| |
|ХЛАМИДИОЗ - СОВРЕМЕННЫЕ ПОДХОДЫ К ДИАГНОСТИКЕ И ЛЕЧЕНИЮ |
|Цитоскопические методы обнаружения хламидий |
|При цитоскопическом методе одновременно с поиском |
|цитоплазматических клеток-включений Провачека учитывается |
|количество лейкоцитов как показателя воспаления, а также |
|дополнительная информация о наличии сопутствующей |
|бактериальной микрофлоры, дрожжеподобных грибов, трихомонад|
|и т.п. |
|Показания: Острая фаза заболевания. |
|Материалом для исследования служат соскобы из уретры у |
|мужчин и уретры и /или цервикального канала у женщин. |
|Материал берут специальными щеточками или ложечками |
|Фолькмана. Выделения из цервикального канала удаляются |
|ватным тампоном. Щеточка вводится в канал на 1-2 см, |
|вращается 15 секунд . Соскобный материал распределяется на |
|предметном стекле, высушивается на воздухе и фиксируется в |
|метаноле или холодном ацетоне. Наиболее популярна окраска |
|по Романовскому-Гимзе. После окраски препараты |
|просматриваются в световом микроскопе, используя |
|иммерсионный объектив (х90). При этом цитоплазма клеток |
|окрашивается в голубой цвет, ядра в фиолетово-синий, |
|цитоплазматические включения определяются в виде |
|темно-синих или розовых микроколоний на фоне голубой |
|цитоплазмы. На стадии элементарных включения хламидий |
|окрашиваются в розовый цвет, на стадии элементарных телец |
|-в синий. |
|Цитоскопический метод широко доступен, но эффективен лишь |
|при острых формах инфекции, значительно менее эффективен и |
|информативен при хронических формах заболевания При |
|урогенитальном хламидиозе частота обнаружения телец |
|Провачека в соскобах уретры и цервикального канала не |
|превышает 10-12 %. Наличие этих телец подтверждает диагноз |
|хламидиоза, однако их отсутствие не исключает наличие |
|инфекции. |
| |
| |
|Прямая иммунофлюоресценция (ПИФ) |
|Этот метод предусматривает прямое выявление антигенов |
|хламидий. При люминесцентной микроскопии включения хламидий|
|определяются в виде зеленой или желто-зеленой флюоресценции|
|включений на коричнево-оранжевом фоне цитоплазмы клеток |
|Включения могут иметь зернистую гомогенную или смешанную |
|структуру. |
|Показаниями для диагностики хламидийной инфекции этим |
|методом являются: |
|1.Острая фаза заболевания. |
|2.Хроническая фаза заболевания |
|3 Установление этиологии хронического инфекционного |
|процесса урогенитального тракта |
|4. Беременность с отягощенным акушерским анамнезом |
|5. Бесплодие неясного генеза. |
|Диагностическая информативность ПИФ связана с тем, что с ее|
|помощью выявляются не только корпускулярные, но и |
|растворимые антигены хламидий Этот метод не зависит от |
|возможного изменения тинкториальных свойств микроорганизма |
|в процессе заболевания и лечения. ПИФ-метод является |
|важнейшим скриннинговым методом диагностики урогенитального|
|хламидиоза. Его чувствительность и специфичность при |
|использовании моноклональных антител составляет |
|соответственно 65-90% и 85-90%. При оценке результатов |
|следует учитывать, что только показатели внутриклеточной |
|флюоресценции могут оцениваться в качестве положительного |
|результата этого теста при использовании поликлональных |
|антихламидийных антител, при использовании моноклональных -|
|результат считают при наличии 10 ЭТ в поле зрения. |
|Соскобные препараты готовят также, как и для |
|цитоскопических исследований. |
|Выпускают диагностические наборы, содержащие моноклональные|
|антитела для ПИФ, следующие фирмы: Syva, Drfco, Kallastad, |
|Bartrels, Boots celltech, California Integrated |
|Diagnostics, Orion Diagnostica. Реагенты фирм Syva, Difco, |
|Kallastad представляют собой меченные ФИТЦ моноклональные |
|антитела к основному белку наружной мембраны хламидий, а |
|реагенты других фирм - моноклональные антитела к |
|родоспецифическому хламидийному липолисахариду (ЛПС). В |
|России ЗАО “НИАРМЕДИК плюс” при НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН|
|выпускает моноклональные антитела к ЛПС хламидий, которые |
|успешно конкурируют с продукцией иностранных фирм по |
|качеству продукции. Это набор “Хламоноскрин” для |
|определения моноклональных антител к родоспецифическому |
|липополисахаридному антигену и набор “Хламоноскрин-2” для |
|определения моноклональных антител к видоспецифическому |
|белковому антигену хламидий трахоматис. Наборы имеют ФС |
|42-359598 и регистрационное удостоверение Минздрава России |
|93/ 270/ 9 . |
|Моноклональные антитела отличаются друг от друга по |
|вызываемой яркости свечения, постоянству выявляемых форм ЭТ|
|и степени специфичности. Для диагностики хламидий этим |
|методом необходим люминесцентный микроскоп. |
|В целом, метод ПИФ отвечает критериям высокой |
|чувствительности и специфичности, но требует исполнения |
|опытным, компетентным лабораторным работником. |
|Высококвалифицированная экспертная оценка методом ПИФ редко|
|бывает доступной, поэтому средняя чувствительность его |
|снижается. Метод недостаточно чувствителен и для |
|стабильного определения малых количеств ЭТ. К тому же |
|невозможно проверить и отрицательные результаты, и, |
|следовательно, обнаружить среди них ложноотрицательные, что|
|приводит к снижению чувствительности. |
| |
| |
|Иммуноморфологические методы |
|Эти методы основаны на обнаружении антигенных субстанций |
|хламидий в эпителии и других тканях путем обработки |
|препаратов специфическими антителами. Антитела |
|диагностической антихламидийной сыворотки соединены с |
|какой-либо меткой - люминесцирующей (ФИТЦ-антитела) или |
|ферментной (энзим-меченые антитела). |
| |
| |
|Непрямой метод иммунофлюресценциии |
|Непрямой метод иммунофлюресценции применяют в тех случаях, |
|когда нет в наличии ФИТЦ-конъюгата антихламидийных антител.|
|В этих случаях приготовленный тем же методом, что и для ПИФ|
|препарат из клинических проб обрабатывают вначале |
|антихламидийными антителами, полученными путем иммунизации |
|хламидиями овец, кроликов, мышей или других животных, а |
|затем второй сывороткой, специфичной для вида животного, |
|которое было иммунизировано хламидиями. Антитела второй |
|сыворотки конъюгированы с ФИТЦ. Показания к применению и |
|специфичность данного метода совпадают с ПИФ. |
| |
| |
|Диагностика хламидий на культуре клеток МсСоу |
|Одним из лучших, но в то же время наиболее трудоемким |
|является метод диагностики хламидий путем изоляции |
|возбудителя на культуре клеток, обработанных различными |
|антиметаболитами (“золотой стандарт”) Для этой цели обычно |
|используют чувствительную культуру клеток, обработанную |
|циклогексимидом. Чувствительность культурального метода по |
|сравнению с ПЦР составляет 70-80%, но в то же время он |
|превосходит молекулярно-биологические методы диагностики по|
|специфичности. В литературе описаны случаи выявления |
|хламидий трахоматис методом ПЦР при отрицательных |
|результатах культурального теста и наоборот. |
|Показаниями для диагностики хламидийной инфекции этим |
|методом являются: |
|1 Беременность с отягощенным акушерским анамнезом. |
|2. Оценка эффективности проведенного антибактериального |
|лечения. |
|3. Выявление чувствительности и резистентности к |
|антибактериальным |
|препаратам. |
|4. Выявление хламидий у ВИЧ-инфицированных или лиц со |
|вторичными иммунодефицитными состояниями (онкологические |
|больные после проведенных курсов лучевой и химиотерапии, |
|трансплантации костного мозга; лица, получающие |
|иммунодепрессанты; больные вирусным гепатитом и |
|туберкулезом). |
|5. Бесплодие неясного генеза. |
|6. Установление этиологии хронического инфекционного |
|процесса урогенитального тракта. |
|Культуральный посев является референс-методом при оценке |
|эффективности антибактериального лечения. При исследовании |
|биопроб методом ПЦР после курса химиотерапии в некоторых |
|случаях можно получить “ложноположительные с клинической |
|точки зрения” результаты. Это связано с тем, что невозможно|
|однозначно оценить жизнеспособность и патогенность |
|микробной клетки на основании выявления фрагмента ее |
|генома, используя только данные молекулярно-биологических |
|методов. В этом случае при исследовании клинического |
|материала с помощью культурального посева микробные клетки,|
|потерявшие эти важные с клинической точки зрения свойства, |
|не дадут роста в клеточной культуре. |
|Для транспортировки и хранения клинического материала |
|используют специальную питательную среду (транспортная |
|среда). Она разливается в пенициллиновые флаконы по 1 мл и |
|хранится при температуре + 4 ° С (в общей камере бытового |
|холодильника) в течение 2-х месяцев. Состав транспортной |
|среды: среда MEM с добавлением 10% сыворотки крупного |
|рогатого скота и антибиотика гентамицина концентрации 50 |
|мкг/мл . |
|Клинический материал после перенесения в транспортную среду|
|хранится в общей камере холодильника при температуре + 4 ° |
|С и, в течение двух суток должен быть доставлен в |
|лабораторию. |
|Процедура посева |
|1. Обработка однодневной клеточной культуры МсСоу 1% |
|раствором ДЕАЕ декстраном в течение 30 минут. |
|2. Заражение обработанных клеток материалом, полученным от |
|больных. |
|3. Центрифугирование зараженных клеток при 2500 g в течение|
|45 минут. |
|4. Отмывка клеток питательной средой. |
|5. Добавление к клеткам ростовой среды, содержащей |
|циклогексимид. |
|6. Инкубирование клеток в течение двух суток при +36 ° С. |
|7. Обнаружение хламидий в клетках методом прямой |
|иммунофлюоресценции или ПЦР. |
|Реальный срок получения результатов этим методом - семь |
|дней. |
| |
|В настоящее время в литературе растет число сообщений о |
|случаях резистентности хламидий к антибактериальным |
|препаратам (эритромицину, тетрациклину, доксициклину, |
|фторхинолонам). Ценность культурального метода состоит в |
|том, что он является пока единственным методом, позволяющим|
|выбрать антибактериальный препарат для лечения хламидийной |
|инфекции и оценить эффективность антибактериальной терапии.|
| |
|Схема метода выявления устойчивости хламидий трахоматис к |
|антибактериальным препаратам |
|-Хламидийным изолятом, выделенным от больного при посеве, |
|заражают чувствительные клетки. |
|-К зараженным клеткам добавляют ростовую среду, содержащую |
|антибиотик. |
|-Зараженные клетки инкубируют 5 дней при температуре + 36 °|
|С. |
|-Чувствительность хламидий к антибиотику определяется по |
|подавлению инфекции в зараженных клетках. Процедура |
|длительная, занимает по времени две недели. |
| |
| |
|Диагностика Chlamydia trachomatis методом полимеразной |
|цепной реакции |
|Дороговизна, длительность и трудоемкость |
|микробиологического выделения хламидий в культуре |
|существенно затрудняет использование этой процедуры в |
|рутинной лабораторной диагностике. В литературе накоплен |
|обширный клинико-лабораторный опыт по использованию метода |
|ПЦР для выявления хламидий трахоматис. Особое внимание при |
|его использовании следует уделять, без сомнения, вопросам |
|правильной интерпретации получаемых результатов. |
|Экстремально высокие показатели чувствительности и |
|специфичности ПЦР делают эту методику во многом |
|революционной в лабораторной диагностике. Основными |
|мишенями при выявлении хламидий трахоматис являются |
|нуклеотидная последовательность видоспецифической |
|криптической плазмиды, последовательность главного белка |
|внутренней мембраны, рибосомальные гены. |
|Данная реакция представляет собой многократно повторяющиеся|
|циклы синтеза (амплификацию) специфической области |
|ДНК-мишени в присутствии термостабильной ДНК-полимеразы, |
|дезоксинуклеотидтрифосфатов, соответствующего солевого |
|буфера и олигонуклеотидных затравок-праймеров, определяющих|
|границы амплифицируемого участка. Каждый цикл состоит из |
|трех стадий с различными температурными режимами. На первой|
|стадии при 94 ° С происходит разделение цепей ДНК, затем |
|при 56-58 ° С - присоединение (отжиг) праймеров к |
|комплементарным последовательностям на ДНК-мишени, и при |
|температуре 72 ° С протекает синтез новых цепей ДНК путем |
|достраивания цепей праймеров в направлении 5’ –3’ . В |
|каждом цикле происходит удвоение числа копий |
|амплифицируемого участка, что позволяет за 25-40 циклов |
|наработать фрагмент ДНК, ограниченный парой выбранных |
|праймеров, в количестве, достаточном для ее детекции с |
|помощью электрофореза или альтернативными ему технологиями |
|По сравнению с широко применяющимися иммунологическими |
|тестами ПЦР-диагностика обладает рядом преимуществ: |
|-высокой и регулируемой специфичностью, обусловленной лишь |
|нуклеотидной последовательностью, применяемой в данной |
|диагностической системе; |
|-высокой чувствительностью, позволяющей диагносцировать не |
|только острые, но и латентные инфекции (возможно выявление |
|даже единичных бактерий или вирусов); |
|-химическое сходство всех нуклеиновых кислот позволяет |
|разрабатывать универсальные процедуры для выявления |
|различных инфекционных агентов, |
|-возможностью идентификации возбудителя в течении 4,5-5 |
|часов. |
| |
|Доставка биоматериала в ПЦР-лабораторию производится в |
|холодовом термоконтейнере или термосе со льдом. Важной |
|отличительной особенностью ПЦР-диагностики является |
|относительно низкая стоимость оборудования для проведения |
|анализа, сочетающаяся с универсальностью метода, что |
|позволяет выявлять весь спектр клинически актуальных |
|инфекционных агентов. |
| |
|ПЦР-лаборатория должна быть разделена на зоны (комнаты). |
|Следует иметь не менее двух комнат |
|-пре-ПЦР-помещение, где проводится обработка клинических |
|образцов, выделение ДНК, приготовление реакционной смеси |
|для ПЦР и постановка ПЦР (при наличии условий два последних|
|этапа рекомендуется также проводить в дополнительном |
|отдельном помещении), в этих помещениях запрещается |
|проводить все другие виды работ с инфекционными агентами |
|(микробиологический анализ, ИФА, другие диагностические |
|тесты), ПЦР-диагностика которых проводится в данной |
|лаборатории. |
|-пост-ПЦР-помещение, где проводится детекция продуктов |
|амплификации, в ПЦР-помещении допускается использовать |
|другие методы детекции инфекций, диагностика которых |
|проводится в данной лаборатории. Комнату детекции продуктов|
|амплификации (пост-ПЦР-помещение) следует располагать как |
|можно дальше от пре-ПЦР-помещений. Следует исключить |
|движение воздушного потока из пост-ПЦР-помещения в |
|пре-ПЦР-помещение. |
|В комнате приготовления реакционной смеси и в комнате |
|обработки клинических образцов должны быть установлены |
|ультрафиолетовые лампы, рабочие поверхности в лаборатории |
|должны обрабатываться дезинфицирующими растворами . |
|Показания для диагностики С. trachomatis методом ПЦР |
|1. Острая фаза заболевания |
|2. Хроническая фаза заболевания |
|3. Установление этиологии хронического инфекционного |
|процесса урогенитального тракта. |
|4. Беременность с отягощенным акушерским анамнезом. 5 |
|Бесплодие неясного генеза. |
|6. Контроль эффективности проведенного антибактериального |
|лечения. |
|В случае выявления фрагмента ДНК хламидии трахоматис после |
|курса химиотерапии следует провести культуральную |
|диагностику для исключения “ложноположительного с |
|клинической точки зрения результата”. Если проведение |
|культуральной диагностики невозможно, то необходимо через |
|5-6 недель (полное обновление эпителиального покрова |
|мочеполовых путей) провести повторное исследование методом |
|ПЦР. |
|7. Выявление хламидии у ВИЧ-инфицированных лиц, больных |
|туберкулезом, вирусным гепатитом и со вторичными |
|иммунодефицитными состояними (онкологические больные после |
|курсов химио- и лучевой терапии, трансплантации костного |
|мозга, получающие иммуносупрессивную терапию). |
|В 1991 году компания Хоффман-ла Рош ЛТД получила от |
|компании Cetus права и патенты на использование ПЦР. В этом|
|же году была создан Roche Molecular Systems, занимающийся |
|исключительно вопросами развития и совершенствования ПЦР. В|
|1992 году были внедрены первые стандартизованные |
|тест-системы для клинической ПЦР-диагностики AMPLICOR |
|Chlamydia trachomatis, а в 1993 году начато производство |
|этих тест систем. Многочисленные проведенные исследования |
|показали высокую чувствительность и специфичность данного |
|набора. Это позволило получить данной тест-системе |
|сертификат Food and Drug Administration (FDA) в 1993 году. |
|В 1995 году появился новый набор AMPLICOR Chlamydia |
|trachomatis/Neisseria gonorrhoeae для одновременной их |
|детекции в одной пробирке. В тесте использованы |
|биотинилированные праймеры (СР24/СР27) из криптической |
|плазмиды С. trachomatis. Чувствительность теста составляет |
|10 копий/мл, специфичность 99,6%. Тест-система включает: |
|набор для сбора и транспортировки образцов, набор для |
|выделения ДНК из цервикальных, уретральных образцов и мочи,|
|набор для амплификации и детекции. Все наборы |
|стандартизованы, полностью готовы к использованию, имеют |
|внутренний контроль, систему защиты от контаминации. |
|Научно-производственной фирмой "Литех" при НИИ |
|физико-химической медицины МЗ РФ выпускается набор |
|реагентов "Полимик" в виде трех отдельных наборов для |
|определения соответственно Chlamydia trachomatis, |
|Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealiticum. Каждый набор |
|“Полимик” комплектуется отдельным набором для выделения ДНК|
|из биопроб. Инструкция по применению набора реагентов |
|рекомендована к утверждению экспертной комиссией Комитета |
|по новой медицинской технике МЗ РФ (протокол No 3 от |
|18.03.96 г.) и утверждена Министерством здравоохранения РФ |
|17.05.96 г. (ТУ 9398-405-17253567-96). |
|В состав реакционной смеси набора “Полимик” входит |
|внутренний контроль (рекомбинантная плазмида, содержащая |
|фрагмент-вставку размером 308 н.п.). Этот компонент |
|позволяет контролировать процесс прохождения реакции |
|амплификации, а также тестировать наличие в пробах веществ,|
|ингибирующих ПЦР. Полоса, соответствующая внутреннему |
|контролю, должна проявляться как в положительном и в |
|отрицательном контролях, так и во всех тестируемых пробах. |
|При выделении ДНК из биопробы (“Набор для выделения ДНК”) |
|используется метод экстракции ДНК из клеток хламидий с |
|помощью гуанидина тиоцианата и связывания высвобождающихся |
|нуклеиновых кислот с частицами крупнопористого стекла. Это |
|позволяет оптимизировать условия выделения и подготовки |
|проб для амплификации, а также уменьшить количество |
|манипуляций с образцом. При этом все манипуляции проводятся|
|в одной пробирке. Выход хромосомной ДНК составляет 70-80% |
|по результатам определения числа колониеобразующих единиц |
|клеток Acholeplasma laidlawii (штамм микоплазм, взятый в |
|качестве стандарта) как в случае чистой культуры, так и при|
|добавлении этих клеток к клиническому материалу, не |
|содержащему определяемых инфекционных агентов. |
|После завершения ПЦР продукты амплификации фракционируют |
|методом электрофореза в 1,5% агарозном геле. |
|Анализ результатов диагностики |
|1. В положительном контрольном образце для хламидий |
|выявляется полоса размером 501 н.п. |
|2. В отрицательном контрольном образце полоса, |
|соответствующая фрагментам генома хламидий, должна |
|отсутствовать. Появление полосы в отрицательном контроле |
|свидетельствует о контаминации компонентов набора. |
|3. В анализируемой пробе отсутствие полосы строго на уровне|
|соответствующего контроля свидетельствует об отсутствии |
|возбудителя в пробе, наличие полосы, соответствующей по |
|электрофоретической подвижности положительному контролю, |
|свидетельствует о наличии хламидий в клинической пробе. |
|4. Во всех образцах выявляется полоса оранжево-красного |
|цвета, соответствующая внутреннему контролю размером 308 |
|н.п. Полученные результаты можно документировать |
|фотографированием гелей с использованием оранжевого или |
|интерференционного (594 нм) светофильтра. При использовании|
|видеосистемы "Gel-doc" возможно документирование |
|результатов электрофореза в виде компьютерного файла, |
|доступного любым приложениям “Windows”. |
|Набор “Полимик” следует хранить при температуре - 18-20 ° С|
|в течение всего срока годности (6 месяцев). Допускается, |
|хранение и транспортировка набора при температуре не выше 0|
|° градусов не более одних суток. |
|По состоянию на третий квартал 1999 г. Минздравом России |
|помимо набора “Полимик” разрешены следующие диагностические|
|наборы для обнаружения хламидий трахоматис методом ПЦР в |
|качестве изделий медицинского назначения: |
|набор реагентов амплификационный для определения ДНК |
|хламидий (Хламидия-Ампли-тест) ТУ 9398-402-18137053-96 |
|производства АО “ВНЦМДЛ”, Москва; |
|набор реактивов для выявления нуклеотидных |
|последовательностей хламидия трахоматис методом ПЦР (Хлам |
|Ам) ТУ “9398-403-29032954-96 производства ЗАО “Внедрение |
|систем в медицину”. Москва, |
|набор реагентов для выявления ДНК хламидий трахоматис |
|методом ПЦР (Хлам-Ген) ТУ 9398-412-46482062-97 производства|
|НПФ “ДНК-технология”, Москва. |
| |
| |
|Достоинства и недостатки различных методов обнаружения Chlamydia |
|trachomatis |
|(Taylor-Robinson О., Thomas B.J ,1991, с дополнениями Говорун В.М,|
|Бочкарев Е.Г., Парфенова Т.М., 1999) |
| |
|Характеристика/ Метод |
|ПИФ |
|Культуральный посев |
|ИФА-методы |
|ПЦР |
| |
|Исследуемый материал |
|Любой |
|Большинство |
|Ограничения из-за неспецифичности реакций |
|Любой |
| |
|Значение правильно взятых проб |
|Решающее |
|Решающее |
|Решающее |
|Решающее |
| |
|Условия транспортировки проб |
|Если препарат фиксирован -условия не важны |
|Быстрая доставка или хранение при низкой температуре |
|Не имеет значения, если проба взята в буфер |
|Быстрая доставка или хранение при низкой to менее важно, чем для |
|культуры клеток |
| |
|Условия хранения |
|На короткое время при +4°С длительно при -20 °С |
|+4°С - сутки-двое. Длит хранение в жидком азоте |
|3 -5 дней при +4°С Замораживание снижает чувствительность |
|На короткое время + 4°С, две недели - 20°С Длительное время - в |
|жидком азоте |
| |
|Проверка адекватности взятия материала |
|Мазки оценивают во время тестирования |
|Не практикуется |
|Не практикуется |
|Определяется, присутствует ли ДНК. |
| |
|Потребность в специальном оборудовании |
|Люминесцентный микроскоп |
|Центрифуга |
|Комплект для ИФА |
|Амплификатор и оборудование для электрофореза |
| |
|Обработка проб |
|Простая |
|Трудоемкая |
|Становится проще для новых тестов |
|Требует строгой предосторожности, чтобы не контаминировать ДНК |
| |
|Чтение результатов |
|Субъективное и утомительное |
|Субъективное умеренно утомительное |
|Объективное, Простое |
|Объективное, простое |
| |
|Время выполнения |
|30 минут |
|12-72 часа |
|3 часа |
|4,5-5 часов |
| |
|Способы проверки результатов |
|Повторный просмотр |
|Повторный просмотр |
|Повторение теста |
|Повторная проба или переваривание эндоуклеазой |
| |
|Результат зависит от следующих причин: |
|Опыта микроскописта |
|Чувствительности клеточной культуры |
|Присущей мощности теста |
|Требует хорошего контроля и отсуствия контаминации |
| |
|Способность к поддержанию штамма |
|Нет |
|Да |
|Нет |
|Нет |
| |
|Использование как контроля эффективности лечения |
|Ограничено |
|Рекомендуется |
|Ограничено |
|Рекомендуется с ограничениями |
| |
| |
| |