ГЕНЕТИЧЕСКИЕ КАРТЫ, ПОЗИЦИОННОЕ КЛОНИРОВАНИЕ.
1 Классификация генетических карт, оценка сцепления.
Генетические карты определяют хромосомную принадлежность и взаимное расположение различных компонентов генома относительно друг друга. Возможность построения таких карт обусловлена двумя фундаментальными характеристиками генома:линейным характером локализации генов в хромосомах (это определяется линейностью молекулы ДНК) и относительной стабильностью расположения облигатных элементов генома в пределах вида. При построении генетических карт используют разные подходы. В первую очередь, к ним относятся анализ генетического сцепления на основе определения частот мейотической рекомбинации в информативных семьях и изучение особенностей насле-дования признаков, сцепленных с маркерными хромосомными перестройками. Во-вторых, исследование экспрессии генов или поиск специфических последовательностей ДНК в клеточных гибридах, содержащих лишь часть генома человека - одну или несколько хромосом или их фрагменты. В ряде случаев с этой целью используют механический сортинг целых хромосом и даже их относительно небольших участковв. Эти приемы позволяют привязать картируемый ген к определенной хромосоме и даже к определенному фрагменту хромосомы. С помощью комплекса весьма тонких методов хромосомного анализа, прежде всего, методов гибридизации in situ (см. Главу I) удается картировать отдельные гены на хромосомах человека часто с точностью до одного бэнда. И, наконец, методами молекулярного анализа осуществляют физическое картирование последовательностей ДНК, локализованных в специфических участках хромосом. Затем проводят идентификацию в этих последовательностях транскрибируемых областей, то есть генов, с последующей изоляцией и клонированием соответствующих им полноразмерных молекул кДНК. Каждый из рассмотренных этапов анализа структуры генома завершается построением карт генов, различающихся по единицам измерения расстояний между отдельными элементами этих карт, масштабам, по насыщенности или степени детализации на различных участках генома. Соответственно различают карты сцепления, генетические карты, цитогенетические карты индивидуальных хромосом и физические или молекулярные карты определенных участков ДНК. Для полной молекулярной идентификации отдельных элементов генома, то есть определения их границ, структуры и нуклеотидной последовательности, необходимо совмещение всех типов карт в местах локализации этих элементов.Первым шагом на пути построения генетических карт является формирование групп сцепления генов, контролирующих различные наследственные признаки, и исследование их взаимного расположения в этих группах. На следующем этапе определяют соответствие между генетическими группами сцепления и цитогенетически идентифицируемыми хромосомами или их фрагментами. Цитогенетическую идентификацию хромосом проводят с использованием методов дифференциальной окраски(см.раздел 2). По мере появления все большего числа локаизованных признаков эффективность построения генетических карт значительно возрастает, так как увеличивается число маркированных участков хромосом и, таким образом, появляется возможность комбинированного использования различных экспериментальных подходов для более подробного исследова-ния этих участков.
Принципиальная схема картирования неизвестных генов,представленная на Рис.3.1, включает следующие этапы. 1. Выяснение группы сцепления; 2. Поиск ближайших фланкирующих маркеров; 3. Определение физической области (ДНК-последова-тельности), включающей искомый ген; 4. Клонирование наборфрагментов ДНК, перекрывающих исследуемую область; 5. Выделение из этого набора клонов, содержащих транскрибируемые ДНК-последовательности, предположительно соответствующие гену или его фрагменту; 6. Анализ специфических мРНК и кло-нирование кДНК-последовательности; 7. Секвенирование и идентификация самого гена (Wicking, Williamson, 1991).
Рассмотрим подробнее эту схему.
Построение карт сцепления основано на изучении процессов расхождения и рекомбинации гомологичных хромосом в мейозе. Генетические признаки, локализованные в разных хромосомах, не сцеплены друг с другом, то есть передаются от родителей детям независимо, и частота их рекомбинации (Q)составляет 0.5. Это обусловлено случайным характером расхождения гомологичных хромосом в мейозе во время редукционного деления. Гены, локализованные в одной хромосоме,рекомбинируют за счет кроссинговера, то есть за счет обмена участками гомологичных хромосом в процессе их спаривания в мейозе . При этом порядок генов не нарушается, но в потомстве могут появиться новые комбинации родительских аллелей. Вероятность кроссинговера между двумя генами зависит от расстояния между ними. Чем ближе гены расположены друг к другу, то есть чем больше они сцеплены, тем эта вероятность меньше.
Оценку сцепления между генами проводят на основании статистического анализа сегрегации признаков в семьях с разветвленными родословными. Чаще всего при этом используют метод максимального правдоподобия (Kao, 1983), то есть подсчитывают десятичный логарифм шансов - lod (log of the odds), где шансы (odds) выражаются как отношение вероятности наблюдаемой родословной при условии, что два гена сцеплены (0 +3, гены локализованы в одной хромосоме, причем максимально правдоподобная оценка соответствует максимальному значению lod. При значениях lod Раздел 2. Соматическая гибридизация, цитогенетический анализ, картирование анонимных последовательностей ДНК.
До начала 70-ых годов построение генетических карт человека продвигалось очень медленными темпами. Небольшой размер семей, длительный период одного поколения, ограниченное число информативных родословных и отсутствие методов эффективного цитогенетического анализа всех пар хромосом затрудняло целенаправленное картирование генов человека. Достаточно сказать, что 1-й ген человека - ген цветной слепоты был картирован на Х-хромосоме в 1911г., а 1-й аутосомный ген-только в 1968г. К 1973г. на хромосомах человека было картировано всего 64 гена, а к 1994 на генетических картах человека было локализовано уже свыше 60 000 маркерных ДНК последовательностей, в том числе около 5 000 структурных генов. Столь стремительный прогресс в картировании генов человека связан с появлением новых технологий в цитогенетике, в клеточных культурах и особенно в молекулярной генетике.
Техника соматической гибридизации, то есть возможность экспериментального конструирования способных к размножению межвидовых клеточных гибридов, явилась одним из наиболее мощных инструментов для нахождения связей между группами сцепления и цитогенетически идентифицируемыми хромосомами и даже их отдельными сегментами. Гибридные клоны получают путем искусственного слияния культивируемых соматических клеток разных видов, в частности, клеток человека и различных грызунов - китайского хомячка, мыши, крысы (Шея,1985).
Культивирование таких соматических гибридов, как оказалось,сопровождается утратой хромосом человека. Так были получены панели гибридных клеточных клонов, содержащих всего одну или несколько хромосом человека и полный набор хромосом другого вида. Обнаружение человеческих белков, специфических мРНК или последовательностей ДНК в таких клонах позволяет однозначно определить хромосомную принадлежность соответствующих генов. Таким способом удалось локализовать более 250 аутосомных генов человека (Kao, 1983).Дальнейший прогресс в области генетического картирования в значительной степени ассоциируется с деятельностью многих научно-исследовательских центров и лабораторий по созданию банков клеточных культур, представляющих наиболее,интересные и обширные родословные. Так, в Центре по Изучению Полиморфизма Человека (CEPH) (Париж, Франция) была создана уникальная коллекция перевиваемых клеточных культур от всех членов семей, многоступенчатые родословные которых насчитывают многие десятки и даже сотни индивидуумов (CEPH-семьи) (Todd,1992; Weissenbach et al,1992). Перевиваемые линии клеток получали из первичных культур, трансфорированных вирусом Эпштейн-Барра, после чего такие лимфобластозные клетки становятся "бессмертными", то есть могут неограниченно долго поддерживаться в условиях культивирования. CEPH-семьи представляют собой идеальные системы для генетического анализа наследственных признаков. В результате исследования этих клеточных линий определены генотипы членов CEPH-семей одновременно по тысячам полиморфных локусов и построены соответствующие генетические карты. Кроме того, совместнымусилиями многих лабораторий мира были созданы Банки Клеточных Культур, в которых поддерживаются коллекции лимфобластозных линий клеток, полученных от членов наиболее информативных семей, в которых наблюдается сегрегация по различным наследственным признакам, в том числе по моногенным заболеваниям. Материал этих линий в виде клеточных клонов или образцов ДНК используется, в частности, для анализа сцепления сегрегирующих генов с известными генетическими маркерами или с вновь описанными полиморфными локусами. Таким образом,во многих случаях при картировании генов человека удается преодолеть ограничения, связанные с недостатком обширных информативных родословных.
Наконец, в начале 70-х годов появилась реальная возможность точной идентификации не только всех хромосом в кариотипе человека, но и их отдельных сегментов. Это связанно с появлением методов дифференциального окрашивания препаратов метафазных хромосом, которые, по сути, произвели революцию в цитогенетике и хромосомологии. Для получения дифференциальной окраски хромосомные препараты окрашивают некоторыми флюорохромами, либо, после соответствующей протеолитической обработки или нагревания, - красителем Гимза. При этом на хромосомах выявляется характерная поперечная исчерченность, так называемые бэнды, расположение которых специфично для каждой хромосомы. На метафазных хромосомах малой степени спирализации идентифицируется около 750 таких полос, на прометафазных хромосомах 2 500 - 3 000. Следовательно, величина небольших бэндов на прометафазных хромосомах примерно соответствует 1 сМ на цитогенетических картах или 1 миллиону пар оснований на физических картах. Такие ориентировочные рассчеты, как уже упоминалось, оказываются полезными при сопоставлении масштабов различных генетических карт.
Согласно официально утвержденной номенклатуре (ISCN,1971) каждая хромосома человека после дифференциальной окраски может быть разделена на сегменты, нумерация которых начинается от центромерного района вверх (короткое плечо -р), либо вниз (длинное плечо - q) (Рис.3.4). Полосы в каждом сегменте также пронумерованы в аналогичном порядке. Крупные полосы зачастую подразделяются на несколько частей, соответствующих более мелким бэндам, выявляемым только при окраске малоспирализованных прометафазных хромосом. Запись положения гена на цитогенетической карте включает номер хромосомы, плечо, а также номер сегмента, бэнда и его субъединицы. Например, запись 7q21.1 означает, что ген локализован в субъединице 1, 1-го бэнда 2-го сегмента длинного плеча хромосомы 7.
Такая подробная запись особенно удобна при использовании для цитогенетического картирования метода гибридизации in situ (см.Главу I), позволяющего локализовать ген с точностью до одного бэнда и даже его субъединицы. Основу данного метода, как уже указывалось составляет гибридизация геномной ДНК целых хромосом на разных стадиях их спирализации с предварительно меченными специфическими ДНК-зондами.Источником последних могут служить геномные последовательности ДНК, сцепленные с картируемым геном, либо кДНК-овые по-следовательности. В настоящее время из тканеспецифических библиотек генов выделено около 20 000 анонимных последовательностей кДНК, представляющих более 10 000 различных генов человека (Sikela, Auffray, 1993). Эти кДНК составляют примерно 10-15% всех кодирующих последовательностей генома. Методом гибридизации in situ уже идентифицировано более 2000 генов, для многих из которых пока не найдено сцепление с полиморфными маркерами (Poduslo et al., 1991). Такие кодирующие последовательности присутствуют на карте генов человека, но их пока нет на картах сцепления.
Раздел 3. Генетические индексные маркеры.
Как мы уже отмечали раньше, успешная локализация неизвестного наследственного признака (гена) в значительной степени определяется присутствием на карте фланкирующих маркеров, находящихся на относительно небольшом расстоянии по обе стороны от гена. В качестве генетических маркеров специфических участков хромосом могут быть использованы любые локализованные в этих участках элементы генома с высоким уровнем легко идентифицируемой популяционной изменчивости или полиморфизма. Отбор сцепленных с картируемым признаком генетических маркеров производят по результатам совместного анализа их сегрегации в информативных семьях.Значительные успехи в геномном картировании были связаны с использованием в качестве генетических маркеров широко распространенной во многих популяциях изменчивости по изоферментному спектру различных белков. Оказалось, что многие ферменты у разных индивидуумов, в разных тканях и на разных стадиях онтогенеза могут находиться в различных изоформах.Такие варианты одного и того же белка обычно не отличаются по специфической активности, но имеют измененную электрофоретическую подвижность. Популяционный анализ изоферментов обнаружил существование полиморфизма для очень многих белковых систем, контролируемых разными генами, локализованными во многих хромосомах. Таким образом, для этих хромосом были найдены генетические маркеры, с помощью которых были идентифицированы соответствующие группы сцепления.
Совершенствование молекулярных методов анализа специфи ческих последовательностей ДНК привело к обнаружению большого числа высокоизменчивых участков генома - полиморфных сайтов рестрикции, гипервариабельных мини- и микросателлитных последовательностей. Эта изменчивость также была использована для маркировки участков хромосом с целью установления более точного взаиморасположения локусов. Вскоре после обнаружения полиморфных сайтов рестрикции были опубликованы теоретические рассчеты, согласно которым от 10 до 20 таких локусов, расположенных равномерно на каждой хромосоме на расстоянии около 20 сМ друг от друга, достаточно для определения хромосомной принадлежности генов, ответственных за любой тип наследственной изменчивости (Botstein et al,1980). По этим оценкам около 200 таких индексных маркеров позволят построить карты сцепления для всех известных генов на основании анализа сегрегации соответствующих признаков в семьях с большим числом мутантов. Для определения порядка расположения генов на хромосомах и оценки генетических расстояний между ними достаточно около 400 рав-номерно распределенных полиморфных маркеров.Идентификация в геноме человека большого числа полиморфных сайтов рестрикции и разработка простых методов анализа индивидуальной изменчивости по этим локусам существенно повысили возможности локализации неизвестных признаков на геномных картах. Уже к 1989г. были картированы более 2000 клонированных последовательностей ДНК, обнаруживающих полиморфизм по длине рестрикционных фрагментов (ПДРФ) в различ-ных популяциях (Kidd et al., 1989). Более 1000 из них типировано в CEPH-коллекциях родословных. В значительной степени это анонимные последовательности, связь которых со специфическими генами не установлена. Их наименования чаще всего соответствуют названию отобранного из библиотеки генов клона. В дальнейшем была разработана стандартная генетическая номенклатура для обозначения используемых в качестве маркеров сегментов ДНК с неизвестной функцией. Первая буква D,что значит ДНК, затем номер хромосомы, далее S для уникальных и Z для повторяющихся последовательностей и в конце номер, идентифицирующий данный зонд в определенном районе ДНК.Применение полиморфных сайтов рестрикции в качестве генетических маркеров имеет два ограничения: сравнительно низкая информативность (частота гетерозигот не может превышает 50%- см. Главы II, Y) и неравномерное распределение ПДРФ-сайтов по хромосомам. Этих недостатков практически лишены гипервариабельные STR-сайты (ди-, три- и тетрануклеатидные повторы). Использование микро- и минисателлитных ДНК последовательностей в качестве индексных генетических марке-ров открыло новую эру в построении карт сцепления генома человека. В настоящее время работа по идентификации высокополиморфных маркеров, перекрывающих весь геном и равномерно распределенных по хромосомам практически завершенаа(Weissenbach et al.,1992; Reed et al.,1994). Эта система построена на базе динуклеотидных (C-A)n повторов.(C-A)n*(G-T)n представляют собой наиболее частый класс простых повторов, обнаруженных в геноме человека (за исключением An* Tn мультимеров). Такие повторы присутствуют примерно в 1% колоний из геномных библиотек, сконструированных на базе фрагментов длиной 300 - 500 п.о., которые образуются 90% из них оказываются полиморфными по числу копий в кластере, причем в 70% локусов присутствует более трех аллелей. В 1992г. группе французских ученых под руководством Жана Вайссенбаха удалось разработать систему идентификации с помощью ПЦР индивидуальной изменчивости в местах локализации (C-A)n повторов и на этой основе создать геномную карту из 814 высокополиморфных индексных маркеров со средним расстоянием между ними около 5 сМ, получившую название Genethon-коллекции микросателлитных маркеров (Weissenbach et al., 1992). Для этого были просеквенированы более 12 000 фрагментов ДНК, выделенных из геномной Alu1-библиотеки путем ее скрининга poly(dC-dA)*poly (dG-dT) ДНК-зондом. Праймеры для амплификации подбирали из последовательностей ДНК, окружающих повторы, используя для этого компьютерные программы.Для дальнейшего анализа было отобрано около 3 000 (C-A)n-сайтов и проведена специфическая амплификация этих участков у четырех неродственных CEPH-индивидуумов. На следующем этапе была определена хромосомная принадлежность полутара тысяч наиболее информативных маркеров путем их идентификации в панели из 18 соматических гибридных клонов, содержащих разные наборы хромосом человека. Детальная карта сцепления индексных маркеров построена по результатам их генотипирования в коллекции 8 самых больших CEPH-родословных.
Предложенная система маркеров перекрывает все хромосомы, а суммарное расстояние между ними соответствует примерно 90% всего генома человека.
К 1994г. число индексных STR-маркеров было увеличено до 2 066, а средний интервал между соседними локусами уменьшен до 2,9 сМ (Gyapay et al.,1994). В последнее время перспективы широкомасштабного картирования всего генома человека стали еще более значительны. Группой английских авторов под руководством Дж.Тодда была разработана система автоматического скринирования 254 динуклеотидных маркеров, перекрывающих весь геном человека со средним расстоянием между соседними маркерами около 13 сМ. 80% этих повторов было отобрано из Genethon-коллекции маркеров, остальные - из других источников (Genome Data Base, Baltimore). Амплификацию всех 254 полиморфных сайтов проводили в 39 мультиплексных ПЦР (МПЦР),причем используемые для этих целей олигопраймеры были мечены четырьмя типами флюорохромов, так что аллели даже одинакового молекулярного веса можно было различить на электрофореграмме по цвету. В каждой из 39 МПЦР скринировали 7 – 9 STR-сайтов какой-то определенной хромосомы. Такие МПЦР-наборы были разработаны для всех 22 аутосом и для Х-хромосомы.Регистрация аллелей всех STR проводилась автоматическим сканнером с использованием компьютерной программы Genotyper.Только с помощью одного автоматического сканнера удается проанализировать по этой схеме более 2.5 тысяч генотипов в день! (Reed et al.,1994). Такая система уже сегодня открывает самые широкие возможности не только для генетического картирования и создания подробных карт сцепления практически любых моногенных заболеваний, но, что особенно существенно,она делает реальной разработку стратегии картирования генов,мутации которых предрасполагают к мультифакториальным забо-леваниям, таким как диабет, гипертония, инфаркт миокарда,психозы и многое другое.
Раздел 4. Хромосом-специфические библиотеки генов,пульсирующий гель-электрофорез.
Используя столь обширную систему молекулярных маркеров и проводя анализ сцепления на коллекциях клеточных культур или на материале информативных родословных можно довольно быстро привязать любой признак, особенно моногенный, не только к определенной хромосоме, но даже к одному бэнду, оп-ределить ближайшие фланкирующие маркеры и перейти непосредственно к позиционному клонированию с целью выделения и идентификации самого гена. В этой связи важное значение в картировании генов принадлежит молекулярно-цитогенетическим подходам, являющимся принципиально важным звеном для успеш-ного совмещения карт сцепления и физических карт целых хромосом и их фрагментов.Точность цитогенетического картирования определяется степенью спирализации хромосом, характером использованной метки и разрешающей способностью микроскопического оборудования. При картировании на стандартных метафазных хромосомах и использовании радиоактивно меченых зондов точность картирования ограничивается одним крупным бэндом или даже сегментом хромосомы и составляет около 5-10 миллионов п.о. При использовании биотиновой метки на прометафазных хромосомах точность картирования возрастает в среднем в 5-10 раз (до 1миллиона п.о.), а при работе со специально приготовленными и растянутыми интерфазными хромосомами может доходить до 50 тысяч п.о.(Boehringer Mannheim Mannual,1992). Тем ни менее,даже при такой разрешающей способности цитогенетическое картирование дает лишь весьма ориентировочные результаты и обы-чно рассматривается как 1-й этап физического картирования.Значительно более точные результаты достигаются на 2-м этапе - этапе физического (рестрикционного) картирования.Среднее расстояние между стандартными сайтами узнавания на рестрикционных картах колеблется в пределах от 10 до 20 кб.
Из-за расхождений почти на два порядка масштабов цитогенетического и молекулярного картирования прямое сопоставление этих типов физических карт практически невозможно.Одним из способов преодоления этих трудностей является конструирование хромосом-специфических библиотек генов. Как уже упоминалось для приготовления таких библиотек используют наборы клеточных линий соматических гибридов с отдельными хромосомами человека либо хромосомы, механически отобранные путем проточной цитометрии. Для некоторых видов молекулярного клонирования удобнее оказались библиотеки генов, построенные из субхромосомальных фрагментов.Получение таких фрагментов достигается путем целенаправленного конструирования соматических гибридов, содержащих лишь часть какой-либо хромосомы человека. Субхромосомные клоны мо-гут быть получены и с помощью микроманипуляций, при которых механически, под контролем микроманипулятора может быть вырезан практически любой видимый фрагмент каждой хромосомы.Разработаны также молекулярные методы выделения из генома и идентификации крупных фрагментов ДНК, приближающихся по размерам к единичным хромосомным бэндам. Это стало возможным после обнаружения редкощепящих рестриктаз, разрезающих ДНК на фрагменты длиной от сотен тысяч до миллиона пар нуклеотидов (Estivill, Williamson, 1987).
Другим важным шагом на пути клонирования и анализа больших субхромосомальных фрагментов ДНК явилась разработка методов их разделения путем гель-электрофореза в пульсирующем поле (Barlow, Lehrach, 1987; Smith, Cantor, 1986; Smithet al., 1987). В соответствии со стандартными методами электрофореза под действием однонаправленного постоянного поля в агарозном или в полиакриламидном гелях удается разделять фрагменты ДНК размером не более 3 - 5 десятков килобаз.Продвижение больших фрагментов ДНК в геле при пульсирующем изменении направления электрического поля происходит, по-видимому, за счет конформационных изменений, обусловленных скручиванием и раскручиванием молекул ДНК в момент переключения направления поля. При этом более короткие молекулы легче адаптируются к изменению условий и потому движутся в геле быстрее. Существуют различные варианты пульсирующего гель-электрофореза, главным образом, связанные с геометрическим расположением направлений полей - ортогональный,гексогональный, инверсионный. При использовании любого из этих вариантов могут быть разделены молекулы ДНК размером от 50 кб до более, чем 9 миллионов п.о. Эффективность разделения фрагментов ДНК зависит не только от их размеров, но и от условий проведения электрофореза (напряжение, температура буфера, концентрация агарозы, время одного импульса). В качестве маркеров для определения величины больших молекул ДНК используют целые хромосомы дрожжей известной молекулярной массы. В дальнейшем отбор крупных фрагментов ДНК, несущих специфические последовательности, также может быть осуществлен путем блот-гибридизации с ДНК-зондами. Разделенные и идентифицированные фрагменты ДНК могут быть элюированы из геля и использованы для рестрикционного картирования, построения библиотек генов и для молекулярного клонирования с целью идентификации и изоляции генных последовательностей. В последнее время для изоляции крупных субхромосомальных сегментов ДНК широко используется метод клонирования в искусственных дрожжевых минихромосомах - YAC, и построения библиотек генов на основе YAC-векторов.
Раздел 5. Позиционное клонирование, прогулка и прыжки по хромосоме, идентификация и изоляция генов.
Мы уже упоминали, что средние размеры гена составляют около 10-30 кб, варьируя в широких пределах . Единицы рекомбинации, размеры цитогенетических бэндов и субхромосомных фрагментов ДНК измеряются миллионами пар нуклеотидов, также как и размеры фрагментов ДНК, выделяемых с помощью обработки геномной ДНК редкощепящими эндонуклеазами, пульсирующего электрофореза и клонирования в дрожжевых минихромосомах. Переход от этих крупных фрагментов к последовательностям ДНК, сопоставимым с размерами гена, осуществляют с помощью молекулярного клонирования, то есть получения набора фаговых или космидных клонов, содержащих относительно небольшие последовательности, насыщаяющие или полностью перекрывающие крупный сегмент ДНК, предположительно,содержащий идентифицируемый ген . Затем проводят упорядочивание клонов в соответствии с взаимным расположением инсертированных в них фрагментов ДНК, осуществляя одновременно молекулярный анализ этих фрагментов с целью идентификации регуляторных или кодирующих областей генов. Позднее мы подробнее остановимся на тех критериях, с помощью которых можно различить транскрибируемые и нетранскрибируемые участки генома. Для молекулярного клонирования используют различные подходы (Iannuzzi, Collins, 1990). Прежде всего, это насыщающее клонирование, то есть изоляция из хромосом-специфических библиотек нескольких сотен клонов с целью картирования различными методами инсертированных в них фрагментов ДНК и идентификации клонов с последовательностями, локализованными в заданном районе. Значительно чаще используется тактика скринирования фаговых, космидных и YAC библиотек,cконструированных из субхромосомальных сегментов ДНК, предварительно отобранных на основании сцепления с различными ДНК-маркерами. При этом методы выделения субхромосомальных сегментов ДНК могут быть самыми различными. Дальнейший поиск в библиотеках генов клонов, содержащих транскрибируемые последовательности ДНК, осуществляют достаточно трудоемкими методами, получившими название "прогулки" и "прыжков" по хромосоме."Прогулка" по хромосоме или скользящее зондирование (Рис.3.6). заключается в последовательном отборе клонов, содержащих частично перекрывающиеся фрагменты ДНК из определенного района генома (Rommens et al.,1989). На первом этапе проводят скрининг библиотеки с помощью маркерной ДНК, сцепленной с геном. После нахождения положительных клонов последние сами служат зондами для изоляции других клонов,содержащих перекрывающиеся последовательности ДНК. Таким образом, каждый раз отобранный фрагмент используется в качестве скринирующего ДНК-зонда для последующего поиска. В результате получют набор клонированных фрагментов ДНК, полностью перекрывающих область поиска гена. Группа подобных клонов носит название "контигов". С помощью физического кар-тирования инсертированной ДНК в разных клонах удается точно установить степень перекрывания между соседними фрагментами и соответственно упорядочить положение клонов в "контигах".При скринировании космидных библиотек с выявлением каждого нового клона к участку ДНК, полностью перекрытому отобранны-ми зондами, в среднем добавляется около 20 кб. Таким способом, однако, редко удается пройти более 200 - 300 кб в одном направлении из-за наличия в геноме повторяющихся и трудно клонируемых последовательностей ДНК.
Для преодоления этих ограничений и ускорения процесса поиска генных последовательностей американским исследователем Фрэнком Коллинзом, ныне президентом Программы Геном Человека, был разработан метод "прыжков" по хромосоме. Этот метод позволяет изолировать фрагменты ДНК, отстоящие в геноме друг от друга на сотни тысяч нуклеотидов (длина прыжка),не изолируя при этом все промежуточные последовательности ДНК (Collins, Weissman, 1984). Как видно на представленной схеме (Рис.3.7), прыжки начинаются со стартового зонда, то есть с последовательности, гибридизующейся со сцепленным с геном ДНК-маркером. Предварительно геномная ДНК переваривается редкощепящей рестриктазой, в результате чего образуются большие фрагменты ДНК, соответствующие по длине одному прыжку. Затем, эти фрагменты переводятся в кольцевую форму за счет искусственного присоединения к их концам небольшого маркерного гена. При этом концы рестрикционных фрагментов сближаются. Кольцевые молекулы ДНК разрезают среднещепящими рестриктазами и из пула относительно небольших фрагментов ДНК отбирают те, которые содержат маркерный ген, а, следовательно, и окружающие его концевые участки исходных крупных фрагментов. Отобранные последовательности клонируют в фаговых или космидных векторах, получая библиотеку генов концевых участков. Затем в этой библиотеке проводят скрининг клонов, содержащих стартовый зонд. Только в этих клонах комплементарные зонду последовательности соединены маркерным геном с последовательностями ДНК, отстоящими от стартового участка поиска на длину прыжка. При необходимости промежуточные сегменты ДНК также могут быть клонированы с использованием метода скользящего зондирования.Остановимся теперь на тех критериях, по которым можно отличить сегменты ДНК, являющиеся частями генов, от любых других последовательностей (Рис.3.7.) (Lindsay, Bird, 1987;Rommens et al., 1989; Wicking, Williamson, 1991; Collins,1992). Условно эти критерии могут быть разделены на три группы. В первой группе исследуют структурные особенности генных последовательностей. Вторая группа критериев основана на поиске функциональных участков генов. В третьем случае анализируют характер нуклеотидных последовательностей тестируемых фрагментов ДНК. Диагностику структурных участков генов осуществляют путем гибридизации с ДНК-зондами или прямым скринированием кДНК-овых библиотек. Функциональная диагностика генов включает улавливание экзонов (exon trapping),промоторных участков, поли-A сигнальных последовательностей,а также перенос генов в иные конструкции и идентификацию в них соответствующих транскриптов. И, наконец, поиск генов может быть осуществлен путем прямого секвенирования крупных фрагментов ДНК с последующим компьютерным анализом нуклеотидной последовательности и сопоставлением её с присутствующими в базах данных идентифицированными генами других видов живых существ.
Как уже отмечено ранее, кодирующие области генов,представленные в геноме уникальными последовательностями,достаточно консервативны в процессе эволюции. Существует высокий процент гомологии в структуре ДНК между одинаковыми генами у разных видов млекопитающих. На этом факте основан,так называемый зоо-блот - скрининг клонированных последовательностей, не содержащих повторов, но дающих перекрестную гибридизацию с геномной ДНК, выделенной из разных видов животных - приматов, сельскохозяйственных животных, грызунов,птиц, рептилий. Клоны, содержащие консервативные последовательности, подвергают дальнейшему анализу на присутствие в инсертированных фрагментах ДНК CpG островков, часто маркирующих 5'-фланкирующие области генов позвоночных, особенно генов домашнего хозяйства ( см.Главу II,2.4), и исследуют наличие открытых рамок считывания -ORF (open reading frames).Дальнейший поиск генов в более узком интервале может быть осуществлен с помощью компьютерного анализа соответствующей нуклеотидной последовательности ДНК. Кроме того, все клонированные ДНК из этого интервала могут быть сразу использованы для анализа РНК-транскриптов (Iannuzzi, Collins, 1990).Важным доказательством принадлежности клонированной ДНК гену является идентификация гомологичных РНК транскриптов в тканях, где можно предполагать экспрессию этого гена. С этой целью проводят гибридизацию уже отобранных по первым двум критериям клонов ДНК с тотальной мРНК, выделенной из этих тканей, а также скринируют соответствующие кДНК-овые библиотеки. Для генов наследственных заболеваний с неизвестным первичным биохимическим дефектом библиотеки конструируют из пораженных органов и тканей. При обнаружении последовательностей кДНК, гибридизующихся с геномными зондами, их, в свою очередь, используют для зондирования библиотеки и выявления всех клонов с перекрывающимися последовательностями кДНК. К сожалению, для генов с низким уровнем экспрессии гибридизация может не дать положительных результатов.
Выделенные клоны, удовлетворяющие перечисленным критериям, с большой вероятностью содержат последовательности ДНК,являющиеся частями гена. Однако, всегда существует опасность выбора какого-то другого гена (или псевдогена), локализованного в той же области ДНК. Поэтому требуются дополнительные доказательства идентичности выбранной последовательности ДНК специфическому гену. Такие доказательства могут быть получены, например, при определении нуклеотидной последовательности кДНК и сопоставлении ее с аминокислотной последовательностью кодируемого этим геном белка. Веским доказательством в пользу правильности проведенной идентификации гена может быть обнаружение мутантных вариантов аллелей в изолированных последовательностях ДНК у больных, страдающих соответствующим наследственным заболеванием. Так, например,при идентификации гена муковисцидоза, у 70% больных в клонируемой кДНК последовательности была обнаружена однотипная мутация - делеция трех нуклеотидов - delF508. Наконец, решающим аргументом правильности идентификации нужного гена является успешно осуществленная с его помощью генокоррекция первичного биохимического дефекта, выполненная на соответствующих культурах мутантных клеток, или получение стойкого терапевтического эффекта у трансгенных животных - биологических моделей данного наследственного заболевания.Определение размера молекул мРНК, гибридизующихся с геномными клонами, дает оценку суммарной величины гена. Эта оценка имеет важное значение для реконструирования полноразмерной кДНК. Её клонирование, по-сути, означает идентификаию гена, так как позволяет определить его границы в геномной ДНК, охарактеризовать его экзонно-интронную структуру и регуляторные элементы. Зная первичную нуклеотидную последовательность кДНК, можно с уверенностью прогнозировать аминокислотную последовательность соответствующего белка и таким образом определить первичное биохимическое звено в патогенезе соответствующего наследственного заболевания.
Описанный способ изучения молекулярных и биохимических основ наследственных заболеваний получил название обратной генетики, а сам процесс в отличие от традиционного пути от белка к гену, так называемого функционального клонирования,был назван позиционным клонированием, тем более, что термин обратной генетики уже использовался ранее для обозначения метода анализа функции гена путем направленного введения в него мутаций (Collins, 1992).
Возможность использования функционального клонирования зависит от доступности информации о белковом продукте и/или о функции соответствующего гена. Для подавляющего большинства моногенных болезней определение первичного биохими-ческого дефекта представляет собой очень трудную задачу из-за недостаточного понимания функционирования огромного числа клеточных ферментов, сложностей их взаимодействия,низких концентраций, отсутствия эффективных методов выделения и очистки а, зачастую, даже из-за отсутствия сведений о клетках - мишенях, в которых следует искать первичный биохимический дефект. Поэтому на фоне стремительного роста данных о структуре генома чеовека и, прежде всего, о насыщенности генами и анонимными ДНК маркерами отдельных хромосом и их сегментов, реальные соотошения функционального и позиционного клонирования в идентификации генов, ответственных за наследственные заболевания, быстро меняются в сторону безусловного доминирования последнего.
Успех позиционного клонирования определяется возможностями картирования гена, при этом функция гена исследуется уже после его идентификации и клонирования. На рис. 3.8 представлена общая схема позиционного клонирования, заимствованная из работы Коллинза (Collins, 1992). Обычно, для нахождения положения неизвестного гена на карте сцепления используют 100 - 200 полиморфных маркеров. После обнаружения хромосомной принадлежности картируемого гена более точная локализациия может быть установлена с помощью прицельного отбора дополнительных индексных маркеров из определенного цитогенетического сегмента. Картирование гена, определяющего наследственное заболевание, может быть значительно ускорено при наличии у какого-то больного цитогенетически видимой структурной перестройки в области локализации этого гена, чаще всего делеции или транслокации. Хотя такие пациенты, как правило, встречаются редко, но описание даже одного такого случая может исключить необходимость картирования гена путем последовательного анализа его сцепления с генетическими маркерами целого генома и позволит перейти непосредственно к молекулярному клонированию. Именно таким образом были идентифицированы гены хронического грануломатоза,миопатии Дюшенна, ретинобластомы, X-сцепленной глухоты, ней-рофиброматоза I, аниридии и некоторых других наследственных болезней.
С другой стороны, в ряде случаев удается исключить длительный процесс молекулярного клонирования, используя метод"кандидатного гена". Разработка методов, облегчающих нахождение транскрибируемых областей генома, улавливание экзоновби регуляторных участков генов, секвенирование и картирование методами гибридизации in situ большого количества анонимных кДНК последовательностей, изолированных из тканеспецифических библиотек, все это в комплексе приводит к значительному увеличению степени насыщенности различных сегментов хромосом известными генными последовательностями, среди которых и осуществляют поиск гена-кандидата. Большая роль в этих исследованиях принадлежит также мутантным генетическим линиям животных, моделирующим различные наследственные заболевания человека (см Глава VIII). Значительное сходство нуклеотидных последовательностей кодирующих участков гомологичных генов млекопитающих и человека, наличие большого числа консервативных групп сцепления с наборами идентичных генов позволяют успешно вести параллельные исследования геномов человека и других животных, значительно ускоряющие эффективность поиска и молекулярного анализа индивидуальных генов человека (Dietrich et al., 1994; Copeland et al, 1993).Молекулярная идентификация генов открывает широкие возможности для анализа тканеспецифической регуляции их экспрессии в процессе развития организма на всех уровнях от транскрипции до трансляции. Следуюшим этапом молекулярного анализа является генотипирование мутаций и исследование тех нарушений в структуре, локализации или в ферментативной активности соответствующих белков, которые возникают в результате изменений нуклеотидных последовательностей ДНК. Эти проблемы более подробно освещены в следующих разделах книги.
Отметим только, что в настоящее время подобные исследования стали возожны для многих сотен наследственных заболеваний человека, для которых идентифицированы геномные последовательности ДНК, соответствующие генам, и проклонированы пол-норазмерные кДНК-последовательности.
Раздел 6. Каталог генов и генных болезней МакКьюсика. Международная программа "Геном человека".
Огромный вклад в систематизацию и обобщение информации о генетических картах хромосом человека, локализации и функциях отдельных генов, и о структуре генома в целом, вносят исследования, проводимые на протяжении последних 30 лет в Университете Джона Хопкинса в Балтиморе под руководством профессора Виктора МакКьюсика. Результатом этих исследований является систематическое, с 2-х-годичным интервалом между последними пятью публикациями, издание энциклопедий, содержащих сводные данные о всех картированных генах человека и связанных с ними наследственных болезнях под названием:"Менделевсое наследование у человека: каталог человеческих генов и генетических болезней" ("Mendelian inheritance in man. Catalogs of autosomal dominant, autosomal recessive,and X-linked phenotypes". Эти издания содержат современные хромоcомные карты генов человека и для каждого локуса обобщенные в виде отдельных статей сведения о характере наследования, функциях и размерах генов; методах их картирования и идентификации; кодируемых продуктах; мутантных аллелях, полиморфизмах и внутригенных повторах; фенотипических проявлениях мутаций, их связи с наследственными заболеваниями, а также о природе основного дефекта, включая патогенез и патофизиологию заболевания. Все статьи снабжены исчерпывающими литературными ссылками. Cводные таблицы по картированным локусам с различным типом наследования и по генам наследствен ных заболеваний составлены либо в соответствии с их хромосомной локализацией, либо в алфавитном порядке по названиям генов или по наименованиям соответствующих генных болезней. Отдельно представлены данные по клонированным генам,для которых известен первичный молекулярный дефект. При этом количество различных идентифицированных мутантных вариантов для разных генов колеблется от одного до нескольких сотен.
Издания содержат также список доступных мутантных клеточных линий.
Каждому локализованному менделирующему локусу в этой энциклопедии присвоен шестизначный номер (MIM), первая цифра которого определяет характер наследования: 1 - для аутосомно-доминантных генов, 2 - для аутосомно-рецессивных, 3 и 4-для генов, локализованных в X- и в Y-хромосомах, соответственно, 5 - для митохондриальных генов. Четыре цифры,следующие после точки непосредственно за шестизначным номером, предназначены для кодирования различных мутантных вариантов данного локуса. Издания выпускаются как в печатной форме, так и в компьютерном варианте (OMIM) на дискетах или на компакт-дисках. В последнем случае они снабжены программами, позволяющими осуществлять поиск по любой позиции и проводить постоянное обновление энциклопедии текущей информацией. Программы OMIM совместимы с другими базами генетических данных, в первую очередь, с GDB (Genome Data Base),содержащей полную информацию (включая последовательности ДНК) обо всех картированных генах, ДНК-маркерах и ДНК-зондах человека, а также и с GenBank - полной базой данных всех известных нуклеотидных gоследовательностей ДНК.
В последнем 11-ом издании энциклопедии МакКьюсика содержатся сведения о 6678 картированных менделирующих локусах человека (McKusick, 1994). Из них 4458 генов с аутосомно-доминантным характером наследования, 1730 - с аутосомно-ре-цессивным, 412 генов локализовано в X-хромосоме, 19 - в Y-хромосоме и 59 - в митохондриальной ДНК. Для более чем 2800 картированных генов определена их функция. С моногенными заболеваниями связано 770 картированных локусов, а общее
число нозологических форм, для которых гены картированы,включает 933 заболевания. При этом более 420 генов наследственных болезней уже клонированы и для каждого из этих генов описано от одного до нескольких сотен мутантных вариантов аллелей, характеризующихся различным фенотипи-ческим проявлением.
Различные хромосомы и их участки картированы с разной степенью детализации. На самой крупной по размерам хромосоме 1 картировано вдвое меньше генов, чем на Х-хромосоме ( 200 и 400 соответственно). Плотность уже картированных генов в
разных хромосомах очень неравномерна. Так, хромосома 19 содержит 178 генов, тогда как хромосома 13 только 40, при этом первая больше второй. Хромосомы 17 и 18 примерно равны по величине, но на первой уже картировано 180 генов, а на второй- только 26. На хромосоме 2 картировано примерно такое же количество генов (около 175), как и на втрое меньше её по размерам хромосоме 17. Существеные различия в числе картированных генов отмечаются и внутри различных участков хромосом. К примеру, 19 из 43 генов хромосомы 21 локализованы в сегменте 21q22.3, составляющем лишь 20% длинного плеча. Область 9q34 занимает 10% хромосомы 9, но содержит 27% генов -38 из 141 (Antonarakis, 1994). Число подобных примеров неравномерного распределения картированных генов по хромосо-мам может быть значительно увеличено.
Более 10 лет тому назад был полностью просеквенирован митохондриальный геном (Anderson et al., 1981), состоящий из 16 569 нуклеотидов и содержащий 37 генов, 22 из которых это гены транспортных РНК, 2 гена рибосомальной РНК и 13 белковых генов, кодирующих субьединицы комплексов окислительного фосфорилирования (OXPHOS). Следует отметить, что 56 субьединиц этого комплекса кодируется ядерными генами (McKusick:1994). Митохондриальная ДНК очень плотно насыщена кодирующими участками, так как митохондриальные гены не содержат интронов и имеют очень ограниченные размеры некодирующих фланкирующих ДНК. В настоящее время описано достаточно много болезней, связанных с мутациями в митохондриальном геноме, и все они развиваются вследствие нарушений в системе окислительного фосфорилирования.
Мы уже упоминали о том, что в настоящее время проклонировано около 20 000 анонимных последовательностей кДНК, выделенных из тканеспецифических библиотек генов и представляющих около 10-15% всех генов человека. Хотя этих последова тельностей пока нет на картах генов, секвенирование, сопоставление с компьютерными базами данных и гибридизация in situ позволят уже в самое ближайшее время провести их идентификацию и локализацию (McKusick, Amberger, 1993).
Следует отметить, что каждый картированный ген и полиморфный локус сами по себе автоматически становятся точками отсчета в геноме, то есть молекулярными маркерами. Наряду с этим, продолжается интенсивное насыщение генома новыми моле-кулярными маркерами типа STS ( sequence tagged sites) и микросателлитными повторами типа STR (short tandem repeats). К сентябрю 1994г Genome Database (GDB) включала 6691 STR-сайтов и 3 752 из них (56%) имели уровень гетерозиготности более 60%. Карты сцепления для индексных маркеров сконструированы, в основном, по результатам генотипирования сорока CEPH референтных семей .
Среднее расстояние между соседними маркерами варьирует от 2 сМ для хромосомы 21 до 5 сМ для самых крупных хромосом с очень небольшим числом участков в геноме с расстоянием между маркерами большим, чем 10 сМ. GDB содержит 672 гена, локализованных на картах сцепления индексных маркеров, из общего числа 3485 клонированных генов (Guapay et al., 1994). Созданные в последние годы достаточно подробные геномные карты сцепления молекулярных маркеров в масштабах 13, 0; 5,0 и даже 2,9 сантиморганид; автоматизация процесса генотипирования маркерных микросателлитных (STR) аллелей; большое число уже картированных структурных генов, анонимных ДНК-последовательностей значительно упрощают и, главное, ускоряют процесс генетического картирования. Если в 1992г. в распоряжении иследователей было только 814 динуклеотидных полиморфных сайтов (Weissenbach et al.,1992), то уже к маю 1994 г. Их число возросло до 3 300 (Guyapay et al.,1994) , а к концу года - до 5 000- 6 000 (Shmitt, Goodfellow, 1994). Столь же быстрыми темпами нарастает число молекулярных маркеров и в геноме лабораторных мышей (Service, 1994). По всей види-мости, человек и лабораторная мышь будут первыми млекопитающими с полностью расшифрованными геномами.Картирование генов человека и выяснение первичной нук-леотидной последовательности человеческого генома составляют основные, взаимосвязанные задачи Международной программы "Геном Человека". Официально эта научная программа с участием ведущих молекулярно-генетических лабораторий США, Западной Европы, России и Японии оформилась в 1990г. Однако, задолго до приобретения официального статуса, в этих странах проводились важные молекулярные исследования по изучению генома человека и картированию его генов. История отечественной программы началась в 1987г. Её инициатором и безусловным
лидером в течение многих лет был академик А.А.Баев. По его настоянию в 1989г. она стала одной из ведущих Государственных научно-технических программ СССР. Основные разделы этой программы как в России, так и во всем мире включают три главных направления научных исследований: 1. Картирование и секвенирование генома; 2. Структурно-функциональное изучение генома; 3. Медицинскую генетику и генотерапию (Баев,1990;1994).
Предполагалось, что основной раздел программы, касающийся секвенирования всего генома, то есть выяснения первичной последовательности всей молекулы ДНК одной клетки человека длиной около 1,5 метров, состоящей из 3.5х10!9 нуклеотидов, будет завершен уже к 2 005 году. Однако, серьезные технические усовершенствования этого трудоемкого процесса,его автоматизация и резкое снижение себестоимости (от 1$ США за один шаг в 1990г. до 0,2$ в 1995г.) позволяют надеяться,что эта гигантская молекула, несущая информацию о всей прог-рамме индивидуального развития человека и его эволюции будет полностью расшифрована уже к 2 000 году ! (Marshall, 1995).
Естественно, что в итоге этой работы будут идентифицированы и все гены человека, то есть будет точно определено их число, взаиморасположение на генетической карте и структурно-функциональные особенности. Предполагается, что осуществление этого проекта, помимо колоссальных теоретических обобщений для фундаментальных наук, окажет огромное влияние на понимание патогенеза, предупреждение и лечение наследственных болезней, значительно ускорит исследование молекулярных механизмов, лежащих в основе развития очень многих моногенных нарушений, будет способствовать более эффективному поиску генетических основ мультифакториальных заболеваний и наследственной предрасположенности к таким широко распространенным болезням человека как атеросклероз, ишемия сердца, психиатрические и онкологические заболевания.