www.diplomrus.ru ® Авторское выполнение научных работ любой сложности – грамотно и в срок Содержание ОглавлениеВведение. 6I. Обзор литературы. 121. Состав и структура клеточной стенки. 122. Биосинтез компонентов клеточной стенки. 213. Биосинтез целлюлозы. 213.1. Субстраты биосинтеза целлюлозы и пути их образования. 243.2. Каталитический центр. Терминальные комплексы,розетки. . 28 3.3.Ориентация микрофибрилл. Участие цитоскелета вформировании клеточной стенки растений. 364. Первичная и вторичная клеточная стенка. 455. Использование методов микроскопии для изучения клеточнойстенки растений. 49II. Объекты и методы. 601. Общая характеристика объектов исследования. 601.1 .Флоэмные волокна стебля льна-долгунца{Linum usitatissimum L). 611.2. Волоски семян хлопчатника (Gossypium hirsutum L.). 671.3. Культура клеток циннии {Zinnia elegans L.),формирующая трахеальные элементы. 682. Подготовка растительного материала. 713. Флуоресцентная микроскопия. 75 3.1. Подготовка срезов стебля льна-долгунца. 75 3.2.Подготовка клеток циннии. 774. Сканирующая электронная микроскопия. 795. Трансмиссионная электронная микроскопия(метод ультратонких срезов). 796. Цитохимический анализ. 887. Иммуноцитохимический анализ. 89-3-7.1. Проведение иммуноцитохимической реакции с антителом к |3-(l-»4)-D - галактанам на ультратонкихсрезах стебля льна. 897.2. Проведение иммуноцитохимической реакции с антителами к сахарозосинтазе, актину и каллозе на ультратонких срезах волосков семян хлопчатника и трахеальных элементах циннии. 908. Статистическая обработка результатов. 938.1. Количественная оценка иммуноэлектронно-микроскопической метки на срезах флоэмныхволокон льна-долгунца. 948.2. Количественная оценка иммуноэлектронно-микроскопической метки на срезах волосковсемян хлопчатника. 948.3. Количественная оценка иммуноэлекроно-микроскопической метки на срезахтрахеальных элементов циннии. 95III. Результаты и обсуждение. 971. Волокна склеренхимы: флоэмные волокна льна-долгунца. 971.1. Флюоресцентная микроскопия. 971.1.1. Характеристика и использование точки слома(ТС) для планирования и проведения экспериментов. 971.1.2. Окрашивание срезов Cellufluor (СФ). 991.1.3. Окрашивание срезов специфическимкрасителем на пектиновые вещества (СКП). 1141.1.4. Динамика формирования флоэмных волокон. 1201.1.5. Аутофлуоресценция лигнина во флоэмныхволокнах и сосудах ксилемы в стебле льна-долгунца. 1241.1.6. Механическое разделение пучков флоэмных волокон(луба) и слоя клеток вторичной ксилемы (древесины). 125-4-1.2. Изучение строения флоэмных волокон и структуры клеточной стенки методом сканирующей электронной микроскопии (СЭМ). 131 1.2.1. Расслоение стебля льна-долгунца напоследних стадиях созревания. 1311.2.2. Поверхность флоэмных волокон.Закрученность волокон. 1391.3. Изучение флоэмных волокон в ходе онтогенеза растений льна-долгунца методами трансмиссионной электронной микроскопии. 1431.3.1. Ультраструктура флоэмных волокон. 1431.3.2. Цитохимический анализ флоэмных волокон. Результаты окрашивания срезов по методу Тьери. Двуслойность клеточной стенки волокон. 1521.3.3. Иммуноцитохимический анализ распределениягалактана в тканях стебля льна-долгунца. 1561.3.4. Определение локализации лигнина во флоэмных волокон и вторичной ксилемы методом цитохимии-ческого анализа фермент-золото (enzyme-gold). 1822. Трихомы: волоски семян хлопчатника. 1932.1. Ультраструктура волосков семян хлопчатника. 1942.2. Иммуноцитохимическая локализация клеточных структур, белков и полисахаридов, участвующих в формировании клеточной стенки и входящих в ее состав. 201 2.2.1. Иммуноцитохимическая локализациясахарозосинтазы. 2022.2.2. Иммуноцитохимическая локализациякаллозы. 2112.2.3. Двойное иммуномечение ультратонкихсрезов: сахарозосинтаза + каллоза. 213-5-2.2.4. Иммуноцитохимическая локализация актина. 2142.2.5. Двойное иммуномечение ультратонкихсрезов: сахарозосинтаза + актин. 218 3. Трахеальные элементы: культивируемые клеткициннии (Zinnia elegans L.). 2203.1. Ультраструктура трахеальных элементов циннии. 2203.2. Иммунофлуорусцентная микроскопия. 2213.3. Электронно-микроскопическая иммунолокализацияклеточных структур и белков, участвующих в формировании клеточной стенки трахеальных элементов циннии. 2243.4. Анализ взаиморасположения структур сиспользованием иммуноцитохимических реакцийна ультратонких серийных срезах. 230Заключение. 231Выводы. 237Список литературы. 238Введение -6-Введение.Целлюлоза является основным по массе органическим веществом биосферы, широко используется во многих современных производствах (Тарчевский, Марченко, 1985). При этом, как отмечается в ряде работ (Amor et al., 1995, Delmer, 1999, Haigler et al., 2001), нет другого такого процесса в растениях, который был бы столь важен и столь мало изучен на молекулярном уровне, как синтез целлюлозы. Основное количество целлюлозы содержится в так называемых вторичных клеточных стенках растений. Вторичная клеточная стенка - это слой клеточной стенки, который формируется клетками, закончившими свой рост. Он характерен, в первую очередь, для клеток тканей, выполняющих опорно-механическую и проводящую функции. Эти клетки обычно обладают рядом особенностей: значительная длина (до нескольких сантиметров), особенности роста, индивидуальная динамика клеточных органелл, толстая клеточная стенка, состав клеточной стенки. Жизнедеятельность этих специализированных клеток в большой степени направлена на интенсивный синтез компонентов клеточной стенки, поэтому они являются удобным объектом для изучения процесса формирования вторичной клеточной стенки и, в частности, процесса биосинтеза целлюлозы.Синтез микрофибрилл целлюлозы в растениях является высоко скоординированным процессом, который происходит на поверхности плазматической мембраны (Delmer, 1982). Имеются основания полагать, что биосинтез целлюлозы обусловлен взаимодействием нескольких белков и участием ряда органелл (Delmer, Amor, 1995, Haigler et al., 2001., Salnikov et al., 2001, 2003), однако детали этого процесса и взаимодействия структур едва начинают поддаваться пониманию.Незаменимым инструментом в исследовании механизмов синтеза целлюлозы и других структурных полисахаридов являются методы электронной микроскопии. Однако их использование для клеток, имеющих вторичную клеточную стенку, сталкивается с рядом проблем. Так, достижение высокого качества химической фиксации материала для ультраструктурных-7-исследований осложняется толщиной клеточной стенки, а также наличием крупной вакуоли и, как следствие, особой чувствительностью к изменениям осмотичности растворов-фиксаторов. Все эти факторы усиливают неизбежность тенденции к медленной химической фиксации, иммобилизирующей цитоплазму в состоянии, когда она уже значительно нарушена в ходе приготовления образца (Mersey, McCully, 1978). Артефакты химической фиксации приносят особенный ущерб исследованиям синтеза целлюлозы, который организован в пределах клеточного кортекса и особенно чувствителен к манипуляциям в ходе приготовления образцов для электронной микроскопии. Появление новых методов фиксации, таких как замораживание-скалывание, замораживание-замещение и замораживание-замещение под высоким давлением, открывают новые возможности для исследований растительных клеток и тканей. Однако к началу наших исследований они не были адаптированы для анализа клеток с толстой вторичной клеточной стенкой.Цель и задачи исследования.Целью нашей работы было изучение структурно-функциональных характеристик формирования клеточных стенок в тканях, специализированных на интенсивном синтезе целлюлозы. Ее реализация связывалась с решением следующих задач:1. Адаптировать современные методы анализа ультраструктуры растительных тканей для клеток, характеризующихся толстой клеточной стенкой с высоким содержанием целлюлозы.2. Проанализировать динамику формирования клеточных стенок в различных тканях, формирующих вторичнюу клеточную стенку.3. Охарактеризовать ультраструктуру разных типов клеток, специализированных на формировании вторичной клеточной стенки.4. Определить локализацию ключевых структур и белков, участвующих в формировании микрофибрилл целлюлозы.-8-5. Сопоставить структурно-функциональные характеристики формирования первичной и вторичной клеточной стенки.Научная новизна работы.В работе получили развитие представления о динамичности и мозаичности структуры клеточной стенки и механизмах формирования целлюлозных микрофибрилл. Показано, что механизмы синтеза целлюлозы первичной и вторичной клеточной стенки качественно различимы.Проведено комплексное исследование по изучению динамики роста и формирования склеренхимных волокон с использованием методов световой флуоресцентной микроскопии, электронной микроскопии (сканирующая и трансмиссионная) и иммуноцитохимического анализа. Впервые продемонстриро-ваны особенности формирования вторичных клеточных стенок флоэмных волокон льна-долгунца. Выявлена постсинтетическая модификация р-(1-*4)-О-галактана во время утолщения клеточной стенки, доказана тканеспецифичность этого высокомолекулярного полимера. Впервые продемонстрирована мозаичность распределения лигнина и других фенольных соединений во вторичной клеточной стенке флоэмных волокон льна-долгунца.Разработаны методы криогенной фиксации (замораживание-замещение) и особый режим проводки образцов через градиент эпоксидных смол. В результате такой фиксации появилась возможность описать ряд органелл волосков семян хлопчатника, включая структуры аппарата Гольджи, мультивезикулярные тельца и пропластиды.Впервые на ультраструктурном уровне локализована особая форма сахарозосинтазы, связанная с плазматической мембраной. При анализе серийных ультратонких срезов впервые установлено взаиморасположение отдельных клеточных структур, участвующих в формировании микрофибрилл целлюлозы.Основные положения, выносимые на защиту.1). В формирующемся стебле льна-долгунца, в верхней его части существует специфический участок - «точка слома», где стебель значительно-9-меняет свои механические свойства, что связано с изменением стадии формирования флоэмных волокон.2). Утолщение клеточной стенки флоэмных волокон льна-долгунца начинается на внешней периферии пучка и продолжается по направлению к центру стебля.3). Обнаруженный во вторичной клеточной стенке флоэмных волокон льна-долгунца буферорастворимый галактан является тканеспецифичным, то есть присутствует только во флоэмных волокнах этих растений.4). Вторичная клеточная стенка флоэмных волокон характеризуется мозаичностью распределения лигнина и других фенольных соединений.5). Метод замораживания-замещения позволяет установить стабильно воспроизводимую локализацию лабильных белковых структур-антигенов.6). В клетках, специализированных на интенсивном синтезе целлюлозы, во время отложения вторичной клеточной стенки всегда присутствует особая форма сахарозосинтазы, которая локализована вплотную к плазматической мембране.7). Актиновые микрофиламенты не являются обязательными участниками формирования вторичных клеточных стенок, а обнаруживаются лишь при сложной пространственной организации этого процесса, например, при образовании локальных утолщений клеточных стенок в трахеальных элементах.8). Каллоза существует в виде постоянного слоя в ходе формирования вторичной клеточной стенки волосков семян хлопчатника и, вероятно, выполняет роль невзаимодействующего матрикса, в котором происходит кристаллизация микрофибрилл целлюлозы.Практическое значение работы.Практическое значение данной работы во многом определяется тем, что объектами исследования были флоэмные волокна льна-долгунца {Linum usitatissimum L.) и волоски семян хлопчатника (Gossipium hirsutum L.) -ткани важнейших технических культур. Получены данные, позволяющие изменить представление об их формировании.-10-Проведен комплексный анализ формирования клеточной стенки волокон льна-долгунца, что может послужить практическим руководством для изучения сходных по значению технических культур таких, как конопля, рами и других.Детально разработаны приемы быстрой криогенной фиксации растительной ткани (замораживание-замещение), анализа серийных ультратонких срезов, современных методов иммуноцитохимии, что может быть использовано в работах, где необходимо установить стабильно воспроизводимую локализацию лабильных белковых структур.Личный вклад соискателя.Представляемые в работе данные были получены в совместных исследованиях с коллегами из лаборатории Казанского института биохимии и биофизики КНЦ РАН и в лаборатории электронной микроскопии Техасского технического университета (США). В диссертацию включены и вынесены на защиту только те результаты, в которых автору принадлежит существенная или определяющая роль.Апробация работы.Материалы диссертации были представлены автором на регулярных итоговых конференциях КИББ КНЦ РАН, на трех Всесоюзных конференциях "Биосинтез целлюлозы" (Казань 1980, 1985, 1990), на Всесоюзной конференции по химии и биохимии углеводов (Пущино, 1982), на VI Всесоюзном симпозиуме "Ультраструктура растений" (Чернигов, 1988), на регулярных международных конференциях по клеточной стенке (VI Cell Wall Meeting -Nijmegen, Голландия, 1992, VII - Santiago de Compostella, Испания, 1995, VIII -Norwich, Англия, 1998, IX - Toulouse, Франция, 2001, X -Sorrento, Италия, 2004), на II Международной конференции по анатомии и морфологии растений (Санкт-Петербург, 2002), на V Съезде физиологов растений России (Пенза, 2004). Диссертационная работа в завершенном виде была представлена в виде устного доклада на семинарах в Казанском институте биохимии и биофизики КНЦ РАН и в Техасском техническом университете (Лаббок, США).-11-Публикации.По теме диссертации опубликовано около 60 научных работ. В список опубликованных работ входят две монографии, статьи в отечественных ("Доклады РАН", "Физиология растений", "Цитология", "Ботанический журнал") и зарубежных ("Plant Molecular Biology", "Phytochemistry", "PlantPhysiology", "Protoplasma", "Annuar Botany", "Natural Fiber", "Industrial Crops and Products") журналах, а также материалы, представленные на конференциях и изданные в научных сборниках.Структура и объем работы.Основной текст диссертации изложен на 272 страницах, состоит из 3 глав, заключения и выводов. Список литературы содержит 369 названий, из них 325 на иностранных языках. Текст диссертации в себя включает 1 тавлицу, 2 схемы, 34 рисунков и 174 фотографии.Благодарности. Приношу свою благодарность профессору д. б. н. Лозовой В.В., под руководством которой в институте были заложены основы исследований физиологии растения льна-долгунца, коллегам, работавшим со мной в разные годы в КИБ КНЦ РАН., с.н.с, к.б.н. Агеевой М.М., с.н.с, к.б.н. Чемикосовой СВ., к.б.н. доценту кафедры физиологии и биотехнологии растений Казанского государственного университета О.А. Тимофеевой, сотрудникам ГНУ ВНИИЛ РАСХ (Торжок) д.б.н. А.А. Жученко и к.б.н Л.Н. Курчаковой, сотрудникам БелНИИЗ (Жодино)| д.с.-х.н. М.И. Афонин)|, Е.Д. Мироновой, Л.М. Кукреш, коллегам из Агротехнологического института (Вагенинген, Нидерланды), особенно Jan van Dam, коллегам Техасского технического университета (Лаббок, Техас, США) С.Н. Haigler, M. Grimson - за совместные экспериментальные работы и плодотворное обсуждение полученных данных. Неоценима роль заведующего нашей лабораторией механизмов роста растительных клеток КИББ КНЦ РАН, моего научного консультанта, превосходного руководителя Татьяны Анатольевны Горшковой, без всесторонней поддержки и помощи которой эта работа была бы осуществима с большими трудностями. Выражаю искреннюю признательность академику И. А.-12-Тарчевскому, по инициативе и усилиями которого в КИБ КНЦ РАН были организованы работы по изучению растительной клеточной стенки.1. Обзор литературы.Роберт Гук, впервые наблюдавший растительную клеточную стенку (Микрография, 1665), не мог предположить, что обнаруженная им "мертвая" структура окажется в будущих исследованиях биологов одним из самых интересных и загадочных компартментов растительной клетки. Р. Гук в самом деле наблюдал уже мертвое образование - срез коры пробкового дерева (рис. 1). Однако цепь событий, которые произошли и продолжают происходить на пути изучения клеточной стенки, потрясают своим драматизмом и без сомнения произвели бы огромное впечатление на первооткрывателя.1.Состав и структура клеточной стенки.Растительная клеточная стенка - высоко специализированная структура, состоящая из различных полисахаридов, белков и ароматических веществ. Одни молекулы клеточной стенки выполняют роль каркаса, другие работают как связывающий каркас матрикс. Молекулярная композиция и расположение полимеров клеточной стенки отличается между видами растений, между тканями внутри одного вида, между отдельными клетками той же ткани и даже между участками одной и той же клетки.Не все функции клеточной стенки являются структурными, механическими. Клеточная стенка также содержит сигнальные молекулы, участвующие в клетка-клетка и стенка - ядро взаимоотношениях. Фрагменты полисахаридов клеточной стенки могут приводить к наработке в клеточной стенке специфических белков и лигнина, которые защищают клетки от проникновения грибов, бактерий и других патогенов. Кроме того, процессы, происходящие в клеточной стенке, во многом определяют созревание плодов, опадение листьев, а также транспорт веществ по растению.-13-Рис. 1. Первое изображение клеточной стенки (Fig. 1) в микрографии Роберта Гука (Hook R., 1665).-14-Наиболее распространенным и обязательным компонентом клеточной стенки является целлюлоза. Она является основным по массе органическим веществом биосферы (Тарчевский, Марченко, 1985, Delmer, 1999, Carpita, McCann, 2000). В составе первичной клеточной стенки целлюлоза составляет 15-30 % от сухого веса всей полисахаридной оболочки. Во вторичной клеточной стенке целлюлоза составляет 50-60 %, а в отдельных специализированных тканях (древесина, волоски семян хлопчатника и др.) - до 90%.Целлюлоза представляет собой линейный высокомолекулярный полисахарид, со степенью полимеризации 10-14 тысяч единиц (Delmer, 1982, Carpita, McCann, 2000, рис. 2). Протяженная форма цепей (3-1,4 -D-глюкана позволяет им очень точно взаимодействовать друг с другом, формируя жесткую структуру. В связи с этим, целлюлоза никогда не встречается в природе в виде отдельных молекул, а существует как комплекс нескольких десятков цепей, названных микрофибриллой. Цепи очень тесно взаимодействуют посредством как внутри, так и межцепочечных связей, так упорядоченно связываются глюкозными остатками, что микрофибриллы целлюлозы имеют свойства кристалличности, хотя это представление оставалось долгие годы не общепринятым. В настоящее время считается, что в кристалле целлюлозы I (форма целлюлозы, которая обнаружена в природе) цепи выстроены параллельно друг другу (Fry, 1985, Brett, Waldron, 1990, Carpita, Gubeaut., 1993, Brown et al., 1996, Delmer, 1999). Длина цепей варьирует среди различных организмов от примерно 2 000 до 20 000 остатков глюкозы, но фактически ничего не известно о том, чем она обуславливается. Размер микрофибрилл также варьирует среди организмов от так называемых элементарных фибрилл (около 36 цепей) до очень крупных фибрилл водорослей, которые могут содержать более чем 200 цепей и так высоко организованы, что дифрагируют как единый чистый кристалл (Kuga, Brown, 1991). Дополнительный уровень организации, когда микрофибриллы объединяются в макрофибриллярные пуч --15-В/ ys-ом /--A»1S Аs > 11Рис. 2. Структура микрофибриллы целлюлозы (Carpita, McCann, 2000). А. Общий вид клеточной стенки. Б. Реплика плазматической мембраны, полученная методом замораживания-скалывания. В. Отдельная микрофибрилла. Г. Вид микрофибриллы на поперечном срезе. Д. Глюкановые цепочки в микрофибрилле отделены друг от друга на определенное расстояние. Е. Отдельный кристалл микрофибриллы целлюлозы.-16-ки пучки, формируется в некоторых растительных клетках при отложении вторичной клеточной стенки.Каллоза, в отличие от целлюлозы, состоит из (1—>3)-р - D- глюкановых цепей, которые не могут формировать спиральные дуплексы и триплексы. Каллоза не является обязательным компонентом клеточной стенки. Она обнаружена в клеточных стенках растущих пыльцевых трубок и в оболочках вновь поделившихся клеток. Также каллоза может синтезироваться в ответ на определенные стрессовые воздействия на клетку, например, в ответ на проникновение гифов грибов в растительные ткани (Waterkeyn, 1981).Пектины, или пектиновые вещества - еще один класс полисахаридов клеточной стенки. У покрытосеменных различают клеточную стенку двух типов (Carpita, McCann, 2000): I) клеточная стенка двудольных, II) клеточная стенка семейства Роасеач и близко родственных видов (commelinoid -коммелиноидной линии однодольных, которая включает в себя бромелаиды, пальмы, имбирь, кипарисы, и травы). По составу пектинов, обязательным компонентом которых является галактуроновая кислота, клеточные стенки первого и второго типов отличаются незначительно. В клеточных стенках I типа доля пектинов составляет до 30 % , тогда как у травянистых растений варьирует в пределах нескольких процентов.Перекрестно-связывающие гликаны - это класс полисахаридов, которые способны образовывать водородные связи с микрофибриллами целлюлозы. Они могут оплетать микрофибриллы и обладают достаточной длиной, чтобы покрыть расстояние между микрофибриллами и связать их для формирования сети. Большинство перекрестно-связывающих гликанов часто называют "гемицеллюлозами" - широко распространенным, но архаичным термином для всего материала, экстрагируемого из клеточной стенки щелочью, независимо от его структуры.Два основных перекрестно-связывающих гликана всех первичных клеточных стенок цветковых растений - ксилоглюкан (XG) и глюкуроноарабиноксилан (GAX). XG является перекрестно-связывающим-17-гликаном в клеточных стенках всех двудольных и части однодольных растений. В клеточных стенках II типа основным перекрестно связывающим гликаном является (GAX) глюкуроноарабиноксилан (Hayashi, 1989, Smith, Fry, 1991, Carpita, McCann, 2000).Хотя основной структурный остов клеточной стенки состоит из полисахаридов (они так и называются структурные), в состав клеточной стенки входят белки, которые также являются структурными элементами клеточной стенки. В настоящее время выделяют четыре класса белков. Три из них получили свое название по аминокислоте. Это: 1) экстенсии — богатый гидроксипролином белок, 2) пролин-богатые белки, 3) глицин-богатые белки. Количество этих белков в клеточной стенке зависит от типа ткани и вида растения. Четвертый класс структурных белков - арабиногалактановые белки на 95 % состоят из углеводов и составляют обширный класс молекул, локализованных в продуцируемых аппаратом Гольджи пузырьках и клеточной стенке. Недостаточно ясна функция каждого из структурных белков, некоторые из них играют определенную архитектурную роль в клеточной стенке и/или могут связывать некоторые полимеры.В состав клеточных стенок большинства растений входят вещества неуглеводного характера, в частности, лигнин - аморфный полимер ароматического строения. Ароматическое вещество лигнин является основным инкрустирующим веществом клеточной стенки. Это полимер состоит из ароматических компонентов. Мономерами лигнина могут быть конифериловый, синаповый и другие спирты (Lewis, Yamomoto, 1990). Интесивная лигнификация клеточных стенок начинается после прекращения роста клетки. Сильному метаморфозу подвергаются оболочки при одревеснении, опробковении, ослизнении и минерализации. Одревеснение состоит в том, что часть целлюлозной толщи стенки пропитывается лигнином. Отношение между целлюлозой и лигнином в одревесневших слоях оболочки было признано аналогичным конструкции железобетонных сооружений. Лигнин, подобно бетонной массе, заполняет промежутки ячеек сетки; при этомСписок литературы