Введение.
Биотехнологияв воспроизводстве и селекции крупного рогатого скота имеет особое значение.Крупный рогатый скот относится к одноплодным видам млекопитающих. Поэтому отодной коровы можно получить в лучшем случае одного теленка в год, в то время,как в её яичнике содержатся сотни тысяч незрелых половых клеток (ооцитов),представляющих огромный генетический резерв. Кардинальное решение проблемыускоренного воспроизводства скота состоит в том, чтобы перейти к нетрадиционнымспособам увеличения плодовитости. Для этого применяется целый рядбиотехнических методов, разработанных на основе углубленных исследованийрепродуктивной функции, её регуляции, а также на совершенствование приемовманипуляции с эмбрионами, половыми и соматическими клетками. В перспективебиотехнология рассматривается как основа ускоренного воспроизводствавысокопродуктивных животных и целых популяций.
Впоследнее время приобрела практическое значение трансплантация эмбрионов,которая рассматривается как эффективный метод биотехнологии ускоренногоразмножения высокоценных племенных животных. Некоторые вопросы трансплантацииэмбрионов крупного рогатого скота рассмотрены в данной курсовой работе.
Отбор доноров.
Вбольшинстве случаев в качестве коров-доноров отбирают матерей потенциальныхплеменных быков. Благодаря этому обеспечивается высокий селекционныйдифференциал. Оценка и отбор коров-доноров, выделенных в группу матерей быков,проводят в два этапа. На первом этапе племенная ценность донора оценивается поглавным признакам молочного скота — по уровню молочной продукции ижирномолочности. На втором этапе, когда отобраны доноры с высокой племеннойценностью по главным признакам, число признаков в зависимости от цели селекциирасширяется. К ним относят форму вымени и сосков, свойства молокоотдачи,резистентность, крепость костяка и копыт, тип и воспроизводительные качества.
Нужноиметь в виду, что оценка коровы-донора по родословной и собственнойпродуктивности является не окончательной, так как в этом случае не учитываетсяэффект расщепления и рекомбинации генов. Поэтому окончательно оцениватькорову-донора можно только при получении и оценке ее потомства.
Высокиезатраты на получение телят путем трансплантации эмбрионов обусловливаютнеобходимость отбирать таких доноров, от которых регулярно можно получатьбольшое количество эмбрионов. Предпочтение следует отдавать коровам, сохранившимв течение трех отелов стабильную воспроизводительную способность.Исследованиями установлено, что потенциальные коровы-доноры с хорошими иустойчивыми воспроизводительными способностями отличаются предрасположенностьюк воспроизводству эмбрионов, которые можно регулярно получать через каждые двамесяца.
Межотельныйпериод является интегральным показателем воспроизводительной способности коров.Его составные части: сервис-период и период стельности.
Сервис-периодболее точно и намного раньше, чем интервал между отелами, выявляетпотенциальные возможности воспроизводительной функции у коров. Он тесно связанс межотельным периодом (коэффициент корреляции составляет 0.9). Оптимальныйсервис-период не должен превышать 80 дней. Однако анализ сервис-периода,проведенный в ведущих племенных стадах черно-пестрой породы, показал, чтоданный показатель воспроизводительной функции коров имеет высокий коэффициентизменчивости, который составил 61%.
Сервис-периодв основном зависит от интервала между отелом и первым осеменением, и интерваламежду первым и последним, т.е. эффективным осеменением. Высокопродуктивныхкоров следует осеменять на втором месяце после нормального отела. Этообусловлено тем, что первый половой цикл проявляется слабо, половая охота клиническиплохо определяется или вовсе не обнаруживается.
Первоеосеменение коров на втором месяце после отела не удлиняет сервис- и межотельныйпериод. При оптимальном сервис-периоде до 80 дней после первого и второгоосеменений средняя оплодотворяемость коров составляет 95-98%, апродолжительность межотельного периода не превышает одного года.
Дляоценки воспроизводительных способностей коров, отобранных в качествепотенциальных доноров, необходимо анализировать такие параметры какоплодотворяемость от первого осеменения и индекс осеменения. При правильнойтехнике осеменения и своевременном определении половой охоты оплодотворяемостькоров от первого осеменения должна составлять в среднем 60%.
Важнымпоказателем воспроизводительной способности коров является индекс осеменения,т.е. количество осеменений на одно оплодотворение. Индекс осемененияхарактеризуется высокой степенью изменчивости — коэффициент вариабельностиможет достигать 70%. Существенное влияние на изменчивость индекса осемененияоказывают такие факторы, как продолжительность периода от отела до первогоосеменения, своевременное выявление коров в половой охоте, оплодотворяющаяспособность спермы быка и др. Индекс осеменения коров, выделенных в группупотенциальных доноров, не должен превышать 1.5. В идеальном случаепотенциальная корова-донор должна иметь индекс осеменения равный 1. Укоров-доноров при всех отелах должны отсутствовать осложнения(мертворождаемость, задержание последа, послеродовые заболевания половыхорганов).
Через15-20 суток после отела ветеринарный специалист методом ректальной пальпацииконтролирует у потенциальной коровы-донора состояние половых органов, чтобыисключить такие нарушения воспроизводительной функции как киста яичника,гипофункция, воспаление яичниковой связки, эндометриты.
Суперовуляция.
Важнымзвеном в современной биотехнологии трансплантации эмбрионов крупного рогатогоскота является гормональноевызывание суперовуляции у коров-доноров. В группудоноров переводят только тех коров, которые положительно реагируют на введениегормонов. Для стимуляции множественной овуляции используют гонадотропин СЖК всочетании с простагландинами и другими биологически активными веществами [3].Этот способ, как показывает практика, позволяет вызвать суперовуляцию примерноу 70% коров.
Однимиз существенных недостатков этого способа суперовуляции является крайне высокаястепень вариабельности числа овуляций, даже при использовании одной и той жеконцентрации гонадотропина СЖК. Она составляет от 0 до 50 овуляций на однукорову-донора. Оптимальным результатом суперовуляции является выход из яичникав воронку яйцепровода 10-20 яйцеклеток.
Shelton, J.N.[7], подытоживая результаты исследований, пришел к выводу, что на инъекциигонадотропинов 25-35% коров-доноров не реагируют, а у положительно реагирующихкоров (3 и более овуляций) вариабельность реакции яичника настолько велика, чтостановится невозможным надежное планирование программы пересадки эмбрионов. Kenneth, L.W.[4] считает, что с учетом имеющейся изменчивости лишь половина коров,реагирующих на введение гонадотропинов, может дать 4-5 эмбрионов, пригодных длятрансплантации. Следовательно, в основном эмбрионы можно получить менее чем отполовины первоначально тщательно отобранных потенциальных коров-доноров.
Посовременному представлению реакция коров на суперовуляцию в значительнойстепени определяется количеством и качеством фолликулов яичников во время ихстимуляции гонадотропинами. Экспериментально было доказано, что во времясуперовуляции для получения хорошей реакции необходимо наличие определенногоколичества малых антральных фолликулов, чувствительных к гонадотропнойстимуляции. Недостаток таких фолликулов, или напротив, наличие больших поразмеру фолликулов снижают уровень реакции или она вообще отсутствует. Этоможет свидетельствовать об интраовариальном регулировании процессасуперовуляции. Поскольку фолликулы растут асинхронно, то в каждый периодинъекция гонадотропинов будет оптимальной лишь для ограниченного числафолликулов.
Кромеразмера фолликула, на реакцию введения гонадотропинов существенное влияниеоказывает интенсивность митотического индекса, которая у нормального фолликулаповышается при формировании полости. Установлено что высокий митотическийиндекс неатретических фолликулов положительно коррелирует с интенсивностьюсуперовуляции.
Имеютсяданные, свидетельствующие о том, что на реакцию гонадотропинов отвечают толькоте малые антральные фолликулы, размеры которых не превышают 2 мм. Установленочто такие фолликулы гормонально активны и быстро овулируют.
Атретическиефолликулы с высоким митотическим индексом, напротив, не овулируют, а послепрохождения фазы лютеинизации подвергаются её воздействию и имитируют наличиежёлтого тела.
Следовательно,для эффективной суперовуляции решающим является физиологическое состояниефолликулов в лютеиальной фазе яичника.
Анализработы станций по пересадке эмбрионов показал, что хорошими донорами можносчитать коров, которые после многократных суперовуляций имеют хорошую реакциюяичника и производят большое число пригодных для пересадки эмбрионов за одновымывание. Однако лишь небольшая часть доноров обнаруживает повторную реакциюяичников после вызывания суперовуляции. В основном же коровы-доноры нерегулярноотвечают на повторную гормональную обработку, поэтому количество овуляций ивыход эмбрионов не являются стабильными.
Дляоценки предрасположенности, или потенциальной изменчивости коров на пригодностьв качестве доноров, были рассчитаны вариансы признаков, на основе которых былопределен коэффициент повторяемости. Рассчитанные коэффициенты повторяемостипризнаков предрасположенности коров в качестве доноров колебались в пределах17.3-23.3%. Это свидетельствует о том, что по итогам оценки за первое вымываниеэмбрионов надежность повторного результата составит лишь 20%. Следовательно, пооценке признака пригодности за первое вымывание эмбриона невозможно достоверносудить о пригодности коровы в качестве донора.
Изменчивостьпригодности коров в качестве доноров включает наследственные и ненаследственныефакторы. Причем вклад ненаследственных факторов значительно выше вкладафакторов генетических.
Отмечено,что прекращение кормления донора после обработки гонадотропинами достоверноуменьшает реакцию яичника на введение гормонов. Для суперовуляции и получениябиологически полноценных эмбрионов необходимо обеспечить полноценное кормлениедонора, сбалансированное не только по основным питательным веществам, ноособенно по аминокислотам и микроэлементам. Кормление доноров должно бытьтаким, чтобы они находились в хорошем физиологическом состоянии.
Дляполучения суперовуляции наиболее широкое распространение во многих странах мираполучил ГСЖК с простагландинами.
Хорошихрезультатов суперовуляции можно ожидать, когда к моменту инъекчии гонадотропинав яичниках коровы функционирует желтое тело диаметорм 1.5 см. При наличии водном из яичников развитого фолликула диаметром 10 мм полиовуляция снижается.Интенсивность множественной овуляции также снижается когда кроме хорошоразвитого желтого тела в яичнике находится развитый фолликул, фолликулярная илилютеиновая киста. Следовательно, эффективность суперовуляции в большой степениопределяется физиологическим состоянием яичников.
Начисло овуляций существенное влияние оказывает интервал между временем введенияГСЖК и началом половой охоты. Определен оптимальный интервал, во время которогоможно получить наибольшее количество овуляций, он составляет 4-7 суток. Приуменьшении этого срока до 1-3 суток число овуляций существенно снижается, а приувеличении свыше 7 суток, хотя число овуляций возрастает, но формируютсябиологически неполноценные яйцеклетки.
Наивысшийэффект суперовуляции достигается при введении ГСЖК между 10-12 сут эстральногоцикла (середина лютеальной фазы) и через 48 часов простагландина F2a (или его аналога), вызывающегорегрессию желтого тела, половую охоту и овуляцию. В течение 48 часов послеинъекции простагландина у 95% коров-доноров происходит полиовуляция со всемипризнаками эструса. При этом доноры могут быть осеменены только в сжатые сроки.Установлено, что после такой технологии гормональной обработки коров происходитв среднем 10 овуляций, а оплодотворяемость яйцеклеток достигает 80%.
Другимгормональным препаратом с суперовуляционным действием являетсяфолликулостимулирующий гормон ФСГ. Суперовуляцию можно вызвать введениемочищенного ФСГ или его комбинации с лютеинизирующим гормоном ЛГ в соотношении5:1. В отличие от гонадотропина СЖК ФСГ вводят не однократно, а многократно.
Обобщениемногочисленных работ по использованию гонадотропина СЖК и ФСГ показало, чтонаблюдается либо одинаковая реакция яичников коров на оба гонадотропина, либоотмечается лучшая реакция при введении гонадотропина ФСГ.
Какотмечалось, следует иметь в виду, что многократная суперовуляция подверженабольшей вариабельности. Поэтому не все коровы-доноры имеют одинаковуюпредрасположенность к многократной суперовуляции. Для эффективной многократнойсуперовуляции необходим тщательный отбор доноров по ряду показателей этогопризнака.
Взаключение следует отметить, что гормональная стимуляция яичников коров,вызывающая полиовуляцию, связана с активизацией метаболических процессов удоноров. Поэтому для протекания нормальных процессов оогенеза, оплодотворения ибиологически полноценного формирования и развития зиготы коров-доноровнеобходимо обеспечить биологически активными веществами (витамины, незаменимыеаминокислоты). Кроме того, для этой цели используют препарат селевит.
Осеменение коров-доноров.
Результатысуперовуляции определяются эффективным осеменением коров-доноров. Проблемаоплодотворения яйцеклеток и получения биологически полноценных эмбрионов всеещё остается открытой. Как показывают результаты исследований, только 60-65%эмбрионов пригодны для трансплантации, остальные яйцеклетки, образовавшиеся врезультате гормональной обработки гонадотропинами, оказываются либонеоплодотворенными, либо после оплодотворения отстают в развитии илидегенерируют. Причина этих нарушений остается неизвестной.
Дляискусственного осеменения коров-доноров необходимо использовать сперму тольковыдающихся быков-производителей, достоверно оцененных по качеству потомства.Как отмечалось, надежным критерием наследственных качеств быка служиткоэффициент повторяемости, т.е. коэффициент регрессии будущих дочерей быка начисло фактически имеющихся дочерей. Если генетическое превосходство дочерейбыка, выраженное величиной отклонения от сверстниц, умножить на коэффициентповторяемости, то полученная величина будет характеризовать генетическоепревосходство будущих дочерей быка, или предсказанную разность. Предсказаннаяразность является одним из наиболее объективных качеств быка, разработанных всовременной селекции молочного скота.
Дляискусственного осеменения коров-доноров следует использовать, как правило,сперму производителей 1-й племенной категории, т.е. таких, племенная ценностькоторых превышает среднюю популяционную величину на два стандартных отклонения.В этом случае существенно повышаются темпы селекции и улучшается племеннаяценность новой генерации.
Племеннойподбор быков-производителей и коров-доноров осуществляется по заказному илицелевому спариванию родителей. В его основе должен лежать принципиндивидуального подбора в соответствии с селекционной программойсовершенствования существующих или создания новых пород, типов и линий.
Требованияк оценке оплодотворяющей способности спермы быков, предназначенной дляосеменения коров-доноров, должна быть значительно выше, чем при оплодотворенииостальных коров. Для повышения оплодотворяемости доноров и выхода эмбрионов,наряду с использованием высококачественной спермы, необходимо определить срокиполовой охоты для своевременного проведения искусственного осеменения. Какправило, коров с гормонально вызванной половой охотой осеменяют дважды: первыйраз при начале появления половой охоты и второй — через 12-24 часа.
Внашей стране коров-доноров искусственно осеменяют дважды в день с интервалом10-12 часов каждый раз двумя-тремя дозами замороженной спермы. Так как присуперовуляции повышается число овулировавших яйцеклеток, в каждой дозе спермыдолжно быть не менее 50 млн подвижных спермиев.
День,в который проводится искусственное осеменение коровы-донора, считается датойоплодотворения. С этого дня начинается отсчет развития эмбрионов in vivo до ихизвлечения.
Извлечение и оценка эмбрионов.
Эффективностьметода трансплантации во многом определяется способом извлечения эмбрионов.Оплодотворенные яйцеклетки от суперовулированных коров-доноров могут бытьизвлечены тремя способами: после убоя коровы-донора; хирургическим;нехирургическим.
Извлечениеэмбриона после убоя коровы-донора. Самым простым и надежным способом извлеченияэмбрионов является убой коровы-донора. Этот способ практиковался только напервых этапах освоения метода трансплантации. В настоящее время из-за потеригенетически ценной коровы-донора он не используется.
Извлечениеэмбриона хирургическим способом. Важным моментом, обеспечивающим эффективностьизвлечения эмбрионов, является определение стадии их развития и места положенияв поовых путях коровы-донора. Для трансплантации рекомендуется использоватьбластоцисты, поэтому эмбрионы извлекают между 7-8-ми сутками после первогоискусственного осеменения (До). Имеется несколько способов хирургическогоизвлечения эмбрионов: разрез верхнего свода влагалища, лапаротомия по белойлинии живота и лапаротомия в области голодной ямки.
Хирургическийспособ извлечения эмбрионов является трудоемким, дорогостоящим и, что особенноважно, им нельзя пользоваться многократно. В настоящее время хирургическийспособ извлечения применяется в редких случаях, главным образом в научныхцелях.
Извлечениеэмбрионов нехирургическим способом. Основное преимущество нехирургическогоспособа извлечения эмбрионов заключается в простоте манипуляций. Для этого нетребуется специального операционного помещения. Эмбрионы можно извлекатьнепосредственно в производственных условиях. С селекционной точки зрения, приправильном применении нехирургического способа воспроизводительная способностьдоноров не нарушается, что позволяет многократно использовать генетическиценных коров-доноров для получения от них большого числа потомков.
Вобщем виде извлечение эмбрионов нехирургическим методом происходит по следующейсхеме. Коров-доноров обследуют на наличие желтых тел, чистят и моют,ограничивают рацион и кратность кормления, а за сутки прекращают кормление ипоение. Перед самым извлечением эмбрионов дезинфицируют наружные половые органыкоров-доноров. Извлекают эмбрионы под местной анестезией. В рог матки вводятпродезинфицированный двухканальный резиновый или пластмассовый катетер снадувным баллончиком, в который нагнетают 10-155 куб см воздуха. Выход из рогаматки закрывают, надувая воздухом тонкостенный резиновый баллончик. Затем в рогвводят промывную жидкость и осторожно массируют, чтобы отделить эмбрионы отстенок матки. В качестве промывной среды применяют PBSдо 500 мл. Этот состав используется и для кратковременного культивированияэмбрионов.
Вымываниеповторяют 5-8 раз. Основную часть эмбрионов извлекают в первых трех-четырехсмывах. Промывание в обоих рогах матки, включая введение катетеров,продолжается 20-50 минут. За это время можно извлечь более 50% эмбрионов,находящихся на стадии морулы или бластоцисты.
Послевымывания эмбрионов в матку вводят раствор антибиотика с целью антисептики.
Вомногих странах разработаны различные устройства для нехирургического извлеченияэмбрионов. В нашей стране в ряде институтов ВАСХНИЛ успешно освоенынехирургические методы извлечения, позволяющие получать 60% от числаовулировавших яйцеклеток. Нужно иметь в виду, что в среднем из вымытыхяйцеклеток до 25% оказываются неоплодотворенными или дезинтегрированными.Причины выхода биологически неполноценных зигот до сих пор окончательно невыяснены.
Кратковременноекультивирование и хранение эмбрионов. Манипуляции с ранними эмбрионами, находящимисяна предимплантационных стадиях развития, т.е. от момента их получения довведения в рога матки реципиента, занимают от 1 до 5 часов. В этот период нужносоздать оптимальные условия, обеспечивающие сохранение их биологическихкачеств. Кратковременное хранение эмбрионов дает также возможностьтранспортировать их в другие хозяйства.
Эмбрионыкрупного рогатого скота можно сохранить путем пересадки их в яйцепровод самокдругих видов млекопитающих. Лучше всего обеспечивается нормальноепредимплантационное развитие эмбрионов коров в яйцепроводе крольчих.Установлено, что эмбрионы коровы в яйцепроводе крольчихи могут успешноразвиваться до стадий, пригодных для трансплантации реципиентам, т.е. до морулыи бластоцисты. Недостатком этого метода является его трудоемкость и возможныепотери зигот при их переносе. В настоящее время широкое распространение получилметод краткосрочного хранения эмбрионов in vitro.
Послеизвлечения и оценки на жизнеспособность эмбрионы переносят в питательные средыс температурой 37 градусов. Большинство сред, в которых культивируют и хранятэмбрионы, включают растворы солей, аминокислоты с бикарбонатным ионом какбуферным агентом, обеспечивающим pH в пределах 7.2-7.6.Проведенные исследования показали, что продолжительность культивирования безпотери биологических качеств эмбрионов возможна до 95 часов.
Впоследние годы проводятся исследования по краткосрочному хранению эмбрионов in vitro приих охлаждении ниже 37 градусов. Разработка этого метода имеет большоепрактическое значение, т.к. позволяет существенно упростить манипуляции сэмбрионами и надежнее обеспечивает их транспортировку.
Оценкаэмбрионов. Оценка эмбрионов крупного рогатого скота производится несколькимиметодами. Наибольшее распространение получил морфологический метод.Установлено, что результаты имплантации эмбрионов зависят от того, насколькополно оценена способность оплодотворенных яйцеклеток к развитию.
Поморфологическим признакам и эмбриональной стадии развития, эмбрионы можноклассифицировать на пригодные и непригодные к трансплантации. Приморфологической оценке эмбрионов основное внимание обращают на фрмулу зиготы,состояние её зоны пеллюцида, число бластомеров, равномерность дробления,выраженность эмбриобласта и трофобласта.
Кромеморфологической, дается оценка эмбрионов по адсорбционным свойствам оболочек ицитоплазмы бластомеров к различным красителям. Для улучшения морфологическойоценки используют флюоресцентную окраску, позволяющую отличить живые эмбрионыот погибших. В частности, этот метод наиболее пригоден для оценкижизнеспособности эмбрионов крупного рогатого скота после их культивирования изамораживания. С помощью флюоресцентных красящих веществ FDAи DAP1 через 3-10-минутный период возможно быстрое идостаточно надежное определение способности эмбрионов к развитию в раннихстадиях. Живые эмбрионы и даже живые бластомеры ярко флюоресцируют послеинкубации в FDA, но не флюоресцируют после инкубации в DAP1. У погибших эмбрионов или бластомеров реакции обратные.Эти методы позволяют более точно определять жизнеспособность эмбрионов подмикроскопом.
Рядавторов предлагает использовать синьку Эванса. В живых эмбрионах притемпературе 37 градусов ею окрашивается только зона пеллюцида, которую затемобесцвечивают в растворе Рингера. В мертвых же эмбрионах краска прочнофиксируется на бластомерах.
Каксчитает М. И. Прокофьев [2], могут быть гистохимические методы оценкижизнеспособности эмбрионов, основанные на специфических реакциях структурныхэлементов и веществ клеток к витальным и флюоресцентным красителям. Такиереакции протекают очень интенсивно и быстро, что позволяет ускорить процессоценки эмбрионов.
Однакоследует учитывать, что флюоресцентная окраска лишь дополняет и улучшаетосновной метод оценки эмбрионов — морфологический. Наиболее важнымиморфологическими признаками при оценке жизнеспособности эмбрионов служат объем,окраска, расположение клеток, величина перивиталлинового пространства и виднеповрежденной зоны пеллюцида. Идеальный эмбрион должен быть компактным,сферической формы, с однородной окраской, с клетками одинаковой величины, сгладкой, плоской и равномерно сформированной зоной пеллюцида, без включений вперивителлиновом пространстве.
Важнейшимкритерием для оценки качества эмбрионов является интенсивность развития стадий.Эмбрионы с замедленным развитием не используются для пересадки, замораживания идругих манипуляций.
Приоценке качества эмбриона в нашей стране принята 5-балльная шкала с учетомследующих показателей: соответствия стадии развития эмбриона его возрасту;правильности формы прозрачной оболочки и ее целостности; равномерностидробления бластомеров, состояния цитоплазмы; прозрачности перивителлиновогопространства.
Наиболеепригодными для трансплантации являются эмбрионы, извлеченные из маткикоровы-донора на 7-8 сутки после первого осеменения. Как показывают результатыисследований и практика, в это время нормально развитые эмбрионы, пригодные длятрансплантации реципиентам, находятся в стадии поздней морулы или бластоцисты.Эти эмбрионы используют для пересадки гормонально подготовленнымкоровам-реципиентам.
Выбраковкеподлежат дегенерированный неоплодотворенные яйцеклетки (ооциты), которые можнообнаружить при извлечении эмбрионов. Морфологически неинтактные, непригодныедля трансплантации эмбрионы имеют дефектную морулу, или бластоцисту, признакамикоторых являются дефекты прозрачной оболочки, распад бластомеров, разнаявеличина бластомеров, нарушение межклеточной связи.
Встадии поздней бластоцисты непригодные для трансплантации эмбрионыхарактеризуются деформацией и ослаблением бластомеров, разрывом межклеточныхсвязей и целостности зоны пеллюцида.
Пересадка эмбрионов реципиентам.
Вкачестве реципиента отбирают гинекологически здоровых коров после двух-трехнормальных половых циклов. Для отбора реципиентов основным показателем являетсяотсутствие гинекологических отклонений, а продуктивные, племенные и породныекачества большой роли не играют. Вместе с тем, у реципиентов с плохойупитанностью, низкой оплодотворяемостью после первого осеменения, могут плохоприживаться эмбрионы. В среднем на каждого донора отбирают 5-6 реципиентов.Большинство специалистов считает, что в качестве реципиентов наиболее пригодныполновозрастные телки с хорошими племенными кондициями.
Основнымусловием хорошего приживления эмбрионов служит синхронность проявления половойохоты у доноров и реципиентов. Разница во времени в проявлении половой охоты недолжна превышать 24 ч, оптимальные же результаты получаются при разнице неболее 12 часов.
Присовременном уровне техники трансплантации рекомендуется пересаживать эмбрионысразу после их извлечения из рогов матки донора и оценки.
Внастоящее время пересадка эмбрионов реципиентам производится хирургическим инехирургическим способами. При пересадке нужно точно знать местонахождениеэмбриона в половых путях коровы. Это связано с переходом предимплантационногопериода, в котором находится эмбрион до пересадки, в новый периодэмбрионального развития — имплантационный. При естественном теченииэмбрионального периода зародый на стадии морулы или бластоцисты находится вверхнем отделе рога матки, поэтому и наиболее благоприятным местом для егоаппликации является верхняя часть рога матки реципиента. Установлено, чтопересадка эмбрионов глубоко в рог матки реципиента лучше всего обеспечиваетсяхирургическим способом. При нехирургической же пересадке, которая происходит впериод диэструса место аппликации эмбриона в роге матки контролируется менееточно.
Эффективностьхирургического способа пересадки эмбриона составляет 60-70%, а число телят — 3-4 на донора. Хирургический способ использовали в основном до середина 70-хгодов. Однако он требует больших затрат средств. Кроме того, широкое применениехирургического метода сдерживается сложностью проведения операций впроизводственных условиях, получением травм вследствие резекции мышц, иневозможностью многократного использования реципиента. Поэтому последние 10-15лет пересадку эмбрионов в основном осуществляют нехирургическим способом.
Принехирургической пересадке основным достоинством, кроме простоты и экономичности,является возможность многократного использования реципиента. Разработанонесколько способов нехирургической пересадки эмбрионов. Однако все они основанына одном принципе — введении эмбриона в рог матки через шейку, вследствие чегоэтот способ назван также цервикальным.
Послепересадки эмбрионов проводят тщательный контроль за реципиентами, обращаяособое внимание на возможное проявление у них повторной половой охоты.
Дляустановления стельности у коров-реципиентов используют несколько методов:визуальный; по уровню прогестерона в крови или молоке; клинический, главнымобразом путем ректальной пальпации.
Важнымзвеном селекционно-племенной работы является достоверность установленияистинного происхождения телят, полученных при трансплантации эмбрионов отгенетически ценных родителей. Истинное происхождение можно установить погруппам крови и типам белков крови. Пробу крови берут у теленка в возрасте от 4недель до 4 месяцев.
Существеннойпричиной, снижающей эффективность нехирургической пересадки эмбрионов, являетсявозможное повреждение эндометрия при введении катетера. В то же время обобщениерезультатов исследований по нехирургической пересадке эмбрионов показывает, чтоэффективность пересадки в большей степени зависит не от того, как глубоко будетвведен катетер в рог матки, а от того, насколько правильно выполнено введение.
Однакона этот счет имеется и другая точка зрения [7]: что конструкция приборовсущественно не влияет на результаты извлечения и пересадки эмбрионов. Этирезультаты более связаны с типом гонадотропина, квалификацией оператора,качеством и стадией развития эмбрионов.
Вцелом же следует отметить, что нехирургический метод пересадки эмбрионовобеспечивает аппликацию зародышей в среднем 50-60%, а применение маточных релаксантовперед пересадкой — до 75%. Это существенно выше, чем при хирургическом методе.Технология нехирургического метода трансплантации сходна с искусственнымосеменением коров и продолжается 3-5 минут, или 15-20 пересадок в час.
Особоговнимания заслуживает приём,ĎĐÉÓÁÎÎŮĘ ×ŇÁÂĎÔĹ Sertich P.L.[6],заключающийся в нехирургической пересадке двух эмбрионов, по одному в каждыйрог матки, что еще больше повышает эффективность трансплантации. Этот приёмможет быть применен для повышения частоты рождения разнояйцевых (дизиготных)двоен. Он позволяет получить двойные отелы у коров, особенно мясных пород,намного быстрее, чем генетическим путем (т.е. селекцией).
Результатыпроведенных исследований показывают, что нехирургическая пересадкадополнительного эмбриона во второй рог матки дает возможность увеличить выходноворожденных телят на 30%. При пересадке двух эмбрионов в каждый рог маткичастота двоен составляет в среднем 55-60%, вместо 2% при естественноммногоплодии коров.
Можнопересаживать (подсаживать) эмбрион и оплодотворенной корове, но вконтрлатеральный по отношению к желтому телу в яичнике рог матки. Средняяприживляемость эмбриона осемененной корове при нехирургической подсадкесоставляет 50%.
Обобщаярезультаты экспериментов по нехирургическому методу пересадки эмбрионов, можнопридти к заключению, что пересадка двух эмбрионов в два рога матки реципиентаили подсадка одного предварительно осемененному реципиенту в контрлатеральныйрог матки являются эффективными и перспективными методами в биотехнологиитрансплантации эмбрионов.
Криоконсервация эмбрионов.
Эффективностьтрансплантации эмбрионов крупного рогатого скота во многом определяетсяусловиями хранения зигот. Самым эффективным и перспективным методом консервацииэмбрионов является их глубокое заморахивание (криоконсервация) в жидком азотепри температуре -196 градусов. Разработка метода долговременного хранениякриоконсервированных эмбрионов значительно расширяет возможноститрансплантации. Только в этом случае она может быть надежной биотехнологическойосновой селекционной программы.
Долговременноехранение глубокозамороженных эмбрионов имеет ряд преимуществ. Отпадаетнеобходимость в содержании больших стад или групп реципиентов, так какпересадки могут быть проведены в любое время независимо от сроков взятияэмбрионов от доноров, что существенно повышает рентабельность трансплантации.Кроме того, криоконсервация эмбрионов позвозяет создавать эмбриобанки отгенетически ценных животных, а также сохранять генофонд редких и исчезающихпород и транспортировать эмбрионы в любые страны мира. По оценке специалистовкриоконсервация эмбрионов экономически оправдана, она исключает генетическийдрейф, т.е. изменение частоты генов в популяции, вызванные случайнымипричинами.
Присоблюдении правильной биотехнологии выживаемость эмбрионов составляет 90%, астельность коров-реципиентов после нехирургической пересадки находится впределах 50-55%. Однако нередко в производственных условиях при несоблюдениитехнологии замораживания-размораживания выживаемость эмбрионов уменьшается, чтосущественно снижает рентабельность криоконсервации. Обосновано, чтоиспользование метода криоконсервации эмбрионов в производственных условияхявляется рентабельным только в том случае, если выживаемость эмбрионов послеразмораживания будет не менее 80%, а процент стельности коров-реципиентовсоставит 55-60%.
Попринятой в России технологии, эмбрионы замораживают с применениемавтоматических устройств, обеспечивающих регулирование скорости охлаждения взаданных режимах. Эмбрионы замораживают в пробирках 50x6мм или в ампулах вместимостью 1 мл. В пробирку или ампулу вносят 1-4 эмбрионаот одного донора и 0.4 мл раствора криопротектора (1.5 М ДМСО или 10%-ныйраствор глицерина). Ампулы перед замораживанием запаивают на пламени газовойгорелки. Ампулы или пробирки маркируют, затем охлаждают с 20 до -6 градусов соскоростью 1 градус в минуту, проводят кристаллизацию, охлаждение со скоростью0.3 градуса в минуту и погружают в жидкий азот. Применяется также и другойрежим: охлаждение от -7 до -35 градусов со скоростью 0.3 градуса в минуту; от-35 до -38 градусов со скоростью 0.1 градус в минуту и погружение в жидкийазот. Оттаивание эмбрионов производится на водяной бане с температурой 25 или37 градусов в течение 10-12 секунд. Для хранения и транспортировки замороженныхэмбрионов используют сосуды Дьюара различных типов.
Практикакриоконсервации эмбрионов крупного рогатого скота свидетельствует о том, что навыживаемость эмбрионов существенное влияние оказывает не только технологияглубокого замораживания и оттаивания, но и их качество и стадия развития. Дляуспешной криоконсервации следует отбирать эмбрионы без морфологическихнарушений, находящиеся на стадиях поздней морулы или ранней бластоцисты.
Необходимостьотбора эмбрионов диктуется еще и тем обстоятельством, что у 10% из нихобнаруживается неправильное развитие, а при криоконсервации повреждаются всреднем еще 25% клеток бластоцисты. Такие эмбрионы испытывают большую редукциюинтактных бластомеров, вследствие чего переживаемость и дальнейшее развитиепосле замораживания и оттаивания существенно нарушаются.
Такимобразом, соблюдение правильной биотехнологии криоконсервации и пересадкиэмбрионов позволит обеспечить стельность реципиентов на том же уровне, что ипри пересадке свежеполученных эмбрионов. Вместе с тем метод криоконсервации вбудущем может быть существенно упрощен, или вообще можно будет отказаться отудаления криопротектора и пересаживать эмбрионы реципиентам непосредственнопосле оттаивания без дальнейших манипуляций. По прогнозу специалистов,криоконсервированные эмбрионы могут храниться десятки и сотни лет.
Влияние трансплантации эмбрионов на генетическийпрогресс популяции.
Созданиебанков глубокозамороженной спермы и разработка методов искусственногоосеменения позволили существенно увеличить интенсивность отбора быков иповысить точность оценки их племенной ценности. На базе интенсивногоиспользования генетически ценных быков-производителей с применениемискусственного осеменения коров глубокозамороженной спермой темпы селекции впопуляции по сравнению с обычными увеличиваются в 2-3 раза.
Вто же время генетический вклад в прогресс селекции матерей быков почти в двараза ниже вклада отцов быков. Это объясняется низкой интенсивностью селекцииматерей быков и ненадежной оценкой их племенной ценности из-за получениянебольшого числа потомков. Эти ограничения и призвана частично снятьтрансплантация эмбрионов. В настоящее время при использовании трансплантацииэмбрионов от одной генетически ценной коровы можно получать двадцать телят,используя малоценных реципиентов.
Однаконередко возникает вопрос о влиянии реципиента на эмбриональное ипостэмбриональное развитие трансплантата. Прямое генетическое влияние наэмбрион реципиент не оказывает, так как пересаженная зигота представляетсформированный генотип, состоящий из гаплоидных наборов хромосом истинныхродителей. Отсутствие прямого генетического влияния реципиента на эмбрионподтверждают межпородные и межвидовые пересадки зигот, а такжеиммуногенетические исследования. В то же время, могут быть вызваны модификациитрансплантата, т.е. ненаследственные изменения признаков, обусловленныевлиянием организма реципиента во время стельности. В отличие от мутаций,модификации по наследству не передаются. При этом нужно иметь в виду, чтохарактер и степень фенотипических изменений определяются генотипом эмбриона.
Встатье Schaeffer, L.R [5] приведены интересные результаты, полученные примоделировании селекции молочного скота. В основе использованной модели, вкоторую были заложены данные о 2000 коров племенного центра, получены следующиепараметры:
долявыбракованных коров по болезням 20%;
долявыбракованных коров по продуктивности 10%
долярепродукции 30%
долякоров, непригодных для трансплантации эмбрионов 20%
цельселекции — выход молочного жира 150 кг
наследуемость0.3
фенотипическоеотклонение 35 кг
генетическоепревосходство первотелок 2 кг
генетическоепревосходство быков 20 кг
Дополнительныйгенетический прогресс за генерацию на основе применения трансплантацииэмбрионов показан в нижеприведенной таблице:Стельность, % Число эмбрионов 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
50 a 13.1 13.6 14.0 14.3 14.6 14.8 14.9 15.1 15.2 15.3
b 10.8 10.8 10.8 10.8 10.8 10.8 10.8 10.8 10.8 10.8
c 21.3 25.9 28.8 31.9 34.2 36.0 37.5 38.8 39.9 40.9
60 a 13.5 14.0 14.4 14.8 15.1 15.4 15.6 15.7 15.9 16.0
b 10.8 10.8 10.8 10.8 10.8 10.8 10.8 10.8 10.8 10.8
c 25.0 29.6 32.8 36.6 39.4 41.6 43.5 45.1 46.5 47.7
70 a 13.7 14.3 14.8 15.3 15.7 16.0 16.2 16.4 16.6 16.7
b 10.8 10.8 10.8 10.8 10.8 10.8 10.8 10.8 10.8 10.8
c 26.8 32.4 36.6 41.1 44.5 47.2 49.4 51.3 52.9 54.4
/> /> /> /> /> /> />
Обозначение:
a — генетический прогресс при трансплантации эмбрионов;
b — генетический прогресс без трансплантации эмбрионов;
c — превосходство a над b, выраженное в процентах.
Изанализа данной таблицы видно, что с увеличением пригодных для трансплантацииэмбрионов и повышением процента стельности коров, генетический прогрессвозрастает. Однако, этот процесс происходит нелинейно.
Вэтой же статье приведены данные по генетическому сдвигу молочной продукции приразных методах воспроизводства и селекции молочного скота. При этомсравнивались результаты общепринятой программы селекции, результатытрансплантации эмбрионов, и результаты трансплантации эмбрионов при интенсивномотборе быков. Результаты показаны в нижеприведенной таблице:
Программа
селекции Племенные категории животных Общий генетич. прогресс, кг/год ďâ ďë íâ íë Традиционная, с применением искусств. осеменения:
доля отселект. % 4 20 6 90
интенсивность отбора 2.53 1.400 1.985 0.195 94.3
Трансплантация эмбрионов, искусственное осеменение:
доля отселект. % 4 20 1 10
интенсивность отбора 2.53 1.400 2.660 1.755 124.8
Трансплантация эмбрионов, искусственное осеменение, интенсивный отбор быков:
доля отселект. % 2 2 1 10
интенсивность отбора 2.420 2.420 2.660 1.755 148.2
/> /> /> /> /> /> /> /> /> /> />
Примечание:предусматривается получение 10 телят от одного донора в год; общий интервалмежду поколениями 22 года (Iоб=5, Iок=5,Iмб=6, Iмк=6); точность оценкиплеменной ценности: rоб=0.8, rок=0.8,rмб=0.6, rмк=0.6.
Изприведенных данных видно, что генетический прогресс по молочной продуктивностисущественно повышается при использовании трансплантации эмбрионов,увеличивающей интенсивность селекции по материнской линии, особенно средиматерей быков. Использование трансплантации позволяет повысить темпыгенетического прогресса с 94.3 до 124.8 кг молока в год, т.е. на 32%. Вместе стем, при повышении интенсивности селекции быков-производителей в сочетании сиспользованием трансплантации эмбрионов, генетический прогресс повышается до148.2 кг молока в год, т.е на 57%.
Заключение.
Трансплантацияэмбрионов занимает прочное место в современных программах селекций. Методтрансплантации вместе с искусственным осеменением рассматривается как основасовременной биотехнологии воспроизводства высокопродуктивных племенныхживотных, несмотря на относительно высокий уровень затрат при использованииэтого метода. В настоящее время в России производится ежегодно более десятитысяч эмбриопересадок, в будущем же планируется получать методом трансплантациине менее 25-30 тысяч телят ежегодно. Новые методы биотехнологии, по мнениюученых, в будущем приведут к коренному изменению в воспроизводстве и селекциикрупного рогатого скота.
Список литературы
ЗавертяевБ. П. Биотехнология в воспроизводстве и селекции крупного рогатого скота. Л.«Агропромиздат», 1989.
ПрокофьевМ. И. Регуляция размножения сельскохозяйственных животных. Л., «Наука», 1983.
ЧерневаИ. Р. Лекции по биотехнологии и пересадке эмбрионов. Московская ветеринарнаяакадемия им. Скрябина, 1997.
Kenneth, L.W… Embryo Cultivation//Biotechnology Magazine vol.1 #2, 1994.
Schaeffer, L.R. Effects of embryo transfer in beef cattle on geneticevaluation methodology//Journal of animal science. Oct 1989. v. 67 (10)
Sertich, P.L. Transcervical embryo transfer in performancemares//Journal of the American Veterinary Medical Association. Oct 1, 1989. v.195 (7)
Shelton, J.N. Embryo manipulation in research and animalproduction.//Australian journal of biological sciences. 1988. v. 41 (1)