N-04-GRIEM-1Паспорт совместного российско-американского проектаНазваниеРазработка нового токсикогеномного подхода для определения биобезопасности наноматериалов на основе комплекса биосенсоров, позволяющих проводить мониторинг изменения активности сигнальных каскадов, регулирующих транскрипцию клетки.АННОТАЦИЯ (Цели и задачи, область исследований, проблема, мотивация)ПРОБЛЕМА. Серьезным препятствием в развитии нанотехнологий является отсутствие понимания тех потенциальных опасностей и рисков которые новые материалы могут представлять для человеческого организма и окружающей среды. Привычные физико-химические методы анализа плохо подходят для решения этой задачи, потому что, в отличие от обычных соединений, не химическая формула, а размеры и пространственная структура в большей степени определяют биоактивности наноматериалов. То есть, в настоящее время, наряду с проведением классических (химическая токсичность и канцерогенность) токсикологических исследований наноматериалов существует необходимость в разработке новых методов анализа влияния наноматериалов на клетку и организм. Эти методы определения токсичности наноматериалов должны быть основаны на анализе всех основных стрессорных реакциях клетки (генотоксический, оксидативный, протеотоксический, тепловой стрессы, стрессы, связанные с гипоксией, повреждением органелл и цитоскелета и др), которые могут возникать в ответ на взаимодействие наноматериалов с клеткой.^ ОСНОВНАЯ ЗАДАЧА данного проекта направлена на разработку нового молекулярно-биологического подхода к определению биологических свойств наноматериалов и их потенциальных токсичных эффектов для человеческого организма. В этом подходе, экспериментатор анализирует ответ человеческих клеток к изучаемому соединению, измеряя активности сигнальных каскадов, регулирующих транскрипцию генной информации в клетках. ТЕХНОЛОГИЯ. Практическое осуществление нового токсикогеномного подхода требует применения соответствующих технологий. В ходе выполнения данного проекта будет разработан комплекс биосенсоров, позволяющих проводить мониторинг изменения активности различных транскрипционных факторов – белков, осуществляющих контроль и регуляцию экспрессии генов. В качестве биосенсоров будут выступать клеточные линии, происходящие из различных органов и тканей человека, что позволит нам моделировать эффекты наноматериалов при различных путях попадания в организм, т.е., через дыхание, пищу, кожный контакт, печень (основную мишень токсических соединений при системном введении) и др. При реализации нового подхода, принципиально, будет создано 2 типа биосенсоров. Первый тип биосенсоров представляет собой набор клеточных культур, в каждая из которых позволяет регистрировать изменение активности одного специфического транскрипционного фактора, активность которого является маркерной для определенного вида клеточного стресса (генотоксический, оксидативный, протеотоксический стресс и др.). Изменение активности транскрипционных факторов (NF-kappaB, AP-1, P53, HIF-1 NRF-2, E2F, и др.) регистрируется по трансактивации экспрессии репортерных генов (люциферазы, b-галактозидазы и др.), находящихся под контролем специфического (для каждого конкретного транскрипционного фактора) промотера. Таким образом, каждый отдельный биосенсор позволяет определять интенсивность одного из видов стрессорных реакций клетки (воспаление; тепловой шок; дефицит питательных веществ и нуклеотидов; нарушение цитоскелета; генотоксический, оксидативный, протеотоксический стресс; и др.).Второй тип биосенсоров будет разработан американской стороной. По аналогии с клеточными биосенсорами описанными выше, будут получены трансгенные животные, каждое из которых будет позволит определять интенсивность развития определенного вида стресса (регистрируемого по изменению трансактивации репортерных генов) в организме животного в ответ на экспозицию наноматериалам. То есть, такие трансгенные животные будут выступать в качестве биосенсоров для оценки биобезопасности наноматериалов в условиях in vivo. Помимо возможности оценки системных эффектов наноматериалов на организм животного, использование такого типа биосенсоров позволит проводить определение воздействия наноматериалов на организм в зависимости от пола и возраста, оценить влияние наноматериалов на протекание беременности, определить эмбриотоксичность, выявить влияние на репродуктивную и другие функции.Третий тип биосенсоров будет реализован на основе технологической платформы, которая позволяет количественно измерять активности множества генно-регуляторных путей в культурах клеток. Эта технология, называемая FACTORIAL™, разработана американской биотехнологической компанией ATTAGENE (Research Triangle Park, NC). Основой FACTORIAL’а является ансамбль специальных рекомбинантных ДНК конструкций, используемых в качестве молекулярных зондов, которые вводятся в изучаемые клетки и производят репортерные РНК молекулы пропорционально активностям измеряемых генно-регуляторных каскадов. Эти репортерные РНК молекулы детектируются особой мультиплексной системой детекции, которая обеспечивает беспрецедентную точность и воспроизводимость измерений (Romanov et al., 2008). FACTORIAL позволяет измерять активности 48 генно-регуляторных каскадов в различных типах клеток. Детектируя изменения активностей этих каскадов при контакте с каким-либо химическим соединением, экспериментатор получает результат “транскрипционной дактилоскопии”, основанный на изменении активности 48 транскрипционных факторов-дескрипторов, которые характеризуют воздействие данного соединения на генно-регуляторные механизмы в данном типе клеток. Многие дескрипторы FACTORIAL’а описывают состояния специфических стресс-индуцируемых генно-регуляторных каскадов (таких как NF-kappaB, AP-1, P53, HIF-1 NRF-2, E2F, и др.). Изменения этих дескрипторов являются индикаторами определенных видов клеточного стресса, таких как воспалительный ответ, разрывы ДНК, гипоксию, свободнорадикальную патологию, метаболический стресс, и др.^ РАБОЧАЯ СТРАТЕГИЯ. Наш проект включает несколько стадий. В ходе выполнения проекта совместно российской и американской стороной будет разработана панель клеточных биосенсоров первого типа, которая позволит моделировать эффекты наноматериалов при различных путях попадания в организм.^ Биосенсоры второго типа (трансгенные животные) будут получены американской стороной и переданы российской стороне для проведения экспериментов (одновременно в РФ и США) по изучению токсичности наноматериалов в условиях in vivo. Параллельно, российской и американской будет разработана новая адаптированная модификация FACTORIAL™ - биосенсоров третьего типа для детекции ответов человеческих клеток к наноматериалам. Эта оптимизация затронет многие параметры, включая состояние клеточных культур, композицию ансамбля ДНК зондов, подбор условий стимуляции и детекции, и др. Далее, все три типа биосенсоров (биосенсоры, основанные на трансактивции репортерных генов и адаптированный FACTORIAL™) будут использованы для изучения биобезопасности наноматериалов. Мы будем использовать различные типы первичных или трансформированных клеток, включая легочный и кишечный эпителий, клетки кожи (кератиноциты) и печени (гепатоциты). Будут определены концентрационные зависимости биологических эффектов наноматериалов. Также, в данном проекте запланировано исследование эффектов различных наноматериалов в обоих типах биосенсоров, при 8-10 концентрациях. Планируется получение нескольких сотен молекулярных профилей активности генно-регуляторных каскадов, которые будут сравниваться с помощью кластерного анализа для классификации наноматериалов по группам, согласно их механизмам действия.^ Описание предполагаемых результатов реализации проекта В результате выполнения проекта будет создано: - три типа биосенсоров, обеспечивающих получение специфических характеристик наноматериалов, описывающих их влияние на генно-регуляторные каскады в условиях in vitro и in vivo, - будут определены молекулярно-биологические механизмы опосредующие действие наиболее распространенных классов наноматериалов на наиболее вероятныe мишени, такие как эпителиальные клетки легких, желудочно-кишечного тракта, кожи, и гепатоциты. Использование этих данных позволит предсказывать наиболее вероятные риски этих наноматериалов и установить количественные критерии для определения предельно допустимых концентраций наноматериалов при различных путях попадания в организм. - будут подготовлены протоколы и проекты рекомендаций по использованию по использованию всех трех типов биосенсоров. - будет подготовлена документация для сертификации разработанных биосенсоров.^ Наиболее близкие по тематике проекты в мире, реализующиеся в настоящее время (не более 5 аналогов) -Стандартные пато-морфологические методы оценки токсичности в животных моделях: определение некротические изменения различных тканей и клеточных органелл, исследование долгосрочных патологических эффектов, включая канцерогеннность, хроническую токсичность, дефекты репродуктивныx функций и эмбрионального развития. - Системно-биологические методы, основанные на аналие изменения спектра генной экспрессии (транскриптомика) и синтезируемых протеинов (протеомика) в клетках-мишенях. ^ Новизна, описание конкурентных преимуществ результатов Уникальная особенность разрабатываемого токсикогеномного подхода заключается в том, что получаемые данные позволяют непосредственно определить механизмы токсичности. Например, в предварительных экспериментах с наноматериалами, мы установили, несколько общих сигнальных каскадов, активированных разными наноматериалами, включая каскады, что контролируют ответы на свободные радикалы и детоксикацию ксенобиотиков. Эти результаты доказывают, что предложенный проект позволит получить информацию о орган-специфических эффектах наноматериалов на генно-регуляторные механизмы клеток. Преимуществом использования технологии FACTORIAL является ее универсальность, связанная с тем, что она позволяет получить “транскрипционную дактилоскопию” (см. пункт 2) конкретного наноматериала, которая определяется только его биологической активностью в отношении данного типа клеток, но не химической структурой. Вследствие этого, FACTORIAL одинаково пригоден как для анализа простыx химические соединений, так и сложных композитов-наноструктур. ^ Кто является потенциальным потребителем результатов Потребителями разработанной продукции, полученной в проекте, являются следующие учреждения: Государственные учреждения осуществляющие контроль и мониторинг биобезопасности наноматериалов (в частности, Министерство здравоохранения и социального развития РФ, Министерство промышленности и торговли РФ, Министерство по чрезвычайным ситуациям и другие заинтересованные государственные учреждения, а также частные компании, выпускающие фармпрепараты и пищевые продукты, а также другие товары в которых используются наноматериалы. Для коммерциализации продукта могут быть созданы Российские и совместные Российско-Американские компании.^ Где, когда и какой эффект, в т.ч. экономический, ожидается от использования результатов проекта Продукт предназаначен для использования: на предприятиях, выпускающих различные наноматериалы; в биомедицинских исследованиях, связанных с изучение биобезопасности наноструктур; в фармацевтической и пищевой промышленности, выпускающей фармпрепараты и пищевые продукты, а также другие товары в которых используются наноматериалы. Внедрение разработанных биосенсоров в практику позволит существенно улучшить и интенсифицировать технологии оценки биобезопасности наноструктур. Эффектом этого будет являться улучшение качества жизни сотрудников, связанных с производством наноматериалов и наноструктур, а также качества жизни населения РФ, являющегося потенциальным потребителем этой продукции.Предполагаемые организации – участники консорциума по профилям: научные, образовательные, бизнес. Контактная информация руководителей проекта в каждой организации и общего координатора Участниками консорциума с Российской стороны: - ФГБУ НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи Минздравсоцразвития РФ, - Учреждение РАМН НИИ Питания РАМН - Приволжский федеральный университет г.Казань - Компания ООО «НИАРМЕДИК»^ Описание вклада каждой организации в итоговый результат.С Российской стороны: ФГБУ НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи Минздравсоцразвития РФ будет участвовать в получении биосенсоров на основе различных культур клеток человека, предназначенных для мониторинга и прогнозирования негативного воздействия наноматериалов на респираторную и выделительную систему. С использованием адаптированной платформы FACTORIALTM будут протестированы наноматериалы различной природы (не менее 20). Дополнительно, в институте будут проводится протеомные исследования, целью которых будет поверка данных, полученных с использованием разработанных биосенсоров. НИИ питания РАМН будет вовлечен в тестирование полученных биосенсоров с использованием продуктов питания в состав которых (или в упаковку которых) входят наноматерилы. Приволжский федеральный университет будет вовлечен в тестирование различных наноматериалов с использованием разработанных биосенсоров в сравнении с традиционными токсикологическими методами. Компания ООО «НИАРМЕДИК» будет вовлечена в проведение испытаний платформы FACTORIALTMи получение разрешитильных документов. В случае необходимости, компания может принимать участие в последующей коммерциализации результатов выполнения проектов.^ Преимущества от участия иностранных организаций Американская сторона: - передает технологию получения клеточных линий-биосенсоров, позволяющих проводить мониторинг активности индивидуальных транскрипционных факоров. - создает трансгенных животных (биосенсоры второго типа), обеспечивающих стабильную экспрессию репортерных конструкций. Использование таких животных-биосенсоров позволит изучать токсические эффекты наноматериалов на уровне различных систем организма. - обеспечивает допуск и обучение технологиям регистрации биолюминисценции и биофлюоресценции в живом организме. - открывает доступ к технологии FACTORIALTM , которая будет являться одним из ключевых моментов создания универсальной технологической платформы для оценки биобезопасности наноматериалов. - будет участвовать в испытаниях нанопрепаратов российского производства.^ Потенциальные иностранные участники проекта, которые могли бы внести существенный вклад в итоговый результат Существующие партнеры с американской стороны: -RoswellPark Cancer Institute, Buffalo, NY (USA) - ATTAGENE Research Triangle Park, North Carolina (USA)^ Краткая предыстория формирования проекта Российская сторона (ФГБУ НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи Минздравсоцразвития РФ) имеет многолетний опыт сотрудничества с Институтом рака Розвелла Парка (RoswellPark Cancer Institute). Взаимоотношения сторон регулируются действующим договором о сотрудничестве. Опыт научного сотрудничества (на уровне ответственных исполнителей проекта с российской и американской стороны) как в области НИР, так и НИОКР, насчитывает 8 лет. В ходе данного сотрудничества Институтом рака Розвелла Парка совместно с ФГБУ НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи Минздравсоцразвития РФ была отработан метод получения клеточных линий – биосенсоров, позволяющих проводить мониторинг активности стресс-активируемых транскрипционных факторов. Технология FACTORIAL применительно к молекулярно-биологическим исследовантям в значительной степени проработана. Американской стороной апробирована и запатентована технология измерения активности генно-регуляторных каскадов. В ходе выполнения проекта данная технология будет адаптирована для оценки биобезопасности наночастиц и наноматериалов.^ Предварительный план подготовки и реализации проекта (основные вехи) по каждой организации, включая координационные мероприятия - ФГБУ НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи Минздравсоцразвития РФ В течение 2011 года будут: 1) созданы системы биосенсоров, основанных на трансактивации репортерных генов на основе различных культур клеток человека для тестирования в условиях in vitro способности различных видов наноматериалов индуцировать известные типы клеточного стресса. 2) апробированы биосенсоры на основе технологии FACTORIALTM для тестирования биобезопасности наноматериалов различной природы. ^ В течение 2012 года будет: Проведена апробация эффективности и специфичности работы системы биосенсоров (основанных на трансактивации репортерных генов) на основных типах наноструктур биогенного и абиогенного происхождения. Проведена апробация эффективности использования животных-биосенсоров (основанных на трансактивации репортерных генов), полученных от американской стороны, для тестирования биобезопасности различных наноматериалов. Проведена подготовка лабораторных образцов наборов биосенсоров и проекта рекомендаций по их использованию.-НИИ питания РАМНВ 2011 году будет проводить тестирование возможности использования технологии FACTORIALа для оценки безопасности продуктов питания (и их упаковок) в состав которых входят наноматерилы. ^ В 2012 году будет - проводить тестирование продуктов питания (и их упаковок) в состав которых входят наноматерилы с использованием системы биосенсоров (основанных на трансактивации репортерных генов) - создавать проекты методических рекомендаций по использованию разработанных биосенсоров.- Приволжский федеральный университет В 2011 году Будет проводить тестирование биобезопасности различных наноматериалов с использованием технологии FACTORIAL, а также проводить поверку результатов FACTORIALа традиционными методами (измерение активности отельных транскрипционных факторов по трансактивации генов - ОТ-ПЦР-анализ, Вестерн-блоттинг и др.)В 2012 году будет проведена работа аналогичная запланированной в 2011 году, но с использованием системы биосенсоров (основанных на трансактивации репортерных генов).- Компания ООО «НИАРМЕДИК» В 2011 году подготовит панель наноматериалов различного происхождения (оксиды металлов, различные формы углерода, синтетические наночастицы, наночастицы биогенного происхождения).В 2012 году будет осуществлять деятельность связанную с подготовкой необходимой документации для сертификации разработанных биосенсоров и методов их использования.Координация проекта будет осуществляться в результате реализации следующих мероприятий: - Ежегодных командировок не менее 2 российских специалистов (на срок не менее чем 2 месяца) для проведения совместных исследований. - Проведения ежемесячных телеконференций. - Проведения координационных совещаний (не менее 2 раз в году).- - Ежегодной конференции (поочередно, в РФ и США) основных исполнителей проекта с отчетами о проделанной работе; подготовкой публикаций и совместных патентов.^ Объем финансирования (существующий и необходимый), включая предполагаемые источники и объемы софинансирования (Указывается необходимый объем инвестиций для реализации проекта с указанием направлений расходования средств (краткий финансовый план проекта).С Российской стороны: Существующий бюджет (средства, затраченные в 2010 году на разработку методов оценки биобезопасности) составил – 3,5 млн. рублей. Продолжтельность проекта – 2 года. Общая стоимость проекта – 55 млн. рублей Необходимый объем финансирования на 2011 год – 30 млн. рублей (в том числе 22 млн. рублей бюджетных средств). Предполагаемый бюджет американской стороны – 3 млн. долларов.