ГЕНОМ ЧЕЛОВЕКА, СТРУКТУРА ГЕНОВ.
Раздел 1. Определение генома и его основных элементов.
Термин геном используется для обозначения полной генетической системы клетки, определяющей характер онтогенетического развития организма и наследственную передачу в ряду поколений всех его структурных и функциональных признаков.Понятие генома может быть применено к таксономической группе, виду, отдельной особи, клетке, микроорганизму или вирусу. Так, можно говорить о структуре генома эукариот и прокариот, сравнивать геномы разных видов, изучать особенности строения генома у конкретных индивидуумов или следить за изменениями, происходящими в геноме специфических клеток в процессе их онтогенетической дифференцировки. Часто геном определяется как генетическая информация, заключенная в молекулах ДНК одной клетки. Однако, такие факты, как отсутствие связи между количеством ДНК в расчете на гаплоидный геном и таксономическим статусом видов, а также многочисленные примеры существования огромных различий в содержании ДНК между близкородственными видами (так называемый"С-парадокс") свидетельствуют о том, что далеко не все участки ДНК связаны с информационными функциями. Понятия генома и ДНК в значительной степени тождественны, так как основные принципы организации и функционирования генома целиком определяются свойствами ДНК. Присущие этим молекулам потенциальные возможности практически неограниченного структурного разнообразия определяют все многообразие мира живых существ, как на уровне межвидовых, так и индивидуальных различий в пределах одного вида (Баев и др.,1990; Ратнер,1985).Процесс эволюции и дифференцировки отдельных видов, как правило, сопровождался накоплением изменений в структуре генома. Это касается, прежде всего, таких параметров, как локализация и характер упаковки ДНК в клетках; количество ДНК,приходящееся на гаплоидный геном; типы, соотношение и функции кодирующих и некодирующих нуклеотидных последовательностей; регуляция экспрессии генов; межпопуляционная вариабильность и филогенетический консерватизм первичной структуры генома. В пределах одного вида основные параметры генома достаточно постоянны, а внутривидовое разнообразие обеспечивается за счет мутационной изменчивости, то есть выпадения,вставки или замены нуклеотидов на сравнительно небольших участках ДНК. Чаще всего такие изменения касаются неэкспрессируемых элементов генома (интронов, псевдогенов,межгенных спэйсерных участков ДНК и т.д.).Геномы эукариот, посуществу, можно рассматривать как мультигеномные симбиотческие конструкции, состоящие из облигатных и факультативных элементов (Golubovsky, 1995). Основу облигатных элементов составляют структурные локусы, количество и расположение которых в геноме достаточно постоянно.Присутствие в хромосомах некоторых видов повторяющихся ДНК,амплифицированных участков, ретровирусных последовательностей, псевдогенов, также как наличие в клетке эписом, ретротранскриптов, ампликонов, дополнительных B-хромосом и различных цитосимбионтов (вирусов, бактерий, простейших) является не строго обязательным, их количество и положение может значительно варьировать, то есть эти элементы являются факультативными. В то же время участие факультативных элементов в наследственной передаче признаков, в формировании мутационной изменчивости и в эволюционных преобразованиях видов несомненно доказано. Кроме того, существует непрерывный переход от одних состояний к другим за счет инсерции экстрахромосомных ДНК в хромосомы и выстраивания транспозоноподобных мобильных элементов из хромосом. Следовательно,несмотря на значительные отличия факультативных последовательностей от облигатных по характеру основных информационных процессов (репликации, транскрипции, трансляции и сегрегации), они также должны рассматриваться, как важнейшие элементы генома.Остановимся теперь более детально на основных принципах организации генома человека. В каждой диплоидной клетке с 46 хромосомами содержится около 6 пикограмм ДНК, а общая длина гаплоидного набора из 23 хромосом составляет 3.5 * 10!9 пар нуклеотидов (Kao, 1985). Этого количества ДНК достаточно для кодирования нескольких миллионов генов. Однако, по многим независимым оценкам истиное число структурных генов находится в пределах от 50 000 до 100 000. В разделе 2.4 изложены современные подходы, используемые для подсчета общего количества генов, из которых следует, что наиболее вероятная оценка их числа составляет около 80 000. Сопоставляя это значение со средними размерами гена и соотношением между величиной их экзонных и интронных областей, можно заключить,что кодирующие последовательности ДНК занимают не более 10-15% всего генома (McKusick, Ruddle, 1977). Таким образом,основная часть молекул ДНК не несет информации об аминокислотной последовательности белков, составляющих основу любого живого организма, и не кодирует структуру рибосомальных, транспортных, ядерных и других типов РНК. Функции этой "избыточной" (junk) ДНК не ясны, хотя ее структура изучена достаточно подробно. Предполагается, что эта ДНК может участвовать в регуляции экспрессии генов и в процессинге РНК, выполнять структурные функции, повышать точность гомологичного спаривания и рекомбинации, способствовать успешной репликации ДНК и, возможно, является носителем принципиально иного генетического кода с неизвестной функцией.Наиболее общая характеристика генома может быть получена с помощью анализа кинетики реассоциации молекул ДНК. Динамика плавления геномной ДНК обнаруживает присутствие по крайней мере трех различающихся по химической сложности фракций(Льюин, 1987; Газарян, Тарантул, 1983). Быстро ренатурирующая фракция ДНК состоит из относительно коротких высокоповторяющихся последовательностей; в промежуточную фракцию входит множество умеренно повторяющихся ДНК - более протяженных, но представленных меньшим числом копий; медленно ренатурирующая фракция объединяет в себе уникальные последовательности ДНК, встречающиеся в геноме не более 1-2 раз.С помощью молекулярного анализа проведена идентификация основных классов повторяющихся последовательностей ДНК,составляющих более 35% всего генома человека и включающих сателлитную ДНК, инвертированные повторы, умеренные и низкокопийные повторы, а также мини- и микросателлитные последовательности ДНК. Классификация этих типов повторов достаточно условна и основана, главным образом, на двух характеристиках: длине повторяющихся коровых единиц, которая может варьировать от 1-2 до более, чем 2000 п.о., и числе их копий, также меняющихся в очень широких пределах - от десятка до миллиона на гаплоидный геном. Не менее важными характеристиками различных классов повторяющихся ДНК являются нуклеотидная последовательность "коровых" единиц повтора, специфичность их организации, хромосомная локализация, внутрии межвидовая стабильность, а также возможные функции этих типов ДНК.
Раздел 2. Повторяющиеся последовательности ДНК.
Сателлитная ДНК это класс высокоповторяющихся последовательностей, составляющих около 10% всего генома человека (Kao, 1985). При центрифугировании геномной ДНК в градиенте плотности CsCl эти последовательности образуют четыре отдельных сателлитных пика с различными средними значениями плавучей плотности. Методом гибридизации in situ показано присутствие сателлитной ДНК преимущественно в центромерных,теломерных и гетерохроматиновых районах большинства хромосом, при этом характер гибридизации сходен для всех четырех групп и не зависит от принадлежности ДНК-зондов к семействам повторов, образующих различные сателлитные пики. В каждой из этих групп, однако, присутствует небольшое количество последовательностей, имеющих специфическую хромосомную локализацию. Так например, около 40% длинного плеча Y хромосомы составляет семейство последовательностей, тандемно повторяющихся более 3000 раз и не найденных в других хромосомах.Выделяют три основных типа сателлитной ДНК: (1) короткие- от 2 до 20 п.о., стабильные тандемные повторы с кратностью в несколько десятков тысяч раз, которые иногда перемежаются с неповторяющимися последовательностями; (2) кластеры более протяженных повторов, слегка различающихся по нуклеотидной последовательности; (3) сложные, достигающие нескольких сотен пар нуклеотидов, повторяющиеся последовательности различной степени гомологии (Газарян,Тарантул,1983). К последнему типу относятся альфа-сателлитные или альфоидные ДНК,среди которых найдено много хромосом-специфических последовательностей. Размеры повтрояющихся "коровых" единиц альфоидной ДНК составляют около 170-200 п.о. В геноме человека и других приматов эти мономеры организованы в кластеры по 20 и более "коровых" единиц. После расщепления рестриктазой BamHI в альфоидной ДНК выявляется серия фрагментов, длиной около 2000 п.о., в составе которых обнаруживаются альфоидные последовательности, специфичные для гетерохроматиновых районов разных хромосом человека (1, 3, 4, 5, 9, 6, 7, 11, 17, 19,Х). В некоторых случаях эти повторы гомологичны двум разным хромосомам (9 и 15, 13 и 21, 18 и Х) ( Willard,Waye, 1987).Хромосом-специфические последовательности сателлитной альфо-идной ДНК нашли широкое применение в молекулярной цитогенетике в качестве ДНК-зондов, удобных для маркирования индивидуальных хромосом в метафазных и интерфазных клетках человека (Юров, 1987). Предполагается, что сателлитные ДНК играют важную роль в поддержании структур хромосом и, возможно, в их спаривании в процессе мейоза (Charlesworth et al., 1994).Особое место среди сателлитных ДНК занимают микро- и минисателлитные последовательности, представляющие собой многочисленную группу рассеянных по всему геному относительно коротких тандемных повторов. Микросателлиты - это класс динуклеотидных повторов. Размер повторяющихся единиц в минисателитных последовательностях может меняться от 3 - 4 до 10 - 15 нуклеотидов. Отличительной особенностью микро- и минисателлитов является наличие среди них большого количества участков, вариабильных по числу копий в кластере.Инвертированные или обращенные повторы составляют до 5% генома. Они состоят из двух тождественных копий длиной около 300 п.о., ориентированных в противоположных направлениях на одной нити ДНК и лежащих на расстоянии от нуля до десятка тысяч пар нуклеотидов друг от друга (в среднем - 1,6 кб).Около 1/3 обращенных повторов не разделены промежуточными последовательностями и носят название палиндромов. Среднее расстояние между двумя различными парами инвертированных повторов около 12 кб, и их распределение по геному носит случайный характер. Комплементарные пары легко ассоциируют при отжиге, образуя шпилечные структуры с дуплексной ножкой и однонитевой петлей, длина которой соответствует расстоянию между парой обращенных повторов. Вследствие этого оказываются приблеженными достаточно удаленные друг от друга участки ДНК, что важно для работы ряда ферментов, обеспечивающих процессы репликации и транскрипции. Важно отметить и то, что однонитевой участок ДНК, образующий петлю, становится доступным для действя нуклеазы S1, специфически разрушающей однонитевую ДНК.
Группа умеренно повторяющихся последовательностей очень гетерогенна по длине и числу копий и составляет около 20% генома человека. Как правило, они распределены дисперсно по всем хромосомам, причем относительно короткие последовательности ДНК до 500 п.о., так называемые короткие диспергированные повторы - Sine, повторяются более 100 000 раз, в среднем, через каждые 2.2 кб. Число копий более длинных диспергированных последовательностей - Line, не превышает 10 000. Умеренные повторы найдены во всех структурных компонентах генома за исключением кодирующих областей генов. Два главных семейства умеренных повторов, Alu и Kpn1, занимают,по крайней мере, 10% генома и практически столько же занято несколькими сотнями других семейств повторов этого класса.Основной единицей Alu семейства является короткая последовательность из 300 п.о., повторенная в геноме человека несколько сот тысяч раз, в среднем, через каждые 5 кб или через каждые 2 - 3 диспергированных повтора, принадлежащих другим семействам (Kao, 1985; Льюин, 1987). При этом,кластеры Alu-повторов, как правило, лежат внутри R-дисков метафазных хромосом - Гимза отрицательных (G- дисков). Распределение Alu-повторов по геному весьма неравномерно как между хромосомами, так и по их длине. Так, в хромосомах 14,16, 21 Alu-последовательности концентрируются в области центромеры, а в хромосомах 4, 19, 20, Х и У выраженные кластеры Alu повторов не найдены. Члены Alu семейства не полностью идентичны друг другу. Однако, все они содержат сайт рестрикции для фермента AluI и имеют димерную структуру, то есть состоят из двух прямых повторов длиной около 130 п.о. с богатой аденином вставкой из 31 нуклеотида во втором мономере. Каждая Alu последовательность фланкирована прямыми повторами длиной от 7 до 20 п.о., различными для разных членов семейства и имеющими большую степень гомологии с транспозоноподобными элементами про- и эукариот. Некоторые члены Alu семейства могут транскрибироваться с помощью фермента РНК-полимеразы 111. Предпологается, что при определенных условиях образующиеся при этом молекулы РНК могут обратно транскрибироваться, что в свою очередь, может привести к появлению в клетках Alu-содержащих кДНК, обладающих свойствами ретропазонов, то есть способных инсертироваться в геномную ДНК. В литературе описаны случаи инсерционного мутагенеза Alu повторов, приводящие к гемофилии В и нейрофиброматозу типа 1. Однако, частота таких событий, по-видимому,невелика. Предполагается, что короткие умеренные повторы,подобные Alu семейству, участвуют в регуляции транскрипции,в процессинге РНК и в инициации репликации ДНК. Кроме того,обнаружена высокая степень гомологии Alu последовательностей с одним из видов низкомолекулярной РНК (7 S РНК), участвующей в секреции белков.К числу Line повторов относится Kpn1 семейство, которое состоит из более длинных и значительно более гетерогенных последовательностей, рассеянных по всему геному. В ряде случаев члены Kpn1 семейства группирются в кластеры, образуя более длинные структуры, повторяющиеся несколько тысяч раз.Для некоторых членов этого семейства также доказана возможность инсерции кДНК-овых копий Kpn1- РНК-транскриптов в геномную ДНК и возникновение мутаций. Такое явление было обна-ружено в одном случае гемофилии А. Некоторые Kpn1- последовательности не только транскрибируются, но и способны транслироваться (Charlesworth et al.,1994).
Раздел 3. Мультигенные семейства, псевдогены, онкогены.
Многие гены человека повторены в геноме от нескольких единиц до нескольких сотен раз и образуют мультигенные семейства (Газарян, Тарантул, 1983; Босток, Самнер, 1981; Kao,1985; Льюин, 1987). Эти гены обычно сгруппированы в кластеры в определенных районах одной, либо нескольких хромосом. Во многих мультигенных семействах наряду с функционально активными генами содержатся псевдогены - мутационно измененные последовательности, не способные транскрибироваться или продуцирующие функционально неактивный генный продукт. Примерами мультигенных семейств могут служить гены рибосомальных,транспортных и ядерных РНК, гены альфа- и бета-глобинов, тубулинов, миоглобина, актина, интерферона и многих других. В ряде случаев, возможна избирательная амплификация некоторых семейств генов в процессе их экспрессии, как, например, генов рибосомальных РНК. При этом число способных транскрибироваться копий генов увеличивается за счет их избирательной амплификации в сотни и даже тысячи раз, что сопровождается лавинообразным нарастанием доли соответствующего генопродукта в клетках. Особое место среди мультигенных семейств занимают супергены - очень большие кластеры из сотен функционально и структурно родственных генов, расположенных в сег-ментах отдельных хромосом. Классическим примером супергена может служить HLA комплекс, контролируюший главные антигены гистосовместимости. Он занимает район более 6000 кб на коротком плече хромосомы 6р21 и состоит из серии тесно сцепленных генов, ответственных за синтез множества белков,включающих клеточные поверхностные антигены, молекулы иммунного ответа и некоторые компоненты комплемента. К супергенным семействам относятся три комлекса расположенных на разных хромосомах мультигенов, контролирующих синтез тяжелых и легких цепей иммуноглобулинов. Интересно, что в процессе диффиренцировки B лимфоцитов, продуцирующих иммуноглобулины,происходит структурная перестройка этих семейств. При этом отдельные последовательности ДНК элиминируются, тогда как другие сливаются, так что структура генов иммуноглобулинов в зрелых B лимфоцитах значительно отличается от исходной, то есть от той, которая наблюдается в зародышевых клетках.Одной из важных структурных особенностей генома человека является наличие так называемых псевдогенов, уникальных последовательностей, очень сходных по своей структуре с определенными нормальными генами, но в силу присутствия в кодирующих последовательностях целого ряда мутаций не способных транскрибироваться или правильно транслироваться с образованием структурно и функционально активного продукта.Псевдогены обнаружены для многих генов. Их количество варьирует от одной до нескольких десятков копий на геном и в этом случае они, как правило расположены тандемно. Иногда псевдогены тесно сцеплены с нормальными генами, во многих случаях псевдогены и гены локализованы в разных хромосомах.Для некоторых моногенных заболеваний идентифицированы мутантные аллели, сходные с мутациями в соответствующих псевдогенах. В этих случаях обсуждаеся возможная роль псевдогенов в спнтанном мутационном процессе.
В геноме человека присутствуют также нуклеотидные последовательности, гомологичные генам некоторых вирусов.Впервые эти последовательности были идентифицированы в геноме вирусов, индуцирующих развитие опухолей у животных и человека, и потому они были названы онкогенами. Гомологичные последовательностям в геноме человека носят название протоонкогенов. В настоящее время уже идентифицировано более 100 протоонкогенов. Белковые продукты протоонкогенов, по-видимому, играют важную роль в нормальной пролиферации клеток особенно на ранних стадиях эмбрионального развития, контролируя клеточный цикл и выбор геномной программы развития клетки.При возникновении специфических мутаций в протоонкогенах, а также при нарушениях регуляции их работы, выражающихся в гиперпродукции или в зкспрессии в нетипичномном месте или в несвойственный момент жизнедеятельности клетки, они начинают вести себя как онкогены, стимулируя неконтролируемое размножение и пролиферацию определенных клеточных клонов, что и может, в конечном счете, привести к формированию опухоли.
Раздел 4. Современное определение понятия "ген",транскрипция, регуляторные элементы генов.
Около 10-15% генома человека представлено уникальными транскрибируемыми последовательностями, составляющими основу структурных генов (Льюин, 1987). В настоящее время в понятие"ген" включается не только его транскрибируемая область -экзоны + интроны, но также фланкирующие последовательности -лидерная, предшествующая началу гена, и хвостовая нетранслируемая область, раположенная на 3' конце гена (Рис.2.1 ). В отличие от генов прокариот гены человека редко представлены одной непрерывной последовательностью и в подавляющем большинстве имеют прерывистую структуру. Относительно короткие кодирующие участки - зкзоны, чередуются с длинными интронами, которые транскрибируются и входят в состав первичного РНК-продукта, но затем при процессинге первичного РНК-транскрипта они вырезаются и не участвуют в трансляции.Процесс вырезания интронов из первичных транскриптов получил название сплайсинга. Таким образом, в зрелой мРНК интронные области отсутствуют, а экзоны составляют непрерывную кодирующую последовательность. Размеры зрелых мРНК нередко в десятки раз меньше первичных РНК-транскрипов и, соответственно, размеров самого гена. Согласно классическим представлениям ген - это локус,на хромосоме, мутации в котором реализуются на уровне фенотипа. В молекулярной биологии ген трактуется как ассоциированный с регуляторными последовательностями фрагмент ДНК, соответствующий определенной единице транскрипции. Следовательно, представления о гене формальных генетиков далеко не полностью тождественны его физической единице и соотношения между этими двумя понятиями достаточно запутанные. Отметим некоторые причины этих противоречий. Известно, что мутации одного гена могут приводить к совершенно разным и даже в ряде случаев к комплементарным фенотипам. Результаты прямого секвенирования генома свидетельствуют о присутствии в нем значительного большего числа генов, чем можно ожидать от результатов мутационного анализа. Одна и та же последователь-ность ДНК в геноме может кодировать несколько различных белков, что достигается за счет так называемого альтернативного сплайсинга (образование разных мРНК из одного первичного РНК-транскрипта). В крупных интронах ряда генов обнаружены смысловые последовательности других генов ("ген в гене"),считываемые в противоположном направлении. Транскрипционные единицы генома могут перекрываться за счет наличия разных промоторов. Наконец, благодаря соматической рекомбинации структура транскрибируемых последовательнстей некоторых генов может быть различной в разных клонах клеток одного организма (Т-клеточные рецепторы). Ситуация с определением понятия "ген" еще больше осложняется, если в это понятие включать многочисленные регуляторные последовательности. Возникает вопрос: "Как далеко от гена могут располагаться эти последовательности, чтобы их можно было включать в структуру гена?". Для многих целей оказывается удобным введенное в последнее время понятие "считаемый ген"- counting gene.Последний рассматривается как отдельная транскрибируемая единица ДНК или её часть, которая может транслироваться в одну или несколько взаимосвязанных аминокислотных последова-тельностей. Поэтому последовательность, дающая две транскрипционные единицы за счет альтернативного сплайсинга и, как следствие, два разных белка учитывается как один ген.Однако, если степень гомологии двух генопродуктов, имеющих общий транскрибируемый участок, невелика, то эти последовательности расцениваются как два разных гена (Fields et al.,1994).
По своему функциональному назначению гены могут быть разделены на две группы. Группа I представлена генами, кодирующими собственно белки; группа II - генами, контролирующими синтез рибосомальных, транспортных и ядерных РНК. По характеру экспрессии гены также могут быть подразделены на две группы - гены "домашнего хозяйства" (housekeeping genes),продукты которых необходимы для обеспечения жизнедеятельности любого типа клеток, и тканеспецифические гены, обеспечивающие специализированные функции клеток, то есть гены,функционально активные только в определенных типах клеток(тканей) и только на определенных стадиях онтогенеза, так называемые гены терминальной дифференцировки.Считается, что средние размеры гена человека составляют, примерно, от 10 до 30 кб. Однако, эта величина может колебаться от нескольких десятков до миллионов пар нуклеоти-дов. Согласно последним данным, самый маленький из известных генов- МСС-7, имеет размеры всего 21 п.о. (Gonzales-Pastoret al.,1994), а самый болшой - ген дистрофина -2.2 мегабаз.Гены отделены друг от друга протяженными промежутками -спейсерами, содержащими в своем составе большое количество повторяющихся последовательностей ДНК и нетранскрибируемые уникальные последовательности.
Рассмотрим более подробно современные данные о числе генов в геноме человека. Полученные разными методами оценки этой величены приведены в Табл.2.1. Исходя из размера генома (около 3 000 миллионов п.о.), и среднего размера одного гена порядка 10 - 30 тыс.п.о. (Gilbert, 1992), общее число генов должно быть порядка 100 000. При этом, как уже указывалось,распределение генов на хромосомах крайне неравномерно. Установлено, что более 90% генов находится в Гимза -отрицатель-ных районах метафазных хромосом, в так называемых R-бэндах (Antequera,Bird ,1993). Проведенные недавно прямые исследования методом секвенирования показывают, что в R-бэндах их число достигает 43-50 на один бэнд, а в Гимза- положительных районах хромосом (G бэндах), - только 1-2 на 75-80 килобаз,то есть всего в геноме можно ожидать около 70 000 генов.Оценка числа генов по доле транскрибируемой части генома (всего 12%) дает совсем маленькую величину - 20 000 генов(Wagner et al.,1993). Методом исследования кинетики реассоциации РНК в культуре клеток число генов оценивается между 20 - 40 000 (Lewin, 1990). В то же время в клетках мозга число различных мРНК по некоторым данным достигает 97 000(Wagner et al.,1993). Наиболее точные подсчеты числа генов человека проведены в последнее время и основаны на оценке числа CpG островков (Табл.2.1). Известно, что в промоторной области всех генов "домашнего хозяйства" и примерно у 40 % генов терминальной дифференцировки, обеспечивающих специализированные функции дифференцированных клеток, находятся области коротких динуклеотидных CpG повторов. Разработаны молекулярные методы точной регистрации этих участков, которые показали, что их число в геноме около 45 000, отсюда число структурных генов оценивается в 67-70 000 ( Antequera, Bird,1993). Практически такое же число генов (64 000) определено недавно методом учета маркерных экспрессирующихся последовательностей (expressed sequence tags) (Fields et al., 1994).Таким образом, суммируя вышеизложенное, можно сделать вывод,что в геноме человека содержится, в среднем, около 70-80 000 отдельных транскрибируемых ДНК последовательностей, то есть генов.
Транскрипция гена начинается с 5' конца первого экзона,где расположен сайт инициации транскрипциии. Определенной гомологии между стартовыми сайтами разных генов не наблюдается, но чаще всего они начинаются с нуклеотида А, окруженного пиримидиновыми основаниями. На границах между экзонами и интронами имеются консервативные канонические последовательности, играющие существенную роль в обеспечении точности вырезания интронов во время сплайсинга РНК. Все интронные последовательности начинаются с динуклеотида GT и заканчиваются динуклеотидом AG, называемыми, соответственно, донорными и акцепторными сайтами сплайсинга. На 3' конце многих структурных генов идентифицирована поли(А)-сигнальная последовательность (AATAAA), участвующая в процессе модификации первичного РНК транскрипта и ответственная за альтернативный сплайсинг мРНК, обеспечивающий синтез разных зрелых мРНК с одного и того же первичного РНК транскрипта.
Транскрипция генов осуществляется с помощью фермента РНК-полимеразы. Около 50-70% клеточного синтеза РНК обеспечивается РНК-полимеразой I, локализованной в ядрышках и ответственной за синтез генов рибосомальной РНК. РНК-полимераза II обеспечивает транскрипцию генов, кодирующих собственно структурные белки. Этот фермент локализован в ядре (но не в ядрышках). На его долю приходится 20 - 40% синтеза РНК.РНК-полимераза III контролирует синтез ядерных и транспортных РНК (Льюин, 1987). На 1-м этапе РНК-полимераза связывается с двухнитевым участком ДНК и, расплетая его, делает доступным спаривание смысловой нити ДНК с рибонуклеотидами. После того как первый нуклеотид РНК инкорпорируется в сайт инициации транскрипции, полимераза начинает продвигаться по нити ДНК в направлении 5'- 3', расплетая двойные нити ДНК впереди себя и заплетая их позади. Этот процесс продолжается до достижения терминирующего сигнала,представляющего собой один или несколько терминирующих кодонов. Затем молекулы РНК и фермента высвобождаются и двойная спираль (дуплекс) ДНК полностью восстанавливается.Для правильного начала синтеза РНК необходимо точное взаимодействие РНК-полимеразы с молекулой ДНК. Этот процесс контролируется промотором - специальной регуляторной последовательностью ДНК размерами около 75 п.о., локализованной,как правило, в 5'-фланкирующей области гена. Иногда под контролем одного промотора считывается несколько генов c образованием единого первичного РНК-транскрипта. Промоторные области различных генов довольно разнообразны по своему нуклеотидному составу. Однако, почти для всех промоторов характерно наличие консервативной последовательности из 7 оснований на расстоянии 19-27 нуклеотидов слева от сайта инициации транскрипции. Это, так называемый, TATA -бокс (блок Хогнесса), обеспечивающий корректное расположение РНК полимеразы по отношению к стартовому сайту. На расстоянии 70 – 80 п.о. в направлении 5'-конца от начала транскрипции часто расположена другая консервативная последовательность из 9 п.о. - CAAT- бокс, контролирующий начальное связывание РНК-полимеразы. Мутации в TATA- или в CAAT-боксах могут существенно влиять на скорость синтеза РНК. В 5'-фланкирующей области гена на расстоянии до тысячи пар оснований от начала его кодирующей части располагаются другие регуляторные последовательности, так называемые инхансеры (усилители),способные резко увеличивать продукцию гена за счет увеличения скорости транскрипции. Эти контролирующие элементы могут работать независимо от их ориентации по отношению к сайту инициации. Для некоторых генов найдены участки ДНК, подавляющие транскрипцию, а также так называемые аттенюаторы (ослабители) - последовательности, лежащие между сайтом инициации транскрипции и собственно геном. Они могут блокировать продвижение РНК-полимеразы. Благодаря такому сложному механизму контроля, достигается очень тонкая и эффективная регуляция экспрессии генов практически на всех этапах транскрипции,трансляции и образования функционально зрелого белка. Эти механизмы более детально рассмотрены в других разделах.
Раздел 5 .Изменчивость генома, полиморфные сайты рестрикции, ПДРФ-анализ.
Кодирующие и регуляторные области структурных генов наиболее консервативны в процессе эволюции, так как мутации в них подвержены давлению жесткого естественного отбора.Действительно, небольшие изменения в этих последовательностях, даже замена одного основания, делеция или инсерция нескольких нуклеотидов, могут привести к прекращению синтеза белка или к потере его функции, что, как правило, драматическим образом сказывается на жизнеспособности особей, несущих подобные мутации. Однако, около 90% генома человека состоит из некодирующих последовательностей, подобных сателлитным ДНК, умеренным повторам, интронам и спейсерным промежуткам между генами. Эти участки значительно более изменчивы и содержат множество, так называемых нейтральных мутаций или полиморфизмов, не имеющих фенотипического выражения и не оказывающих заметного влияния на жизнеспособность или репродуктивные свойства особей и, таким образом, не подверженных прямому давлению естественного отбора. Полиморфные локусы являются удобными генетическими маркерами. На основе анализа родословных можно проследить их наследование в ряду поколений, проанализировать сцепление друг с другом, с известными генами и с анонимными последовательностями ДНК, то есть использовать в качестве обычных менделевских признаков в классическом генетическом анализе. Информативность полиморфных локусов определяется уровнем их генетической изменчивости в различных популяциях.
Экспериментально легко выявляются два варианта геномного полиморфизма. Количественые изменения в области локализации мини- и микросателлитных последовательностей ДНК и качественные замены отдельных нуклеотидов, приводящие к появлению полиморфных сайтов рестрикции. В первом случае изменчивость по числу повторенных "коровых " единиц создает серию аллелей, характер и частота которых уникальны для каждого вариабильного локуса. Полиморфизм в сайтах рестрикции связан с присутствием точковых нейтральных мутаций, локализованых, как правило, в уникальных последовательностях некодирующих участков ДНК. Подобные мутации в силу вырожденности генетического кода могут возникать и в кодирующих последовательностях генов. Спонтанные мутации, возникающие в сайтах узнавания для определенных рестриктаз, делают их ре-зистентными к действию этих ферментов. Аналогичным образом,при таких заменах могут создаваться новые сайты рестрикции.Показано, что полиморфные локусы встречаются во всех хромосомах с частотой приблизительно один полиморфный сайт на 300-500 п.о. Этот тип изменчивости ДНК был выявлен и использован для молекулярной маркировки специфических участков генома исторически раньше по сравнению с вариабильными сателлитными повторами (Botstein et al.,1980).Мутационная изменчивость в сайтах рестрикции может быть легко обнаружена по изменению длины рестрикционных фрагментов ДНК, гибридизующихся со специфическими ДНК-зондами. Анализ полиморфизма длины рестрикционных фрагментов, так называемый ПДРФ-анализ (Restriction Fragment Length Polymorphism-RFLP analysis), включает следующие этапы: выделение геномной ДНК, ее рестрикцию специфической эндонуклеазой, элекрофоретическое разделение образующихся фрагментов ДНК и идентификацию фрагментов ДНК, содержащих полиморфный сайт рестрикции, путем блот-гибридизации по Саузерну.При отсутствии рестрикции в полиморфном сайте на электрофореграммах или радиоавтографах (в зависимости от типа мечения ДНК-зонда) будет выявляться один крупный фрагмент, соответствующий по длине последовательности ДНК между двумя соседними константными сайтами рестрикции для той же эндонуклеазы. При наличии рестрикции в полиморфном локусе на электрофореграмме будет присутствовать меньший по размерам фрагмент, равный расстоянию между полиморфным сайтом рестрикции и одним из ближайших константных сайтов рестрикции. С каким именно из двух фрагментов, прилегающих к полиморфному локусу, будет происходить гибридизация зависит от локализации используемого для анализа ДНК-зонда. В частном случае возможна гибридизация одновременно с двумя соседними рестрикционными фрагментами, если выбранный ДНК-зонд комплемен-тарен последовательности, содержащей полиморфный сайт рестрикци. Однако, такие зонды очень редко используются на практике, так как длина рестрикционных фрагментов обычно в десятки раз больше длины ДНК-зондов и далеко не всегда удается выделить и проклонировать фрагмент ДНК, содержащий полиморфный сайт рестрикции. Поэтому в дальнейшем для простоты изложения мы будем рассматривать только более общую ситуацию и считать, что при отсутствии рестрикции в полиморфном сайте ДНК-зонд гибридизуется с одним длинным фрагментом, а при на-личии рестрикции гибридизующийся фрагмент имеет меньшую длину. Таким образом, при анализе ДНК особей, в обеих хромосомах которых присутствует сайт рестрикции в полиморфной области, на электрофореграмме будет выявлен только один бэнд в нижней области геля, соответствующий более короткому фрагменту ДНК. У особей, гомозиготных по мутации, изменяющей полиморфный сайт рестрикции, будет наблюдаться один бэнд в верхней части геля, соответствующий фрагменту большей длины,тогда как у гетерозигот проявятся оба эти бэнда (Рис. 2.3а).ПДРФ-анализ может быть значительно упрощен в том случае,если возможна специфическая амплификация участка ДНК, содержащего полиморфный сайт рестрикции. Тестирование состояния этого локуса возможно путем проведения ПЦР и рестрикции амплифицированного фрагмента. При отсутствии сайта узнавания в исследуемой области ДНК размеры амплифицированного фрагмента не изменятся после его обработки соответствующей эндонуклеазой, тогда как при полном соответствии полиморфной области сайту рестрикции образуются два фрагмента меньшей длины. У гетерозигот будут присутствовать 3 фрагмента,один из которых по длине будет соответствовать размеру амплификата до рестрикции, плюс 2 маленьких фрагмента с той же суммарной длиной. Таким образом, как и в случае использования для анализа блот гибридизации по Саузерну, трем возможным вариантам генотипа будут соответствовать три различных варианта электрофореграмм.
Необходимо подчеркнуть, что первичная идентификация полиморфных сайтов рестрикции, сцепленных с определенными генами, возможна только при наличии соответствующих ДНК-зондов. Дальнейшая тактика заключается в поиске рестрикционной нуклеазы, выявляющей полиморфизм. С этой целью используют широкий набор эндонуклеаз для рестрикции геномной ДНК, выделенной из группы неродственных индивидуумов, представляющих собой репрезентативную выборку популяции. Затем проводят ПДРФ-анализ отдельно для каждой из рестриктаз с набором имеющихся ДНК-зондов. После обнаружения полиморфизма в одной из популяций аналогичные исследования проводят в других популяциях.Следует учитывать, что полиморфные сайты рестрикции всегда представляют собой двухаллельную систему, поэтому даже при самой высокой вариабильности такого сайта, число гетерозиготных по данному локусу особей в популяции не будет превышать 50% Между тем, только при наличии полиморфного сайта в гетерозиготном состоянии можно отличить мутантный аллель от нормального, то есть осуществить его молекулярную маркировку. Следовательно, информационная емкость такого полиморфизма относительно невелика ( см. Главы Y и VII).
Раздел 6. Вариабильные микро- и минисателлитные ДНК.
Гипервариабильные сателлитные повторы являются гораздо более информтивными маркерами по сравнению с полиморфными сайтами рестрикции, так как представляют собой мультиаллельные системы с уровнем гетерозиготности, достигающим 70 -90%. Кроме того, оказалось, что количество высокоизменчивых микрои минисателлитных последовательностей в геноме человека, по-видимому, превышает несколько десятков тысяч, они достаточно плотно и равномерно расположены в каждой из хромосом. Так более 90% из 5000 идентифицированных (C-A)-повторов являются полиморфными, причем в большинстве из них уровень гетерозиготности значительно превышает 50% (Weissenbach et al, 1992). Среди гипервариабильных мини-сателлитных последовательностей различают варьирующие по числу тандемные повторы - VNTR, три-, тетра- и пентануклеотидные повторы, а
также некоторые другие классы повторов. Общее число высокополиморфных минисателлитных последовательностей в геноме превышает 1500 (Armour et al., 1990; Charlesworth et al.,1994). VNTR (variable number tandem repeats - варьирующие по числу тандемные повторы) -характеризуются наличием 10 - 15 -ти нуклеотидных "коровых" последовательностей, сходных с контролирующими элементами рекомбинации E.coli (Jeffreys et al., 1985). С помощью ДНК-зондов, сконструированных на основе тандемно повторяющихся "коровых" последовательностей,можно анализировать индивидуальную изменчивость в единичных или множественных высокополиморфных локусах, несущих однотипную коровую последовательность. Примером может служить VNTR, обнаруженная в интроне миоглобинового гена, включающая четыре тандемных повтора из 33 п.о., фланкированных прямыми повторами из 9 п.о. Полученные из этого района ДНК-зонды с успехом используются для идентификации личности методом ДНК-фингерпринта, так как вероятность совпадения аллелей у двух неродственных индивидуумов по всем гипервариабильным локусам, гибридизующихися с этим ДНК-зондом, значительно меньше 10!-7 (Jeffreys et al.,1991). Высокополиморфные VNTR найдены также в гене инсулина, в области глобинового псевдогена и в Х-хромосоме, содержащей последовательности, гомологичные ДНК вируса гепатита В (Nakamura et al., 1985). В последнее время многочисленные VNTR- последовательности обнаружены в хромосомах 1, 2q, 14, 16, 17, 19 (O'Brien,1992).Поиск новых гипервариабильных локусов основан на системати-ческом скрининге клонированных последовательностей ДНК с помощью искусственно синтезированных "коровых" зондов. Особенно удобны для такого скрининга геномные библиотеки,сконструированные на основе предварительно фракционированных по величине Mbo1 или Sau3A1 фрагментов ДНК, так как большие фрагменты обогащены длинными и более вариабильными минисателитными последовательностями (Armour, et al., 1990). Хорошие результаты были получены также при скринировании космидных библиотек с помощью G-богатых синтетических ДНК-зондов и использование хемолюминесцентного метода в сочетании с ПЦР (Decorte, Cassiman, 1990). В некоторых случаях с этой целью применяют также последовательности ДНК, выделенные из фага М13, имеющего в своем составе сходные структуры (Armour etal., 1990).
Одним из вариантов минисателлитных последовательностей являются тримерные и тетрамерные короткие тандемные повторы-STR (short tandem repeats), которые стабильно наследуются и также обладают высоким уровнем полиморфизма по числу коровых единиц (Edwards et al., 1991). В X хромосоме такие повторы обнаружены через каждые 300 - 500 кб, тогда как в других частях генома они встречаются на расстоянии 10 кб друг от друга. По некоторым оценкам их частота может достигать 1/20кб (Charlesworth et al.,1994). Возможно, истиное число три-и тетрамерных повторов в геноме человека еще больше, так как они обнаружены во многих генах. Подобно другим повторам STR обычно встречаются в некодирующих частях генов. В последнее время, однако, обнаружена группа структурных генов, несущих тримерные повторы в регуляторных и даже в транслируемых частях генов. Изменения числа этих внутригенных повторов в сторону их увеличения может приводить к нарушению функции этих генов вплоть до полного блока экспрессии и быть причиной ряда тяжелых наследственных заболеваний - болезни экспансии (см.Главу X). В качестве зондов для выявления коротких тандемных повторов используют синтетические олигонуклеотиды, построенные из простых повторов трех или четырех нуклеотидов.
В последнее время для обнаружения различных классов микросателлитных последовательностей и STR-повторов применяют эффективные методы, основанные на использовании ПЦР (Edwards et al., 1991). Для этих локусов характерно большое число аллелей, которые различаются по числу коровых единиц.Продукты амплификации этих сайтов могут отличаться друг от друга числом ди- три- или тетрануклеотидных повторов. Для удобства идентификации различных аллелей полимеразную цепную реакцию проводят в присутствии меченых нуклеотидов, а для электрофоретического разделения продуктов амплификации используют специальные секвенирующие гели. Многие STR-локусы настолько полиморфны, что нашли применение в судебной медицине для идентификации личности. Для повышения достоверности результатов с этой целью используют мультиплексные варианты ПЦР, позволяющие устанавливать генотип индивидуума одновременно по нескольким STR-сайтам (Weber,May, 1994; Асеев и др.,1995). Возможность точного генотипирования личности с использованием полимеразной цепной реакции, то есть на минимальном количестве ДНК, является важным методическим преимуществом STR перед ранее рассмотренными VNTR, для анализа которых чаще используют блот-гибридизацию по Саузерну.пр Высокая частота коротких тандемных повторов, уникальность комбинаций числа тетра-, три- и димеров в разных сайтах в сочетании с их большой вариабильностью и сравнительной легкостью идентификации аллелей позволяет широко использовать эти повторы для генетического и физического картирования в качестве наиболее удобных индексных маркеров геномных ДНК-последовательностей (см.Главу III). Такие маркерные сайты получили название STS (sequence tagged sites). В настоящее время в геноме человека уже идентифицировано около 10 000 STS, подавляющее большинство которых представляет собой тандемные повторы 2 - 4 нуклеотидов. Благодаря выраженной индивидуальной специфичности и достаточно стабильному менделевскому типу наследования STS-сайты нашли широкое применение и в молекулярной диагностике генных болезней, прежде всего в качестве молекулярных маркеров для идентификации мутантных хромосом в семьях высокого риска (см. Главу VII).Наличие большого числа гипервариабильных микро- и минисателлитных последовательностей ДНК является характерной особенностью генома человека. Аналогичные последовательности, обнаруженные в геноме приматов, значительно более однородны,что доказывает возможность существенного увеличения вариа-бильности этих участков ДНК за сравнительно короткий эволюционный промежуток (Юров,1988; Gray et al., 1991).Сведения о мутабильности высокополиморфных последовательностей в геноме человека весьма противоречивы. Показано,однако, что в наиболее вариабильных минисателлитных локусах частота мутаций может достигать 5% на гамету (Jeffreys et al., 1988). Предполагается, что одной из главных функций гипервариабильных микро- и минисателлитных последовательностей ДНК может быть контроль гомологичной рекомбинации в мейозе.На культурах клеток показано стимулирующее влияние минисателлитных последовательностей ДНК на гомологичную рекомбинацию. Так, инсерция синтезированной последовательности,составленной на основе гипервариабильных минисателлитов в геномную ДНК приводит к более, чем 10-кратному увеличению числа реципрокных обменов, причем степень этого влияния обратно пропорциональна расстоянию между STR и сайтом рекомбинации (Wahls et al., 1990). Вместе с тем, многие авторы об-ращают внимание на достаточно высокую стабильность минисателлитных аллелей, что позволяет их широко использовать как для генетического маркирования, так и для популяционных исследований и идентификации личности методом ДНК-фингерпринта (Decorte,Cassiman 1993; Edwards et al.,1991; Иванов,1989).
Для многих мутаций, локализованных в некодирующих частях генома, характерны высокие уровни популяционного полиморфизма. Необходимо, однако, подчеркнуть, что эта изменчивость не затрагивает общей структуры генома, определяющей различия между видами. Более того, сопосталение первичных нуклеотидных последовательностей сравнительно протяженных секвенированных участков ДНК (области Т-рецепторных генов длиной около 100 кб) обнаружило сохранение высокой степени гомологии не только в кодирующих, но и, что особенно удивительно, в некодирующих частях этих последовательностей. Если учесть, что эволюционно человек и мышь разделены почти 80 миллионами лет эволюции, эти данные рассматриваются как свидетельство функциональной значимости некодирующих частей этих генов По-видимому, далеко не всякие мутации в некодирующих районах ДНК являются нейтральными и в определенных случаях они могут отрицательно влиять на жизнеспособность. К сожалению, в настоящее время ничего или почти ничего неизвестно о функциях некодирующих ДНК-последовательностей.Высказывалось даже предположение, что их единственной функ-цией является репликация. Отсюда возникло представление об"эгоистической" или "паразитической" ДНК. Конечно, полностью исключить наличие подобных паразитических последовательностей ДНК в любом геноме нельзя. Тем ни менее, представляется маловероятным, что значительная часть генома человека,также как и других видов, относится к эгоистической ДНК.По-видимому, наши знания о роли некодирующей или, как еще говорят, "избыточной" ДНК все еще явно недостаточны. Стабильность структурной организации генома в пределах вида свидетельствует скорее о важной эволюционной роли некодирующих ДНК-последовательностей и об их участии в процессах онтогенеза. Можно предполагать, что ответ на этот интригующий вопрос в какой-то мере будет получен при расшифровке и сравнении полной первичной нуклеотидной последовательности гено-мов у животных разных видов и, прежде всего, у человека и мыши, где прогресс в секвенировании геномной ДНК особенно значителен (см.Главу III). Уместно заметить, что проведенный недавно компьютерный анализ генома человека позволяет предполагать наличие в его некодирующей части особого, пока еще непонятного генетического кода, смысл и значение которого остаются загадочными.
Раздел 7. Мобильность генома, облигатные и факультативные элементы генома.
До сих пор мы рассматривали основные структурные элементы генома человека, положение которых в соответствии с представлениями классической генетики достаточно постоянно.Начиная с 50-х годов стали накапливаться данные о существовании большого числа мобильных генетических элементов,присутствие которых в геноме не является обязательным, а их топография и количество может варьировать в различных клетках, тканях и у разных индивидуумов (McClintock, 1984; Berg,Howe, 1989). У прокариот такие элементы получили название транспозонов. Их структура и функции достаточно хорошо изучены. Отличительной особенностью мобильных элементов является способность существовать как в интегрированном с хромосомой виде, так и в виде отдельных макромолекул - эписом,плазмид, вирусных частиц. Почти 50 различных семейств мобильных элементов описано у дрозофилы . Вместе эти последовательности составляют около 12% гаплоидного набора(Golubovsky, 1995). В геноме млекопитающих содержится до 50 000 диспергированных копий ретропозона LINE размером около 6500 пар основанийю. Семейство Alu- повторов, содержащее от 300 до 500 тысяч копий, также относится к числу мобильных элементов генома (Сharlesworth et al.,1994). Явление лизогении, то есть присутствие вирусных последовательностей в составе ДНК человека и наличие фрагментов генов человека в вирусных геномах, служит одним из примеров мобильности ДНК и возможности "горизонтальной" передачи наследственно закрепленных признаков между видами. Мобильные ДНК, как правило,относятся к факультативным элементам. Как уже отмечалось, не существует четких границ между облигатными и факультативными элементами генома, так как возможен взаимный переход от одного состояния к другому. Структурные локусы или сегменты хромосом могут трансформироваться в факультативные элементы за счет амплификации, интеграции в мобильные элементы или путем образования цитоплазматических ретротранскриптов. Обратный переход от факультативных элементов к облигатным осуществляется посредством инсерций, транспозон-индуцированных перестроек и обратной транскрипции.Факультативные элементы существуют в геноме как популяции информативных макромолекул. Изменения, возникающие в них под воздействием внешних факторов, носят совершенно иной характер по сравнению с классическими мутациями в структурных локусах. Для описания изменений в факультативных элементах предложен термин " вариации" (Голубовский, 1985). Этот термин впервые использован Жакобом и Воллманом для описания поведения эписом (Jacob, Wollman, 1961). Вариации могут приводить к изменениям на генотипическом уровне, то есть к мутациям, вследствие простого перемещения факультативных элементов или сдвига в соотношении между факультативными и облигатными элементами. В этих случаях мутации встречаются одновременно у многих индивидуумов. Подобные изменения упорядочены, могут происходить сразу во многих локусах и отличаются высокой сайт-специфичностью. Локализация структурных перестроек, возникающих в результате вариаций, предопределена первоначальной топографией факультативных элементов на хромосомах. И наконец, сами вариации могут быть индуцированы обычными "не-мутагенными" факторами, такими как температура или межлинейные кроссы (Golubovsky, 1995). Факультативные элементы могут рассматриваться как оперативная память генома, так как во многих случаях спонтанное возникновение мутаций в облигатных элементах опосредовано их активацией. Считается, в частности, что инсерционный мутагенез является причиной спонтанного возникновения 70% видимых мутаций в природных популяциях дрозофилы. Однако, у человека пока зарегистрированы лишь единичные случаи возникновения мутаций вследствие перемещения мобильных элементов генома (Vidaud et al.,1993).
Раздел 8. Изохоры, метилирование, гиперчувствительные сайты.
Перечисленные выше компоненты генома не случайным образом связаны с последовательностями нуклеотидов. И в этом смысле можно говорить о существовании в геноме человека структур более высокого иерархического порядка. Примером служат изохоры - длинные, в среднем, свыше 300 кб сегменты ДНК, гомогенные по композиции оснований или по GC-уровням.62% генома состоит из GC-бедных изохор и в них локализовано около 34% генов, 31% генома представлен GC-богатыми изохорами, содержащими 38% генов, и в 3% изохор, обогащенных GC-последовательностями (так называемых H3 изохор), находится 28% генов (Mouchiroud et al., 1991; Saссone et al.,1993). Таким образом, существуют относительно небольшие участки ДНК, в которых плотность генов в 10 -20 раз выше,чем в остальных последовательностях.
Другой общей чертой генома человека является то, что in vivo значительная доля цитозиновых остатков в молекуле ДНК метилирована, то-есть находится в форме 5-метилдезоксицитидина. Экспериментальное изучение характера метилирования основано на сопоставлении рестрикционных фрагметов, образующихся после обработки ДНК эндонуклеазами, для которых сайты узнавания одинаковы и содержат в своем составе цитозин, но действуют эти ферменты по-разному, в зависимости от того,находится ли это основание в метилированном состоянии или нет. В частности, рестриктазы - Msp1 и Hpa11, узнают последовательность CCGG, но в отличие от Msp1, Hpa11 не расщепляет ДНК в тех сайтах, где внутренний CpG динуклеотид метилирован. Некоторые сегменты генома, особенно это относится к повторяющимся последовательностям, полностью метилированы в местах 5'-CCGG-3' и частично метилированы в 5'-GCGC-3' - сайтах рестрикции для Hha1. В других сегментах наблюдается характерный рисунок частичного метилирования в 5'-CCGG-3'последовательностях (Behn-Krappa et al., 1991). Различные индивидуумы, независимо от их этнического происхождения, практически не различаются по характеру метилирования ДНК в одних и тех же типах тканей, тогда как в процессе онтогенетической дифференцировки происходят значительные изменения рисунков метилирования. В перевиваемых культурах клеток опухолевого происхождения число метилированных сайтов резко уменьшено.
Высказано предположение о наличии прямой связи между метилированием ДНК и состоянием генетической активности в клетках. Существует класс белков, которые специфическим образом связываются с метилированными участками ДНК, делая их недоступными для действия ряда ферментов, в том числе, возможно, и для полимераз. Получено много прямых экспериментальных доказательств роли метилирования ДНК в инактивации эукариотических промоторов, а, значит, и в регуляции активности генов. Напротив, гипометилирование промоторной области генов, в особенности CpG островков, как правило, свидетельствует о функциональной активности генов. Показано, что необычные структуры в молекуле ДНК, также как экзогенная ДНК, инкорпорированная в процессе генетической трансформации, нередко подвергаются метилированию. Известно, что метилирование играет важную роль в инактивации X хромосомы у самок, в регуляции экспрессии генов в процессе развития, а также непосредственно вовлечено в феномен хромосомного (геномного) импринтинга, связанного с различиями пенетрантности некоторых аллелей в зависимости от их происхождения, то есть прохождения через материнский или отцовский гаметогенез (Баранов, 1991).
В GC-богатых изохорах локализовано большое количество CpG островков - последовательностей от 500 до 2000 п.о., характеризующихся очень высоким содержанием гуанина и цитозина (G+C > 60%), представленных в виде кластеров неметилированных CpG дуплетов и, так называемых, G/C боксов - локусов, родственных сайту узнавания для одного из транскрипционных факторов Sp1 - (G)4C(G)4C (Lindsay, Bird, 1987; Bird, 1986;Aissani, Bernardi, 1991). CpG острова содержат много сайтов узнавания для чувствительной к метилированию эндонуклеазы HpaII, а также сайты для редкощепящих рестриктаз, узнающих неметилированные CpG дуплеты. В частности, более 80% Nor1-сайтов связано с CpG-богатыми островками. Как правило,CpG островки локализованы в 5'- фланкирующих последовательностях, 5'-зкзонах и 5'-интронах всех изученных хаузкипинг-генов и 40% тканеспецифических генов. CpG островки являются характерной особенностью транскрибируемых участков генома. Их идентификация в клонированных последовательностях геномных библиотек существенно облегчает поиск конкретных структурных генов . Наибольшая плотность CpG островков наблюдается в теломерных участках хромосом 1, 9,15, 16, 17, 19, 20, 22 (Antonarakis,1994). Точные молекулярные методы регистрации СрG островков показали, что их число в геноме человека приближается к 45000 (Antequera,Bird,1993).
Можно также отметить существование в геноме человека сайтов, гиперчувствительных к действию ДНК-азы 1 и структурно отличающихся от основной массы хроматина. Присутствие таких сайтов показано для многих генов млекопитающих и, по-видимому, это необходимое, но не достаточное условие их экспрессии. Локализация гиперчувствительных сайтов может меняться в процессе развития и под действием гормонов. В некоторых случаях эти участки маркируют положение транскрипционных регуляторных элементов генома, действующих как в положительном, так и в отрицательном направлениях. В других случаях это области функционально активных генов, находящихся в деспирализованном состоянии и имеющих однонитевую структуру.Именно такие однонитевые участки ДНК особенно выско чувствительны к ДНК-азе 1. На этом их свойстве основан метод ник-трансляции in situ, позволяющий непосредственно на хромосомных препаратах визуализировать функционально активные районы хромосом. С этой целью хромосомные препараты обрабатывают ДНК-азой 1, после чего непосредственно на них с помощью ДНК-полимеразы проводят синтез ДНК в присутствии меченых нуклеотидов. При этом метка включается преимущественно только в те участки хромосом,где находятся функционально активные гены (Verma, Babu, 1989).