Технология ферментных препаратов

Ферменты как биокатализаторы обладают рядом уникальных свойств, например, таких как высокая каталитическая активность и избирательность действия. В ряде случаев ферменты обладают абсолютной специфичностью, катализируя превращение только одного вещества. Для каждого фермента существует свой оптимум рН, при котором его каталитическое действие максимально. При резком изменении рН ферменты инактивируются из-за необратимой денатурации. Ускорение реакции при повышении температуры также лимитировано определенными пределами, поскольку уже при температуре 40-50оС многие ферменты денатурируют. Эти свойства ферментов приходится учитывать при разработке технологии нового препарата.

Поскольку ферменты - вещества белковой природы, в смеси с другими белками их количество определить практически невозможно. Наличие фермента в препарате может быть установлено лишь по протеканию той реакции, которую катализирует фермент. При этом количественную оценку содержания фермента можно дать, определив либо количество образовавшихся продуктов реакции, либо количество израсходовавшегося субстрата. За единицу активности фермента принимают то его количество, которое катализирует превращение одного микромоля субстрата в 1 минуту при заданных стандартных условиях - стандартная единица активности.

По решению Международного биохимического союза активность решено определять при t = 30оС по начальной скорости реакции, когда концентрация насыщения фермента и временная зависимость близка к кинетике реакции нулевого порядка. Остальные параметры реакции индивидуальны для каждого фермента. Активность ферментного препарата выражается в микромолях субстрата, прореагировавшего под действием 1 мл ферментного раствора или 1 грамма препарата в оптимальных условиях за 1 минуту. Если ферментный препарат не содержит балласта, то его активность выражается в тех же стандартных единицах на 1 мг фермента. Если же есть балласт, то активность считается на 1 мг белка в ферментном препарате. Активность выпускаемого препарата - важнейший нормируемый показатель качества.

Основную часть ферментов, получаемых промышленным способом, составляют гидролазы. К ним относятся, в первую очередь амилолитические ферменты: α-амилаза, β-амилаза, глюкоамилаза. Их основная функция - гидролиз крахмала и гликогена. Крахмал при гидролизе расщепляется на декстрины, а затем до глюкозы. Эти ферменты применяются в спиртовой промышленности, хлебопечении.

Протеолитические ферменты образуют класс пептидгидролаз. Их действие заключается в ускорении гидролиза пептидных связей в белках и пептидах. Важная их особенность - селективный характер действия на пептидные связи в белковой молекуле. Например, пепсин действует только на связь с ароматическими аминокислотами, трипсин - на связь между аргинином и лизином. В промышленности протеолитические ферменты классифицируют по способности проявлять активность в определенной области рН:

рН 1.5 - 3.7 - кислые протеазы;

рН 6.5 - 7.5 - протеазы;

pH > 8.0 - щелочные протеазы.

Протеазы находят широчайшее применение в разных отраслях промышленности:

мясная - для смягчения мяса;

кожевенная - смягчение шкур;

кинопроизводство - растворение желатинового слоя при регенерации пленок;

парфюмерная - добавки в зубную пасту, кремы, лосьоны;

производство моющих средств - добавки для удаления загрязнений белковой природы;

медицина - при лечении воспалительных процессов, тромбозов и т.д.

Пектолитические ферменты уменьшают молекулярную массу и снижают вязкость пектиновых веществ. Пектиназы делятся на две группы - гидролазы и трансэлиминазы. Гидралазы отщепляют метильные остатки или разрывают гликозидные связи. Трансэлиминазы ускоряют негидролитическое расщепление пектиновых веществ с образованием двойных связей. Применяются в текстильной промышленности (вымачивание льна перед переработкой), в виноделии - осветление вин, а также при консервировании фруктовых соков.

Целлюлолитические ферменты очень специфичны, их действие проявляется в деполимеризации молекул целлюлозы. Обычно используются в виде комплекса, доводящего гидролиз целлюлозы до глюкозы (в гидролизной промышленности). В медицинской промышленности их используют для выделения стероидов из растений, в пищевой - для улучшения качества растительных масел, в сельском хозяйстве - как добавки в комбикорма для жвачных животных.

Существует ряд факторов, влияющих на биосинтез ферментов. В первую очередь, к ним относится генетический. Состав и количество синтезируемых ферментов наследственно детерминированы. Применяя мутагены можно изменить генетические свойства микроорганизмов и получить штаммы с ценными для промышленности свойствами. К мутагенным факторам относятся ионизирующее и неионизирующее излучения, изотопы, антибиотики, другие химические соединения, преобразующие наследственные элементы клетки. Несмотря на определяющую роль генетического фактора в биосинтезе ферментов, производительность биотехнологических процессов зависит и от состава питательной среды. При этом важно не только наличие источников основных питательных веществ, но и веществ, играющих роль индукторов или репрессоров биосинтеза данного конкретного фермента или их групп. Механизм этого явления еще не вполне изучен, но сам факт должен учитываться при выборе технологии.

Рассмотрим несколько примеров. Фермент липаза почти не синтезируется грибом Aspergillus awamori на среде без индуктора, добавление жира кашалота усиливает биосинтез фермента в сотни раз. При добавлении же в среду крахмала и при полном исключении минерального фосфора интенсивно синтезируется фосфатаза. Не только наличие индуктора способно увеличивать выход фермента. Важную роль играет состав питательной среды и условия культивирования. При разработке процесса биосинтеза a-амилазы культурой Aspergillus oryzae замена сахарозы (как источника углерода) на крахмал увеличила активность фермента в 3 раза, добавление солодового экстракта (из проросших семян злаковых) ещё в 10 раз, а повышение концентрации основных элементов питательной среды на 50% - ещё в 2 раза.

Для интенсификации процесса роста и синтеза ферментов добавляют различные факторы роста, например, аминокислоты, пуриновые основания и их производные, РНК и продукты её гидролиза. В качестве источника углерода используют крахмал, кукурузный экстракт, соевую муку, гидролизаты биомассы дрожжей. Микроорганизмы могут утилизировать и минеральные источники азота. В состав питательных сред входят и ионы MG, Mn, Zn, Fe, Cu и др. металлов. Механизм действия большинства из них неизвестен. Некоторые входят в состав фермента. Ионы Ca повышают устойчивость a-амилазы, ионы Fe и Mg активизируют и стабилизируют протеолитические ферменты.

Оптимальный состав питательной среды для каждого продуцента может быть определен двумя способами: эмпирический и построение математической модели с использованием компьютера. Последний, естественно, предпочтительнее. По характеру культивирования все технологические процессы производства ферментных препаратов делятся на две большие группы: глубинный и поверхностный методы.

Глубинный метод производства ферментов

В этом случае микроорганизмы выращиваются в жидкой питательной среде. Технически более совершенен, чем поверхностный, так как легко поддается автоматизации и механизации. Концентрация фермента в среде при глубинном культивировании обычно значительно ниже, чем в водных экстрактах поверхностной культуры. Это вызывает необходимость предварительного концентрирования фильтрата перед его выделением.

При глубинном культивировании продуцентов ферментов выделяют, как и в любом биотехнологическом процессе, 5 этапов.

1. Приготовление питательных сред зависит от состава компонентов.

Некоторые предварительно измельчают, отваривают или гидролитически расщепляют. Готовые к растворению компоненты подают при постоянном помешивании в емкость для приготовления среды в определенной последовательности. Стерилизацию среды проводят либо путем микрофильтрации с помощью полупроницаемых мембран, либо при помощи высоких температур. Время обработки в этом случае зависит как от интенсивности фактора, так и от уровня обсемененности объекта. Стерилизуются также все коммуникации и аппараты. Воздух очищается до и после аэрирования. До - потому что содержит частицы пыли органической и неорганической природы, после - так как несет клетки продуцента.

2. Получение засевного материала.

Для засева питательной среды материал готовят также глубинным методом. Вид его зависит от продуцента: для грибов это мицелиальная вегетативная масса, для бактерий - молодая растущая культура на начальной стадии спорообразования. Получение посевного материала состоит в увеличении массы продуцента в 3-4 стадии. Объем посевного материала зависит от физиологических особенностей продуцента. Если продуцент размножается только вегетативно, он резко возрастает (до 5-20%). Если же происходит обильное спороношение - сокращается до 1%.

3. Производственное культивирование.

Биосинтез ферментов в глубинной культуре протекает в течение 2-4 суток при непрерывной подаче воздуха и перемешивании. Высокая концентрация питательных веществ на первых этапах могут тормозить рост биомассы продуцента, поэтому часто свежая среда или некоторые её компоненты вводятся в ферментер на стадии активного роста. Температурный оптимум находится в интервале 22-32оС. В современных технологических процессах ведется непрерывное автоматическое определение содержания в среде углеводов, количества образовавшихся метаболитов и концентрации клеток. Данные поступают в компьютер, который определяет стратегию коррекции процесса и автоматически регулирует его. Этим достигается максимальная производительность и наилучшее качество продуктов.

4. Выделение.

В мицелии трёхсуточной культуры обычно остается не более 15% ферментов. Остальные выделяются в окружающую клетки жидкую среду. В этом случае препараты ферментов выделяют из фильтратов после отделения биомассы.

5. Получение товарной формы.

Производство ферментов при поверхностном культивировании продуцентов

При поверхностном методе культура растет на поверхности твердой увлажненной питательной среды. Мицелий полностью обволакивает и довольно прочно скрепляет твердые частицы субстрата, из которого получают питательные вещества. Поскольку для дыхания клетки используют кислород, то среда должна быть рыхлой, а слой культуры-продуцента небольшим.

Выращивание производственной культуры происходит обычно в асептических условиях, но среду и кюветы необходимо простерилизовать. Перед каждой новой загрузкой также необходима стерилизация оборудования.

Преимущества поверхностной культуры: значительно более высокая конечная концентрация фермента на единицу массу среды (при осахаривании крахмала 5 кг поверхностной культуры заменяют 100 кг культуральной жидкости), поверхностная культура относительно легко высушивается, легко переводится в товарную форму.

Посевной материал может быть трёх видов:

- культура, выросшая на твердой питательной среде;

- споровый материал;

- мицелиальная культура, выращенная глубинным способом.

В три этапа получают и посевную культуру. Сначала музейную культуру продуцента пересевают на 1 - 1.5 г увлажненных стерильных пшеничных отрубей в пробирку и выращивают в термостате до обильного спорообразования. Второй этап - аналогично, но в колбах, третий - в сосудах с 500 г среды.

Основу питательной среды составляют пшеничные отруби, как источник необходимых питательных и ростовых веществ. Кроме того, они создают необходимую структуру среды. Для повышения активности ферментов к отрубям можно добавлять свекловичный жом, соевый шрот, крахмал, растительные отходы. Стерилизуют среду острым паром при помешивании (температура - 105-140 С, время 60-90 минут). После этого среду засевают и раскладывают ровным слоем в стерильных кюветах. Кюветы помещают в растильные камеры. Культивируют в течение 36-48 часов.

Рост делится на три периода, примерно равных по времени. Сначала происходит набухание конидий и их прорастание (температура не ниже 28о С), затем рост мицелия в виде пушка серовато-белого цвета (необходимо выводить выделяемое тепло) и образование конидий. Для создания благоприятных условий роста и развития продуцента необходима аэрация и поддержание оптимальной влажности (55-70%).

Выросшая в неподвижном слое при поверхностном культивировании культура представляет корж из набухших частиц среды, плотно связанных сросшимся мицелием. Массу размельчают до гранул 5-5 мм. Культуру высушивают до 10-12% влажности при температурах не выше 40оС, не долее 30 минут. Иногда препарат применяют прямо в неочищенном виде - в кожевенной и спиртовой промышленности. В пищевой и особенно медицинской промышленности используются ферменты только высокой степени очистки.

Схема очистки сводится к следующему:

- освобождение от нерастворимых веществ;

- освобождение от сопутствующих растворимых веществ;

- фракционирование (как правило, хроматографическими методами).

Для выделения фермента из поверхностной культуры необходима экстракция. Как правило, экстраген - вода. При этом в раствор переходят сахара, продукты гидролиза пектиновых веществ и целлюлозы. Стадию выделения и очистки завершает сушка. После сушки препарат должен содержать не более 6-8% влаги, тогда он может в герметичной упаковке храниться до года без потери активности.

Стандартизация ферментного препарата - доводка активности фермента до стандартной, соответствующей требованиям ГОСТ. Для этого используются различные нейтральные наполнители - крахмал, лактоза и др.

Учитывая огромные перспективы применения ферментных препаратов в различных отраслях промышленности и сельского хозяйства, медицине, можно сделать заключение о необходимости расширения исследований в этой области для оптимизации технологии и гарантийного получения высокоактивных и стабильных препаратов микробных ферментов.

Иммобилизация ферментов

В современной биотехнологии одно из видных мест принадлежит ферментам. Ферменты и ферментные системы широко используются в различных отраслях промышленности, медицине, сельском хозяйстве, химическом анализе и т.д.

Ферменты - вещества белковой природы и поэтому неустойчивы при хранении, а также чувствительны к тепловым воздействиям. Кроме того, ферменты не могут быть использованы многократно из-за трудностей в отделении их от реагентов и продуктов реакции. Решить эти проблемы помогает создание иммобилизованных ферментов. Начало этому методу было положено в 1916 году, когда Дж. Нельсон и Е. Гриффин адсорбировали на угле инвертазу и показали, что она сохраняет в таком виде каталитическую активность. Сам термин "иммобилизованные ферменты узаконен в 1971 году, и означает любое ограничение свободы передвижения белковых молекул в пространстве.

. Сущность иммобилизации ферментов — прикрепление их в активной форме к нерастворимой основе или заключение в полупроницаемую мембранную систему. Прикрепление фермента к носителю осуществляется адсорбционно, химической связью или путем механического включения фермента в органический или неорганический гель (в капсулу и т. п.). При этом допускается прикрепление фермента только за счет функциональных групп, не входящих в активный центр фермента и не участвующих в образовании фермент-субстратного комплекса. Носитель фермента или матрица может име^ь вид зернистого материала, волокнистой структуры, пластинчатой поверхности, пленок или тканей, полых волокон, трубочек, капсул и т. д. Имеет значение размер частиц носителя. Важно иметь большую поверхность, поэтому рекомендуются небольшие частицы диаметром 0,1—0,2 мм. Носитель фермента может быть как природное вещество, так и синтетический полимер.

Преимущества иммобилизованных ферментов перед нативными предшественниками:

1. Гетерогенный катализатор легко отделим от реакционной среды, что дает возможность остановить реакцию в любой момент, использовать фермент повторно, а также получать чистый от фермента продукт.

2. Ферментативный процесс с использованием иммобилизованных ферментов можно проводить непрерывно, регулируя скорость катализируемой реакции и выход продукта.

3. Модификация фермента целенаправленно изменяет его свойства, такие как специфичность (особенно в отношении макромолекулярного субстрата), зависимость каталитической активности от рН, ионного состава и других параметров среды, стабильность к денатурирующим воздействиям.

4. Можно регулировать каталитическую активность иммобилизованных ферментов путем изменения свойств носителя действием физических факторов, таких как свет и звук. Иммобилизовать ферменты можно как путем связывания на нерастворимых носителях, так и путем внутримолекулярной или межмолекулярной сшивки белковых молекул низкомолекулярными бифункциональными соединениями, а также путем присоединения к растворимому полимеру.

Широкое применение в нашей стране и за рубежом находят ферментные препараты и продукты, обладающие амилолитической активностью. В нашей стране выпускают следующие амилолитические ферментные препараты: с активной &-амилазой — Амилоризин П10Х, Амилосубтилин Г10Х; глюкоамилазой — Глюкоамилаза очищенная. Кроме того, производятся белый солод и солодовые экстракты с активной &-амилазой, которые вырабатываются из проросшего зерна ржи или ячменя.

Под действием амилолитических ферментов повышается содержание сбраживаемых сахаров в тесте, что приводит к интенсификации процесса созревания полуфабрикатов, увеличению количества декстринов, что способствует сохранению свежести хлеба.

При добавлении ферментных препаратов в оптимальных дозировках увеличивается объем хлебобулочных изделий, улучшается структура их пористости, мякиш становится более нежным, улучшаются вкус и аромат хлеба, корка приобретает более интенсивную окраску и глянец.

В составе Амилоризина П10Х содержится комплекс ферментов амилолитического и протеолитического действия, наибольшее значение из которых имеет &-амилаза. Продуцентом Амилоризина П10Х является плесневой гриб Aspergillus oryzae. Оптимальные условия действия Амилоризина ШОХ-рН 4,7-5,4 и температура 40-45°С.

Амилосубтилин Г10Х представляет собой очищенный ферментный препарат, образуемый Bacillus subtilis. Препарат содержит &-амилазу, (3-глюканазу и протеазу. Оптимальными условиями действия препарата являются рН 6,0-6,3 и температура 50-55°С. Бактериальная ?-амилаза по сравнению с грибной обладает высокой термостабильностью, температура инактивации составляет 63-71°С.

Амилоризин П10Х и Амилосубтилин Г10Х оказывают наиболее эффективное действие при добавлении к муке с упругой, недостаточно эластичной клейковиной, с пониженной и нормальной сахарообразующей способностью (180—250 мг мальтозы на 10 г муки) и автолитической активностью до 30%.

Глюкоамилаза очищенная (оптимальные условия действия: рН 3,0-5,0; температура 55-60°С) — препарат, продуцентом которого являются гриб Aspergollus awamory или штамм дрожжей Endomycopsiz sp. 20-9, находит применение при производстве высокоосахаренных ферментативных полуфабрикатов и жидких дрожжей.

Значительным недостатком применения амилолитических препаратов является наличие в их составе протеазы, что затрудняет их использование при переработке муки с пониженным содержанием клейковины, а также слабой по силе. Хлебные изделия лучшего качества получаются при совместном внесении амилолитических ферментов и улучшителей окислительного действия.

Отечественный цитолитический ферментный препарат, продуцентом которого является культура гриба Trichothecium rozeum, обладает гемицеллюлазной, целлобиазной, пентозаназной активностью. В результате исследований по поиску возможностей использования в хлебопекарной промышленности Цитороземина П10Х, который отличается высокой цитолитической и незначительной амиполитической и протеолитической активностью, было сделано следующее заключение: добавление его в тесто в диапазоне концентраций от 0,01 до 0,1% к массе муки способствует дополнительному обогащению теста редуцирующими сахарами, приводит к значительному накоплению в нем водорастворимых пентозанов, изменению упруго-пластических свойств клейковины, способствует улучшению реологических свойств геста, что приводит к увеличению объемного выхода хлеба.

Зарубежные аналоги ферментных препаратов

Зарубежными фирмами, также выпускаются ферментные препараты, обладающие амилолитической активностью. К ним относятся: Fungamyl BG (Фунгамил BG), приготовленный на основе очищенной грибной амилазы (оптимум рН 4,5-5,0 температуры 53-55°С), Bioferm P, Biobake P conc, Grindamyl A 1000, характеризующиеся низким уровнем амилоглюкозидазной и протеиназной активности, что позволяет применять их при переработке муки с различными хлебопекарными свойствами.

Gungamyl Super AX, Biobake 721 и Grindarmyl100 разработаны для коррекции низкой амилолитической активности муки, а также для улучшения структуры мякиша, повышения объема хлебобулочных изделий и продления срока сохранения свежести.

Препараты Novamyl, Biobake 2000, Grindamyl MAX-LIFE U4 и Grindamyl MAX-LIFE Е5 предназначены для удлинения срока хранения хлеба в свежем состоянии. Ферментный препарат Novamyl проявляет максимальную активность при выпечке тестовых заготовок (оптимумы рН 5,8-6,0, температуры 54-76°С) и способствует более полному протеканию процесса клейстеризации крахмала, что приводит к значительному увеличению срока свежести хлеба.

Grindamyl MAX-LIFE U4 - ферментный комплекс, состоящий из грибной и бактериальной амилаз, разработанный для замедления черствения хлебных изделий, вырабатываемых опарными способами, Кроме того, добавление ферментного препарата Grindamyl MAX-LIFE U4 приводит к улучшению показателя стабильности теста. Препарат Grindamyl MAX-LIFE E5 грибного происхождения целесообразно применять при ускоренных технологиях.

Ферментные препараты с гемицеллюлазной активностью действуют на нерастворимые высокомолекулярные пентозаны, содержащиеся в пшеничном тесте, увеличивают долю низкомолекулярных пентозанов, что способствует образованию более прочного клейковинного каркаса. Внесение препаратов с гемицеллюлазной активностью способствует увеличению доли связанной влаги в тесте. Это приводит к увеличению водопотлотительной способности полуфабрикатов и, следовательно, к улучшению структурно-механических свойств теста.

Из зарубежных ферментных препаратов с гемицеллюлазной активностью применяют препарат Pentopan 500 BG (Пентопан 500 BG), представляющий очищенный препарат фермента, полученного при культивировании Humicola insolens и проявляющего пентозаназную активность (оптимальные условия рН 5—6 и 4°С). Применение этого препарата способствует стабилизации свойств теста, увеличению объема хлеба, улучшению структуры мякиша, продлению срока сохранения свежести готовых изделий.

Протеолитические ферментные препараты, катализирующие гидролитическое расщепление белковых веществ, целесообразно использовать при переработке муки с чрезмерно сильной клейковиной, так как ферменты этой группы, проявляя восстановительную активность, оказывают деструктурирующее действие на клейковину муки и улучшают реологические свойства теста. Крове того, ферментные препараты этой группы применяют при производстве затяжного печенья, крекеров, слоеных изделий из бездрожжевого теста.К протеолитическим ферментным препаратам относятся Прото-субтилин Г10Х или Г20Х, продуцентом которого является Bacillus subtilis, а также Протозим, Neutease (Novo Noelisk).

Ферментные препараты, обладающие липолитической активностью, в качестве основного фермента содержат активную липазу. Фермент липаза осуществляет гидролиз триацилглицеридов с образованием жирных кислот и глицерина. В качестве препарата с липолитической активностью применяют Новозим 677 BG (Novo Noelisk). Применение этого препарата позволяет увеличивать стабильность теста и объем хлеба, улучшать структуру пористости и цвет мякиша.

Список использованной литературы

1. Бирюков, В.В. Основы промышленной биотехнологии / В.В. Бирюков. – М. КолосС, 2004.

2. Варфоломеев С.Д., Гуревич К.Г. Биокинетика: практический курс. - М.: ФАЙР-ПРЕСС, 1999. - 720 с.

3. Грачева И.М., Кривова А.Ю. Технология ферментных препаратов. – 3-е изд., перераб. и доп. М.: Изд-во “Элевар” 2000. 512с. ил.

4. Грачева, И.М. Технология ферментных препаратов / И.М. Грачева. – М.: Агропромиздат, 1985.

5. Кислухина, О.В. Ферменты в производстве пищи и кормов / О.В.Кислухина. – М.: КолосС, 2002.

6. Манаков, М.Н. Теоретические основы промышленной биотехнологии / М.Н. Манаков, Д.Г. Победимский. – М.: Высшая школа, 1989. – 310 с.