БИОЛОГИЧЕСКИЕ МОДЕЛИ НАСЛЕДСТВЕННЫХ БОЛЕЗНЕЙ ЧЕЛОВЕКА.
1. Генетические линии животных.
Большая роль в исследовании проблем генетики человека и медицинской генетики принадлежит мутантным генетическим линиям животных и, в особенности, генетическим линиям мышей(Конюхов, 1969, 1980; Корочкин, 1978). Высокий процент сходства по нуклеотидными последовательностям между кодирующими, регуляторными и даже интронными областями гомологичных генов млекопитающих и человека, а также наличие большого числа консервативных групп сцепления с идентичным расположением генов наряду с возможностями использования очень мощных экспериментальных подходов для идентификации и клонирования генов линейных животных позволяют проводить параллельные исследования, значительно ускоряющие эффективность поиска и молекулярного анализа индивидуальных генов человека.Для многих моногенных заболеваний человека животные,несущие мутации в гомологичных генах, являются лучшими, а зачастую и единственными моделями для исследования молекулярных основ патогенеза и отработки оптимальных схем лечения, в том числе и с применением методов генной терапии. Поиск таких биологических моделей, прежде всего, ведется, среди уже существующих генетических линий животных с установленным типом наследования определенных аномальных признаков. Наиболее трудным при этом является доказательство идентичности мутантных генов и, соответственно первичных биохимических дефектов, у человека и у линейных животных.
В различных питомниках мира, в том числе и в России,созданы и поддерживаются кллекции, насчитывающие от десятков до несколько сотен генетических линий различных экспериментальных животных - мышей, крыс, кроликов, собак и др. (Конюхов, 1969; 1980; Staat, 1969; Hogan et al, 1989; Бландова и др., 1990). Среди них генетические линии мышей наиболее многочислены в первую очередь из-за высокой плодовитости,удобства содержания, относительной легкости экспериментального манипулирования и целого ряда других причин. Некоторые из этих линий представляют собой случайные находки, другие,а их большинство, получены в результате действия различных мутагенных факторов. Так, значительное число биологических моделей было получено путем биохимической селекции потомства мышей самцов, обработанных сильными мутагенами - этилнитроз-мочевиной, триэтиленмеламином или облученных Рентгеном. Так были смоделированы на мышах альфа-талассемия, полицитемия,почечный ацидоз (Erickson, 1988). Однако, такой способ получения животных-моделей, хотя и более эффективен, чем поиск спонтанно мутировавших особей, также основан на чистой случайности и не позволяет направленно менять структуру нужного гена.
Процесс создания подобных генетических линий обычно включает отбор особей с фенотипическими отклонениями; анализ наследования этих фенотипческих признаков; длительное близкородственное разведение отселектированных особей. При моногенном наследовании такие линии могут либо целиком состоять из мутантных гомозигот, либо поддерживаться через гетерозиготных особей в случае сниженной жизнеспособности и нарушения плодовитости у гомозигот.
На первом этапе поиска адекватной модели какого-либо моногенного наследственного заболевания руководствуются сходством клинических проявлений течения болезни и фенотипом мутантных животных. Однако, одного этого сходства недостаточно (Конюхов, 1969). Необходимо доказать гомологичность генотипической природы наблюдаемых нарушений, то есть доказать, что у человека и у животных (мышей) фенотипические изменения обусловлены мутациями в гомологичных генах. Огромная мировая генетическая коллекция мышей насчитывет несколько сотен линий, в каждой из которых различные дефекты наследуются по моногенному типу. Спонтанные биологические модели наследственных болезней известны и достаточно полно изучены для многих других экспериментальных и домашних животных.Представляется удивительным, что, несмотря на большое сходство геномов млекопитающих и наличие близких по первичной структуре и тождественных по функциям структурных генов,для значительной части наследственных болезней человека генетические аналоги среди животных до сих пор не найдены (Конюхов, 1969).
Это ограничение в настоящее время может быть преодалено путем целенаправленного конструирования генетических модельных линий животных. Экспериментальные основы такого подхода уже хорошо разработаны (Erickson, 1988; Аллен и др., 1990;Melton, 1993; Stewart et al., 1994). Для этого используют технику культивирования и трансфекции эмбриональных стволовых клеток (см.ниже), отбор in vitro клонов с нужными генетческим изменениями и пересадку их в зародыши или в соматические ткани животных. Для анализа экспрессии мутантных генов in vivo и оценки их биологического действия особенно удобными оказались трансгенные животные.
Раздел 2. Трансгенные животные.
Трансгенных животных получают в результате искусственного введения - трансгеноза, чужеродного генетического материала, представляющего из себя фрагмент гена или иную последовательности ДНК, в оплодотворенную яйцеклетку или в ранние зародыши млекопитающих. Подобные модели являются идеальными экспериментальными системами для исследования молекулярно-генетических основ онтогенеза, для изучения функции чужеродного гена, оценки его биологического действия на организм, а также для производства различных манипуляций со спе-цифическими клеточными клонами in vivo. Разработано несколько способов получения трансгенных животных. Исторически более ранним и широко применяемым до настоящего времени является микроиньекция чужеродной ДНК в пронуклеус - ядро оплодотворенной яйцеклетки. Существуют детальные описания этого метода (Аллен и др., 1990; Hogan et al, 1989). Суть метода состоит в том, что под контролем микроскопа при помощи микроманипулятора в мужской пронуклеус оплодотворенной яйцеклетки тонкой иглой (до 1 микрона) вводят около 2 пиколитров раствора ДНК. Чужеродная ДНК, вначале свободно лежащая в нуклеоплазме, в течение нескольких последующих делений дробления случайным образом интегрирует в один из сайтов какой-либо хромосомы, то есть встраивается в ДНК-реципиента.При этом, как показали эксперименты с меченой ДНК, в различных бластомерах одного и того же дробящегося зародыша интеграция может происходить в разные хромсомные сайты и число интегрированных копий ДНК в каждом из этих сайтов может значительно варьировать. Тем не менее, поскольку сам эмбрион развивается, по-сути, из одного бластомера, во всех клетках такой особи после рождения чужеродная ДНК обычно находится только в одном каком-нибудь хромосомном сайте, хотя у разных особей она интегрируется по-разному и в разные сайты. После введения чужеродной ДНК в пронуклеус яйцеклетку трансплантируют самке-реципиенту. Доля трансгенных животных в потомстве таких самок варьирует от 10% до 30%. Это означает, что подобный механический вариант трансфекции чужеродных генов на ранней стадии эмбриогенеза является чрезвычайно эффективным.Идентификацию трансгенных животных производят путем анализа геномной ДНК на наличие экзогенных последовательностей, используя при этом методы блот-гибридизации или ПЦР. Экспрессию введенного гена анализируют путем идентификации специфических мРНК и/или соответствующих белковых продуктов в различных тканях трансгенного животного.Другой, более более прогрессивный способ получения трансгенных животных основан на том, что трансфекции подвергается не зигота, а тотипотентные эмбриональные стволовые клетки , которые затем трансплантируют в полость бластоцисты (Gardner, 1978). Этот метод и его решающие преимущества в плане генетического моделирования подробно рассмотрены в разделе 4.
Как правило, иньецированная ДНК при встраивании в хромосому образует блок из множества тандемно расположенных копий, при этом число единиц повтора в блоке у разных особей может варьировать от единицы до нескольких сотен.После интеграции введенной ДНК в хромосому различные генетические конструкции устойчивы и стабильно передаются потомству в соответствии с законами Менделя. Встраивание введенной ДНК в функционально значимые области генома может приводить к их дестабилизации и сопровождаться появлением мутаций, спектр которых очень разнообразен. Таким образом,животные, полученные при введении одного и того же гена, будут различаться как по сайтам интеграции, так и по количеству копий встроенной чужеродной ДНК, а в некоторых случаях,по уровню мутабильности и по типам индуцированных мутаций.Таким образом, каждое трансгенное животное в этом смысле уникально.
Трансгенные животные являются черезвычайно удобным обьектом для анализа роли отдельных элементов гена в регуляции его работы. Так, сопоставление характера экспрессии введенного гена у животных, различающихся по длине фланкирующих последовательностей иньецированной ДНК, дает возможность обнаружить элементы гена, контролирующие его работу в разных типах тканей. Для облегчения анализа регуляторных последовательностей гена часто вводят генетические конструкции, сочетающие эти элементы с геном-репортером, экспрессия которого выражается в появлении известной и легко определяемой ферментативной активности. Использование для трансгеноза рекомбинантных молекул ДНК, представляющих собой различные комбинации регуляторных элементов и кодирующих последовательностей, ведет к более глубокому пониманию молекулярных механизмов активации генов в разных типах тканей.Как уже указывалось, случайный характер интеграции чуже-родной ДНК нередко индуцирует мутации и нарушает экспрессию нормальных генов реципиента. В ряде случаев наблюдаемые отклонения в развитии оказываются аналогичными или сходными с уже известными наследственными нарушениями у человека и подобные животные также могут использоваться в качестве гене-тических моделей заболеваний. Этот подход был применен для получения моделей таких заболеваний, в патогенезе которых решающую роль играет эффект дозы генов. В частности, путем трансфекции зиготы мышей генами бета-глобина, коллагена, ре-нина, антигенов гистосовместимости удалось получить биологические модели таких заболеваний, как бета-талассемия, несовершенный остеогенез, гипертония и диабет, соответственно (Erickson, 1988). Во всех перечисленных случаях введение дополнительной дозы экспрессирующего гена приводило к нарушению балланса белковых генопродуктов в клетках и, как следствие этого, было причиной патологических процессов.
Раздел 3. Экспериментальное моделирование.
Другой вариант биологического моделирования основан на получении животных с определенными очень специфичными, но ненаследственными изменениями. Эти животные также могут быть использованы для анализа молекулярных основ патогенеза и разработки методов адекватного лечения. Рассмотрим несколько примеров подобного экспериментального моделирования.Описанная технология трансгеноза (введение генов в пронуклеус) может быть использована, в частности, для направленного получения животных с избирательными дефектами (уродствами) тех или иных тканей и органов. Метод заключается в возможности селективной элиминации тех специфических типов клеток, которые отсутствуют или дефектны у больных с моделируемым типом заболевания. Такие животные могут быть получены при иньекции в зародыш рекомбинантной ДНК, содержащей какой-либо цитотоксический ген, например, ген дифтерийного токсина, находящийся под контролем работающих в определенных типах клеток регуляторных элементов ДНК. При активации этих контролирующих элементов на определеной стадии развития экспрессия токсического гена приводит к избирательной гибели всей специфической популяции клеток, то есть такая система действует как очень точный скальпель.
Дальнейшая модификация метода заключается в использовании для трансгеноза условно летального гена, каким является,например, ген тимидинкиназы вируса Герпеса. Клетки,экспрессирующие этот ген, функционируют совершенно нормально. Однако, на любой стадии онтогенетического развития можно вызвать их селективную гибель при введении животному ганцикловира - противогерпесного препарата. Эта система дает больше возможностей для экспериментального анализа роли специфических клонов клеток в процессе нормального развития, а также для изучения патологичеких процессов, связанных с гибелью этих клеток. Подобная методология используется также при разработке генотерапевтических подходов для лечения некоторых ненаследственных, в частности онкологических заболева-ний.Весьма многообещающим методом моделирования представляется направленное выключение работы определенных генов путем введения в доимплантационные зародыши антисмысловых мРНК.Такой подход был применен, в частности, при попытке моделирования болезни Гоше - лизосомного заболевания, обусловленного дефицитом бета-глюкуронидазы (Bevilacqua et al., 1988).Естественно, что в этом случае выключение экспрессии гена носит транзиторный характер, то есть моделью, по-сути, является само животное - реципиент антисмысловой мРНК матрицы.
Другой пример экспериментального моделирования основан на пересадке тканей или клеток атимусным иммунодефицитным мышам nu/nu. У мышей этой линии в связи с отсутствием тимуса и выраженным врожденным иммунодефицитом не происходит оттор-жение трансплантированных чужеродных тканей. Более того, у таких животных может происходить дифференцировка трансплантированных подкожно эмбриональных зачатков и регенерация пересаженных кусочков тканей из различных органов других видов животных и человека. Так например, кусочки трахеи крысы с нанесенными на них клетками бронхогенного эпителия человека,имплантированные подкожно атимусным мышам, формируют структуру поверхностного эпителия, сходную с той, которая имеется в бронхах человека. Именно таким путем мыши nu/nu были ак-тивно использованы для анализа экспрессии мутантных вариантов гена муковисцидоза человека, а также для испытания эффективности коррекции этого генетического дефекта с помощью методов генотерапии. В последнем случае мутантные эпителиальные клетки пациентов с муковисцидозом вначале подвергали трансфекции ретровирусными или аденовирусными векторами, несущими, наряду с геном - репортером, полноразмерную кДНК нормального гена муковисцидоза. Относительная простота подобных моделей и возможность генетического манипулирования с клетками человека до их трансплантации атимусным мышам делают этот подход весьма привлекательным для решения многих экспериментальных вопросов. Основные недостатки таких моделей связаны с трудностями содержания и разведения атимусных мышей и их низкой жизнеспособностью. Генетические линии животных в этом отношении имеют значительные преимущества.
Раздел 4. Конструирование модельных генетических линий животных.
Современный уровень экспериментальной эмбриологии млекопитающих и современные достижения молекулярной генетики позволяют осуществлять направленное получение генетических моделей наследственных болезней путем введения сайт-специфических модификаций в геном млекопитающих. Такой значительный качественный прорыв в генетическом моделировании стал возможен благодаря появлению принципиально новой технологии манипулирования с ранними зародышами млекопитающих. Особенно важными в этом отношении оказались два новых методических подхода: получение зародышей-химер, состоящих из клеточных клонов разных зигот, путем введения тотипотентных клеток в полость бластоцисты (Gardner, 1978) и разработка технологии культивирования клеточных векторов, так называемых эмбриональных стволовых клеток (Evans, Kaufman, 1981). С другой стороны, появились методы сайт-специфического переноса клонированных последовательностей ДНК в геном эукариот, основанные на отборе клеточных клонов, в которых после трансфекции происходит инсерция экзогенной ДНК в гомологичном сайте геномной ДНК без какого-либо нарушения последовательности ДНК в месте встраивания.
Конструированию генетических моделей должны предшествовать идентификация и сравнительный анализ двух гетерологичных генов - гена человека, вследствие нарушения работы которого развивается моделируемое заболевание, и его гомолога у выбранного для моделирования животного. При выборе обьекта моделирования, в первую очередь, руководствуются методическими возможностями экспериментального манипулирования с животными. Важное значение имеет сходство кодирующих областей гетерологичных генов по нуклеотидным последовательностям. В большинстве случаев мыши представляются наиболее удобным обьектом для моделирования. Современный алгоритм формирования генетической линии животных с мутациями в заданном гене предполагает: (1) наличие культур тотипотентных, то есть способных к неограниченному развитию и дифференцировке, эмбриональных стволовых клеток; (2) создание на базе рекомбинантных ДНК генно-инженерных конструкций для направленного переноса генов; (3) трансфекцию этих конструкций в культуры эмбриональных стволовых клеток последующим скринингом и отбором клонов со специфическими генетическими модификациями;(4) введение отобранных модифицированных клеток в зародыш на стадии бластоцисты по методу Гарднера с целью получения химерных трансгенных животных; (5) отбор химерных особей, не-сущих модифицированные гены в различных тканях и органах;(6) селекцию особей, гетерозиготных по данной мутации; (7)инбредное разведение и селекцию гомозигот.
Как упоминалось ранее, идеальной системой для направленного переноса мутаций в геном млекопитающих являются эмбриональные стволовые клетки - ЭСК (Evans, Kaufman, 1981;Erickson, 1988; Labosky et al., 1994). Первичные культуры этих клеток получают из клеток бластоцисты (внутренней клеточной массы) или из первичных половых клеток ранних постимплантационных зародышей. При выращивании на питательном слое из эмбриональных фибробластов ЭСК сохраняются в недифференцированном состоянии от трех месяцев до года. При этом они могут быть несколько раз заморожены и оттаяны без потери способности к дифференцировке. ЭСК, введенные в бластоцель (полость бластоцисты), сохраняют свою тотипотентность и могут участвовать в формировании, практически, всех эмбрио-нальных зачатков и органов развивающегося зародыша. В результате образуется животное - химера, состоящее из клеточных клонов двух разных типов: клеток исходного родительского генотипа и ЭСК. Если эти клетки различаются, например, по генам окраски шерсти, животное - химера будет иметь поперечную или пятнистую окрашенность. При этом все животные, независимым образом полученные в результате введения в одинаковые по генотипу зародыши одной и той же линии клеток, будут отличаться друг от друга по характеру пятнистости, так как все химеры различны по набору клеточных клонов, развившихся и дифференцировавшихся из введенных в зародыш ЭСК. Химерные животные, у которых ЭСК дифференцировались в половые клетки и дали начало полноценным зрелым гаметам будут устойчиво передавать своим потомкам генетическую информацию, содержащуюся в ЭСК. Таких животных ингда называют зародышевыми трансмиттерами. При скрещивании их с мышами дикого типа часть потомков будет уже гетерозиготна по мутантным генам ЭСК, то есть будут нести мутацию в гаплоидном состоянии в каждом типе клеток. Это в равной степени относится и к мутациям, искусственно введенным предварительно в ЭСК. Скрещивая таких гетерозигот, можно получить животных, гомозиготных по заданной мутации. Естественно, последнее достижимо только в том случае, если мутация не окажется летальной в гомозиготном состоянии у животных этого вида.Возможность вести селекцию нужных мутантных или трансгенных клонов ЭСК и лишь затем их использовать в качестве клеточных векторов нашло широкое применение в генетическом моделировании. Первоначально для этой цели ЭСК обрабатывали различными мутагенами (этилнитрозомочевиной) отбирали клоны клеток, несущих мутацию в нужном гене, и затем использовали их для создания инъекционных химер по Гарднеру.Таким способом на мышах была получена модель болезни Леш-Нихана - мутация гена гипоксантин-фосфорибозил-трансферазы(Hooper et al.,1987). C разработкой технологии адресной доставки чужеродной ДНК в гены-мишени этот способ генетического моделирования стал особенно эффективным. Сайт-специ-фическая модификация генов ЭСК достигается за счет гомологичной рекомбинации между экзогенной и хромосомной ДНК. При трансфекции большая часть проникших в ядра молекул рекомбинантной ДНК сохраняется там в течение двух-трех дней в виде кольцевых эписом и в дальнейшем теряется либо происходит интеграция трансфецирующей плазмиды в геном клетки- хозяина путем негомологичной рекомбинации, то есть в случайные сайты хромосомной ДНК. В таких клетках экспрессия введенных генов устойчиво сохраняется. Частота интеграции экзогенной ДНК может быть повышена при использовании линейных плазмид и специальных, преимущественно, ретровирусных векторов экзогенной ДНК (см. Главу IX). Случаи стабильной интеграции экзогенной ДНК могут быть легко выявлены, если трансфецирующие плазмид или вектора содержат селектируемый маркерный ген. Чаще всего в качестве маркера используют прокариотический ген neo, сообщающий клеткам устойчивость к неомицину. Клетки, в которых произошла интеграции такой плазмиды в хромосомную ДНК, будут образовывать устойчивые клоны при выращивании на среде G418, содержащей неомицин, в то время как все другие клоны клеток будут в этих условиях деградировать.
Раздел 5. Методы направленного переноса генов.
Наиболее важным шагом на пути искусственного получения мутантной линии животных является отбор клонов ЭСК с сайт-специфической модификацией определенного гена. Однако, случаи инсерции экзогенной ДНК в ген-мишень очень редки, их общая частота, обычно, не превышает 10-6. Предпринимаются попытки генетической модификации ЭСК с тем, чтобы повысить в них частоту гомологичной рекомбинации. Идентифицированы некоторые гены, контролирующие этот процесс у мышей и у человека. Однако, в любом случае схемы направленной модификации генов должны включать селекцию нужных клонов клеток. Впервые направленная сайт-специфическая модификация была выполнена также на гене гипоксантин-фосфорибозил-трансферазы и была получена еще одна генетическая линия мышей, моделирующая вызванную дефектом в HPRT-гене болезнь Леш-Нихана у человека(Thomas, Capecci, 1987). Успех этих исследований, в первую очередь, обусловленсуществованием простых схем отбора клеток с функционирующим и нефункционирующим HPRT-геном на селективных средах. Важно также, что этот ген локализован в X-хромосоме и в ХУ-клетках он представлен одной копией.При этих условиях случаи модификации гена, вызванные инсерцией экзогенной ДНК в правильном положении, легко идентифицируются - .В настоящее время предложено несколько вариантов для направленного переноса неселектируемых генов за счет дополнительной инсерции в трансфецирующую плазмиду селектируемого маркерного гена в таком положении, при котором его экспрессия происходит преимущественно при правильном встраивании векторной последовательности в ген-мишень. Так,маркерный ген neo, помещенный в инсертируемую область ДНК плазмиды без собственного промотора, может экспрессироваться только находясь под контролем какого-либо другого промотора хромосомной ДНК. Для этого инсерция экзогенной ДНК должна произойти в область гена-мишени без сдвига рамки считывания.При случайной интеграции экспрессии маркерного гена не будет Таким образом, отбор неомицин-устойчивых клеток приведет к резкому увеличению частоты клонов, в которых произошла гомологичная рекомбинация между зкзогенной и геномной ДНК. На этом же принципе основано использование генетических конструкций с геном neo, не содержащим поли-А последовательности в 3' области. Дальнейший поиск гомологичных рекомбинантов среди G418-устойчивых клеток проводят путем блот-гибридизации, используя в качестве ДНК-зонда фрагмент векторной последовательности, расположенный вне направленно переносимого участка экзогенной ДНК.Особенно перспективным на сегоднешний день представляется метод позитивно-негативной селекции (Melton, 1994). Метод сочетает отбор клеток, в которых произошла интеграция экзогенной ДНК, с селективной элиминацией тех из них, где встраивание произошло за счет негомологичной рекомбинации.Для этого маркерный селектируемый ген neo с регуляторными последовательностями инсертируют в переносимую область ДНК плазмиды, а вне этой области встраивают условно летальный вирусный ген тимидинкиназы герпеса (HSV-tk). При интеграции такого вектора в геномную ДНК путем гомологичной рекомбинации HSV-tk ген не инкорпорируется в хромосому, тогда как при негомологичной рекомбинации этот ген будет присутствовать в неомицин-устойчивых клетках. Обработка таких клеток противогерписным агентом - ганцикловиром, будет сопровождаться гибелью всех клонов, экспрессирующих вирусную тимидинкиназу.
Отбор клеток с модифицированным геном также может производиться с помощью ПЦР. При этом не используют какие-либо маркерные гены и/или селектируемые среды. Олигопраймеры для амплификации выбирают таким образом, что один из них гомоло-гичен соседней с сайтом интеграции последовательности модифицируемого гена, а другой соответствует участку инсертируемой экзогенной ДНК.Метод позволяет обнаруживать присутствие пяти правильно модифицированных клеток среди 50 000. После трансфекции клетки разделяются на группы, в каждой из которых проводят тестирование с помощью ПЦР. При положительном ответе группу клеток разбивают на подгруппы и процедуру повторяют до тех пор, пока не удается изолировать нужные клоны.
Направленное выключение генов-мишеней может быть достигнуто несколькими способами. Так называемые, нулевые мутации могут быть получены путем встраивания плазмиды, содержащей,наряду с экзонными последовательностями модифицируемого гена и селектируемым маркерным геном, сильные транскрипционные и трансляционные стоп-сигналы. При этом в разрушенном за счет инсерции экзоне транскрипция прекращается, в результате чего образуется укороченный белок, незащищенный от действия клеточных протеаз.
Более совершенной является разработанная недавно техника двойной замены гена. Для этого используют ЭСК, дефицитные по ферменту HPRT - НМ1 (Melton, 1994). На первом этапе ген-мишень инактивируют путем замены одного из экзонов и прилежащих последовательностей на HPRT мини-ген. При этом в нокаутирующем векторе HPRT маркер фланкируется ДНК последовательностями, гомологичными месту вставки в ДНК гена-мишени. В этот же вектор включен и ген вирусной тимидинкиназы. После трансфекции отбираются клетки позитивные по HPRT и негативные по вирусной тимидин-киназе. Именно в таких клетках с высокой степенью вероятности произошла гомологичная рекомбинация с заменой одного из экзонов на инсертированный мини-ген HPRT. Факт такого встраивания доказывается при помощи ПЦР. На следующем этапе инсертированный HPRT мини-ген заменяют на отсутствующий фрагмент гена-мишени, в который предварительно вносят интересующие исследователя мутации. При этом альтернативный вектор несет те же фланкирующие ДНК-последоваельности гена-мишени, что и первый (нокаутирующий) вектор. Клетки HPRT минус на этом, 2- м этапе с большой вероятностью будут нести гомологичную рекомбинацию встроенной конструкции мини-HPRT гена и альтернативного фрагмента исходного гена. Факт такой рекомбинации контролируется с помощью ПЦР. Таким образом, вместо обычного выключения функции гена, что достигается уже на 1-м этапе, данная технология позволяет вносить в структуру гена дикого типа различные,заранее спланированные изменения, в том числе и специфические мутации, аналогичные таковым при наследственных болезнях у человека. Следовательно, данный подход позволяет проводить более тонкое генетическое моделирование и исследовать особенности функции мутантного гена in vivo.
Для введения специфических мутаций в определенные экзоны гена используют, так называемые "hit & run" векторы (Hasty et al., 1991). Перспективным также представляется использование дрожжевых YAC-векторов, несущих полноразмерные кДНК-овые последовательности гена. Так как уровень гомологичной рекомбинации у дрожжей достаточно высок, в такие конструкции легко вводить специфические мутации и затем использовать их для трансфекции ЭСК и получения трансгенных животных 4.
Отбор клонов эмбриональных стволовых клеток, в которых произошла направленная модификация гена-мишени, в значительной степени, предопределяет успех всего комплекса работ по созданию модельной генетической линии. Однако, и дальнейшие этапы этой программы, включающие получение химерных трансгенных животных, идентификацию зародышевых трансмиттеров(химер, продуцирующих трансфецированные половые клетки) и селекцию гетерозиготных, а затем гомозиготных мутантнах особей, требуют большой квалификации, труда и времени. Осложняющим обстоятельством является то, что химерные животные нередко имеют сниженную жизнеспособность и плодовитость. То же может быть справедливо и в отношении гетерозиготных мутантных особей. В гомозиготном состоянии инсертированные мутации могут не только снижать жизнеспособность и плодовитость, но и обладать летальным или полулетальным эффектом уже в пренатальном периоде. В таком случае линия поддерживается путем отбора и скрещивания гетерозигот.
Несмотря на огромные методические сложности и высокую стоимость, направленное получение моделей наследственных болезней оправдывает затраченные усилия. Мутантные животные представляют уникальную возможность исследовать патофизиоло-гические процессы, развивающиеся в организме вследствие нарушений работы определенного гена, анализировать влияние специфических мутаций на фенотип, тестировать новые лекарственные препараты и испытывать различные терапевтические подходы. Велика также роль генетических линий в разработке методов генной терапии.