А.Б.Рубин, О.Р.Кольс, Т.Е.Кренделева и др.
Направление«медицинская биофизика» ориентированно на использовании в медицине результатовфундаментальных исследований в области мембранных процессов, фотобиологии, биофизикиклетки. Эти результаты медицина использует для познания на молекулярном уровнемеханизмов возникновения заболеваний, для ранней диагностики, для выработкиспособов воздействия на патологические процессы.
Важнымнаправлением исследований в области биофизики клетки, имеющим прикладноемедицинское значение, являются исследование функциональных свойств эритроцитови связи изменения формы и объема клетки, а также вязкости и проницаемостиклеточной мембраны, с конформацией гемопорфирина гемоглобина и эффективностьюпереноса кислорода. Выявлены изменения вязкости и проницаемости плазматическоймембраны эритроцита и сродства гемоглобина к О2 и NO у больных артериальной гипертониейи ишемической болезнью сердца. Установлено, что при этих болезнях наблюдаютсяувеличение вязкости липидов различных областей плазматической мембраны, болеевысокие скорости Na+ /H+ — обмена, активность Са2+ — зависимых К+ — каналов инизкая активность Са2+ — АТФазы. Предполагается, что выявленные изменениявязкости и проницаемости плазматической мембраны снижают эффективность переносакислорода гемоглобином при артериальной гипертонией и ишемической болезньюсердца. Установлен характер изменения вязкости плазматической мембраныэритроцита и сродства гемоглобина к О2 и NO у здоровых доноров, проживающих вусловиях высокогорья. Вероятно, изменения в содержании комплексов гемоглобин —лиганд и гемоглобин — NO у доноров, проживающих в условиях высокогорья, повышаютэффективность переноса кислорода гемоглобином.
Исследовановоздействия факторов космического полета (α- частицы и дейтроны, магнитноеполе, оптическое, лазерное излучение) на функционирование нервной клетки иэритроцитов. Впервые обнаружены особенности связывания кислорода в эритроцитахчеловека в ходе космического полета. Выявлено увеличение вязкости и отношениясодержания холестерина к содержанию фосфолипидов, а также увеличениеспецифической проницаемости плазматической мембраны для ионов Na+ и H+ иизменения конформации гемопорфирина гемоглобина. Установлено, что послекосмического полета обратимо снижается содержание гемоглобина и его комплексов.В ходе космического полета снижение числа дискоцитов осуществляется за счетувеличения числа трансформированных эритроцитов (книзоцитов и овалоцитов).По-видимому, в условиях космического полета связывание кислорода и содержаниекомплексов гемоглобина зависит от формы клетки, вязкости и проницаемостиплазматической мембраны.
Методы адресной доставки лекарств и генетическогоматериала в клетки
Этиисследования находятся на стыке биофизики, молекулярной биологии, биоинженерии,нанобиолотехнологии, фармакологии и онкологии. Одним из методов являетсяопосредованный мембранными рецепторами эндоцитоз (см. иллюстрацию на последнейстранице обложки) — процесс избирательного концентрирования и поглощенияклеткой веществ, для которых на плазмалемме существуют специфичныеинтернализуемые рецепторы.
Большоеместо в этих работах занимает проблема внутриклеточной доставки противораковыхлекарств. Фотосенсибилизаторы − молекулы, генерирующие при освещенииактивные формы кислорода, − используются для фотодинамической терапиирака и ряда др. болезней; к сожалению, они вызывают поражение здоровых клеток итканей, и другие побочные эффекты, причем их цитотоксическое действиеограничивается преимущественно плазматической мембраной. Для доставкифотосенсибилизаторов в наиболее чувствительную к ним мишень — ядро —сконструированы модульные рекомбинантные транспортеры (МРТ). В состав МРТвходят:
лигандк интернализуемым рецепторам, обеспечивайщий поглощение МРТ клеткой,
эндосомолитическийкомпонент, обеспечивайщий выход МРТ из эндосом в цитоплазму,
сигналядерной локализации, ответственный за транспорт МРТ в ядро клетки,
белок-носительи
фотосенсибилизаторлибо другой лекарственный компонент, который требуется доставить в ядро.
Дляулучшения внутриядерной доставки конъюгатов применяются аттенюированные(ослабленные) аденовирусы, обладающие способностью образовывать поры вмембранах эндосом. Наиболее эффективные модульные конъюгаты оказались нанесколько порядков более эффективными, чем свободные, неконъюгированныефотосенсибилизаторы. Транспортеры могут быть эффективно использованы длядоставки других локально действующих лекарств − радионуклидов, испускающихальфа- частицы и также применяемых для терапии рака. Показано, что транспортерымогут увеличивать цитотоксическое действие источника альфа-эмиттера астата-211примерно в десять раз.
МРТпридают фотосенсибилизаторам клеточную специфичность: конъюгатыфотосенсибилизатор-МРТ обладают в сотни и тысячи раз большей эффективностью вотношении клеток- мишеней, чем немодифицированные фотосенсибилизаторы, но −в отличие от последних − не фототоксичны в отношении клеток, неявляющихся мишенями. Оказалось возможным заменять лигандные модули в составеМРТ, что позволило переключить МРТ на другой тип клеток-мишеней, а такжесущественно (более чем в 3000 раз) увеличить фототоксическую эффективностьприменяемых фотосенсибилизаторов.
Приразработке метода рецептор-опосредуемой трансфекции предпринята попыткаимитировать вирусный путь доставки генетической информации, используяискусственные конструкции. Известно, что вирусы эффективно переносят свойгенетический материал в клетки-хозяева. У большинства вирионов есть:
компоненты,ответственные за узнавание интернализуемых (т.е. поглощаемых путем эндоцитозапосле связывания с соответствующим лигандом) рецепторов на поверхности этихклеток,
компоненты,обладающие эндосомолитической активностью,
участки,обеспечивающие транспорт нуклеиновых кислот в ядро,
компоненты,обратимо связывающие нуклеиновые кислоты.
Удалосьпродемонстрировать возможность доставки генов in vivo, например, вэпителиальные клетки молочных желез с использованием конструкций, доставляющихДНК путем рецептор-опосредуемого эндоцитоза. Этот же подход был эффективноиспользован и для трансфекции ранних эмбрионов млекопитающих.
Антимикробная фотодинамическая терапия
Антимикробнаяфотодинамическая терапия — новый перспективный метод лечения инфекций кожи ислизистых, основанный на избирательной окислительной деструкции патогенныхмикроорганизмов при комбинированном воздействии красителя (фотосенсибилизатора)и оптического излучения соответствующего спектрального состава.
Приисследовании молекулярных основ фотодинамической инактивации клеток большоевнимание уделяется комплексному определению параметров их жизнедеятельности:интенсивности дыхания, целостности плазматической мембраны и генетическогоаппарата. Это помогает установить механизмы действия фотосенсибилизаторов, ихсубклеточную локализацию и основные мишени окислительной деструкции. Разработанновый метод скрининга фотосенсибилизаторов с антибактериальной активностью потесту фотоиндуцированного подавления биолюминесценции генно-инженерных штаммовбактерий.
Впоследние годы отмечается все ускоряющийся процесс развития лекарственнойустойчивости патогенных микроорганизмов. В этой связи антимикробнойфотодинамической терапии уделяется большое внимание, и этот методрассматривается как альтернативный способ борьбы со штаммами возбудителейзаболеваний, устойчивыми к действию традиционных лекарственных препаратов.
Разработаныновые и модифицированы известные методики качественной и количественной оценкивнутриклеточной локализации и внутриклеточного движения макромолекул. В ихчисло входят: методы конфокальной лазерной сканирующей микроскопии, методвосстановления флуоресценции после фотоотбеливания, позволяющий определятьконстанты скорости и коэффициенты диффузии перемещающихся молекул в клетке, долюподвижных и неподвижных изучаемых молекул и др., методы радиационнойинактивации, различные варианты видео-интенсифицированной микроскопии, включаяметоды деконволюции, поверхностный плазмонный резонанс и атомно-силоваямикроскопия.
Разработкановых методов исследования часто приводит к появлению новых направлений вмедицинской практике. Так произошло и в случае метода зондовогомикрофлуорометрического анализа клеток или метод флуоресцентных зондов.Активное его применение в последние десятилетия показало широкие, подчаснедоступные для других методов, возможности такого подхода. Это, в первуюочередь, связано с возможностью проведения с помощью набора флуорохромовкомплексного количественного анализа структуры и различных сторон метаболизмаживой клетки.
Целыйряд флуоресцирующих соединений (как внутриклеточной природы, так и вводимых вклетку извне) обладает способностью отвечать изменением параметров собственнойфлуоресценции на изменение физико-химических свойств окружения. Благодаря этомусоздается возможность следить за такими параметрами клетки, как электрическийпотенциал на мембране, концентрация протонов и кальция, вязкость липидногобислоя, подвижность компонентов плазматической мембраны и ее проницаемость, клеточнаяжизнеспособность, синтетическая активность клетки, состояние еемитохондриального и лизосомального аппарата, содержание некоторыхвнутриклеточных соединений. Число специально синтезируемых флуорохромовпостоянно растет, что позволяет изучать все новые стороны клеточногометаболизма.
Спомощью зондового микрофлуориметрического анализа клеток и молекулярнойфотобиологии микроорганизмов исследуют механизмы модифицирующего иповреждающего действия на клетки биологически активных факторов различной природы(электромагнитного излучения рентгеновского и ультрафиолетового и видимогодиапазонов, изменения силы тяжести, гипоксии и реоксигенации, активных формкислорода, биологически активных веществ, регуляторных пептидов, рядафармакологических препаратов, включая фотосенсибилизаторы). На базе проводимыхисследований ведется работа по созданию клеточных тест-систем и животныхмоделей для оценки эффективности биологического действия факторов физической ихимической природы и изучению механизмов их действия.
Впоследние годы флуорохромы все более активно применяются при изучении одиночныхклеток. Такой подход, в значительной степени благодаря успешному развитиюмикрофлуориметрической техники (конфокальная микроскопия и др.), оказываетсязначительно более информативным, чем флуориметрия клеточных суспензий, ипозволяет проводить более тонкий анализ механизмов функционирования клетки, вчастности, даже на уровне отдельных внутриклеточных органелл. Следует особоподчеркнуть, что метод дает уникальную возможность для изучения гетерогенностиклеток в популяции по исследуемому параметру. С этой целью используютсяспециально разработанные приборы — проточные флуориметры. Важным достоинствоммикрофлуориметрического метода является также и то, что для проведения исследованийтребуются минимальные количества биологического материала. Это особенно важно вусловиях, когда по тем или иным причинам количества его ограничены, как, например,в случае использования клинического материала в научно-исследовательской работеи при постановке флуоресцентных диагностических тестов, которые получают всеболее широкое применение в медицине.
Однимиз направлений исследований, проводимых с использованием зондовогомикрофлуориметрического анализа животных клеток, является анализ механизмов модифицирующегои повреждающего действия на клетки (главным образом — иммунокомпетентные)биологически активных факторов различной природы. С использованиемразработанного микрофлуориметрического метода определения внутриклеточного рНизучается влияние различных факторов физической и химической природы (и ихсочетаний) на функционально- метаболическую активность клеток, состояние ихплазматических мембран, систему внутриклеточной рН-регуляции, генерацию имиактивных форм кислорода и др. Применение ингибиторов и активаторов различныхрегуляторных систем клетки позволило углубить представления о процессах, происходящихпри этом на клеточном уровне и выявить связь наблюдаемых изменений с состояниемсистемы внутриклеточной рН-регуляции.
Особоевнимание в последние годы уделяется изучению механизмов повреждающего действияна клетки Н2 О2 — индуцированного окислительного стресса и защиты от него спомощью факторов различной природы (лекарственные препараты семакс и мексидант,внутри- и внеклеточный рН и др.).
Список литературы
Дляподготовки данной работы были использованы материалы с сайта bio-cat.ru/