--PAGE_BREAK--V. Локализация по органам и тканям.
В растениях флавоноиды локализуются в различных органах, но чаще в надземных: цветках, обуславливая окраску лепестков(бессмертник песчаный, василек синий, пижма обыкновенная); в траве(фиалка, чистец, рута, горец), плодах(боярышник, софора японская); значительно меньше их в стеблях и подземных органах (солодка, шлемник байкальский, стальник полевой). Наиболее богаты ими молодые цветки, незрелые плоды. Локализуются в клеточном соке в растворенном виде. Содержание флавоноидов в растениях различно: в среднем 0,5-5%, иногда достигает 30% (в цветках софоры японской) [энт].
В клетках растений флавоноиды накапливаются в форме гликозидов, главным образом в вакуолях, а в свободном состоянии — в специальных образованиях, зачастую имеющих довольно сложное строение — смоляных и эфирномасличных ходах, канальцах, вместилищах, железках и т.д. В надземных частях растений более 85% суммы флавоноидов локализуется в клетках эпидермы и только 15% — в остальных тканях [2].
В лепестках цветков обычно находятся антоцианы, обуславливая окраску большинства алых, красных, розово-лиловых и синих цветков. В окраске желтых цветов принимают участие флавоноловые гликозиды, ауроны, и халконы, хотя наиболее важным источником этого цвета являются каротиноиды. Поскольку антоцианиды и флавонолы особенно близко связаны структурно и биогенетически, то они часто присутствуют вместе в одинаковых гликозидных структурах. С антоцианами совместно могут находиться также гликозиды флавонов, флавононов, ауронов и халконов. Очевидно, в зависимости от сочетаний этих соединений лепестки цветков приобретают разные оттенки. Гликолизирование флавоноидных пигментов цветков имеет существенное значение. С одной стороны, это состояние обеспечивает их устойчивость к свету и к действию ферментов, с другой – в форме гликозидов улучшается растворимость пигментов в клеточном соке.
В большинстве плодов основной их окраски являются также антоцианы. Широко распространены и флавоноловые гликозиды. В листьях главными являются флавоноловые гликозиды, а антоцианов в них сравнительно мало. В семенах флавоноиды могут находиться как в свободном, так и в связанном состоянии. Например, это может относиться к флавонолу кверцетину. Функция флавоноидов в семенах неясна. Высказано предположение, что они могут быть ингибиторами прорастания [5].
VI. Роль флавоноидов в жизнедеятельности растительного организма.
Биологическая роль флавоноидов в жизни растений изучена еще недостаточно.
Некоторые авторы считают, что флавоноиды принимают участие:
• в окислительно-восстановительных процессах растений;
• в выработке иммунитета;
• в защите растений от неблагоприятных воздействий ультрафиолетовых лучей и низких температур. Предполагается, что благодаря способности поглощать ультрафиолетовое излучение (330–350 нм) и часть видимых лучей (520–560 нм)флавоноиды защищают растительные ткани от избыточной радиации. Это подтверждается локализацией флавоноидов в эпидермальных (близких к поверхности) клетках растений.
• в процессе оплодотворения высших растений;
• обуславливают огромное разнообразие окрасок цветков и плодов, что привлекает насекомых и тем самым способствуют опылению;
• некоторые флавоноиды защищают аскорбиновую кислоту от окисления (т.е. являются антиоксидантами).
· входя в состав экстрактивных веществ древесины, флавоноиды способны придавать ей особую прочность и устойчивость к поражениям патогенными грибами [2].
VII. Влияние онтогенетических факторов и условий среды на накопление флавоноидов в растениях. На накопление флавоноидов оказывают влияние возраст и фаза развития растения. В молодых растениях их больше; в старых растениях их количество уменьшается. Максимальное содержание флавоноидов наблюдается в цветках, листьях и травах в период бутонизации и цветения, а к фазе плодоношения содержание снижается; в плодах и семенах — в период молочной зрелости — полного созревания; в корнях — в период увядания надземной массы осенью. На накопление флавоноидов влияет освещенность. Содержание флавоноидов в растениях увеличивается с ростом освещенности, а степень их гидроксилирования (число -ОН групп) — с увеличением высоты над уровнем моря. На накопление флавоноидов влияет температура. Содержание антоцианов увеличивается при понижении температуры (покраснение листьев у щавеля), у других групп флавоноидов, наоборот, содержание увеличивается при повышении температуры [2]. VIII. Сбор, сушка и хранение ЛРС, содержащего флавоноиды.
Сбор сырья проводится в фазу наибольшего накопления флавоноидов. Заготовку надземных частей проводят в фазу бутонизации или начала цветения, подземных – в конце вегетации [2]. В фазу цветения собирают цветки василька синего, пижмы, бессмертника, траву сушеницы, горцев, пустырника. Особенностью сбора сушеницы является выдергивание растения с корнем. Пустырник собирают при цветении нижних цветков. В фазе полного цветения наступает «перезревание», чашечка твердеет и становится колючей, а сырье считается некачественным. Траву череды собирают в период бутонизации. После цветения образуются плоды — семянки с колючими остями. Сбор дикорастущего сырья производят вручную с использованием ножей, ножниц и серпов. Для сбора культивированных растений (цветки бессмертника, плоды боярышника) применяют малую механизацию [7].
Сырье необходимо сушить вскоре после сбора, т.к. флавоноидные гликозиды под влиянием ферментов в присутствии влаги легко гидролизуются на сахар и агликон, а свободные агликоны могут окисляться.
Сушить сырье следует в тени или в сушилках с искусственным и естественным обогревом. Плоды сушат при температуре 70-90°С, траву — 50-60°С; цветки — 40°С. Не допускается сушка на солнце. Медленная сушка, особенно на солнце, ведет к разрушению флавоноидов.
Сырье необходимо оберегать от влаги и прямых солнечных лучей. Сохранять в плотно укупоренной таре, в хорошо проветриваемом помещении [2].
продолжение
--PAGE_BREAK--IX. Методы выделения.
Для флавоноидов, как и для других веществ, не существует способа выделения, универсального для всех растительных материалов. В каждом конкретном случае прибегают к наиболее подходящему методу или сочетанию методов, с учётом в основном свойств веществ и особенностей растительного сырья. Наиболее часто используются избирательная экстракция, осаждение с помощью солей тяжёлых металлов и хроматографические методы [5].
Для выделения флавоноидов из растительного сырья в качестве экстрагента чаще всего используют метиловый или этиловый спирты или их смеси с водой.
Полученное спиртовое извлечение упаривают (упаривание проводят в вакууме при возможно низкой температуре (50-70º)), разбавляют горячей водой и удаляют липофильные вещества (жирные масла, смолы, хлорофилл) из водной фазы делительной воронки дихлорэтаном или четыреххлористым углеродом. После этой очистки агликоны извлекают этиловым эфиром, монозиды (в основном) этилацетатом и биозиды, триозиды – н- бутанолом, насыщенным водой.
Компоненты каждой фракции разделяют, используя колоночную хроматографию, с применением в качестве сорбента полиамида, силикагеля или целлюлозы. Элюирование веществ с колонки (агликоны) проводят смесью хлороформа с метанолом или этанолом с возрастающей концентрацией спиртов или спиртоводными смесями (гликозиды), начиная с воды и увеличивая концентрацию спирта [6].
Для отделения и очистки многих флавоноидов иногда используют их способность образовывать нерастворимые в воде и спирте соли при взаимодействии с ионами тяжелых металлов, а также влияние рН на образование таких осадков. Флавоноиды, содержащие свободные орто-гидроксильные группы в кольце В, при обработке их спиртовых растворов солями среднего или основного ацетата свинца образуют осадки, окрашенные в ярко-желтый и красный цвета. Осадки затем центрифугируют и после суспендирования в разбавленных спиртах разлагают с помощью сероводорода. Далее флавоноиды отделяют либо путем перекристаллизации, либо хроматографическими методами [5].
Для идентификации флавоноидов используют их физико-химические свойства: определение температуры плавления, определение удельного вращения гликозидов и сравнение их УФ-, ИК-, ПМР- спектров со спектрами известных образцов [6].
X. Методы анализа. Качественное определение.
Для обнаружения флавоноидов в ЛРС используют химические реакции и хроматографию. Химические реакции подразделяются на цветные и реакции осаждения.
1.Цветные реакции.
1.Цианидиновая проба.
Общей реакцией на флавоноидные соединения является цианидиновая проба, проводимая с помощью концентрированной соляной кислоты и металлического магния. Действие водорода в момент выделения приводит к восстановлению карбонильной группы и образованию ненасыщенного пиранового цикла, который под действием соляной кислоты превращается в оксониевое соединение, имеющее окраску от оранжевой (флавоны) до красно-фиолетовой (флаваноны, флавонолы, флаванонолы).
Изменение условий восстановления путем замены магния на цинк приводит к изменению окраски. При использовании цинка положительную реакцию дают флавонолы и флавонол-3-гликозиды, а флаваноны не обнаруживают ее.
Цианидиновую реакцию не обнаруживают халконы, ауроны, но при добавлении концентрированной соляной кислоты (без магния) образуют красное окрашивание за счет образования оксониевых солей [6].
Для постановки реакции 1 г порошка сырья заливают 10 мл 95% этанола, нагревают на водяной бане до кипения и настаивают 3-4 ч. Спиртовое извлечение фильтруют, упаривают до объема 2 мл, делят пополам и разливают в 2 пробирки; в каждую пробирку прибавляют по 3 капли концентрированной хлористоводородной кислоты. В 1-ю пробирку добавляют 0,03-0,05 г цинковой пыли и нагревают на водяной бане до кипения. Жидкость окрашивается в красный цвет. Во 2-й пробирке окрашивание отсутствует [7].
ЦИАНИДИНХЛОРИД
2. Борно-лимонная реакция (реакция Вильсона- Таубека).
5-оксифлавоны и 5-оксифлавонолы, взаимодействуя с борной кислотой в присутствии лимонной (реактив Вильсона), образуют желтую окраску с красноватой флюоресценцией в УФ-свете. При замене лимонной кислоты на щавелевую (реактив Таубека) в УФ-свете отмечается зеленая или желтая флюоресценция.
3. Реакция с треххлористой сурьмой.
5-оксифлавоны и 5-оксифлавонолы, взаимодействуя с треххлористой сурьмой, образуют комплексные соединения, окрашенные в желтый или желто-оранжевый цвет — флавоны, в красный или красно-фиолетовый — халконы.
4. Характерной реакцией на флавоноиды является их взаимодействие со щелочами с образованием желтой окраски. Халконы и ауроны дают со щелочами красное или ярко-желтое окрашивание, антоцианидины-синее окрашивание.
5.Флавоноиды со свободной 7-оксигруппой легко образуют азо-красители с диазотированной сулъфаниловой кислотой и другими производными ароматических аминов [6]. Появление тотчас же оранжево-красной окраски в видимом свете указывает на присутствие 7-оксифлавонов, 7-оксифлавонолов, 7-оксиизофлавонов. Появление окраски через 1-2 минуты, подтверждает наличие 7-оксифлавононов [5].
6.Ряд флавоноидов дает окрашенные комплексы с ионами алюминия, циркония, окрашенные, как правило, в УФ-свете в ярко-желтый цвет, что используется при их хроматографическом обнаружении.
7. Как все фенольные соединения, флавоноиды взаимодействуют с хлоридом окисного железа с образованием различно окрашенных комплексов (от зеленого до коричневого). Реакция мало специфична [6].
продолжение
--PAGE_BREAK--