Федеральноеагентство по образованию
ГОУ ВПО «Челябинскийгосударственный университет»
/>/>Химический факультет/>/>/>
Кафедрафизической и аналитической химии
/>/>
Курсовая работапо аналитической химии
Тема: «Жидкостно-жидкостнаяхроматография»
Челябинск
2010
Содержание
Введение
1. Спецификаметода жидкостно-жидкостная хроматография
2. Аппаратурадля жидкостной хроматографии
3. Колоночныйвариант
4. Распределительнаяхроматография на бумаге (бумажная хроматография)
5. Гель-хроматография
6. Высокоэффективнаяжидкостная хроматография
7. Применение
Списоклитературы
хроматографиясорбционный химический распределительный
Введение
Хроматография — этофизико-химический метод разделения и анализа смесей газов, паров, жидкостей илирастворенных веществ сорбционными методами в динамических условиях.
Метод основан на различномраспределении веществ между двумя несмешивающимися фазами — подвижно и неподвижной. Подвижной фазой может быть жидкость или газ, неподвижной фазой –твердое вещество, которое называют носителем. При движении подвижной фазы вдольнеподвижной, компоненты смеси сорбируются на неподвижной фазе. Каждый компонентсорбируется в соответствии со сродством к материалу неподвижной фазы(вследствие адсорбции или других механизмов). Поэтому неподвижную фазу называюттакже сорбентом. Захваченные сорбентом молекулы могут перейти в подвижную фазуи продвигаться с ней дальше, затем снова сорбироваться. Таким образом,хроматографию можно определить как процесс, основанный на многократномповторении актов сорбции и десорбции вещества при перемещении его в потокеподвижной фазы вдоль неподвижного сорбента. Чем сильнее сродство компонента кнеподвижной фазе, тем сильнее он сорбируется и дольше задерживается насорбенте; тем медленнее его продвижение вместе с подвижной фазой. Поскольку компонентысмеси обладают разным сродством к сорбенту, при перемещении смеси вдольсорбента произойдет разделение: одни компоненты задержаться в начале пути,другие продвинуться дальше. В хроматографическом процессе сочетаютсятермодинамический (установление равновесия между фазами) и кинетический(движение компонентов с разной скоростью) аспекты. В зависимости от агрегатногосостояния фаз, механизма взаимодействия и оформления различают основные видыхроматографии, которые приведены в таблице:
Неподвижная фаза Подвижная фаза газообразная жидкая Твердая Газовая адсорбционная хроматография Жидкостная адсорбционная, ионообменная, тонкослойная, осадочная хроматография Жидкая Газожидкостная распределительная хроматография, капиллярная Жидкостная распределительная, высокоэффективная жидкостная, гельхроматография
Рассмотрим болееподробно хроматографию в системе жидкость-жидкость.
1. Специфика методажидкостно-жидкостной хроматографии
Жидкостно-жидкостнаяхроматография (ЖЖХ) по сути, близка к газожидкостной хроматографии. На твердыйноситель также наносится пленка жидкой фазы и через колонку, наполненную такимсорбентом, пропускают жидкий раствор. Жидкость, нанесенную на носитель,называют неподвижной жидкой фазой, а растворитель, передвигающийся через носитель,- подвижной жидкой фазой. ЖЖХ может проводиться в колонке (колоночный вариант)и на бумаге (бумажная хроматография, или хроматография на бумаге).[2]
2. Аппаратура для жидкостнойхроматографии
В современной жидкостнойхроматографии используют приборы различной степени сложности — от наиболеепростых систем, до хроматографов высокого класса, снабженных различнымидополнительными устройствами.
На рис.1. представлена блок-схемажидкостного хроматографа, содержащая минимально необходимый набор составныхчастей, в том или ином виде, присутствующих в любой хроматографической системе.
/>
Рис. 1 Блок-схема жидкостногохроматографа: 2 – насос предназначен для создания постоянного потокарастворителя. Его конструкция определяется, прежде всего, рабочим давлением всистеме. Для работы в диапазоне 10-500 МПа используются насосы плунжерного(шприцевого), либо пистонного типов. Недостатком первых является необходимостьпериодических остановок для заполнения элюентом, а вторых — большая сложностьконструкции и, как следствие, высокая цена. Для простых систем с невысокимирабочими давлениями 1-5 МПа с успехом применяют недорогие перистальтическиенасосы, но так как при этом трудно добиться постоянства давления и скоростипотока, их использование ограничено препаративными задачами.
3 — инжектор обеспечивает вводпробы смеси разделяемых компонентов в колонку с достаточно высокойвоспроизводимостью. Простые системы ввода пробы — «stop-flow» требуютостановки насоса и, поэтому, менее удобны, чем петлевые дозаторы, разработанныефирмой Reodyne.
4 — колонки для ВЭЖХ представляютсобой толстостенные трубки из нержавеющей стали, способные выдержать высокоедавление. Большую роль играет плотность и равномерность набивки колонкисорбентом. Для жидкостной хроматографии низкого давления с успехом используюттолстостенные стеклянные колонки.
5 – термостат обеспечиваетпостоянноство температуры.
6 – детекторы для жидкостнойхроматографии имеют проточную кювету, в которой происходит непрерывноеизмерение какого-либо свойства протекающего элюента
7 — регистрирующая система впростейшем случае состоит из дифференциального усилителя и самописца.Желательно также наличие интегратора, позволяющего рассчитывать относительныеплощади получаемых пиков. В сложных хроматографических системах используетсяблок интерфейса, соединяющий хроматограф с персональным компьютером (8),который осуществляет не только сбор и обработку информации, но и управляетприбором. [11]
3. Колоночный вариант
Разделениесмеси веществ в жидкостно-жидкостной хроматографии основываются на различиикоэффициентов распределения вещества между несмешивающимися растворителями.Коэффициент распределения вещества равен:
Кп, н=сп/сн
где сп и сн — концентрациявещества в подвижной и неподвижной фазах.
Для членоводного гомологического ряда установлены некоторые закономерности в величинах Кп.н. Известна,например, зависимость Кп.н в данном гомологическом ряду от числаатомов углерода.
Поискнесмешивающихся фаз, обеспечивающих разделение, обычно производится эмпирическина основе экспериментальных данных. Широкое применение в жидкостно-жидкостнойхроматографии получили тройные системы, состоящие из двух несмешивающихсярастворителей и третьего, растворимого в обеих фазах. Такие системы позволяютполучать набор несмешивающихся фаз различной селективности. В качестве примераможно привести систему из несмешивающихся между собой гептана и воды, в которуювведен этанол, растворяющийся в обоих растворителях.
Хотя вкачестве подвижной и неподвижной фаз выбираются растворители, не смешивающиесямежду собой, все же во многих системах наблюдается некоторая взаимнаярастворимость. Чтобы предотвратить процессы взаимного растворения жидкостей входе хроматографирования, подвижную жидкую фазу предварительно насыщаютнеподвижной. Для сохранения неизменного состава фаз применяют также метод химическогозакрепления неподвижной фазы на сорбенте. При этом используют взаимодействиерастворителя с группами ОН- на поверхности носителя. Адсорбенты сзакрепленной на их поверхности жидкой фазой выпускаются промышленностью.
Эффективностьколонки связана с вязкостью, коэффициентом диффузии и другими физическимисвойствами жидкостей. С уменьшением вязкости подвижной фазы сокращаетсяпродолжительность анализа, но с увеличением вязкости несколько возрастаетэффективность. В практике обычно используют маловязкие растворители, так каквозрастание эффективности колонок при увеличении вязкости не очень велико.
Носительнеподвижной фазы должен обладать достаточно развитой поверхностью, бытьхимически инертным, прочно удерживать на своей поверхности жидкую фазу и не растворятьсяв применяемых растворителях. В качестве носителей используют вещества различнойхимической природы: гидрофильные носители — силикагель, целлюлоза и др. игидрофобные — фторопласт, тефлон и другие полимеры.[2]
/>
Рис 3. Видхроматограммы в зависимости от эффективности и селективности хроматографическойсистемы:
а — нормальная селективность, пониженная эффективность;
б — нормальная эффективность и селективность;
в — повышенная селективность, нормальная эффективность.[12]
4. Распределительнаяхроматография на бумаге (бумажная хроматография)
Кроме обычныхносителей, используемых для заполнения колонок, в распределительнойхроматографии применяют специфический носитель, позволяющий обходиться вообщебез колонки. Таким носителем является специальная хроматографическая бумага, аметодика, основанная на ее применении, получила название распределительнойхроматографии на бумаге или распределительной бумажной хроматографии. Во многомона сходна с хроматографией в тонком слое (ТСХ). Бумажнуюхроматографию, как и хроматографию вообще, можно разделить на:
· Распределительную
· Адсорбционную
· Ионообменную
· Препаративную
· Аналитическую.
В распределительнойбумажной хроматографии можно выделить:
· нормальную
· обращённо-фазнуюхроматографию. [2]
По технике выполнения различаютследующие виды бумажной хроматографии:
· Одномерную
· Двумерную (хроматографирование производят дважды во взаимнопротивоположных направлениях: после обработки пробы одним растворителемхроматограмму поворачивают на 90° и хроматографируют вторично уже другимрастворителем)
· Круговую
· Электрофоретическую[2]
/>
Рис 4. I – линия старта;
II – линия фронта;
1 – длинапятна;
2 – отрезокот линии старта до пятна;
3 – отрезокот линии старта до центра пятна — />;
4 – отрезокот линии старта до линии фронта — />.
Важной характеристикой в бумажнойраспределительной хроматографии, так же как и в ТСХ, является Rf=x/Xf, где х — смещение зоны компонента; хf — смещение фронта растворителя.Методика определения Rf в бумажной хроматографии неотличается от соответствующей методики в ТСХ, основанной на измерениях всоответствии с рис. 1. В начальный момент времени хроматографируемая пробананосится на начальную (стартовую) линию бумажной полоски и подвергаетсядействию подвижной фазы (растворителя). Если компоненты окрашены, черезнекоторое время на хроматограмме можно будет видеть отдельные цветные пятна.Первый компонент будет иметь Rf1=x1/xf, второй —R f2=X2/Xf и т. д.[2]
При идеальныхусловиях коэффициент Rf определяется только природойвещества, параметрами бумаги и свойствами растворителей, но не зависит отконцентрации вещества и присутствия других компонентов. В действительностикоэффициент Rf в некоторой степени оказалсязависящим от этих факторов и техники эксперимента. [2]
Хроматографическаябумага должна быть химически чистой, нейтральной, инертной по отношению ккомпонентам раствора и подвижному растворителю и быть однородной по плотности.Имеют значение также такие свойства, как структура молекул целлюлозы в бумаге,набухаемость, ориентация волокна и другие, влияющие на скорость движениярастворителя и на иные характеристики процесса. [2]
В атмосфереводяных паров бумага поглощает значительное количество влаги (до 20...25 %своей массы), поэтому, когда неподвижной жидкой фазой является вода, никакогодополнительного увлажнения бумаги не делают. При выборе в качестве неподвижнойфазы некоторых органических веществ, гидрофильную бумагу превращают вгидрофобную, пропитывая ее растворами различных гидрофобных веществ (парафина,растительного масла и др.).[2]
В выбранныхрастворителях компоненты пробы должны иметь разную растворимость, иначеразделения вообще не произойдет. В растворителе, являющемся подвижной фазой,растворимость каждого компонента должна быть меньшей, чем в растворителенеподвижной фазы, но все же составлять вполне заметное значение. Этоограничение связано с тем, что если растворимость вещества будет очень велика,вещество будет двигаться вместе с фронтом растворителя, а если растворимостьбудет очень мала, вещество останется на начальной линии.[2]
Дляразделения водорастворимых веществ в качестве подвижной фазы обычно беруторганический растворитель, а в качестве неподвижной — воду. Если веществорастворимо в органических растворителях, вода используется уже в качествеподвижной фазы, а органический растворитель является неподвижной фазой. Это такназываемый метод обращенных фаз.[2]
Крастворителям обычно предъявляются следующие требования:
· растворители подвижной и неподвижной фаз не должнысмешиваться
· состав растворителя в процессе хроматографирования не долженизменяться
· растворители должны легко удаляться с бумаги
· быть недефицитными и безвредными для человека.[2]
Индивидуальныерастворители в распределительной хроматографии используют относительно редко.Чаще для этой цели употребляют смеси веществ, например бутилового или амиловогоспирта с метиловым или этиловым, насыщенные водные растворы фенола, крезола идр., смеси бутилового спирта с уксусной кислотой, аммиаком и т. д. Применениеразличных смесей растворителей позволяет плавно изменять Rf и тем самым создавать наиболее благоприятные условияразделения.[2]
В бумажнойхроматографии вещества различаются по их относительному положению на бумагепосле того, как растворитель пройдёт определённое расстояние. Небольшоеколичество раствора смеси (10-20мкл), которую нужно разделить, наносят вотмеченную точку на бумаге и высушивают. Полученное пятно называют стартовым.Затем бумагу помещают в герметичную камеру и один её конец погружают врастворитель, который является подвижной фазой. Под действием капиллярных силрастворитель движется по бумаге, растворяя и увлекая за собой компонентыобразца. До начала движения образец должен полностью раствориться, поэтомускорость растворения компонентов в подвижной фазе является одним из факторов,определяющих эффективность разделения. После того, как растворитель пройдётопределённое расстояние, лист вынимают и сушат. Пятнана хроматограммах могут быть обнаружены по цвету, флуоресценции, с помощьюхимических реакций, для чего бумагу опрыскивают или погружают в различныереагенты, или же по радиоактивности. Идентификацию проводят обычно путёмсравнения с образцами с известными величинами Rfили после элюирования, которое сводится к вырезанию зоны, содержащей пятно, ипоследующему промыванию её соответствующим растворителем. [5]
5. Гель-хроматография
Гель-фильтрация (синонимгель-хроматография) — метод разделения смеси веществ с различными молекулярнымимассами путем фильтрации через различные так называемые ячеистые гели. [7]
Неподвижнойфазой в гель-хроматографии является растворитель, находящийся в порах геля, а подвижной– сам растворитель, т.е и подвижную и неподвижную фазы составляет одно и тожевещество или одна и та же смесь вещества. Гель готовят на основе, например,декстрана, полиакриламида или других природных и синтетических соединений.
Вотличии от других хроматографических методов, использующих различия вхимических свойствах разделяемых веществ, проявляющихся при их распределениимежду стационарной и подвижной фазами, разделение основано на ситовом эффекте,характерном для гелей с определенным радиусом пор. Растворитель (подвижнаяфаза) заполняет как внешний объем между зернами геля, так и внутренний объемпор. Объем растворителя между зернами геля – Vм называютпромежуточным, транспортным или мертвым объемом, а внутренний объем пор – Vпрассматривается как объект стационарной фазы. Когда в колонку вводятпробу, содержащую несколько типов ионов или молекул с разными размерами, то онистремятся из подвижной фазы проникнуть внутрь пор. Такое проникновениеобусловлено энтропийным распределением, поскольку концентрация молекулразделяемых веществ в наружном растворе оказывается выше, чем в поровомпространстве. Но оно становится возможным только в том случае, если размерыионов или молекул меньше диаметра пор. [3]
/>
Рис5 Общий вид градуировочной кривой в гель-хроматографии:
1– область исключения, где все молекулы имеют размер больше m2;
2– область проникновения или разделения, где размеры молекул лежат в интервалеот m1 и m2;
3- область, где происходит полное проникновение молекул с размерами менее m1.[3]
Впроцессе гель-хроматографирования могут быть отделены крупные молекулы, которыегелем не сорбируются, так как их размеры превышают размеры пор, от мелких,которые проникают в поры, а затем могут быть элюированы. Проводятся и более тонкиеразделения, так как размеры пор можно регулировать, изменяя, например, составрастворителя и, как следствие, набухаемость геля. Гель-хроматография может бытьвыполнена в колоночном варианте и втонкослойном.
Применяемыена практике гели обычно подразделяют на мягкие, полужесткие и жесткие. Мягкимигелями являются высокомолекулярные органические соединения с незначительнымчислом поперечных связей. Фактор емкости, равный отношению объема растворителявнутри геля к его объему вне геля, у них равен 3. При набухании они значительноувеличивают собственный объем. Это сефадексыили декстрановые гели, агарочные гели, крахмал и др. Они применяются дляразделения смесей низкомолекулярных веществ, часто в тонкослойном варианте.Хроматографирование на мягких гелях называютгель — фильтрацией.
Полужесткиегели получают путем полимеризации. Большое распространение получили стирогели —продукты сополимеризации стирола и дивинилбензола с большим числом поперечныхсвязей. Фактор емкости полужестких гелей лежит в пределах 0,8...1,2, их объемпри набухании увеличивается не очень значительно (в 1,2...1,8 раза ).Хроматографирование на полужестких гелях называют гель-проникающейхроматографией.
Кжестким гелям относят силикагели и часто пористые стекла, хотя они и не являютсягелями. Жесткие гели имеют небольшой фактор емкости (0,8...1,1) и фиксированныйразмер пор. Эти материалы используют в гель-хроматографии при высоком давлении.
Растворителигель-хроматографии должны растворять все компоненты смеси, смачивать поверхностьгеля и не адсорбироваться на ней.
Практическоеприменение гель-хроматографии связано, главным образом, с разделением смесивысокомолекулярных соединений, хотя нередко они используются для разделения инизкомолекулярных, так как разделение этим методом возможно при комнатнойтемпературе. [2]
6. Высокоэффективная жидкостнаяхроматография (ВЖКХ)
Высокоэффективная жидкостнаяхроматография – наиболее эффективный метод анализа органических проб сложногосостава. Процесс анализа пробы делится на 2 этапа:
· разделениепробы на составляющие компоненты;
· детектированиеи измерение содержания каждого компонента.
/>
Задача разделения решается припомощи хроматографической колонки, которая представляет собой трубку,заполненную сорбентом. При проведении анализа через хроматографическую колонкуподают жидкость (элюент) определенного состава с постоянной скоростью. В этотпоток вводят точно отмеренную дозу пробы.
Компоненты пробы, введенной вхроматографическую колонку, из-за их разного сродства к сорбенту колонкидвигаются по ней с различными скоростями и достигают детектора последовательнов разные моменты времени.
Таким образом, хроматографическаяколонка отвечает за селективность и эффективность разделения компонентов.Подбирая различные типы колонок можно управлять степенью разделенияанализируемых веществ. Идентификация соединений осуществляется по их времениудерживания. Количественное определение каждого из компонентов рассчитывают,исходя из величины аналитического сигнала, измеренного с помощью детектора,подключенного к выходу хроматографической колонки.
При анализе соединений с низкимиПДК (биогенные амины, полиароматические углеводороды, гормоны, токсины) из-затрудоемкости подготовки реальных проб особенно важной характеристикойстановится чувствительность и селективность метода. Применениефлуориметрического детектора позволяет не только снизить пределы обнаружения,но и селективно выделить анализируемые вещества на фоне матричных и сопутствующихкомпонентов пробы.
Метод ВЭЖХ применяется всанитарно-гигиенических исследованиях, экологии, медицине, фармацевтике,нефтехимии, криминалистике, для контроля качества и сертификации продукции.
В качестве блока подачи элюентаиспользуется насос «Питон» шприцевого типа, который имеет следующиеособенности:
· отсутствиепульсаций давления при подаче растворителя;
· большойдиапазон объемных скоростей потока;
· большойобъем камеры насоса;
· расширяемость(возможность сочетать несколько блоков для создания градиентной системы).
В хроматографической системемогут использоваться различные типы детекторов, например, «Флюорат-02-2М»(спектральная селекция осуществляется фильтрами) или «Флюорат-02 Панорама»(спектральная селекция осуществляется монохроматорами).[8]
/>
7. Применение
Жидкостнаяхроматография важнейший физико-химический метод исследования в химии, биологии,биохимии, медицине, биотехнологии. Ее используют для анализа, разделения,очистки и выделения аминокислот, пептидов, белков, ферментов, вирусов,нуклеотидов, нуклеиновых кислот, углеводов, липидов, гормонов и т. д.; изученияпроцессов метаболизма в живых организмах лекарственных препаратов; диагностикив медицине; анализа продуктов химического и нефтехимического синтеза,полупродуктов, красителей, топлив, смазок, нефтей, сточных вод; изученияизотерм сорбции из раствора, кинетики и селективности хим. процессов.
В химиивысокомолекулярных соединений и в производстве полимеров с помощью жидкостнойхроматографии анализируют качество мономеров, изучают молекулярно-массовоераспределение и распределение по типам функциональности олигомеров и полимеров,что необходимо для контроля продукции. Жидкостную хроматографию используюттакже в парфюмерии, пищевой промышленности, для анализа загрязнений окружающейсреды, в криминалистике. [9]
Заключение
Начало ХХ векаознаменовалось открытием хроматографического метода анализа, обогатившего иобъединившего различные области науки, без которых немыслим научный прогрессXXI века. Внедрение хроматографических методов, и в первую очередь жидкостнойхроматографии, в медицину позволило решить многие жизненно важные проблемы:исследование степени чистоты и стабильности лекарственных средств, препаративноевыделение индивидуальных гормональных препаратов (например, инсулина,интерферона), количественное определение в биологических объектахнейромедиаторов: адреналина, норадреналина. С наличием этих веществ в живоморганизме связывают способность к запоминанию, обучению, приобретениюкаких-либо навыков. Идентификация методами ВЭЖХ стероидов, аминокислот, аминови других соединений оказалась крайне важной при диагностике некоторыхнаследственных заболеваний: инфаркта миокарда, диабета, различных заболеванийнервной системы. Одной из актуальных задач клинической медицины дляэкспресс-диагностики является проведение так называемого профильного анализакомпонентов биологического объекта, осуществляемого методами жидкостнойхроматографии, что позволяет не проводить идентификацию каждого пика, асопоставлять профили хроматограмм для заключения о норме или патологии.Обработка огромного массива информации осуществляется только с использованиемЭВМ (метод получил название «метод распознавания образов»).[10]
Список литературы
1. ВасильевВ. П. Аналитическая химия, В 2 кн. Кн. 2 Физико-химическиеметоды анализа: Учеб. для студ. вузов, обучающихся похимико-технол. спец. – 4-е изд., стереотип. – М.: Дрофа, 2004 – 384 с.
2. МосквинЛ.Н., Царицына Л.Г. Методы разделения и концентрирования в аналитической химии. – Л.: Химия, 1991. – 256 с.
3. http://bibliofond.ru/view.aspx?id=43468
4. http://ru.wikipedia.org/wiki/Бумажная_хроматография
5. http://referats.qip.ru/referats/preview/93743/6
6. http://www.curemed.ru/medarticle/articles/12186.htm
7. http://www.lumex.ru/method.php?id=16
8. http://www.xumuk.ru/encyklopedia/1544.html
9. http://www.pereplet.ru/obrazovanie/stsoros/1110.html
10. http://www.chem.msu.su/rus/teaching/oil/spezprakt-chr.html
11. http://www.prochrom.ru/ru/?idp=110