--PAGE_BREAK--При дослідженні впливу процедури заморожування КТ в температурному інтервалі кристалізації (від 0/-1,5 до -35…-40 °C) на показники структурної цілісності і функціональних властивостей кріоконсервованих тромбоцитів застосовували наступні програми:
програму №1: охолодження зразка від 22 ± 2 °C до -35…-40 °C проводили зі швидкістю 1°C/хв, після чого – занурювали у рідкий азот;
програму №2: зразок охолоджували аналогічно програмі №1, але додатково вводили процедуру температурної ініціації кристалізації, після чого застосовували контрольовану швидкість охолодження 6 – 7 °C/хв;
програму №3: охолодження зразка проводили аналогічно програмі №2, але після процедури температурної ініціації кристалізації зменшували швидкість його охолодження до 0,2 – 0,3 °C/хв.
Заморожування зразків за зазначеними програмами здійснювали з кріопротектором та без нього. При застосуванні програм, що передбачали процедуру температурної ініціації кристалізації, величина переохолодження не перевищувала 0,5 – 1 °С.
При дослідженні впливу швидкості заморожування КТ з ДМСО в зоні евтектичних температур (від -35…40 до -80 єC) на показники структурної цілісності і функціональних властивостей тромбоцитів застосовували програми №4 – №7 (табл. 1).
Показники структурної цілісності і функціональних властивостей тромбоцитів, отримані після кріоконсервування КТ за програмами №4 – №7, порівнювали з відповідними показниками після заморожування КТ того ж донора за програмами №1, №2 та №8 [Balint B. еt al., 2006], що за даними літератури забезпечує високий рівень збереженості кров’яних пластинок. При дослідженні кріозахисної ефективності середовищ різного композиційного складу застосовували програми заморожування №1 та №2.
Таблиця 1
Програми заморожування №4 – №7
Прог-
рами
Швидкість охолодження в температурних інтервалах
від 22 ± 2 до
-35…-40 °C
від -35…-40 до -80 °C
від -80 до -196 °C
№4
1 °C/хв
0,5 – 1 °С/хв
занурення в рідкий азот
№5
1 °C/хв
5 – 7 °С/хв
занурення в рідкий азот
№6
1 °C/хв
10 – 15 °С/хв
занурення в рідкий азот
№7
1 °C/хв
25 – 30 °С/хв
занурення в рідкий азот
Відігрівання зразків здійснювали на водяній бані при 37 °C, одразу після чого проводили оцінку кількісної збереженості тромбоцитів та визначення ступеня їх пошкодження за активністю в супернатанті цитозольних ферментів. Ступінь пошкодження тромбоцитів після термоциклювання (Т) приймали за 100 %. Морфофункціональні показники кріоконсервованих клітин визначали після видалення кріопротектора.
Статистичну обробку одержаних результатів проводили із застосуванням критерію Стьюдента та непараметричного критерію Вілкоксона-Манна-Уітні.
Результати досліджень та їх обговорення
Відомо, що процедура отримання КТ спричиняє зміну морфофункціонального стану певної частини кров’яних пластинок, їх активацію [Bode A.P., 1990; Estebanell E. et al., 2000]. Ступінь активації залежить від умов та способу виділення клітин [Bцck M. et al, 2002]. На першому етапі досліджень, при оцінці морфофункціонального стану тромбоцитів, виділених з донорської крові двома різними методами, ми застосували люмінесцентну мікроскопію, яка базується на здатності кров’яних пластинок акумулювати в гранулярному апараті флуорохром АО. Порівняльний аналіз співвідношення морфологічних форм тромбоцитів в препаратах ЗТП та КТ показав, що останні містять значно більшу кількість активованих гранулярних, агранулярних форм (рис. 1) та агрегатів тромбоцитів, характеризуються нижчим показником гранулярності та вищим ступенем мікровезикуляції (табл. 2). Зазначені ознаки активації тромбоцитів виявилися більш вираженими в препаратах КТ із ЗТП, ніж КТ з ЛТШ.
Таблиця 2
Показники активації тромбоцитів ЗТП, КТ з ЛТШ та КТ із ЗТП (М ± у, n = 6)
Показники
Компонент
ЗТП
КТ з ЛТШ
КТ із ЗТП
Агрегати тромбоцитів (в полі зору)
0 – 1
2 – 3
4 – 6
Мікровезикуляція
– / +
++
+++
Показник гранулярності
4,5 ± 0,4
2,8 ± 0,6
1,9 ± 0,7*
Примітка: * – відмінності статистично достовірні порівняно з відповідним показником ЗТП, та КТ з ЛТШ, РU
У межах 2 – 4 годин після виділення КТ спостерігалося значне пригнічення індукованої АДФ і колагеном агрегації кров’яних пластинок у порівнянні з даними для ЗТП (рис. 2А, 2Б). При цьому агрегація тромбоцитів КТ з ЛТШ була достовірно вищою від агрегації тромбоцитів КТ із ЗТП. Протягом наступних 18 – 24 годин зберігання КТ при 22 ± 2 єС агрегаційна здатність тромбоцитів дещо відновлювалася. Показники агрегації тромбоцитів КТ з ЛТШ достовірно не відрізнялися від відповідних показників тромбоцитів ЗТП. Агрегаційна здатність тромбоцитів КТ із ЗТП залишалася значно нижчою, ніж тромбоцитів ЗТП та КТ з ЛТШ. Ступінь РГШ тромбоцитів КТ із ЗТП виявився достовірно нижчим, ніж тромбоцитів ЗТП та КТ з ЛТШ в межах 2 – 4 годин після виділення (рис. 2В). Після 18 – 24 годин зберігання при 22 ± 2 єС не виявлено достовірних відмінностей між показниками РГШ тромбоцитів КТ, виділених різними методами. Активність ЛДГ після виділення КТ обома методами була значно вищою порівняно з активністю ферменту у ЗТП до виділення КТ. Виявлено також суттєві відмінності між активністю ЛДГ у КТ, отриманих різними методами. Отже, результати досліджень показали, що обрані нами методи виділення КТ спричиняють різний ступінь активації/травматизації тромбоцитів.
Наступним етапом роботи було порівняльне дослідження ефективності кріоконсервування КТ, виділених з донорської крові двома різними методами. Виявилося, що кріоконсервування КТ з ДМСО за програмою №1 призводить до значного порушення або втрати здатності тромбоцитів до накопичення АО. Про це свідчить збільшення у КТ після відігрівання вмісту активованих форм тромбоцитів та наявність формених елементів, що не включають флуорохром –акридин-негативних (рис. 1).
Для кращої репрезентації здатності популяції в цілому до накопичення АО ми ввели інтегральний показник – індекс акумуляції флуорохрому (ІАФ), для обчислення якого застосували формулу Астальді і Верга [Меньшиков В.В., 1982]. Розрахований для зразків ЗТП ІАФ (2,84 ± 0,057) виявився достовірно вищим порівняно з ІАФ, розрахованими для КТ із ЗТП (1,57 ± 0,039) та КТ з ЛТШ (1,75 ± 0,058). ІАФ тромбоцитів КТ із ЗТП виявився достовірно нижчим, ніж ІАФ КТ з ЛТШ не тільки до, а й після кріоконсервування (відповідно 0,79 ± 0,025 та 0,98 ± 0,023).
У результаті кріоконсервування значно порушувалася також агрегаційна здатність тромбоцитів та РГШ (рис. 2). Встановлено, що збереженість цих морфофункціональних властивостей тромбоцитів після відігрівання значною мірою залежить від ступеня активації/травматизації останніх перед заморожуванням. Саме тому вибір способу одержання тромбоцитів для подальшого їх кріоконсервування є надзвичайно важливим. Метод виділення КТ з ЛТШ забезпечує менший ступінь активації кров’яних пластинок, нижчий вміст тромбоцитарних агрегатів та залишкових клітин і, як результат, – вищий рівень збереженості морфофункціональних властивостей клітин після кріоконсервування. У подальших експериментах з кріоконсервування ми використовували КТ, виділені з ЛТШ.
Активація вільнорадикальних процесів із залученням мембранних ліпідів при заморожуванні-відігріванні сприяє поглибленню структурної дезорганізації мембран та розвитку їх деструкції [Richter E. et al., 1985; Белоус А.М., 1997]. Порівняльне дослідження антирадикальних властивостей органічних сполук різних хімічних класів, що найчастіше застосовуються при низькотемпературному консервуванні тромбоцитів, показало: всі кріопротектори з ряду досліджених мають здатність перехоплювати гідроксильні радикали в модельній системі їх генерації і за даною властивістю розташувалися у порядку зростання: ГЛ
Присутність у системі “тромбоцити-плазма” таких кріопротекторів, як ГЛ та ОЕГn=5 у досліджуваних концентраціях призводила до достовірного підвищення інтенсивності індукованого іонами заліза ПОЛ порівняно з контролем (рис. 4). Інтенсивність індукованого ПОЛ у системі за присутності ДМАЦ, 1,2-ПД та ДМСО у концентрації 0,7 М залишалася на рівні контролю.
Очевидно, характер впливу кріопротектора на інтенсивність ПОЛ у системі “тромбоцити-плазма”, перш за все, визначається його хімічною природою та концентрацією. Можливо, структурні зміни мембрани, пов’язані з відносно швидким додаванням повільно проникаючого через мембрану тромбоцитів ГЛ та непроникаючого ОЕГn=5, роблять її більш чутливою до окислювальних впливів. Нам не вдалося виявити залежності між здатністю кріопротекторів до перехоплення гідроксильних радикалів у модельній системі та характером їх впливу на інтенсивність ПОЛ у системі “тромбоцити-плазма”.
Важливою умовою адекватної оцінки морфофункціонального стану тромбоцитів на етапах кріоконсервування є максимальне видалення кріопротектора із суспензії кров’яних пластинок. Процедура видалення кріопротекторів, яку зазвичай здійснюють центрифугуванням з наступним ресуспендуванням осаджених клітин у плазмі, призводить до додаткового суттєвого пошкодження кров’яних пластинок [Zilber M. et al., 2003; Schoenfeld H. et al., 2005]. Нами був розроблений і апробований спосіб максимального видалення кріопротектора із суспензії тромбоцитів за умов мінімального механічного та осмотичного навантаження на кров’яні пластинки [Пат. №15014 Україна, 2006]. Застосування розробленого способу в наших дослідженнях дозволило отримати більш достовірну інформацію щодо впливу кріопротекторів та інших факторів кріоконсервування на морфофункціональний стан тромбоцитів.
Дослідженнями встановлено, що експозиція КТ з ДМСО, ДМАЦ та 1,2-ПД у кінцевій концентрації 0,7 М не супроводжується помітними змінами морфофункціональних властивостей тромбоцитів: здатності до акумуляції АО, індукованої АДФ та колагеном агрегації, РГШ. Достовірні зміни морфофункціональних властивостей тромбоцитів спостерігалися при підвищенні концентрації кріопротекторів у суспензії клітин до 1,4 М: у КТ збільшувався вміст активованих форм та агрегатів, зменшувався показник гранулярності, змінювалися показники агрегаційної здатності та РГШ. Так як обрані кріопротектори у кінцевій концентрації 0,7 М не викликали значних змін морфофункціонального стану тромбоцитів, у подальших експериментах з кріоконсервування вони застосовувалися у даній концентрації.
Відомо, що одним із відповідальних етапів при низькотемпературному консервуванні є охолодження біологічного об’єкта в температурному інтервалі кристалізації кріобіологічної системи. Значний вплив на характер кристалізаційних процесів мають швидкість охолодження та ступінь переохолодження [Белоус А.М. и др., 1987]. На першому етапі було досліджено вплив процедури заморожування КТ з 0,7 М ДМСО та без кріопротектора в температурному інтервалі від 0/-1,5 до -35…-40 єC на ступінь пошкодження тромбоцитів, визначений за активністю цитозольних ферментів у позаклітинному середовищі, та на показники їх морфофункціональної збереженості. Отримані результати свідчать, що заморожування за програмою №2, яка передбачає застосування процедури температурної ініціації кристалізації, має результатом значно менший ступінь пошкодження тромбоцитів, ніж заморожування за лінійною програмою №1 (рис. 5). Причому, в присутності кріопротектора значення процедури ініціації кристалізації було помітно меншим, ніж за його відсутності. Не виявлено достовірних відмінностей між показниками пошкодження тромбоцитів після заморожування КТ без кріопротектора за програмою №2 з ініціацією кристалізації та після кріоконсервування КТ з 0,7 М ДМСО за лінійною програмою №1. Так як програма №2 передбачає застосування не тільки процедури ініціації кристалізації, а й наступної контрольованої (6 – 7 °C/хв) швидкості охолодження, ми вирішили дослідити значення швидкості охолодження кріобіологічної системи після ініціації кристалізації. Для цього додатково застосували програму №3, що забезпечувала швидкість охолодження в зазначеному температурному інтервалі 0,2 – 0,3 °C/хв. Ступінь пошкодження тромбоцитів, заморожених з 0,7 М ДМСО та без кріопротектора за програмою №3, виявився достовірно вищим, а рівень збереженості функціональних властивостей – нижчим, ніж заморожених за програмою №2. Зменшення швидкості охолодження призвело до збільшення часу знаходження клітин у системі, що кристалізується. Очевидно, основним механізмом пошкодження клітин за цих умов став так званий “ефект розчину”, значення якого в присутності кріопротектора було помітно меншим. Отже, лише поєднання процедури зняття переохолодження з наступною певною контрольованою швидкістю охолодження в температурному інтервалі кристалізації може забезпечити істотне зниження ступеня пошкодження кров’яних пластинок.
Дослідженнями останніх років виявлено явище низькотемпературного евтектичного розшарування розчину ДМСО і показано, що даний фізичний чинник може викликати летальні пошкодження кріолабільних клітин [Kyryliuk G.L. et al., 2006]. Зменшити його вплив запропоновано шляхом проходження температурного інтервалу, в якому відбувається евтектичне розшарування розчину кріопротектора, з підібраною експериментально швидкістю охолодження. Тому важливим було дослідити вплив швидкості заморожування КТ з 0,7 М ДМСО в зоні евтектичних температур (від -35…-40 до -80 єC) на ступінь пошкодження кров’яних пластинок. З підвищенням швидкості проходження даного температурного інтервалу (від 0,5 – 1 до 25 – 30 єC/хв) спостерігалася тенденція до зменшення ступеня пошкодження кріоконсервованих тромбоцитів (рис. 6). Але швидкість, що реалізувалася при прямому зануренні зразка у рідкий азот (програма №1), була занадто великою, про що свідчить підвищення активності Г6ФДГ і ЛДГ у позаклітинному середовищі (р
Ступінь пошкодження тромбоцитів після кріоконсервування за програмою Balint B. (№8), яка передбачала проходження з різною контрольованою швидкістю інших температурних інтервалів, достовірно не відрізнявся від аналогічних показників після кріоконсервування за програмами №2,4,5,6,7. Ефективність даної програми заморожування виявилася достовірно вищою порівняно з програмами №1 та №3 (рис. 5; 6).
Таким чином, швидкість охолодження суспензії тромбоцитів у температурному інтервалі кристалізації та зоні евтектичних температур є фактором, що має визначальний вплив на ефективність кріоконсервування КТ.
Дослідження впливу композиційного складу середовища кріоконсервування на морфофункціональні показники кріоконсервованих тромбоцитів показали, що найвищий рівень збереженості індукованої АДФ агрегації забезпечив ДМАЦ та його комбінації з 1,2-ПД (рис. 7А). За здатністю зберігати дану властивість тромбоцитів досліджені кріопротектори та їх комбінації розмістилися в порядку зростання: 0,7 М 1,2-ПД ≤ 0,7 М ДМСО
продолжение
--PAGE_BREAK--