--PAGE_BREAK--Культуру острівкових клітин кроля отримували за наступною схемою (Шумаков В.И. и др., 1995): видалення у кроля віком 2 тижні підшлункової залози, пунктирування протоку із введенням 0,25% розчину трипсину, механічна дезагрегація і глибока трипсинізація, центрифугування. Після видалення супернатанту у клітинний осад додавали поживне середовище Ігла. Життєздатність клітин перевіряли у камері Горяєва із одномоментним підрахунком їх кількості. Концентрація життєздатних клітин в 1 мл суспензії становила 2,5 млн/мл. Далі первинну суспензію розводили та розділяли на порції по 0,3 мл, кожна з котрих містила 50 тис. клітин. Культуру терміново вводили щурам-реципієнтам. Встановлено, що культура острівкових клітин ПШЗ містила 73,7% бета-клітин, 20,6% – альфа-клітин і 5,7% інших клітин.
Визначення рівня глюкози, ТГ, ЗХ і холестерину ЛПНЩ і ЛПВЩ проводили на напівавтоматичних біохімічних аналізаторах. Індекс атерогенності (ІА) розраховували за стандартною формулою: ІА=(ЗХ–ЛПВЩ)/ЛПВЩ. Вміст інсуліну визначали за допомогою імуноферментного аналізу.
Морфологічне і морфометричне дослідження проведене у лабораторії фундаментальних досліджень Інституту невідкладної і відновної хірургії ім… В.К.Гусака АМН України. З видалених тканин виготовляли забарвлені гематоксиліном та еозином препарати за стандартною методикою (Меркулов Г.А.., 1969). При імуногістохімічному забарвленні використовували первинні антитіла проти інсуліну (поліклональні, мурчакові), глюкагону (поліклональні, кролячі) та ядерного антигену клітин, що проліферують, – PCNA (моноклональні, клон PC10). Первинні антитіла виявляли за допомогою системи візуалізації “LSAB 2 for rat” (всі реактиви фірми DAKO, Данія).
Для підтвердження припущень щодо механізму впливу клітинних культур на острівковий апарат ПШЗ було виконано потрійне імунофлюоресцентне фарбування тканини залози у 3 тварин кожної групи на 45 та 70 добу експерименту… Для цього використовували антитіла проти інсуліну, PCNA, а також DAPI в якості ядерного барвника. Первинні антитіла виявляли за допомогою вторинних із флуоресцентними мітками таким чином, щоб ядра клітин, що діляться, забарвлювались у червоний колір, інших клітин – у синій, цитоплазма інсулін-позитивних клітин – у зелений колір.
Дослідження препаратів здійснювали на мікроскопі Axiostar (Carl Zeiss, Німеччина). Мікрофотографування проводили на дослідницькому мікроскопі Olympus AX70 (Японія) цифровою камерою Olympus DP50, морфометрічне дослідження – з використанням програми AnalySIS Pro 3.2 (фірма SoftImaging, Німеччина).
Морфометричне дослідження стану острівкового апарату проводили на забарвлених імуногістохімічно препаратах. Підраховували загальну кількість клітин в острівцях, кількість клітин, в ядрах яких експресується PCNA-антиген (клітини, що знаходяться у процесі поділу), кількість клітин, що містять у цитоплазмі інсулін і глюкагон, виміряли розмір кожного острівця. Для вивчення мікроангіопатії було обрано серце. Під час морфометричного дослідження судин серця вимірювали мінімальний внутрішній і зовнішній діаметри певної судини і вираховували радіус, абсолютну та відносну товщину стінки судини. Оскільки діаметр вивчених судин коливався від 10 до 150 мкм, то вони було розподілені на три групи: а) дрібні артерії з діаметром від 75 до 150 мкм; б) артеріоли з діаметром від 25 до 75 мкм; в) прекапілярні артеріоли з діаметром менше 25 мкм.
Статистичну обробку проводили за допомогою програми статистичного аналізу Primer of Biostatistics 4.03 (США) і Statistica 6.0 (StatSoft, США). Розбіжності між групами розраховувалися із використанням непараметричного критерію Крускала-Уолліса. Зв'язок між параметрами оцінювали за допомогою коефіцієнту рангової кореляції Спірмена.
Результати досліджень. Після введення алоксану через 30 діб у тварин розвивалася типова картина інсулін-залежного цукрового діабету із підвищенням середнього рівня глюкози до 12,52±2,02 ммоль/л (табл.1), що в 2,9 рази вище в порівнянні з контролем (p
Надалі (на 45 і 70 доби експерименту) спостерігали ознаки регенерації острівкової тканини. І хоча кількість острівців на одиницю площі не змінилася, у самих острівцях залишався високим процент клітин, що проліферують (табл.2,3), він був менший ніж на 30 добу, але значно вищий (в 4,3 рази на 45 добу і в 3,1 рази на 70 добу), ніж в інтактних тварин. Але прискорення проліферації клітин не відобразилося на питомому об’ємі острівкової тканини. Істотні зміни відбувалися у клітинному складі острівців. Якщо на 30 добу відносна кількість бета-клітин дорівнювала 34,0±2,7%, то на 45 добу вона вже була на рівні 45,9±3,8% (p
Таблиця 1
Показники обміну вуглеводів у тварин різних експериментальних груп на 70 добу експерименту
Група тварин
Глюкоза, ммоль/л
Інсулін, мкг/л
Контрольна (інтактні тварини)
4,31±0,48
1,03±0,25
Тварини на 30 добу експерименту
12,94±1,47
0,02±0,01
1 група
9,68±1,23
0,04±0,02
2А група
6,65±0,61##
0,24±0,08##
2Б група
6,14±1,11##
0,43±0,09##
3 група
7,68±1,78#
0,14±0,05##
4 група
5,82±0,80##
0,63±0,14##
Примітки: 1. Відмінності всіх показників у всіх експериментальних групах із відповідними показниками інтактних тварин достовірні при p
2.Вірогідність відмінностей показників із 1 групою тварин: # – p
Таблиця 2
Провідні морфометричні показники підшлункової залози у щурів різних груп на 45 добу експерименту
Показник
Інтактні тварини
(n=10)
На 30 добу експери-менту (n=3)
На 45 добу експерименту
1 група (n=3)
2А група (n=3)
2Б група (n=3)
3 група (n=3)
4 група (n=3)
Клітини, що проліферують, %
1,04±0,14
6,20±2,07†
4,44±0,62†
16,73±3,67†,§,*
21,79±2,19†,§,*
15,42±1,09†,§,*
44,13±4,85†,§,*
Питомий об’єм острівкової тканини, %
0,93±0,10
0,10±0,01†
0,10±0,01†
0,18±0,03†,§,*
0,22±0,33†,§,*
0,14±0,02†,§,*
0,31±0,04†,§,*
Середня кількість острівців на 10 мм2
11,70±1,62
2,21±0,37†
1,99±0,14†
4,00±0,51†,§,*
4,14±0,32†,§,*
3,70±0,16†,§,*
4,11±0,23†,§,*
Середня кількість ІСК на 1 мм2
69,03±8,50
3,37±0,10†
4,82±1,56†
7,03±1,08†,§
8,48±0,52†,§,*
5,89±0,23†,§
11,02±1,77†,§,*
Середня площа острівця, мкм2
8110,6±1056,6
4803,1±652,1†
5554,6±604,6†
5992,6±953,4†
7435,6±614,8§,*
4271,8±337,9†,*
6178,0±482,3†,§
Інсулін-позитивні клітини, %
77,5±2,1
34,0±2,7†
45,9±3,8†,§
32,4±5,5†,*
34,1±2,5†,*
40,4±2,7†,§
22,1±2,6†,§,*
Глюкагон-позитивні клітини, %
21,9±2,1
58,6±1,2†
49,7±2,8†,§
60,1±4,5†,*
52,1±5,0†,§
51,3±0,9†,§
31,5±1,1†,§,*
Інсулін- і глюкагон-негативні клітини, %
0,54±0,20
7,35±1,56†
7,09±1,01†
7,38±1,21†
13,66±2,67†,§,*
8,22±3,30†
46,09±3,32†,§,*
Відношення інсулін+ до глюкагон+ клітин
3,57±0,39
0,58±0,06†
0,93±0,13†,§
0,55±0,13†,*
0,66±0,11†,*
0,79±0,05†,§,*
0,70±0,07†,§,*
Середня кількість кластерів інсулін-позитивних ацинарних клітин на 10 мм2
—
2,96±0,59
3,15±0,58
3,07±0,47
3,54±0,23
3,65±0,45
3,41±0,28
Середня кількість клітин в кластері
—
4,42±0,51
4,68±0,40
4,25±0,53
4,15±0,59
4,23±0,34
4,34±0,70
Примітки: 1. Вірогідність відмінностей із групою інтактних тварин: † – p
Таблиця 3
Провідні морфометричні показники підшлункової залози у щурів різних груп на 70 добу експерименту
Показник
На 70 добу експерименту
1 група (n=9)
2А група (n=8)
2Б група (n=9)
3 група (n=8)
4 група (n=9)
Клітини, що проліферують, %
3,20±0,41†††,§
8,64±1,37†††,***
11,47±2,26†††,***,§
7,12±1,28†††,***
17,48±3,80†††,***,§
Питомий об’єм острівкової тканини, %
0,11±0,02†††
0,28±0,05†††,***,§
0,36±0,03†††,***,§
0,17±0,03†††,***,§
0,55±0,10†††,***,§
Середня кількість острівців на 10 мм2
1,96±0,42†††
4,30±0,56†††,***,§
3,93±0,67†††,***,§
3,82±0,93†††,***,§
4,41±1,13†††,***
Середня кількість ІСК на 1 мм2
6,41±0,66†††,§
11,06±2,55†††,***,§
26,02±2,29†††,***,§
7,50±1,25†††,*,§
39,90±7,79†††,***,§
Середня площа острівця, мкм2
6066,4±1342,4††
6288,7±1567,8†
9310,7±1257,8†,***,§
4681,9±790,9†††,*
13890,3±5305,8†††,***
Інсулін-позитивні клітини, %
60,2±3,9†††,§
46,1±7,8†††,***,§
71,7±2,4†††,***,§
51,5±6,1†††,**,§
77,6±1,7***,§
Глюкагон-позитивні клітини, %
33,1±3,4†††,§
53,4±7,8†††,***
22,3±3,5***,§
39,8±6,1†††,*,§
19,5±2,2†,***,§
Інсулін- і глюкагон-негативні клітини, %
6,75±2,52†††,§
0,45±0,12***,§
6,04±1,54†††
8,67±2,55†††,§
2,93±1,17†††,***,§
Відношення інсулін+ до глюкагон+ клітин
1,85±0,32†††,§
0,90±0,32†††,***,§
3,30±0,60***,§
1,34±0,37†††,**,§
4,03±0,54†,***,§
Примітки: 1. Вірогідність відмінностей із групою інтактних тварин: † – p
Таблиця 4
Основні показники ліпідного обміну у щурів різних груп
Показник
Інтактні щури (n=10)
На 30 добу експерименту (n=3)
На 70 добу експерименту
1 група (n=9)
2А група
(n=8)
2Б група
(n=9)
3 група
(n=8)
4 група
(n=9)
ТГ, ммоль/л
0,47±0,07
1,23±0,10†
1,27±0,20†††
0,68±0,15††,§,***
0,65±0,13††,§,***
0,87±0,22†††,§,**
0,54±0,09§,***
ЗХ, ммоль/л
1,03±0,12
1,69±0,04†
1,69±0,16†††
1,35±0,16†††,§,***
1,32±0,14††,§,***
1,50±0,29††
1,10±0,13§,***
ЛПВЩ, ммоль/л
0,46±0,07
0,26±0,05†
0,29±0,08††
0,37±0,11
0,41±0,10§,*
0,33±0,06††
0,42±0,07§,**
ЛПНЩ, ммоль/л
0,37±0,06
0,77±0,05†
0,72±0,08†††
0,64±0,17††
0,57±0,10†††,§,**
0,71±0,21††
0,44±0,08†,§,***
ІА
1,27±0,18
5,69±1,36†
5,25±1,49†††
2,96±1,15†††,§,**
2,34±0,59†††,§,***
3,67±0,98†††,§
1,62±0,21††,§,***
Примітки: 1. Вірогідність відмінностей із інтактними тваринами: † – p
Таблиця 5
Середня абсолютна товщина стінки судин у тварин різних груп на 70 добу експерименту
Групи
продолжение
--PAGE_BREAK----PAGE_BREAK--