--PAGE_BREAK--При вивченні специфічного гуморального імунітету визначали вміст антиендотоксинових антитіл до ЛПС E.coli у сироватці крові. При визначенні антиендотоксинових антитіл як антиген використовували ЛПС грамнегативної ентеробактерії Escherichia coli K30 (О9: К30: Н12), виділений з бактерійної біомаси методом водно-фенолової екстракції і додатково очищений від домішок РНК обробкою цетавлоном («Serva», Німеччина). Сироваткові антиендотоксинові антитіла до гліколіпіду Salmonella minnesota Re595 визначали методом тІФА [Гордиенко А.И. и соавт., 2004]. Визначення циркулюючих комплексів ЛПС — ФН проводилося із застосуванням «сендвич»-ваpіанта тІФА.
Для культивування мононуклеарних лейкоцитів і визначення впливу на функціональну активність клітин гормонів репродуктивної сфери використаний модифікований метод короткострокових органних культур [Лурія Е.А., 1972].
Враховуючи, що клітини ендотелію отримували в основному з мікроциркуляторного русла зразків тканин легенів, отриманих intra operationem, нами використана методика виділення ендотеліальних клітин [Ryan U.S., Ryan J.W., 1980]. Ендотеліальні клітини в моношаровій культурі культивували протягом 2-х діб [Patel J., Block E., 1993]. З ендотеліальними клітинами легеневих судин осіб контрольної групи паралельно проводилися декілька експериментів, включаючи культивацію із введенням суспензії мононуклеарів хворих 1-ої і 2-ої груп, а також введенням суспензії мононуклеарів після преінкубації клітин з 6,0 нг/мл людського тестостерону, 12,0 ОД/мл розчину хоріонічного гонадотропіну і 20 мкг/мл ЛПС грамнегативної ентеробактерії Escherichia coli K30 (О9: К30: Н12), «Serva», Німеччина).
У культуральних експериментах по завершенню культивування визначалася також фібринолітичну активність [Astrup T., Mullertz S., 1972] культурального середовища культури ендотеліальних клітин, фібринолітична (активаторна) активність за еуглобуліновим тестом [Januszko T., Dubinska L.,1965; Скипетров В.П. и соавт., 1978], а також прокоагулянтна активність культурального середовища культури клітин [Bergerhof H., Roca L., 1954].
Активність ЧВ визначали за ристоміцин-індукованій агрегації формалінізованих тромбоцитів [Поливода С.М. и соавт., 1999]. Визначення вмісту Et-1 в плазмі крові проводили за допомогою імуноферментного набору фірми «Amersham Pharmacia Biotech» і колонок для афінної хроматографії тієї ж фірми.
Результати власних досліджень та їх обговорення. ХОЗЛ – одне з найпоширеніших хронічних захворювань органів дихання, яке не дивлячись на лікування, що проводиться, зазвичай поволі, але неухильно прогресує. Необхідно підкреслити, що в сучасних протоколах лікування різних форм НЗЗЛ мають місце істотні відмінності. Так, враховуючи центральну патогенетичну роль імунного (імунопатологічного) запалення, в лікуванні хворих на бронхіальну астму центральне місце відводиться протизапальному ефекту глюкокортикоїдів. У хворих на ХОЗЛ загострення патологічного процесу також запального генезу, але, на відміну від бронхіальної астми, воно не носить чіткого імунопатологічного характеру. Тому стероїдні глюкокортикоїдні гормони в терапевтичних програмах з ХОЗЛ не займають провідне місце. Протизапальна ж дія М-холіноблокаторів (основних базисних препаратів, що використовуються в лікуванні ХОЗЛ) при загостренні, а також при важких і швидко прогресуючих формах захворювання, явно недостатня. Так, наприклад, при загостренні важких форм ХОЗЛ у стаціонарі проводиться так звана "інтенсивна" терапія (що включає масивну інфузійну дезінтоксикаційну терапію, корекцію pH, лікування серцевої недостатності, антибактеріальну терапію за показаннями тощо), яка нерідко переходить в дії реанімаційного характеру. Тому від успішної ліквідації оборотного запального патогенетичного «компоненту» у фазі нестійкої ремісії, а також при загостренні ХОЗЛ у ряді випадків безпосередньо залежить прогноз захворювання і життя хворого. Таким чином, пошук нових шляхів підвищення ефективності лікування хворих на ХОЗЛ продовжує представляти, на нашу думку, дуже важливу проблему сучасної пульмонології.
Особливі надії на вирішення проблеми хронічного запалення в клінічній практиці в останнє десятиліття пов'язують з розробкою нових методів селективного впливу на найбільш важливі ланки імунопатогенезу захворювань, включаючи біологічні модифікатори імунної відповіді – антизапальні цитокіни, моноклональні антитіла, антагоністи рецепторів, розчинні рецептори [Breedveld F., 2000; Lorenz H., Kalden J., 2002]. Серйозною проблемою використання «антицитокінів» (etanercept, infliximab, adalimumab) в практичній пульмонології стала реактивація прихованої туберкульозної інфекції, що фактично виключає можливість їх використання у осіб, котрі перенесли туберкульоз різної локалізації [Hamdi H. et al., 2006]. При цьому нами враховувалося, що в одиничних роботах документована пряма антицитокінова активність не тільки глюкокортикоїдів, але і гормонів репродуктивної сфери [Pugh P. et al., 2002; Ferreira A., 2004]. З урахуванням вищесказаного, за своєрідну «точку відліку» при формуванні груп порівняння нами вибрана не тільки анамнестична вказівка на перенесений туберкульоз легенів, але враховувався також рівень ендогенного тестостерону (у хворих чоловічої статі, котрі страждають на ХОЗЛ).
Так, нами встановлено (табл. 1), що у хворих 1-ї групи перебіг ХОЗЛ I-II ступеня тяжкості (без вказівок на перенесений туберкульоз в анамнезі) характеризується фізіологічним рівнем секреції ендогенного тестостерону, а також ФСГ, ЛГ і естрадіолу. У хворих на ХОЗЛ I-II ступеня тяжкості, котрі перенесли різні форми туберкульозу легенів (2-а група хворих), формується ендокринний дисбаланс – еугонадотропний гіпогонадизм. При цьому відсутність пониженого синтезу ендогенного тестостерону (дисфункція стероїдогенезу) у хворих 1-ї групи дозволяє виключити зміни в тестикулах, пов'язані з ХОЗЛ.
Таблиця 1
Рівень гормонів репродуктивної сфери в периферичній крові у хворих 1-ї і 2-ї груп
Група
Стат.
показ.
Тестостерон, в плазмі крові, нг/мл
ФСГ, в сироватці крові, мМЕ/мл
ЛГ, в сироватці кровы, мМЕ/мл
Естрадіол, в сироватці крові, пг/мл
1-а група
n = 47
M ± m
р
6,69 ± 0,23
> 0,5
7,32 ± 0,22
5,47 ± 0,20
20,05 ± 0,45
> 0,5
2-а група
n = 39
M ± m
р
р1
4,29 ± 0,27
7,78 ± 0,33
5,84 ± 0,34
20,53 ± 0,72
> 0,5
Здорові, n = 28
M ± m
6,82 ± 0,23
6,98 ± 0,34
5,04 ± 0,23
19,79 ± 0,75
Примітка: р – достовірність відмінностей, обчислена порівняно з групою здорових осіб,
р1 – достовірність відмінностей, обчислена порівняно з 1-ю групою хворих.
Встановлено також (табл. 2), що підвищення рівнів прозапального цитокіну IL-1в в системному кровотоку має місце у хворих на ХОЗЛ як 1-ї, так і 2-ї груп. При цьому, якщо у хворих 1-ї групи досліджений показник підвищений на 17,8 %, то у хворих 2-ї групи – на 34,1%, що також статистично значущо вище, ніж у хворих 1-ї групи. Рівень IL-4 в сироватці крові у хворих 1-ї групи не виходить за межі діапазону його фізіологічних коливань, а у хворих 2-ї групи – підвищений на 13,5 %, що також достовірно вище, ніж у хворих 1-ї групи. У хворих 1-ї групи виявлено достовірне підвищення рівня TNF-б на 22,2 %, у хворих 2-ї групи – на 56,8 %.
Таблиця 2
Рівень цитокінів у сироватці крові у хворих 1-ї і 2-ї груп, пг/мл
Група
Стат. показник
IL-1в
IL-4
TNF-б
1-а група
n = 47
M ± m
р
43,72 ± 1,36
6,75 ± 0,16
19,89 ± 0,73
2-а група
n = 39
M ± m
р
р1
49,76 ± 2,69
7,40 ± 0,24
25,53 ± 1,43
Здорові, n = 28
M ± m
37,11 ± 1,64
6,52 ± 0,19
16,28 ± 0,55
Примітка: р – достовірність відмінностей, обчислена порівняно з групою здорових осіб,
р1 – достовірність відмінностей, обчислена порівняно з 1-ю групою хворих.
Таким чином, нами встановлено, що перенесений (клінічно вилікуваний) туберкульоз легенів є вагомим чинником ризику росту системного цитокінового потенціалу у хворих на ХОЗЛ. Останнє ж розглядається як важливий патогенетичний механізм хронізації і прогресування НЗЗЛ [Keatings V. et al., 2002].
Відомо, що важливим стимулятором синтезу лейкоцитами широкого спектру прозапальних цитокінів у хворих на хронічні обструктивні захворювання легенів є ЛПС ЕТ, що також може супроводжуватися підвищенням судинної проникності і секреції слизу, а також розвитком бронхоспазму [Blease K. et al., 1999]. Тому для розуміння патогенетичної суті підвищення цитокінового потенціалу при ХОЗЛ, на нашу думку, дуже важливою представляється оцінка гормоно-залежної функціональної активності клітинного імунітету та ефективності функціонування системи елімінації ЕТ.
Нами встановлено, що у хворих 1-ї групи вміст СD14+-лімфоцитів підвищений (у контрольній групі СD14+-позитивні клітини не виявляються) та істотно не змінюється під впливом преінкубації клітин з тестостероном і плацентарним гормоном. У хворих 2-ї групи досліджений показник статистично значущо (на 87,5 %) вище, ніж у хворих 1-ї групи і достовірно знижується в дослідах з преінкубацією мононуклеарів з тестостероном (на 48,7 %) і плацентарним гормоном (на 38,7 %). Можна вважати, що підвищений рівень СD14+-В-лімфоцитів в периферичній крові у хворих 1-ї і 2-ї є важливою умовою для прояву патофізіологічної дії ЛПС, включаючи підвищення синтезу цитокінів in loko morbi.
Встановлено також, що у хворих 1-ї і 2-ї груп функціональна активність Т-Т-індукованих хелперів знижена на 23,4–38,0 % і статистично значущо зростає під впливом преінкубації клітин з тестостероном (на 17,1–30,4 %). Під впливом преінкубації клітин з плацентарним гормоном показник ІІНТХЕЛП. зростає на 38,8 % (р1
ЛПС –індукована хелперна активність у хворих на ХОЗЛ також істотно знижена: від 16,07 ± 0,65 % (р
Неспецифічна супресорна активність лімфоцитів у хворих 1-ї і 2-ї груп достовірно знижена на 31,1–45,3 % і статистично значущо зростає під впливом тестостерону (на 21,4–35,6 %) і плацентарного гормону (на 13,6–25,2 %).
Показник ЛПС — ІІНТСУПР. у хворих 1-ї і 2-ї груп достовірно знижений відповідно на 16,7 % і 32,5 % і статистично значущо зростає під впливом преінкубації клітин з тестостероном на 14,1–24,3 % (р1
Важливим гуморальним чинником нейтралізації ЛПС в організмі є антиендотоксинові антитіла. Особлива роль в цьому процесі, як вважають, належить полівалентним низькоафінним антитілам класу М [Дранник Г.Н., 1999]. За рівнем антитіл до ЕТ можливо судити, з одного боку, про надходження його у внутрішнє середовище організму, з іншого, про здатність організму формувати адекватну імунну відповідь, направлену на елімінацію чужорідної субстанції екзогенного або ендогенного походження [Гордиенко А.И. и соавт., 2003]. Тому вивчення вмісту секреторних і сироваткових антитіл до ЛПС розцінюються нами як важливий крок до розуміння патогенетичної суті ХОЗЛ.
Нами встановлено, що у хворих 1-ї і 2-ї груп має місце статистично значуще підвищення рівня анти-ЛПС-IgA в системному кровотоку. Разом з тим у хворих на ХОЗЛ виявлено залежне від рівня ендогенного тестостерону зниження дослідженого показника: у хворих 2-ї групи – на 49,7 % нижче, ніж у хворих 1-ї групи. Також встановлено, що рівень анти-ЛПС-IgМ у хворих 1-ї групи на 59,3 % вище за діапазон фізіологічних коливань даного показника. У хворих же 2-ї групи виявлено відносний дефіцит основного чинника нейтралізації ЛПС – анти-ЛПС-IgM: показник істотно не відрізняється від відповідного показника в контрольній групі осіб.
Перебіг ХОЗЛ характеризується також достовірним ростом рівня анти-ЛПС-IgG в сироватці крові на 62,4 % у хворих 1-ї групи і на 99,1 % у хворих 2-ї групи. Звертає на себе увагу, що наявність у хворих на ХОЗЛ тестостеронової недостатності характеризується ростом рівня анти-ЛПС-IgG в сироватці крові на 22,6 % (р1
При вивченні сироваткових антиендотоксинових антитіл (до гліколіпіду Salmonella minnesota Re595) встановлено, що статистично значущий ріст (у 5,8–4,6 рази, р
Перебіг ХОЗЛ характеризується також статистично значущим ростом рівня анти-Re-антитіл класу G: у хворих 1-ї і 2-ї груп – відповідно в 1,8 і 2,4 рази. При цьому у хворих 2-ї групи досліджений показник на 37,7 % (р1
До важливих ендотоксинзв¢язуючих організму, крім мононуклеарних фагоцитів, гострофазних білків, лізоциму, інтерферону, макроглобулінів, антитіл до Re-гліколипиду, відноситься ФН [Лиходед В.Г. и соавт., 2003]. Результати наших досліджень документують, що рівень циркулюючих комплексів ЛПС — ФН у хворих 1-ї групи підвищений на 87,1 %. У хворих 2-ї групи з дефіцитом синтезу ендогенного тестостерону має місце виснаження системи ФН-залежної елімінації ЛПС – показник підвищений тільки на 44,1 % (р і р1
При дослідженні гормоно-залежної функціональної активність лімфоцитів нами враховувалося, що саме мононуклеари відносяться до основних «цитокінпродукуючих» клітин [Keatings V. et al., 2001]. Нами вивчена гормонозалежна динаміка рівня цитокінів в культуральній рідині і встановлено, що в культуральному середовищі культур мононуклеарних клітин у хворих 1-ї групи рівень цитокіну IL-1в значно нижчий, ніж в системному кровотоку у здорових осіб і складає 13,52 ± 0,55 пг/мл. Під впливом введення в культуральне середовище тестостерону досліджений показник достовірно знижується на 12,1 %, а в культуральній експериментальній моделі з плацентарним гормоном – істотно не змінюється. У хворих 2-ї групи початковий рівень IL-1в значно (на 53,6 %) вищий, ніж у хворих 1-ї групи і статистично значущо знижується під впливом тестостерону і гонадотропіну (відповідно на 16,7 % і 19,0 %).
У культуральному середовищі культури мононуклеарних клітин у хворих 2-ї групи рівень цитокіну IL-4 в 1,6 рази (р1
Рівень цитокіну TNF-б в культуральному середовищі культури мононуклеарних клітин у хворих 1-ї складає 16,31 ± 0,21 пг/мл; у хворих 2-ї групи досліджений показник на 18,5 % вище. У хворих 2-ї групи виявлено також інгібуючі впливи на синтез TNF-б мононуклеарними клітинами тестостерону і плацентарного гормону. У хворих 1-ї групи виявлено зниження дослідженого показника (на 7,7 %, р
продолжение
--PAGE_BREAK--