы на фундаментальные клеточные процессы - стимулируется клеточный рост и ингибируется апоптоз. 4. При эндокринной патологии сахарном диабете 1-го и 2-го типов нарушается функционирование АЦ сигнального механизма действия гормонов инсулиновой природы в основном на уровне

Gs-белка и его сопряжения с АЦ. 5. Сходство структурно-функциональной организации АЦ сигнального механизма действия пептидов инсулинового суперсемейства у позвоночных и беспозвоночных животных свидетельствует об его эволюционной консервативности. Апробация работы Основные результаты и положения работы были представлены и доложены на следующих конференциях и съездах 17-я, 19-я, 20-я, 21-я Конференции Европейского

Общества Эндокринологов Кордова, Испания, 1994 Нидерланды, 1998 Фаро, Португалия, 2000 Бонн, Германия, 2002 4-й Симпозиум по нейробиологии моллюсков Амстердам, Нидерланды, 1994 Симпозиум по инсулину, ИФР-1 и инсулиноподобным пептидам Испания, Барселона, 1997 XXXIII Международный конгресс физиологов

Санкт-Петербург, 1997 2-й съезд Биохимического Общества РАН Москва, 1997 XVII съезд физиологов России Ростов-на-Дону, 1998 конференция Рецепция и внутриклеточная сигнализация Пущино, 1998 Съезд Биохимического общества Университета Глазго Глазго, Великобритания, 1999 18-ый Международный конгресс биохимиков и молекулярных биологов

Бирмингем, Англия, 2000 3-я и 4-я Международные конференция по релаксину и родственным пептидам Брум, Австралия, 2000 Виоминг, США, 2004 XVIII Съезд Физиологического Общества имени И.П.Павлова, Казань, 2001 XI, XII и XIII Международные совещания по эволюционной физиологии Санкт-Петербург, 1996 2001 2006 Международная Европейская конференция

Люксембург, 2002 Вторая конференция Эндокринная регуляция физиологических функций в норме и патологии , посвященная 80-летию со дня рождения М.Г.Колпакова. Новосибирск. Октябрь, 2002 1-й съезд Общества Клеточных Биологов Санкт-Петербург, 2003 Физиологический съезд Екатеринбург, 2004 1-й Съезд физиологов СНГ Сочи, Дагомыс,

2005 Публикации. По теме диссертации опубликовано 75 работ, в том числе 36 статей в рецензируемых отечественных и международных изданиях. Личный вклад автора - Экспериментальные данные получены лично автором или при его непосредственном участии. Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 259 страницах, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, включающего 285

источников. Работа иллюстрирована 43 рисунками и 35 таблицами. Основное содержание работы Объекты и методы исследования. Объектами исследования служили 1 представители позвоночных - крысы Ratus norvegicus линии Wistar 2 куры породы русская белая Леггорн 3 представители беспозвоночных - пресноводный двустворчатый моллюск

Anodonta cygnea 4 культура клеток миобластов куриных эмбрионов 5 фибробластоподобная культура клеток линии Swiss 3T3 6 культура клеток, трансформированная из нормальных фибробластов линии Е1А сНа-ras клетки, впадающие в апоптоз и E1A E1B клетки, не впадающие в апоптоз . Методы. В работе использован широкий спектр физиологических, биохимических и фармакологических методов - выделение фракций плазматических мембран мышечной ткани позвоночных и беспозвоночных животных с использованием

метода дифференциального центрифугирования Kidwai et. al 1973 с нашими модификациями - выделение частично очищенных мембранных фракций культуры клеток миобластов куриных эмбрионов, фибробластоподобных клеток линии Swiss 3T3, E1A cHa-ras, E1A E1B Плеснёва и др 1999 2003 - выделение фракции, содержащей примембранную форму цАМФ-ФДЭ Houslay, 1985 определение активности АЦ с использованием радиоактивного субстрата АЦ реакции - б32P

АТФ Salomon et al 1974 с некоторыми модификациями - определение активности цАМФ-ФДЭ, с использованием радиоактивного субстрата 3H цАМФ Ткачук и др 1978 - АДФ-рибозилирование гетеротримерных G-белков холерным и коклюшным токсинами Pertseva et al 1992 - электрофорез в ПААГ - иммуноблотинг с использованием моноклональных антител для идентификации изоформы

ПКСж - определение ростстимулирующей активности действия инсулина, ИФР-1, ЭФР и цАМФ по включению 14C тимидина в ДНК культуры клеток Swiss3T3 Баркан и др. 1992 Плеснёва и др 1997 1999 - использование модели апоптоза на трансформированных клетках, полученных из нормальных эмбриональных фибробластов введением пары комплементирующих онкогенов E1A cHa-ras, обладающих высокой проапототической чувствительностью к удалению ростовых факторов

Bulavin et.al 1999 и ее характеристика Плеснёва и др 2003 - оценка антиапоптотического действия инсулина, ИФР-1 и цАМФ с использованием метода клоногенной выживаемости культуры клеток E1A cHa-ras Плеснёва и др 2003 - определение активности ферментов углеводного метаболизма - гликогенсинтетазы и глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы Кузнецова, 1998 Кузнецова и др 2004 - определения содержания белков методом Лоури - создания моделей экспериментального диабета 1-го и 2-го типов у позвоночных

Ping et al 1999 с нашими модификациями и диабетоподобного состояния у беспозвоночных Плеснева и др 2006 Кузнецова и др 2007 с использованием стрептозотоцина статистические методы обработки данных по программам Statgraph и Anova . Результаты исследования и их обсуждение В работе представлены экспериментальные доказательства активирующего действия инсулина, ИФР-1 и ИПП на АЦ, установлена структурно-функциональная организация

АЦ сигнального механизма в клетке и его роль в регуляции пептидами инсулиновой природы клеточного роста и апоптоза. Основные этапы работы состояли в исследовании - действия пептидов инсулиновой природы на активность АЦ при разном времени и разной концентрации in vitro и in vivo - участия примембранной цАМФ-ФДЭ в функционировании АЦ сигнального механизма действия инсулиноподобных пептидов - звеньев АЦ сигнального механизма от рецептора до эффекторных систем - роли

АЦ сигнального механизма, как в регуляции клеточных процессов, так и его функционального применения в условиях патологии Влияние in vitro инсулина, ИФР-1 и ИПП на активность АЦ в тканях позвоночных и беспозвоночных и в культурах клеток в разные временные сроки Проведено исследование in vitro динамики во времени АЦ активирующего эффекта инсулина, ИФР-1 и ИПП моллюска при концентрации пептидов 10-8М и для сравнения

эпидермального ростового фактора ЭФР , пептида не инсулиновой природы, обладающего рецептором тирозинкиназного типа Никольский и др 1987 . Показано, что в мембранной фракции скелетных мышц крыс наибольшее выраженное активирующее действие исследованных пептидов на АЦ проявляется через 2.5мин. Активирующий АЦ эффект инсулина составляет 236 . Эффект менее выражен при действии ИФР-1 201 , ЭФР 186 и ИПП моллюска 124 Рис.1 Таблица 1 .

Рис.1. Концентрация пептидов - 10-8М Активация АЦ пептидами в по сравнению с базальной активностью фермента, принятой за 100 , приведена в тексте. Различия достоверны р 0.05 Таблица 1. Динамика во времени действия ИФР-1 на активность АЦ в мембранной фракции скелетных мышц крыс Воздействия Активность АЦ пкмоль цАМФ мин мг белка 2.5мин 5мин 10мин

Без ИФР-1 71.2 4.8 100 85.11 3.3 100 101.20 9.24 100 ИФР-1 214.31 12.1 301 136.16 5.2 160 96.14 4.6 95 Примечание В скобках - базальная активность АЦ без воздействий , принятая за 100 и активность АЦ в при действии ИФР-1 В мембранной фракции культуры куриных миобластов показано рис.2 , что стимулирующий АЦ эффект инсулина через 2.5мин составляет 256 , по сравнению с базальной активностью, принятой за 100

и имеет сходство с данными, полученными на мембранной фракции скелетных мышц крыс 236 рис.1 . В тканях моллюска A.cygnea, ИПП, выделенный из висцеральных органов этого моллюска, оказывает наиболее выраженное активирующее действие на АЦ 422 , по сравнению с ЭФР 221 , ИФР-1 169 и инсулином 133 Рис.3 Таблица 2 . Следует отметить, что активирующий АЦ эффект исследуемых пептидов в наибольшей степени проявляется

через 2,5мин, через 5мин снижается, а через 10 минут практически отсутствует Таблица 2 Рис.3 . Рис.2. Концентрация инсулина 10-8М. Различия достоверны р 0.05 Таблица 2. Динамика во времени действия ИФР-1 на активность АЦ в мембранной фракции гладких мышц моллюска Воздействия Активность АЦ пкмоль цАМФ мин мг белка 2.5мин 5мин 10мин

Без ИФР-1 110.21 10.8 100 125.31 9.3 100 106.04 6.6 100 ИФР-1 259.92 11.4 269 229.31 5.2 183 103.81 5.8 98 Примечание - как в таблице 1. Таким образом, в мембранных фракциях, выделенных из мышечных тканей исследуемых животных и культуры клеток куриных миобластов, наблюдается закономерность проявления эффекта пептидов в зависимости от времени действия. Инсулин, ИФР-1,

ИПП и ЭФР оказывают активирующее действие на АЦ в течение 2,5 и 5мин с максимальным эффектом через 2.5мин. АЦ активирующий эффект исследуемых пептидов видоспецифичен. В скелетных мышцах крыс ряд эффективности пептидов по их влиянию на АЦ имеет следующий порядок инсулин ИФР-1 ЭФР ИПП, а в мышечных тканях моллюска - ИПП ЭФР ИФР-1 инсулин. Рис.3. Концентрация пептидов -

10-8 М Активация АЦ пептидами в по сравнению с базальной активностью фермента, принятой за 100 , приведена в тексте. Различия достоверны р 0.05 Влияние in vivo разных доз инсулина на активность АЦ в тканях позвоночных и беспозвоночных в разные временные сроки Обнаружив в опытах in vitro стимулирующее влияние пептидов инсулинового суперсемейства на активность АЦ, мы исследовали влияние инсулина, основного представителя инсулинового суперсемейства, на активность

АЦ в разных дозах и при разном времени действия в условиях in vivo. Эксперименты проведены на фракциях мышечных мембран крыс, куриных эмбрионов и моллюсков после введения инсулина внутрибрюшинно или внутрижелточно в дозах 0.05 нг г-10 нг г веса тела вес крысы или куриного эмбриона, вес моллюска без раковины . Доза, вводимого in vivo инсулина рассчитывалась с учетом концентрации инсулина, используемой в опытах in vitro. Основанием для выбора дозы служили данные литературы и результаты

наших опытов in vitro. Было показано, что в скелетных мышцах крыс стимулирующий АЦ эффект инсулина 222 выявляется через 5мин после введения гормона 1 нг г , а через 15мин он снижается почти в три раза 67 Рис.4 . При более высокой дозе инсулина 10 нг г , стимулирующий АЦ эффект гормона через 5мин выражен слабее 124 , а через 15мин отсутствовал. Рис.4. Активация АЦ пептидами в по сравнению с базальной активностью

АЦ, принятой за 100 , приведена в тексте. Различия достоверны р 0.05 В экспериментах in vivo в мембранных фракциях мышц куриных эмбрионов разного возраста обнаружен АЦ активирующий эффект инсулина. У 10-дневных куриных эмбрионов он выявлялся уже через 5мин, более четко выражен через 15мин, а через 30мин не проявлялся рис.5 . Рис.5. Различия достоверны р 0.05 У 17-дневных куриных эмбрионов выявлено дозозависимое активирующее

действие инсулина на активность АЦ через 5 минут Рис.6 , которое ослабевает через 15 и 30мин после введения гормона. Рис.6. Различия достоверны р 0.05 При введении моллюскам инсулина 0.5 нг г и 5.0 нг г активность АЦ возрастала через 5мин после введения гормона на 49 и 381 , соответственно, по сравнению с контролем, принятым за 100 . Через 20мин влияние гормона 0.5 нг г на активность АЦ снижается 22 и практически исчезает 6 через 40мин

Рис.7 . При введении инсулина 5 нг г моллюскам АЦ стимулирующий эффект гормона через 20мин составлял 110 , а через 40мин 50 рис.7 . Рис.7. Светлые столбики - базальная активность АЦ. Заштрихованные столбики - инсулин-стимулированная активность АЦ при разных дозах гормона. Различия достоверны р 0.05 Из полученных нами данных следует, что отчетливое влияние инсулина на активность

АЦ в мышечных мембранах моллюска Рис.7 выявляется при более высокой дозе инсулина, чем у млекопитающих и птиц. Это можно объяснить тем, что у моллюска A.cygnea рецепторы к инсулину не обнаружены Лейбуш, Чистякова, 2003 , а эффект инсулина может реализовываться через ИФР-1 - подобные рецепторы или рецепторы ИПП моллюска, которые способны опосредовать активирующее влияние инсулина на АЦ Шпаков и др 2005 . Следует отметить, что проявление

АЦ стимулирующего влияния инсулина и инсулиноподобных пептидов во времени имеет сходство в опытах in vitro и in vivo. АЦ активирующий эффект пептидов отчетливо выявляется при коротких сроках влияния пептида 2,5 и 5мин при физиологических концентрациях 10-9-10-8М , с увеличением времени действия эффект пептидов ослабевает или отсутствует. АЦ активирующий эффект инсулина, ИФР-1 и ИПП при разных концентрациях в условиях in vitro

Установив оптимальное время действия пептидов инсулинового суперсемейства, при котором происходит активация АЦС 2.5мин , необходимо было выявить при каких концентрациях АЦ стимулирующий эффект пептидов наиболее выражен. В разных тканях стимулирующий эффект пептидов инсулиновой природы осуществляется через специфичные рецепторы, отличающиеся по сродству к пептиду в гомологичных и негомологичных пептиду тканях.

Проведено исследование влияния инсулина, ИФР-1, ИПП моллюска и ЭФР в течение 2.5мин при разных концентрациях 10-12-10-6М в мембранных фракциях крыс, кур, моллюсков, а также во фракции, выделенной из культуры клеток куриных миобластов. В мембранной фракции скелетных мышц крыс стимулирующий АЦ эффект инсулина, ИФР-1, ИПП обнаруживается при концентрациях -

10-11-10-7М Рис.8 . Наиболее выраженный АЦ стимулирующий эффект составляет для инсулина 250 при 10-8М для ИФР-1 91 при 10-9М для ИПП 111 при 10-8М для ЭФР 190 при 10-10М. Рис.8 . Можно отметить, что в диапазоне концентраций 10-10-10-7М наиболее четко выражен активирующий АЦ эффект инсулина, эффекты других исследованных пептидов инсулиновой природы проявлялись слабее. АЦ стимулирующий эффект ЭФР проявлялся при более низких концентрациях 10-11-10-10М .

Рис.8. Базальная активность АЦ принята за 100 . Время действия пептидов 2.5мин Таблица 3. Влияние in vitro разных концентраций инсулина на активность АЦ во фракциях мышечных мембран куриных эмбрионов разного возраста и цыплят Объекты возраст 10-сут Эмбрионы 13-сут Эмбрионы 16-сут Эмбрионы Цыплята 3-сут Воздействия Активность АЦ пмоль цАМФ мин мг белка

В скобках - Активность АЦ в в присутствии инсулина, по отношению к базальной активности, принятой за 100 . Без Инсулина 14.021.10 100 3.900.45 100 2.010.09 100 8.520.41 100 инсулин 10-11 М 16.341.35 117 4.210.34 108 4.810.46 239 10.110.55 119 инсулин 10-10 М 39.141.93 279 10.330.89 265 5.280.30 263 11.240.48 132 инсулин 10-9 М 48.252.21 344 15.921.24 408 10.240.62 509 14.540.82 171 инсулин 10-8

М 19.871.44 142 9.840.56 252 9.920.47 494 19.551.13 238 инсулин 10-7 М 17.130.98 122 4.930.45 126 7.510.33 374 22.211.37 261 инсулин 10-6 М 17.901.12 128 5.120.21 131 1.950.22 97 24.391.62 286 Изучение АЦ стимулирующего эффекта пептидов инсулинового суперсемейства и ЭФР в онтогенезе позволило выявить следующие факты.

Наиболее выраженный АЦ активирующий эффект инсулина 10-11М-10-6М обнаруживается у куриных эмбрионов 10, 13, 16 суток и цыплят 3 суток при концентрации гормона 10-9М, и составляет у 10-суточных эмбрионов 244 , у 13-суточных 308 , у 16-суточных 409 Таблица 3 , а у 3-х суточных цыплят 186 при более высокой концентрации 10-6М, что может быть связано с переходом эмбрионов в постэмбриональный период, когда процессы роста и дифференцировки заканчиваются. Проведенные нами исследования действия инсулина и

ИФР-1 на активность АЦ в мембранной фракции, выделенной из культуры клеток куриных миобластов 4-й день развития показали, что наибольший АЦ стимулирующий эффект инсулина 352 выявляется при концентрации 10-9М, а ИФР-1 289 при концентрации 10-10М данные в диссертации . В мембранной фракции мышц моллюска АЦ стимулирующий эффект инсулина, ИФР-1, ИПП и ЭФР выявляется при концентрациях - 10-11-10-8М

Рис.9 . Инсулин и ИФР-1 оказывают наиболее выраженное стимулирующее действие на активность АЦ при концентрации 10-8М 63 и 54 , соответственно , а ИПП и ЭФР при 10-9М 415 и 223 , соответственно . Таким образом, определен диапазон концентраций, при которых проявляется АЦ активирующий эффект исследуемых пептидов. Следует отметить видоспецифичность действия пептидов.

Действие ИПП, выделенного из висцеральных ганглиев моллюска A.cygnea, является более эффективным в ткани моллюска и менее эффективным в тканях позвоночных. Рис.9. Базальная активность АЦ принята за 100 . Время действия пептидов - 2.5мин. Участие ц-АМФ-зависимой ФДЭ в механизме действия пептидов инсулинового суперсемейства Уровень цАМФ в клетке зависит не только от АЦ - фермента, осуществляющего его синтез, но и от фосфодиэстеразы

ФДЭ - фермента, обеспечивающего его деградацию. Исследована динамика во времени активности примембранной формы цАМФ-ФДЭ во фракции скелетных мышц кур. Эта изоформа ФДЭ локализована на внутренней стороне мембраны и способна активироваться инсулином Houslay, 1985 . Нами показано, что активность примембранной цАМФ-ФДЭ не изменяется через 2.5 и 5.0мин после действия инсулина, увеличивается на 115 через 10мин и на 179

через 20мин, по сравнению с базальной активностью фермента, принятой за 100 Таблица 4 . Таблица 4. Влияние инсулина 10-8М на активность примембранной цАМФ-ФДЭ в скелетных мышц кур в зависимости от времени Воздействия Активность цАМФ-ФДЭ нмоль АМФ мин мг белка 2.5мин 5.0мин 10.0мин 20.0мин Без инсулина 3.37 0.5 100 3.70 0.33 100 3.56 0.61 100 3.21 0.28 100 инсулин 3.06 0.21 91 4.07 0.18 110 7.65 0.23 215 8.95 0.44 279

Примечание в скобках представлена активность цАМФ-ФДЭ в в присутствии инсулина и базальная активность фермента, принятая за 100 При исследовании действия разных концентраций инсулина 10-9М-10-7М обнаружено, что наиболее выраженное действие гормона 115 на активность цАМФ-ФДЭ выявляется через 10мин при концентрации 10-8М данные в диссертации . Соотношение активности систем АЦ-цАМФ и цАМФ-ФДЭ в реализации действия инсулина на клетку является

важным моментом в понимании внутриклеточных механизмов функционирования пептидов инсулиновой природы. При активации АЦ гормонами скорость синтеза цАМФ начинает превышать скорость его деградации. Повышение уровня цАМФ приводит к активации мишени его действия - ПКА. Сродство ПКА к цАМФ в 100-1000 раз больше, чем у ФДЭ. При усилении синтеза цАМФ происходит сначала насыщение цАМФ-регуляторных центров

ПКА, и лишь затем гидролиз цАМФ с участием ФДЭ. Исходя из представленных нами данных, активирующие эффекты инсулина на АЦ и цАМФ-ФДЭ четко разделены во времени. АЦ активирующий эффект инсулина проявляется через 2.5 и 5мин и отсутствует через 10мин. Между тем, цАМФ-ФДЭ активируется инсулином только через 10 минут инкубации с гормоном. Таким образом, активация цАМФ-ФДЭ наступает лишь тогда, когда цАМФ как вторичный посредник выполнит

свою функцию, достигнет порогового уровня и осуществит свое активирующее действие на ПКА, а затем и на эффекторные системы Ткачук, 1983 , что согласуется с нашими данными о действии инсулина на активность АЦ и цАМФ-ФДЭ и данными литературы. В связи с этим основное внимание будет уделено исследованию АЦС, участвующей в осуществлении регуляторного действия пептидов инсулинового суперсемейства на клеточные процессы. Использование антиинсулиновой сыворотки для доказательства специфичности

АЦ стимулирующего эффекта инсулина Для доказательства АЦ стимулирующего действие инсулина, а не других пептидных гормонов, не относящихся к гормонам инсулинового суперсемейства, была использована анти-инсулиновая сыворотка АИС , выработанная в лаборатории на инсулин млекопитающих, которая нейтрализует действие инсулина и, как установлено нами подавляет стимулирующее действие инсулина на

АЦ. При добавлении нормальной сыворотки без инсулина к фракции скелетных мышц крыс и гладких мышц моллюска, активирующий АЦ эффект инсулина составляет 68 у крыс и 41 у моллюсков. При использовании АИС стимулирующий АЦ эффект инсулина отсутствует у крыс 7 и моллюсков -5 Табл. 5 . Полученные данные свидетельствуют о том, что обнаруженное нами активирующее действие инсулина на АЦ в мышечных тканях исследуемых объектов осуществляется именно инсулином и является специфичным

при действии этого гормона. Таблица 5. Нейтрализация АЦ стимулирующего эффекта инсулина в мембранных фракциях скелетных мышц крыс и гладких мышц моллюска в присутствии антиинсулиновой сыворотки Воздействия Активность АЦ пкмоль цАМФ мин мг белка Нормальная сыворотка Анти-инсулиновая сыворотка Гладкие мышцы моллюска Anodonta cygnea

Без инсулина 111.186.13 100 148.294.31 100 Инсулин 10-8М 156.768.54 141 158.678.16 107 Скелетные мышцы крысы Без инсулина 97.344.58 100 115.826.49 100 Инсулин 10-8М 163.496.17 168 110.037.12 95 Примечание приведены данные из трех независимых экспериментов, повторенных три раза. Значения представлены в виде среднего арифметического с учетом ошибки среднего. Различия достоверны р 0.05 . В скобках - активность

АЦ в . Базальная активность принята за 100 . Следующая часть работы посвящена расшифровке структурно-функциональной организации механизма АЦ активирующего действия инсулина и ИФР-1. В этой части работы мы поэтапно исследовали звенья, которые могут быть вовлечены в реализацию действия инсулиноподобных пептидов, начиная от рецептора и заканчивая эффекторными системами, которые являются конечным звеном реализации сигнала. Участие рецептора тирозинкиназного типа в реализации

АЦ стимулирующего эффекта пептидов инсулинового суперсемейства Для доказательства участия рецептора тирозинкиназного типа, характерного для пептидов инсулинового суперсемейства в реализации АЦ стимулирующего эффекта пептидов инсулиновой природы, использовали селективные ингибиторы рецепторных тирозинкиназ - тирфостин 47 и генистеин, которые блокируют тирозинкиназную функцию рецептора инсулина и других пептидов инсулиновой природы. Ингибиторы инкубировали с пробами в течение 15мин после

чего в пробу добавляли пептиды время действия 2.5мин при концентрации, вызывающей максимальный АЦ стимулирующий эффект. Влияние этих ингибиторов на активирующие АЦ эффекты инсулина, ИФР-1, ЭФР и для сравнения на эффект изопротеренола в случае позвоночных и серотонина в случае беспозвоночных , которые также действуют активирующим образом на АЦ, но через рецептор серпантинного типа, изучали in vitro во фракции мембранных препаратов мышечной

ткани крыс, культуры куриных миобластов, моллюсков. У крыс в присутствии тирфостина 47 1.25-5.0 мкМ активирующий АЦ эффект пептидов снижался при действии инсулина до 50 , при ИФР-1 до 65 , при ЭФР до 50 по отношению к максимальному эффекту пептидов, принятому за 100 Рис.10 . В присутствии генистеина 1.25-5.0 мкМ снижение

АЦ стимулирующих эффектов всех используемых пептидов у крыс было более выражено. Эффект инсулина снижался до 40 , эффект ИФР-1 до 10 , эффект ЭФР - до 18 рис.11 . В тоже время у крыс стимулирующий эффект изопротеренола на АЦ 10-6М практически не изменялся в присутствии тирфостина 47 и генистеина 0.5-20.0 мкМ . В культуре клеток 4-х суточных куриных миобластов тирфостин 47

Рис.12 и генистеин данные представлены в диссертации ингибировали АЦ активирующий эффект инсулина до 43 и 38 , соответственно. Однако, активирующее действие изопротеренола на АЦ в присутствии ингибиторов тирозинкиназ тирфостина 47 и генистеина не изменялось р 0.05 . Это свидетельствует о том, что классические рецепторы серпантинного типа не участвуют в механизме действия пептидов инсулиновой природы.

Рис.10. По оси ординат - снижение стимулирующего эффекта пептидов и изопротеренола на АЦ принятого за 100 в присутствии тирфостина 47 Рис.11. По оси ординат - снижение стимулирующего эффекта пептидов и изопротеренола на АЦ принятого за 100 в присутствии генистеина Рис.12. По оси ординат - снижение стимулирующего эффекта инсулина и изопротеренола на

АЦ принятого за 100 в присутствии тирфостина 47 Рис.13. По оси ординат - снижение стимулирующего эффекта пептидов и серотонина на АЦ принятого за 100 Рис.14. По оси абсцисс - концентрация генистеина в мкМ по оси ординат - снижение АЦ стимулирующего эффекта пептидов и серотонина принятого за 100 в присутствии генистеина У моллюсков наиболее выраженное снижение АЦ стимулирующего эффекта пептидов наблюдалось в присутствии

тирфостина 47 2.5 мкМ . Эффект инсулина уменьшался до 20 , эффект ЭФР до 30-35 . Рис.13 . В присутствии генистеина АЦ стимулирующий эффект пептидов снижался до 25 в случае инсулина 1.25 мкМ генистеин , и до 50-75 в случае ЭФР 5 мкМ генистеин рис.14 . Необходимо подчеркнуть, что у моллюсков A.cygnea активность АЦ увеличивается не в присутствии изопротеренола, а в присутствии серотонина, реализующего свое действие

также через рецепторы серпантинного типа Pertseva et al 1992 . Исследование действия ингибиторов тирозинкиназ - тирфостина 47 и генистеина 0.5-20.0 мкМ на стимулирующий АЦ эффект серотонина в мембранной фракции мышечных тканей моллюсков не выявило изменений в действии этого биогенного амина на активность АЦ. Таким образом, в мембранной фракции крыс, моллюсков и культуры клеток куриных миобластов стимулирующее влияние исследуемых пептидов на

АЦ снижалось в присутствии тирфостина 47 и генистеина в диапазоне концентраций - 1.25, 2.5, 5.0, 10, 20 мкМ во всех исследуемых объектах Рис.10-14 . Стимулирующее действие изопротеренола крысы, куры или серотонина моллюски на АЦ, реализуемое через рецепторы серпантинного типа не изменялись в присутствии тирфостина 47 или генистеина в исследуемых объектах см. Рис.10-14 . Можно заключить, что в мышечной ткани млекопитающих крысы , птиц

куры , культуре клеток куриных миобластов и в мышцах моллюсков активирующее действие инсулина, ИФР-1, ЭФР на АЦ осуществляется с участием рецепторов тирозинкиназного типа, специфичных для действия этих пептидов. Pertseva et al 1996 Plesneva et al 2003 . Участие G-белков в реализации АЦ стимулирующего эффекта инсулина Для доказательства участия G-белков в действии инсулина на активность

АЦ был применен широко распространенный подход, в котором используется набор гуаниновых нуклеотидов, способных в разной степени либо стимулировать ГТФ-азную активность G-белков в присутствии ГТФ и его аналогов - ГТФгS, ГИДФ и тем самым активировать АЦ, либо ингибировать ГТФ-азную активность G-белка в присутствии ГДФвS. Было исследовано влияние

ГТФ и ряда его негидролизуемых аналогов на активность АЦ в присутствии и отсутствии гормона Табл. 6 . Таблица 6. Влияние гуаниновых нуклеотидов в отсутствии и присутствии инсулина на активность АЦ во фракции мышечных мембран крысы и моллюска Воздействия Животные Крыса Моллюск Активность АЦ Контроль 100 1.01 100 1.3

Инсулин 10-8М 222 1.3 122 186 1.8 86 ГТФгS 10-5М 242 1.4 142 470 9.4 370 ГИДФ 10-5М 236 1.8 136 269 4.9 169 ГТФ 10-5М 135 1.05 35 163 5.1 63 ГДФвS 10-5М 95 1.2 -5 92 2.4 -8 Инсулин ГТФгS 473 2.5 373 109 726 20.3 626 170 Инсулин ГИДФ 399 8.2 299 41 441 12.3 341 86 Инсулин ГТФ 277 10.1 177 20 279 8.4 179 30 Инсулин ГДФвS 102 5.4 2 -17 105 4.3 5 -86

Примечание в круглых скобках - активирующий АЦ эффект используемых агентов в по отношению к базальной активности, принятой за 100 . В квадратных скобках - потенцирование эффекта гормона в присутствии гуаниновых нуклеотидов в . Согласно представленным данным, ГТФгS, ГИДФ, ГТФ стимулируют активность АЦ в мышечных мембранах крыс и моллюсков. При совместном действии инсулина и гуаниновых нуклеотидов происходит усиление потенцирование эффекта

гормона по сравнению с аддитивным эффектом гормона и гуаниновых нуклеотидов, действующих раздельно - в присутствии ГТФгS, ГИДФ и ГТФ на 109 , 41 и 20 у крыс и на 170 , 86 и 30 у моллюсков табл. 6 . ГДФвS же напротив снижает АЦ стимулирующий эффект инсулина как в мышцах крыс, так и моллюсков. Потенцирование эффекта инсулина в присутствии ГТФгS,

ГИДФ, ГТФ и отсутствие потенцирующего эффекта в присутствии ГДФвS свидетельствует о вовлеченности Gs-белков в АЦ сигнальный механизм действия пептидов инсулинового суперсемейства. Таблица 7. Влияние коклюшного и холерного токсинов на базальную, инсулин- и ИФР1-стимулируемую активность АЦ в скелетных мышцах крысы и моллюска A.cygnea Активность АЦ пкмоль цАМФ мин мг белка Воздействия

Скелетные мышцы крысы Гладкие мышцы моллюска Без КТ КТ Без КТ КТ Без пептидов 39.7 3.4 48.5 2.0 63.2 4.1 69.1 9,6 100 100 100 100 Инсулин 67.9 3.6 48.2 2.7 200.5 14.4 74.2 7.6 10-9М 171 99 317 108 ИФР-1 57.4 2.1 43.1 1.6 139.2 12.4 76.8 7.3 10-9М 145 89 220 111 Без ХТ ХТ Без ХТ ХТ Без пептидов 39.6 2.6 79.7 2.7 47.4 3.0 94.3 5.6 100 100 100 100

Инсулин 69.3 2.8 105.8 7.4 151.7 9.8 134.0 7.5 10-9М 175 133 320 142 ИФР-1 56.7 4.2 106.2 6.5 100.0 5.4 122.6 8.8 10-9М 143 133 210 130 Примечание В скобках - активность АЦ в . Активность АЦ без пептидов принята за 100 . Для выяснения типов G белков, вовлеченных в АЦ сигнальный механизм действия инсулина и

ИФР-1 были использованы бактериальные токсины коклюшный и холерный , которые модифицируют б-субъединицы Gi и Gs белков. Коклюшный токсин вызывает АДФ-рибозилирование бi-субъединицы Gi белка, что ведет к потере его функциональной активности Milligan, 1988 Reisine, 1990 . Известно, что вг-димер Gi белка обладает собственной регуляторной способностью и может стимулировать активность

ФИ-3-К.Обработка мышечных мембран крысы и моллюска коклюшным токсином приводила к блокированию АЦ стимулирующего эффекта, как инсулина, так и ИФР-1 таблица 7 , что можно объяснить нарушением диссоциации гетеротримерного Gi белка на бi-субъединицу и вг димер в условиях действия коклюшного токсина. Таким образом, коклюшный токсин, предотвращая индуцируемую инсулином или ИФР-l стимуляцию активности ФИ-3-К, реализуемую через вг-зависимый механизм, тормозит активацию

АЦ. Влияние холерного токсина на мембраны приводит к блокаде ГТФ-азной активности бs-субъединицы и тем самым переводит её в перманентно активированное состояние. В связи с этим обработка мембран холерным токсином может повлечь за собой стимулирование каталитической активности АЦ и наряду с этим ослабление регуляторных эффектов гормонов, действие которых на АЦ осуществляется через Gs белок Milligan, 1988 Reisine,

1990 . Обработка фракции мышечных мембран крысы и моллюска холерным токсином приводит к 2х-кратному увеличению базальной активности АЦ и снижению стимулирующего эффекта инсулина и ИФР-1 на активность фермента таблица 7 , что полностью согласуются со сведениями литературы и указывает на вовлеченность Gs белка в активацию АЦ с участием инсулина или ИФР-1. Таким образом, совокупность данных, полученных с использованием коклюшного и холерного токсинов,

указывает на участие как Gi, так и Gs белков в АЦ сигнальном механизме действия инсулина и ИФР-l. Участие фосфатидилинозитол-3 киназы в реализации АЦ стимулирующего эффекта инсулина и ИФР-1 Для выяснения участия ФИ-3-К в АЦ сигнальном механизме действия пептидов инсулинового суперсемейства инсулина и ИФР-1 был использован специфический ингибитор этого фермента - вортманнин.

Инкубация мышечных мембран крысы и моллюска с вортманнином 10-9-10-7М несколько снижает базальную активность АЦ таблица 8 . В отсутствии ингибитора инсулин и ИФР-1 отчетливо стимулируют активность АЦ. Между тем, АЦ стимулирующий эффект инсулина и ИФР-1 снижается в зависимости от концентрации ингибитора 10-9-10-7М . Ингибирующее действие вортманнина было наиболее выражено при концентрации 10-7М таблица 8 . Установленные факты свидетельствуют об участии ФИ-3-К в

АЦ сигнальном механизме действия инсулина и ИФР-1 в мышечных тканях изучаемых объектов. Таблица 8. Влияние вортманнина 10-9М-10-7М на стимуляцию ИФР-1 10-8М и инсулином 10-8 М активности АЦ в мембранной фракции скелетных мышцах крыс и гладких мышц моллюска Anodonta cygnea Активность АЦ пкмоль цАМФ мин мг белка объекты Крысы Моллюски воздействия без пептида ИФР-l инсулин без пептида

ИФР-l инсулин без ворманнина 21 1.6 38.2 1.0 41.4 2.3 17.8 1.0 41.1 2.6 24.5 1.0 вортманнин 10-9М 17.9 2.0 9.4 1.3 9.7 1.4 15.8 2.0 14.6 1.3 14.2 0.4 вортманнин 10-8М 16.5 2.3 8.6 1.3 8.4 1.3 14.6 2.3 13.9 0.8 11.6 1.0 вортманнин 10-7М 13.2 1.9 6.3 0.9 6.8 0.8 14.3 0.9 13.8 1.8 7.4 0.5 Примечание значения активности АЦ в присутствии пептидов, достоверно отличающиеся от активности фермента в отсутствии пептидов р 0.05 , отмечены звездочкой. Для проверки гормоноспецифичности ингибирующего действия вортманнина на

АЦ стимулирующие эффекты инсулина и ИФР-1 были использованы изопротеренол и серотонин, гормоны неродственные пептидам инсулиновой природы и реализующие действие через рецептор серпантинного типа, не связанный с ФИ-3-К сигнальной системой. Результаты этих опытов показали отсутствие влияния вортманнина на катехоламинчувствительную АЦ сигнальную систему данные приведены в диссертации . Этот факт указывает на участие ФИ-3-К в, обнаруженным нами,

АЦ сигнальном механизме действия инсулина и ИФР-1. Участие протеинкиназы С в АЦ сигнальном механизме действия пептидов инсулинового суперсемейства Для доказательства участия ПКС в АЦ сигнальном механизме действия пептидов инсулиновой природы использовали селективный блокатор ПКС - кальфостин Yoing et al 2005 . В отсутствии кальфостина АЦ активирующий эффект инсулина и

ИФР-1 составлял 101 и 73 у крыс, и 78 и 86 у моллюсков соответственно, по отношению к базальной АЦ, принятой за 100 . Как обнаружено нами, кальфостин 10-10-10-8М блокировал АЦ стимулирующие эффекты инсулина и ИФР-1 в мембранных фракциях мышц крысы и моллюска. Наиболее выраженный ингибирующий эффект кальфостина обнаруживается при концентрации 10-8М. В присутствии кальфостина 10-8М АЦ стимулирующий эффект инсулина и

ИФР-1 снижался на 46 и 32 у крыс, и на 47 и 50 у моллюсков, соответственно, по отношению к максимальному АЦ стимулирующему эффекту пептидов, принятому за 100 данные в диссертации . Для идентификации изоформы ПКС, участвующей в АЦ сигнальном механизме действия пептидов инсулиновой природы использовали моноклональные антитела к ПКСж, которая по данным литературы является одним из участников реализации сигналов инсулиновой природы.

Таблица 9. Влияние антител к ПКСж на АЦ активирующий эффект ИФР-1 10-8М и инсулина 10-8М в мышечных мембранах крысы и моллюска A.cygnea Активность АЦ Объекты Крысы Моллюски Воздейтсвия Без пептида ИФР-1 Инсулин Без пептида ИФР-1 инсулин без антител 100 4.4 253 17 247 24 100 12 307 24 255 18 АТ 1 1000 104 9.5 102 14 108 16 166 25 251 21 254 12

АТ 1 100 98 8.2 95 12 103 5 163 18 327 27 237 20 АТ 1 10 94 6.8 68 3.6 88 8 145 5 403 33 238 25 Активность АЦ выражена в к контрольным величинам, принятым за 100 . Антитела к ПКСж почти полностью блокировали АЦ стимулирующий эффект инсулина и ИФР-1 в мышечных мембранах крыс таблица 9 . Таким образом, использование моноклональных антител к ПКСж показало, что эта изоформа фермента вовлечена в стимулирующее действие инсулина и

ИФР-1 на АЦ в скелетных мышцах крыс. Между тем, в гладких мышцах моллюска эти антитела не оказывали блокирующего действия на АЦ стимулирующий эффект инсулина и ИФР-1. Мышцы моллюска обладают иным набором ПКС Sossin et а1 1996 и в АЦ стимулирующем действии этих пептидов инсулинового суперсемейства, по-видимому, участвует другая изоформа ПКС, близкая по своим свойствам к ПКСе из мозга позвоночных.

Таким образом, настоящее исследование привело к обнаружению и расшифровке ранее неизвестного АЦ сигнального механизма действия инсулина, ИФР-1 и ИПП моллюска в мышечных тканях позвоночных и беспозвоночных животных. Этот механизм имеет принципиально сходную структурно-функциональную организацию в случае инсулин- ИФР-1- и ИПП-компетентных АЦ сигнальных систем. Он может быть представлен в клетке шестикомпонентным

сигнальным каскадом рецептор-тирозинкиназа Gi-белок вг-димер фосфатидилинозитол-3-киназа протеинкиназа С Gs-белок аденилатциклаза. АЦ является генератором внутриклеточного посредника - цАМФ, который способен через активацию цАМФ-зависимой протеинкиназы A передавать гормональный сигнал к различным эффекторным системам. В плане изучения функциональной роли, обнаруженного нами, АЦ сигнального механизма, генерирующего цАМФ, было исследовано его участие в реализации регуляторного

действия пептидов инсулиновой природы на такие фундаментальные клеточные процессы, как клеточный рост и апоптоз. Участие АЦ сигнального механизма в митогенном действии пептидов инсулиновой природы Для изучения митогенного действия пептидов инсулинового суперсемейства мы использовали фибробластоподобную культуру клеток Swiss 3T3, любезно предоставленную нам из банка культур Института цитологии РАН Санкт-Петербург . Проведена функциональная характеристика

АЦ системы в культуре Swiss3T3 клеток. Установлено, что АЦ система в культуре этих клеток Таблица 10. Функциональные свойства АЦС культуры Swiss3T3 клеток Воздействия Активность АЦ пкмоль цАМФ мин мг белка Стимулирующий АЦ эффект в Базальная 30.59 1.41 100 базальная NaF 10-2 М 178.91 4.15 585 485 форсколин 10-5

М 99.26 3.21 324 224 ГИДФ 10-6 М 111.20 3.48 364 264 ГТФ 10-5 М 82.98 2.92 271 171 ЭФР 10-9 М 168.31 4.75 550 450 ИФР-1 10-9 М 102.14 3.34 334 224 Инсулин 10-9 М 74.89 2.11 245 145 В скобках - активирующий АЦ эффект агентов гормональной и негормональной природы в , по отношению к базальной активности АЦ, принятой за 100 , стимулируется классическими негормональными активаторами

АЦ - NaF, форсколином, ГИДФ, ГТФ, а также инсулином, ИФР-1 и ЭФР таблица 10 . Проведенные нами исследования показали, что в культуре Swiss 3T3 присутствует АЦС с функциональными свойствами, близкими к АЦС других клеток и тканей позвоночных, которая способна к восприятию внеклеточных сигналов различной природы. Оценив функциональные свойства АЦ сигнальной системы культуры

Swiss3T3 клеток, была исследована способность инсулина, ИФР-1 и ЭФР индуцировать в культуре клеток Swiss3T3 митогенный эффект, оцениваемый по включению 14C -тимидина в ДНК Рис.15-1 . Показано, что инсулин 1000 нг мл , ИФР 1 50 нг мл и ЭФР 10 нг мл стимулировали синтез ДНК прирост от 100 до 250 . Исследуемые пептиды в тех же концентрациях оказывали стимулирующее влияние 2,5мин

на активность АЦ. Рис.15-2 . Для подтверждения участия цАМФ в реализации митогенного эффекта был использован его дибутириловый аналог цАМФ, обладающий способностью проникать в клетку. Этот аналог, взятый при низких концентрациях 10-12-10-9 М , вызывал четкий митогенный эффект, по величине даже превосходящий аналогичный эффект ЭФР и ИФР-1. Эффект оценивали по включению 14C -тимидина в

ДНК Рис.15-3 . Представленные экспериментальные данные подтверждают нашу гипотезу Перцева, 2000 об участии АЦ сигнального механизма действия пептидов инсулинового суперсемейства и, продуцируемого им цАМФ, в реализации митогенных процессов. Участие аденилатциклазного сигнального механизм в антиапоптотическом действии инсулина и инсулиноподобного фактора роста 1 Нами подобрана модель апоптоза, включающая клеточные линии, с разной степенью устойчивости к условиям,

вызывающим незапрограммированную гибель клеток апоптоз . В экспериментах использовали культуру клеток E1A cHa-ras, обладающую высокой проапоптотической чувствительностью к удалению ростовых факторов и действию ДНК-повреждающих агентов впадают в апоптоз Bulavin et al 1999 и культуру клеток Е1А Е1В с высокой устойчивостью как к действию ДНК повреждающих агентов, так и к удалению ростовых факторов из среды не впадают в апоптоз .

В клеточных культурах была охарактеризована чувствительность АЦС к действию инсулина и ИФР-1 Таблица 11 . Полученные результаты свидетельствуют о том, что клетки культуры линий Е1А сНа-ras и Е1А Е1В способны отвечать на действие инсулина и ИФР-1 10-8М активацией АЦ, что указывает на наличие в них рецепторов инсулина и ИФР-1, а также АЦС, чувствительной к этим пептидам.

Клетки сохраняют чувствительность АЦС к инсулину и ИФР-1 как в среде с 10 сывороткой, так и в среде с 0.5 сывороткой. Согласно данным литературы пептиды инсулинового суперсемейства - инсулин и ИФР-1, а также цАМФ, образующийся в результате активации АЦ, способны оказывать антиапоптотическое действие на клетки.

Показано, что инсулин 10-7М , ИФР-1 10-8М и дибутирил-цАМФ 10-9М оказывают ингибирующее влияние на апоптоз, вызванный удалением ростовых факторов сыворотки, в культуре клеток E1A cHa-ras Плеснева, 2003 . Оценка антиапоптотического эффекта инсулина, ИФР-1 и дибутирил-цАМФ проводилась на клетках культуры E1A cHa-ras с использованием метода клоногенной выживаемости, который относится к числу наиболее чувствительных

способов тестирования антиапоптотического действия агентов. Обнаружено, что культивирование Таблица 11. Влияние инсулина и ИФР-1 на активность АЦ в грубой мембранной фракции культур клеток E1A cHa-ras и E1A E1B Условия Активность АЦ пмоль цАМФ мин мг белка In vitro E1A cHa-ras клетки, впадающие в апоптоз Е1А

Е1В клетки, не впадающие в апоптоз Контроль Инсулин ИФР-1 Контроль Инсулин ИФР-1 Среда 10 сыворотка 33.93.4 100 48.12.1 142 56.41.3 166 4.90.5 100 14.31.2 292 17.61 359 Среда 0.5 сыворотка апоптоз 95,93,4 100 137,09,0 143 181,68,2 189 26.70.5 100 61.41.2 230 86.32.1 323 In vivo E1A cHa-ras клетки, впадающие в апоптоз Е1А Е1В клетки, не впадающие в апоптоз Контроль Инсулин

ИФР-1 Контроль Инсулин ИФР-1 Среда 10 сыворотка 4.10.29 100 6.00.9 146 12.20.5 297 5.20.3 100 8.51.0 163 11.41.3 219 Среда 0.5 сыворотка апоптоз 11.01.2 100 17.21.2 156 24.82.2 225 5.80.6 100 10.00.7 172 13.60.6 234 Примечание. В опытах in vitro гормоны 10-8М добавляли прямо в пробу, содержащую грубую мембранную фракцию клеток, для определения активности АЦ. Время инкубации 2.5мин. В опытах in vivo инсулин 10-7М и ИФР-1 10-8М добавляли к культурам клеток, время инкубации 5мин.

Цифры в скобках - эффект гормонов в процентах к контролю, принятому за 100 . Апоптоз индуцировали удалением ростовых факторов сыворотки из среды. Трансформантов на среде без ростовых факторов уменьшает число живых клеток, способных дать потомство в клональном посеве минимум в 2 раза, по сравнению с клетками, культивируемыми в нормальных условиях среда 10 сыворотки . Показано, что только 43 культуры клеток выживают в условиях, когда клетки впадают

в апоптоз среда 0.5 сыворотки по сравнению с контролем среда 10 сыворотка, принято за 100 . В экспериментах, когда в среду с 0,5 сывороткой был добавлен инсулин, ИФР-1 или дибутирил-цАМФ в указанных выше концентрациях, способность клеток давать жизнеспособное потомство восстанавливалась до значений, составляющих около 70 для инсулина 77 , для ИФР-1 67 , для дибутирил цАМФ 66 по сравнению с контролем, принятым за 100 .

Таким образом, эксперименты показали способность инсулина и ИФР-1 через, обнаруженный нами, АЦ сигнальный механизм и продуцируемый им цАМФ, оказывать митогенное и антиапоптотическое действие в клеточных культурах. Исследования подтверждают участие АЦ сигнального механизма в реализации антиапоптотического действия пептидов инсулинового ряда - инсулина и ИФР-1. Функциональное состояние

АЦ сигнального механизма действия инсулина при сахарном диабете На основе концепции молекулярных дефектов в гормональных сигнальных системах как ключевых причин эндокринных заболеваний Перцева, 2004 исследовано функционирование АЦ сигнального механизма при экспериментальном стрептозотоциновом сахарном диабете 1-го и 2-го типа у позвоночных крысы и диабетоподобном состоянии у беспозвоночных моллюски .

Диабет вызывали однократным введением i.p. стрептозотоцина 80 нг г веса животного . На 30-сут стрептозотоцинового диабета обнаружена гипергликемия в крови крыс, в 4,2 раза превышающая уровень глюкозы у контрольных крыс. Впервые выявлено увеличение уровня глюкозы в гемолимфе моллюсков в 2,5 раза на 2-е и 4-е сутки развития диабетоподобного состояния. Обнаружено при диабете снижение АЦ-стимулирующего эффекта инсулина и его потенцирования гуаниновыми

нуклеотидами у крыс и у моллюсков. Инсулин независимый диабет 2-го типа вызывали введением новорожденным крысятам 1-2 сут однократно стрептозотоцина 80 нг г веса животного . При этом типе диабета также возникают нарушения в АЦ сигнальном механизме действия инсулина. АЦ стимулирующий эффект инсулина и потенцирование не проявляется. На основании полученных данных выявлены функциональные дефекты в

АЦ сигнальном механизме действия инсулина при диабете, в мышцах крыс и моллюсков, затрагивающие дистальные звенья АЦ сигнального механизма на уровне каталитического компонента - АЦ, Gs-белка и его сопряжения с АЦ. Заключение Настоящее исследование привело к обнаружению и расшифровке ранее неизвестного АЦ сигнального механизма действия инсулина, ИФР-1 и ИПП моллюска в мышечных тканях позвоночных и беспозвоночных животных.

Эти оригинальные данные расширяют современные представления о круге сигнальных путей действия пептидов инсулинового суперсемейства и способствуют формированию нового позитивного взгляда на вовлеченность АЦ сигнального механизма в действие гормонов и ростовых факторов инсулиновой природы, осуществляемого через рецепторы тирозинкиназного типа. До наших исследований в литературе существовала точка зрения об участии АЦ сигнального механизма только в действии гормонов, обладающих рецепторами серпантинного

типа. Важными представляются доказательства, полученные в работе, о распространенности обнаруженного АЦ сигнального механизма действия изученных пептидов в тканях как позвоночных, так и беспозвоночных животных. Установлена принципиально сходная структурно-функциональная организация инсулин ИФР-1- и ИПП-компетентной АЦ сигнальных систем. На современном этапе наших исследований она представлена в клетке шестикомпонентным сигнальным каскадом рецептор-тирозинкиназа

Gi-белок вг-димер фосфатидилинозитол-3-киназа протеинкиназа С Gs-белок аденилатциклаза. АЦ сигнальный механизм охватывает стадии от рецептора тирозинкиназного типа до фермента - АЦ, являющейся генератором вторичного внутриклеточного посредника - цАМФ. Образовавшийся цАМФ способен через активацию цАМФ-зависимой протеинкиназы A передавать гормональный сигнал к различным эффекторным системам.

Открытый нами АЦ сигнальный механизм действия пептидов инсулиновой природы по своей структурно-функциональной организации наряду со сходством, обладает и существенными отличиями от известных до сих пор гормональных АЦ сигнальных систем. Эти отличия сводятся - во-первых, к участию в одном АЦ сигнальном механизме сразу дух типов гетеротримерных G-белков Gs и Gi , которые обычно вовлечены в разные сигнальные системы - во-вторых, к взаимодействию

рецепторов тирозинкиназного типа, специфичных для гормонов инсулиновой группы с Gi-белком, выступающим в качестве донора вг субъединиц, а не бi-субъединицы как во многих других сигнальных системах в-третьих, к большему числу, составляющих его блоков шесть компонентов, во всяком случае по сравнению с трехкомпонентным АЦ сигнальным механизмом действия биогенных аминов рецептор серпантинного типа Gs или Gi-белок АЦ За период, прошедший со времени обнаружения нами

АЦ сигнального механизма действия пептидов инсулинового суперсемейства Plesneva et.al 1994 Kuznetsova et al 1999 Plesneva et al 2001 в литературе появились данные, касающиеся отдельных его сигнальных блоков, подтверждающие установленную нами структурно-функциональную организацию этого АЦ сигнального механизма. Так показано, что рецепторы инсулина и ИФР-1 функционально сопряжены с Gi-белком Kuemmerle,

Murthy, 2001 Dupont et al 2003 Kreuzer et al 2004 . Также установлено участие ФИ-3-К и ПКС и связь их с продукцией цАМФ в ряде сигнальных путей действия пептидов инсулинового суперсемейства Dessauer, Nguyen, 2005 Nguyen, Dessauer, 2005 . В плане изучения спектра функций, обнаруженного нами АЦ сигнального механизма, генерирующего цАМФ, установлено его участие в реализации регуляторного действия

пептидов инсулиновой природы на такие фундаментальные клеточные процессы, как клеточный рост стимуляция Плеснева и др. 1999 и апоптоз ингибирование Плеснева и др 2003 , способствующие в итоге выживанию клетки. Таким образом, выдвинутая нами гипотеза Перцева, 2001 о важной роли АЦ сигнального механизма в реализации регуляторного действия инсулина и ИФР-1 на жизненно-важные клеточные процессы - клеточный рост, апоптоз нашла подтверждение в наших исследованиях

Плеснева и др 1999 Плеснева и др 2003 . Основываясь на эволюционном подходе Л.А.Орбели ко всем изучаемым явлениям Орбели, 1958 мы использовали комплекс методов эволюционной физиологии применительно к изучению биохимических систем организма. Исследование включало несколько аспектов а изучение трех эволюционно родственных пептидов инсулинового суперсемейства - инсулина и ИФР-1 позвоночных, а также

ИПП беспозвоночных моллюска Anodonta cygnea б изучение действия этих пептидов на АЦС в тканях-мишенях животных разного филогенетического уровня позвоночные - млекопитающие и птицы а также беспозвоночные - моллюск Anodonta cygnea в часть исследований птицы проведена в онтогенезе г исследованы АЦ сигнальные механизмы действия пептидов инсулинового суперсемейства и выявлены функциональные нарушения в них при патологии - сахарном диабете. В плане развиваемой в лаборатории концепции

Перцева, Шпаков, 2004 молекулярных дефектов в гормональных сигнальных системах как ключевых причин эндокринных заболеваний проведено исследование функциональных нарушений в АЦ сигнальном механизме действия инсулина и ИФР-1, возникающих при сахарном диабете. Впервые обнаружены дефекты в этом сигнальном механизме на уровне каталитического компонента - АЦ, Gs-белка и его сопряжения с АЦ, а также ослабление регуляторных метаболических эффектов гормона

у крыс с экспериментальным стрептозотоциновым диабетом 1-го и 2-го типов. Использование эволюционного подхода позволило выявить не только существование АЦ сигнального механизма действия ряда пептидов инсулинового суперсемейства у позвоночных и беспозвоночных, но и обнаружить принципиальное сходство в его структурно-функциональной организации, свидетельствующее об эволюционной консервативности этой сигнальной системы

Выводы 1. В мышечных тканях представителей позвоночных крысы и беспозвоночных моллюски животных обнаружена чувствительная к влиянию пептидов инсулиноподобного суперсемейства АЦС. Инсулин, ИФР-1 и ИПП моллюска оказывают ГТФ-зависимое активирующее действие на АЦ. АДФ-рибозилирование бактериальными токсинами позволило выявить участие G-белков как ингибирующего Gi-белок , так и стимулирующего

Gs-белок типов в АЦ сигнальном механизме действия изученных пептидов. 2. Установлено участие рецепторов тирозинкиназного типа, в активирующем действии инсулина, ИФР-1 и ИПП моллюска на АЦС, ведущем к образованию внутриклеточного посредника - цАМФ. Показано, что селективные ингибиторы рецепторных тирозинкиназ - тирфостин 47 и генистеин, блокируют активирующее действие исследуемых пептидов на АЦ в мышцах позвоночных и беспозвоночных.

3. Выявлено участие фосфатидилинозитол-3 киназы в АЦ сигнальном механизме действия пептидов инсулинового суперсемейства, на что указывает блокирование активирующего влияния пептидов инсулиновой природы на АЦ в присутствии специфического ингибитор ФИ-3-К - вортманнина. 4. Установлено участие протеинкиназы ПКС идентифицированной с помощью моноклональных антител в реализации

АЦ стимулирующего действия пептидов инсулинового суперсемейства в мышечных тканях позвоночных. 5. На основе совокупности полученных данных, сделан вывод о существовании в клетках позвоночных, ранее неизвестного АЦ сигнального механизма действия инсулина и ИФР 1, включающего сигнальную цепь рецептор-тирозинкиназа Gi-белок г фосфатидилинозитол-3-киназа ПКС Gs-белок аденилатциклаза.

Сходный механизм обнаружен в мышцах моллюска Anodonta cygnea, отличающийся только изоформой ПКС. 6. Экспериментально подтверждена гипотеза о важной роли АЦ сигнального механизма в реализации регуляторного действия инсулина и ИФР-1 на фундаментальные клеточные процессы. Показана их способность стимулировать клеточный рост в культуре клеток Swiss3T3 и ингибировать апоптоз в культуре клеток

Е1А сНа-ras . 7. Обнаружение АЦ сигнального механизма действия пептидов инсулинового суперсемейства природы в тканях-мишенях у представителей как позвоночных, так и беспозвоночных животных, а также сходство в его структурно-функциональной организации указывает на консервативность этого сигнального механизма в эволюции. 8. При эндокринной патологии сахарном диабете 1-го и 2-го типов у человека, а также у экспериментальных животных позвоночных и беспозвоночных при стрептозотоциновой модели диабета обнаружены функциональные

нарушения в АЦ сигнальном механизме действия инсулина и ИФР-1, локализованные в основном на уровне G-белка и его сопряжения с АЦ. Публикации по теме диссертации 1. PertsevaM.N KuznetsovaL.A PlesnevaS.A GrishinA.V PanchenkoV.P. в-agonist-induced inhibitory-guanine-nucleotide regulatory protein coupling to adenylate in mollusk Anodonta cygnea foot muscle sarcolemma

Eur. J. Biochem. Pharmacol. 1992. V. 210. P. 279-286. 2. ПерцеваМ.Н ПлесневаС.А ШпаковА.О РусаковЮ.И КузнецоваЛ.А.Новые данные, свидетельствующие об участии аденилатциклазной системы в механизме действия инсулина и родственных пептидов Доклады Академии наук. 1995. T. 342. 3. C. 410-412. 3. PertsevaM.N PlesnevaS.A ShpakovA.

O Rusakov Yu.I Kuznetsova L.A. Involvement of adenylyl cyclase signalling system in the action of insulin and mollusc insulin-like peptide Comp. Biochem. Physiol. 1995. V. 112. P. 689-695. 4. ПерцеваМ.Н ШпаковА.О ПлесневаС.А. Современные достижения в изучении сигнальных механизмов действия инсулина и родственных ему пептидов Журн. эвол. биохим. физиол. 1996. T. 32. 3.

C. 318-340. 5. PertsevaM.N PlesnevaS.A KuznetsovaL.A ShpakovA.O Derkach K.V. On the tyrosine kinase mechanism of the novel effect of insulin and insulin-like growth factor-I Stimulation of adenylyl cyclase system in muscle tissues Biochem. Pharmacol. 1996. V. 52. 12. P. 1867-1874. 6. ПлесневаС.А БарканР.С РешетниковаГ.Ф КузнецоваЛ.А ПерцеваМ.

Н.Аденилатциклазный сигнальный механизм в митогенном действии инсулина, инсулиноподобного и эпидермального факторов роста Доклады Академии наук, 1999. Т. 368. 6. С.833-838. 7. Kuznetsova L Plesneva S Derjabina N Omeljaniuk E Pertseva M.N. On the mechanism of relaxin action the involvement of adenylyl cyclase signalling system Regulatory Peptides. 1999. V. 80. P. 33-39. 8. ПлесневаС.

А КузнецоваЛ.А ОмельянюкЕ.В ШпаковА.О ПерцеваМ.Н.Аденилатциклазный сигнальный механизм действия релаксина Журн. эвол. биохим. физиол. 2000. T. 36. 6. C. 562-568. 9. КузнецоваЛ.А ПлесневаС.А. Влияние биогенных аминов и полипептидных гормонов на активность протеинкиназы А и аденилатциклазы в мышцах моллюска Anodonta cygnea Журн. эвол. биохим. физиол. 2001. Т. 37. 5.С.395-400. 10.

PlesnevaS.A ShpakovA.O KuznetsovaL.A PertsevaM.N. A dual role of protein kinase C in insulin signal transduction via adenylyl cyclase signaling system in muscle tissues of vertebrates and invertebrates Biochem. Pharmacol. 2001. V. 61. 10. P. 1277-1291. 11. ПлесневаС.А ШпаковА.О КузнецоваЛ.А ПерцеваМ.Н.Роль протеинкиназы С в регуляции процесса трансдукции инсулинового сигнала через аденилатциклазный

сигнальный механизм Российский Физиологический журнал им. И.М.Сеченова. 2001. T 87. 8. C. 1106-1117. 12. ШпаковА.О ПлесневаС.А КузнецоваЛ.А ПерцеваМ.Н.Исследование функциональной организации нового - аденилатциклазного сигнального механизма действия инсулина Биохимия. 2002. T. 67. 3. C. 403-412. 13. PertsevaM.N ShpakovA.O PlesnevaS.

A KuznetsovaL.A. A novel view on the mechanisms of action of insulin and other insulin superfamily peptides involvement of adenylyl cyclase signaling system Comp. Biochem. Physiol. 2003. V. 134. 1. P. 11-36. 14. ШпаковА.О ГурьяновИ.А ВласоваЕ.Н КорольковВ.И КузнецоваЛ.А ПлесневаС.А ВласовГ.П ПерцеваМ.Н.Ингибирование синтетическими катионными пептидами стимулирующего влияния

гормонов на функциональную активность аденилатциклазной сигнальной системы Доклады Академии наук. 2003. T. 389. 1. C. 127-130. 15. ШпаковА.О ПлесневаС.А КузнецоваЛ.А ЛеонтьеваЕ.А.Инсулинрегулируемая аденилатциклазная сигнальная система в клеточной культуре фибробластов мыши линии L Журн. эвол. биохим. физиол. 2003. T. 39. 5. C. 438-444. 16. ПлесневаС.А ПоспеловаТ.

В КузнецоваЛ.А БыковаТ.В ШпаковА.О ПерцеваМ.Н.Новая инсулинкомпетентная аденилатциклазная сигнальная система как возможный механизм антиапоптотического действия инсулина и инсулиноподобного фактора роста 1 Доклады Академии наук. 2003. T. 393. 4. C. 551-553. 17. Kuznetsova L Shpakov A Rusakov Yu Plesneva S Bondareva V Pertseva M. Comparative study of biological activity of insulin of lower vertebrates in the novel

adenylyl cyclase test-system Regulatory Peptides. 2003. V. 116. 1-3. P. 81-86. 18. КузнецоваЛ.А ПлесневаС.А ШпаковА.О ШароваТ.С.Стимулирующее влияние инсулина и эпидермального фактора роста на активность протеинкиназы А, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы и гликогенсинтетазы в скелетных мышцах кур в эмбриогенезе Журн. эвол. биохим. физиол 2004. T. 40. 4. C. 325-333. 19.

КузнецоваЛ.А ПлесневаС.А ШпаковА.О БондареваВ.М ПерцеваМ.Н.Инсулинрегулируемая аденилатциклазная сигнальная система скелетных мышц крысы в условиях введения инсулина in vivo и при инсулиновой недостаточности, вызванной стрептозотоциновым диабетом Журн. эвол. биохим. физиол. 2004. T. 40. 4. C. 334-343. 20. ШпаковА.О ШипиловВ.Н КузнецоваЛ.А БондареваВ.М ПлесневаС.

А ПерцеваМ.Н.Реактивность аденилатциклазной сигнальной системы нервных ганглиев моллюска Anodonta cygnea к серотонину и адренергическим агонистам Нейрохимия. 2004. T. 21. 3. C. 190-197. 21. ШпаковА.О КузнецоваЛ.А ПлесневаС.А ПерцеваМ.Н. О вовлеченности фосфатидилинозитол-3-киназы и протеинкиназы С в аденилатциклазный сигнальный механизм действия релаксина в мышечных тканях крыс и моллюсков

Бюл. экспер. биол. мед. 2004. T. 138. 10. C. 420-423. 22. ШпаковА.О ГурьяновИ.А КузнецоваЛ.А ПлесневаС.А КорольковВ.И ПерцеваМ.Н ВласовГ.П.Использование С-концевых пептидов -субъединиц G-белков для исследования их функционального сопряжения с рецепторами биогенных аминов в тканях крыс и моллюсков Биол. мембраны. 2004. T. 21. 6. C. 441-450. 23.

ШпаковА.О ШипиловВ.Н БондареваВ.М КузнецоваЛ.А ПлесневаС.А РусаковЮ.И ПерцеваМ.Н.Регуляторное действие родственных инсулину нейропептидов моллюска Anodonta cygnea на функциональную активность аденилатциклазной сигнальной системы Нейрохимия. 2005. T. 22. 1. C. 28-37. 24. ШпаковА.О ШипиловВ.Н ГурьяновИ.А КузнецоваЛ.А БондареваВ.М ПлесневаС.

А ПерцеваМ.Н.Молекулярные механизмы регуляторного действия биогенных аминов на функциональную активность аденилатциклазной сигнальной системы в нервных ганглиях моллюска Anodonta cygnea Доклады Академии наук. 2005. T. 401. 6. C. 829-832. 25. ШпаковА.О КузнецоваЛ.А ПлесневаС.А ГурьяновИ.А ПерцеваМ.Н.Молекулярные причины изменения чувствительности аденилатциклазной сигнальной

системы сердечной мышцы к биогенным аминам при экспериментальном стрептозотоциновом диабете Цитология. 2005. T. 47. 6. C. 540-548. 26. ШпаковА.О КузнецоваЛ.А ПлесневаС.А ПерцеваМ.Н.Молекулярные механизмы изменения чувствительности аденилатциклазной сигнальной системы к биогенным аминам при стрептозотоциновом диабете Бюл. экспер. биол. мед. 2005. Т. 140. 9. С.286-290.