Ферменты микроорганизмов и их классификация

. Использование ферментов микробов в практической деятельности человека.

Ферменты — биологические катализаторы. Они катализируют тысячи химических реакций, из которых слагается метаболизм микроорганизма. В настоящее время известно около двух тысяч ферментов.
Ферменты представляют собой белки с i молекулярной массой от 10000 до нескольких миллионов. Название ферменту дается по веществу, на которое он действует с изменением окончания на «аза». Например, целлюлаза катализирует гидролиз целлюлозы до целлобиозы, уреаза катализирует гидролиз мочевины (urea) до аммиака и С02 и т. п. Однако чаще фермент получает название, которое указывает на природу катализируемой,йм химической реакции.

Ферменты синтезируются самой микробной клеткой и имеют сложное строение. Некоторые состоят из белка – протеина, а другие представляют собой протеиды, состоящие из белка – апофермента и структуры небелковой природы – кофермента. В этом случае апофермент соединяется с активной группой изменяемого вещества, а кофермент способствует течению реакции.

Современная классификация ферментов также строится с учетом природы катализируемых ими реакций. Согласно разработанной комиссией по ферментам Международного биохимического союза классификации, они подразделяются на шесть главных классов.
Оксидоредуктазы — это ферменты, катализирующие окислительно-восстановительные реакции. Они играют большую роль в процессах биологического получения энергии. К ним относятся дегидрогеназы (НАД, НАДФ, ФАД), цитохромы (Ь, с, сь а, а), ферменты, участвующие в переносе водорода, электронов и кислорода, и др.
Трансферазы катализируют перенос отдельных радикалов, частей молекул или целых атомных группировок от одних соединений к другим. Например, ацетилтрансферазы переносят остатки уксусной кислоты — СН3СО, а также молекул жирных кислот; фосфотрансферазы, или киназы, обусловливают перенос остатков фосфорной кислоты Н2Р 0 3 2 _. Известны многие другие трансферазы (аминотрансферазы, фосфорилазы и т. д.).
Гидролазы катализируют реакции расщепления и синтеза таких сложных соединений, как белки, жиры и углеводы, с участием воды. К этому классу относятся протеолитические ферменты (или пептидгидролазы), действующие на белки или пептиды; гидролазы глюкозидов, осуществляющие каталитическое расщепление углеводов и глюкозидов (р-фруктофуранозидаза, а-глюкозидаза, а- и р-амилаза, р-галактозидаза и др.); эстеразы, катализирующие расщепление и синтез сложных эфиров   (липазы, фосфатазы).
Лиазы включают в себя ферменты, катализирующие отщепление от субстратов определенных химических групп с образованием двойных связей или присоединение отдельных групп или радикалов к двойным связям. Так, пируватдекарбоксилаза катализирует отщепление С02 от пировиноградной кислоты.
К лиазам относится также фермент альдолаза, расщепляющий шестиуглеродную молекулу фруктозо-1,6-дифосфата на два трех-углеродных соединения. Альдолаза имеет большое значение в процессе обмена веществ.
Изомеразы осуществляют превращение органических соединений в их изомеры. При изомеризации происходит внутримолекулярное перемещение атомов, атомных группировок, различных радикалов и т. п. Изомеризации подвергаются углеводы и их производные, органические кислоты, аминокислоты и т. д. Ферменты этой группы играют большую роль в ряде процессов метаболизма. К ним относятся триозофосфатизомераза, глюкозофосфатизомера-за и др.
Лигазы катализируют синтез сложных органических соединений из простых. Например, аспарагинсинтетаза осуществляет синтез амида аспарагина из аспарагиновой кислоты и аммиака с обязательным участием аденозинтрифосфорной кислоты (АТФ), дающей энергию для этой реакции.
К группе лигаз относятся также карбоксилазы, катализирующие присоединение С02 к различным органическим кислотам. Например, фермент пируваткарбоксилаза катализирует синтез щаве-левоуксусной кислоты из пировиноградной и С02.

Каждый класс ферментов обозначается цифрами. Первая цифра означает класс фермента; вторая – подкласс, указывающий соединение, на который действует фермент; третья – подподкласс; четвёртая – номер фермента. Все цифры разделяются точками. Так, каталаза обозначается 1.11.1.6.

Для определения вида микроорганизма пользуются определением у него наличия или отсутствия ферментов класса гидролаз.

Ферменты нашли широкое применение в пищевой промышленности и в меньшей степени в других видах производства. Дело  в  том, что иммобилизованные ферменты и клетки в основном используют в получении пищевых продуктов и в меньшей степени фармацевтических препаратов. Такое ограничение вызвано весьма малой доступностью  (в широких масштабах)  ферментов, способных катализировать реакции технологической значимости, на пример, в органической или неорганической химии, нефтехимии, полимерной химии, фармацевтической промышленности и т. д. Напротив, традиционное использование растворимых ферментов в пищевой промышленности создало определенный фундамент для дальнейшего совершенствования методов в этой области.

Определение понятий «бактериемия», «септицемия», «токсемия», «моноинфекция», «смешанная инфекция», «вторичная (секундарная) инфекция», «реинфекция», «суперинфекция», «ремиссия», «микробоносительство», «сверхострое, острое, подострое и хроническое течение болезни», «типичная и атипичная (абортивная), доброкачественная и злокачественная формы болезни».

Бактериемия - наличие бактерий в крови. В норме кровь стерильна, и обнаружение бактерий в крови (обычно при помощи посева крови) всегда свидетельствует о патологии. Наличие циркулирующих в крови бактерий является серьезным осложнением инфекций (таких как пневмония и менингит), операций (особенно включающих в себя работу со слизистыми, такими как желудочно-кишечный тракт), катетеризации или попадания инородных тел в артерии или вены (включая внутривенные инфекции). Бактериемия может вызвать несколько серьезных последствий. Иммунный ответ на бактерии может вызвать сепсис (заражение крови) и септический шок, с высокой вероятностью смерти. Бактерии могут использовать кровь для распространения по организму (гематогенное распространение), вызывая вторичные очаги инфекции на значительном удалении от первичного очага инфицирования. Примером может быть эндокардит и остеомиелит. Лечение антибиотиками, противомикробными препаратами.

Септицемия - наличие в крови гноеродных микроорганизмов и их токсинов без образования гнойников в органах и тканях, удаленных от первичного очага воспаления. Данный термин также используется в более широком смысле для обозначения любого заражения крови. 

Токсемия - отравление крови токсинами бактерий, размножающихся в инфекционном очаге, в результате чего у больного повышается температура тела, возникают понос и рвота. Выделяют три причины возникновения токсемии:

Токсемия возникает тогда, когда при работе органов  в организме полноценно не выводятся естественные продукты распада.

Токсемия возникает тогда, когда в крови накапливаются продукты распада от жизнедеятельности микроорганизмов, населяющих тело.

Токсемия возникает тогда, когда животное вносит в свой организм продукты, которые являются токсичными для тканей, или в результате метаболизма которых возникают токсичные метаболиты, т.е. отравления.

Моноинфекция – инфекция, вызванная одним возбудителем. Например, лептоспироз.

Смешанная инфекция – инфекция, вызванная двумя и более видами микроорганизмов.

Вторичная инфекция - инфекция, которая развивается на фоне какой-либо первичной (основной), в результате активизации условно патогенных микробов.

Реинфекция возникает после перенесения болезни и освобождения организма животного от её возбудителя происходит повторное заболевание вследствие заражения тем же патогенным микробом.

Суперинфекция -  следствие нового (повторного) заражения, наступившего на фоне уже развивавшейся болезни, вызванной тем же патогенным микробом.

Ремиссия - период течения хронической болезни человека или животного, характеризующийся ослаблением или исчезновением её признаков. Ремиссии могут возникать вследствие цикличности течения заболевания (например, малярия); спонтанно (например, при мочекаменной болезни); в результате лечения (например, хронической дизентерии). В зависимости от степени уменьшения субъективных и объективных признаков болезни различают полные и неполные ремиссии Полные ремиссии в одних случаях (например, при лимфогранулематозе) продолжаются месяцами и годами, в других — нестойкие и быстро сменяются новым обострением (рецидивом) болезни. При полных ремиссиях также сохраняются некоторые признаки заболевания (например, хромосомные нарушения при лейкозах), поэтому во многих случаях продолжают поддерживающую терапию. В других случаях многолетние полные ремиссии трудно отграничить от практического выздоровления.

Микробоносительство - более или менее продолжительное пребывание возбудителей болезни в организме здорового животного. При микробоносительстве нет патологических изменений каких-либо органов или функциональных расстройств, размножение микробов сдерживается на определённом уровне. Однако животные - микробоносители представляют опасность как потенциальные источники возбудителя инфекции. Такое истинное, или “здоровое”, микробоносительство не связано с предшествующим переболеванием, не сопровождается иммунологической перестройкой организма и выявляется лишь с помощью бактериологического (вирусологического) исследования. Микробоносителями обычно называют животных, которые, будучи клинически здоровыми, представляют опасность как источник возбудителя инфекции. В эту категорию входят животные, выделяющие патогенных микробов в инкубационном периоде болезни (чума свиней, ящур, бешенство), а также животные, оставшиеся носителями возбудителя после исчезновения симптомов перенесённой явной инфекции. В последнем случае микробоносительство называется реконвалесцентным и условно подразделяют на острое (длительностью до 3 мес.) и хроническое. К микробоносителям относят и животных, у которых инфекция протекает скрыто, бессимптомно, что часто бывает при бруцеллёзе, туберкулёзе, паратуберкулёзе, сапе и инфекционной анемии лошадей. В подобных случаях, как и при реконвалесцентном микробоносительстве, с целью диагностики проводят не только бактериологическое (вирусологическое), но и серологическое, аллергическое исследования, а при вскрытии нередко находят очаги поражения отдельных органов.

Сверхострое, острое, подострое и хроническое течение болезни :

Сверхострое течение болезни (молниеносное течение) характеризуется быстрым развитием симптомов и в течении нескольких минут заболевшее животное погибает (молниеносное течение сибирской язвы у овец).

Острое течение болезни характеризуется развитием симптомов в течении 1-3 дней, после чего животное, если не лечить, погибает или выздоравливает (абортивное течение).

Подострое течение болезни длится до 5-8 дней и при должном лечении заканчивается благополучно (если есть возможность лечить).

Хроническое течение болезни характеризуется длительностью до 2-3 месяцев, а иногда и нескольких лет с периодическими обострениями клиники (бруцеллёз).

Иммунодефициты и причины, вызывающие их.

Иммунодефициты (ИДС) — нарушения иммунологической реактивности, обусловленные выпадением одного или нескольких компонентов иммунного аппарата или тесно взаимодействующих с ним неспецифических факторов. По происхождению иммунодефициты делят на первичные и вторичные.

Первичные иммунодефициты — это врожденные (генетические или эмбриопатии) дефекты иммунной системы. В зависимости от уровня нарушений и локализации дефекта они бывают:

гуморальные или антительные — с преимущественным поражением системы В-лимфоцитов)

клеточные

комбинированные

недостаточность системы комплемента

дефекты фагоцитоза

Вторичные иммунодефициты – дефекты иммунной системы, возникающие в следствии воздействия различных факторов, как внешней среды (экологический фактор), так и внутренними факторами организма. Вторичные иммунодефициты являются частым осложнением многих заболеваний и состояний. Основные причины вторичных ИДС:

дефект питания и общее истощение организма также приводит к снижению иммунитета. На фоне общего истощения организма нарушается работа всехвнутренних органов. Иммунная система особенно чувствительна к недостатку витаминов, минералов и питательных веществ, так как осуществление иммунной защиты это энергоемкий процесс. Часто снижение иммунитета наблюдается во время сезонной витаминной недостаточности (зима-весна)

хронические бактериальные и вирусные инфекции, а также паразитарные инвазии (туберкулез, стафилококкоз, пневмококкоз, герпес, хронические вирусные гепатиты, малярия, токсоплазмоз, лейшманиоз, аскаридоз и др.). При различных хронических заболеваниях инфекционного характера иммунная система претерпевает серьезные изменения: нарушается иммунореактивность, развивается повышенная сенсибилизация по отношению к различным антигенам микробов. Кроме того, на фоне хронического инфекционного процесса наблюдается интоксикация организма и угнетение функции кроветворения. Иммунодефицит во время инфекции FIV опосредован избирательным поражением клеток иммунной системы вирусом

гельминтозы

потеря факторов иммунной защиты наблюдается во время сильных потерь крови, при ожогах или при заболеваниях почек (протеинурия, ХПН). Общей особенностью этих патологий является значительная потеря плазмы крови или растворенных в ней белков, часть их которых является иммуноглобулинами и другими компонентами иммунной системы (белки системы комплимента, C-реактивный белок). Во время кровотечений теряется не только плазма, но и клетки крови, поэтому на фоне сильного кровотечения снижение иммунитета имеет комбинированный характер (клеточно-гуморальный)

диарейный синдром

стресс-синдром

тяжелые травмы и операции также протекают со снижением функции иммунной системы. Вообще любое серьезное заболевание организма приводит к вторичному иммунодефициту. Отчасти это связано с нарушением обмена веществ и интоксикацией организма, а отчасти с тем, что во время травм или операций выделяются большие количества гормонов надпочечников, которые угнетают функцию иммунной системы

эндокринопатии (СД, гипотиреоз, гипертиреоз) приводят к снижению иммунитета за счет нарушения обмена веществ организма. Наиболее выраженное снижение иммунной реактивности организма наблюдается при сахарном диабете и гипотиреозе. При этих заболеваниях снижается выработка энергии в тканях, что приводит к нарушению процессов деления и дифференциации клеток, в том числе и клеток иммунной системы. На фоне сахарного диабета частота различных инфекционных заболеваний значительно повышается. Связано это не только с угнетением функции иммунной системы, но и с тем, что повышенное содержание глюкозы в крови больных диабетом стимулирует размножение бактерий

прием различных лекарственных препаратов и наркотических средств оказывает выраженное иммунодепрессивное действие. Особенно выражено снижение иммунной защиты во время приема цитостатиков, глюкокортикоидных гормонов, антиметаболитов, антибиотиков

низкая масса тела при рождении

снижение иммунной защиты у людей старческого возраста, беременных женщин и детей связано с возрастными и физиологическими особенностями организма этих категорий людей

злокачественные новообразования – нарушают деятельность всех систем организма. Наиболее выраженное снижение иммунитета наблюдается в случае злокачественных заболеваний крови (лейкемия) и при замещении красного костного мозга метастазами опухолей. На фоне лейкемии количество иммунных клеток в крови порой повышается в десятки, сотни и тысячи раз, однако эти клетки нефункциональны и потому не могут обеспечить нормальной иммунной защиты организма

аутоиммунные заболевания возникают из-за нарушения функции иммунной системы. На фоне заболеваний этого типа и при их лечении иммунная система работает недостаточно и, порой, неправильно, что приводит к повреждению собственных тканей и неспособности побороть инфекцию

Возбудитель ботулизма.

Ботулизм - токсикоинфекция, отравление животных токсином Cl. botulum. Характеризуется тяжёлым поражением ЦНС, параличами мышц глотки, языка, нижней челюсти и скелетных мышц.

Морфология.

Возбудитель ботулизма Clostridium botulinum относится к роду Clostridium, семейству Bacillaceae. Это анаэробная, подвижная, грамположительная, спорообразующая палочка размерами (0,6—1,0)х(4—9) мкм: В мазках имеет вид палочек с закруглёнными концами, образуют субтерминально расположенные споры, диаметр которых превышает поперечник вегетативной формы. Из-за спор возбудитель имеет форму теннисной ракетки (чем характерно отличается от других клостридий). Не образуют капсулы, подвижны, перитрихи, облигатные анаэробы, располагающиеся беспорядочными скоплениями или небольшими цепочками. Известно 8 типов возбудителя — А, В, Са2beta, D, Е, F и G, различающихся по антигенной структуре выделяемого экзотоксина.

В России преимущественно встречаются типы А, В, Е. Возбудители ботулизма широко распространены в природе и обитают в почве. Бактерия размножается и вырабатывает токсин в процессе жизнедеятельности. Токсины вырабатываются вегетативными формами. В процессе жизнедеятельности происходит характерное для большинства клостридий газообразование.

Прогревание при температуре 80 °C в течение 30 мин вызывает гибель вегетативных форм, однако споровые формы его хорошо переносят, и, попадая в благоприятную среду, прорастают. Для полного уничтожения применяют дробную пастеризацию-тиндализацию. Ботулотоксин относится к полипептидам и при кипячении в течение свыше 30 мин инактивируется. Ботулотоксин является одним из наиболее сильных природных ядов (летальная доза для человека 5—50 нг/кг массы тела). Также описаны продуцирующие ботулотоксин штаммы других видов — Clostridium butyricum и Clostridium baratii , но они чрезвычайно редки.

Культивирование.

Возбудители ботулизма – строгие анаэробы. На поверхности плотных питательных сред растут при условии крайне низкого остаточного давление кислорода (0,40—1,33 кПа) и температурного режима в пределах 28—35 °C, pH 7,4-7,7. Стоит так же отметить, что споры возбудителей типов Е и F могут проростать и при 4°С. Для культивирования применяются специальные среды – глюкозо-кровяной агар Цейсслера, ПГГА, среду Китт-Тароцци, бульон Хоттингера под вазелиновым маслом с кусочками мяса или печени с добавлением перед посевом 1% глюкозы.

На среде Китт-Тароцци образуется помутнение, затем появляется осадок и жидкость светлеет. Культура издает запах прогорклого масла. На агаре Цейсслера образуются прозрачные колонии – росинки, величиной в несколько миллиметров блестящей поверхностью, светло-серого или коричневого цвета и окружённые зоной гемолиза.

Биохимические свойства.

При посеве на среды с сахарами клостридия ферментирует с образованием газа и кислоты: мальтозу, глюкозу, левулёзу, глицерин, декстрин, адонит, инозит, и не разлагает галактозу, сахарозу, дульцит, маннит, арабинозу и рамнозу. Однако эти свойства не постоянны и не могут служить для дифференцировки его типов. Бактерии типов А и В обладают высокой протеолитической активностью, в то время как протеолитические свойства у типов С, Д и Е минимальны.

Патогенность.

В анаэробных условиях в организме животных, субстратах растительного происхождения, на специальных питательных средах Cl. botulum продуцирует экзотоксин, относящийся к нейротоксинам. Самый сильный токсин вырабатывает тип А – он является самым сильным ядом в природе. Каждый из 8 типов возбудителя ботулизма обладает оригинальным токсином, имеющим только ему присущую антигенную структуру. В составе токсина различают не менее 5ти факторов – нейротоксин, гемолизин, гемолизин-гемагглютинин, липазу и протеазу. Токсическими факторами так же являются ферменты патогенности – протеиназы, лецитиназы, декорбоксилазы.

Наиболее чувствительны к ботулотоксину лошади, у них заболевание чаще вызывается токсинами типа В, реже А и С. КРС поражается токсинами типов С и Д, МРС так же чувствительны к токсинам этих типов. Свиньи в естественных условиях проявляют значительную толерантность к токсинам всех типов. Кошачьи и собачьи, серые крысы резистентны к заболеванию. К ботулизму восприимчивы птицы (голуби, куры, индейки, утки, гуси) и человек. Рыбы, амфибии и рептилии практически невосприимчивы.

Патогенез.

При обычном заражении он попадает в организм вместе с пищей, содержащей также и вегетативные формы возбудителей — продуцентов яда. Ботулотоксин всасывается из слизистой оболочки или лёгких. В желудке под действиемсоляной кислоты желудочного сока ботулотоксин не разрушается. Наиболее значимо поступление токсина через слизистую оболочку желудка и тонкой кишки, откуда он попадает в кровь и разносится по всему организму, нарушая деятельность нервных клеток, ответственных за передачу возбуждения к мышцам. При ботулизме поражаются все черепно-мозговые нервы, кроме чувствительных, таких как обонятельный нерв,зрительный нерв, преддверно-улитковый нерв. В первую очередь, страдают мышцы глаз, глотки и гортани, затем дыхательные мышцы. Особой чувствительностью к ботулотоксину обладают мотонейроны спинного и продолговатого мозга, что проявляется развитием бульбарного и паралитического синдромов. Ботулотоксин блокирует освобождение ацетилхолина в холинергических синапсах, что обусловливает развитие периферических параличей. Холинэстеразная активность в синапсах практически не изменяется.

Также в патогенезе ботулизма большую роль играет гипоксия. Развитие прогрессирующей острой дыхательной недостаточности обусловлено угнетением активности больших мотонейронов передних рогов спинного мозга, иннервирующих дыхательную мускулатуру. Гипоксическая гипоксия нарастает при обтурации бронхов аспирационными рвотными массами, слюной и пищей, что связано с парезами мышц гортани, глотки и надгортанника. Из-за гипосаливации воспаляется слизистая оболочка ротоглотки, может развиваться гнойный паротит вследствие восходящей инфекции. Гибель обычно наступает от вентиляционной дыхательной недостаточности и иногда от внезапной остановки сердца. Токсинемия вызывает угнетение ферментовпентозофосфатного шунта, ингибирование клеточных Na+/K+ насосов и обусловливает развитие гемической гипоксии.

Антигенная структура.

Все 8 серологических типов экзотоксина обладают иммунологической специфичностью, выявляемой реакцией нейтрализации. Специфичность токсинов А, В и Е очень высока, С и D несколько ограничена. Токсины этих двух типов не нейтрализуются антитоксинами А, В и Е, но небольшие дозы токсинов С и D нейтрализуются перекрёстно большими количествами антитоксинов D и С.

Возбудители ботулизма имеют жгутиковый Н- и соматический О-антигены, различающиеся в реакции нейтрализации. O-антиген является групповым антигеном типов А и В и Cl. sporogenes. H-антиген типоспецифичен.

Иммунитет.

По своей природе иммунитет антитоксический. У восприимчивых животных специфического иммунитета не существует. Перенесённое заболевание не оставляет иммунитета ни у животных, ни у человека. Доказана возможность создания стойкого иммунитета к ботулизму путём искусственной вакцинацией анатоксином.

Диагностика.

Материалом для исследования служат пробы кормов, послуживших причиной заболевания, содержимое желудка и кишечника, кровь, паренхиматозные органы свежих трупов погибших животных. Основным методом лабораторной диагностики является обнаружение в субстратах ботулотоксина; параллельно проводят выделение культуры (удаётся не всегда).

Биопрепараты.

Для специфической профилактики используют анатоксины с адъювантами – квасцы или гидроокись алюминия.

Из животных вакцинируются только норки, так как они более чувствительны к токсину типа С и при поедании недоброкачественных кормов заболевают ботулизмом и погибают.

Вакцина против ботулизма норок представляет собой анакультуру штаммов типа С, преципетированную квасцами. Вводят её однократно в дозе 1 мл в/м. Иммунитет наступает через 2-3 недели и сохраняется в течении года.

Рис. 1 Основные формы бактерий

Рис.2 Схема строения прокариотической клетки.

Рис.3 Жгутики и ворсинки (пили).

А – монотрих;

В – лофотрих;

С – амфитрих;

D – перитрих.

Рис. 4 Схема строения клетки гриба.

Рис.5 Микроскопические грибы: мукоровые, пенициллы, аспергиллы

АВ

С

А – Мукор: 1-мицелий со спорангиеносцами; 2-спорангий; 3-спора

В – Пеницилл

С – Аспергилл

Рис.6 Схема строения бактериофага.

Используемая литература:

Эпизоотология. - под ред. Р.Ф. Соколова, 2е изд., - М.: Колосс, 1974;

Справочник ветеринарного врача. – под ред. С.Э. Иванова, - СПб.: Издательство Санкт-Петербургской академии ветеринарной медицины, 2001;

Тимаков В.Д. - Общая эпизоотология и зоопрофилактика. – София, 1973;

Никифоро В.Н., Никифоров В.В. – Ботулизм.- Л.: Медицина, 1985;

Ветеринарная микробиология.- под ред. Е.В. Козловского, П.А. Емельяненко.- М.: издательство «Колосс», 1982

Ющук Н. Д., Мартынов Ю. В., - Эпидемиология: Учеб. пособие. — 2-е изд., перераб. и доп. — М.: Медицина, 2003.