Пищевой дизайн: исследование накопления ксантофиллов в желтке куриных яиц

Л.А. Дейнека, А.А. Шапошников, С.М. Вострикова, В.И. Дейнека

Белгородский государственный университет

В работе спектрофотометрическими и хроматографическими методами исследовано накопление ксантофиллов в желтке куриных яиц. Установлено, что среднее содержание каротиноидов в образцах промышленного производства (20 мкг на 1 г желтка) заметно ниже, чем в образцах индивидуальных хозяйств. Основными компонентами каротиноидного комплекса желтка являются неэтерифицированные ксантофиллы (лютеин и зеаксантин). Экспериментально подтверждена возможность существенного повышения содержания ксантофиллов в желтке при использовании обогащенных каротиноидами кормовых добавок.

Введение

Относительно новое направление - пищевой дизайн (food design) - ориентировано на получение продукции с заданными свойствами. Применительно к птицеводству известно использование специально разработанных подкормок с целью, например, повышения содержания в яйцах эссенциальных жирных кислот, ксантофиллов [1], иода и т.д. Особое внимание, уделяемое содержанию ксантофиллов (лютеина и зеаксантина) в желтке, связано с установлением влияния недостатка этих веществ на развитие возрастного заболевания макулы (желтого пятна в сетчатке глаз). Потребление до 3 мг в сутки этих веществ позволяет существенно снизить риск заболевания [2]. В странах Западной Европы и США выпускается несколько кормовых добавок, предназначенных для улучшения цвета желтка. Они содержат ксантофиллы растительного происхождения, поскольку известно, что в организме птицы эти вещества не синтезируются (в том числе из Р-каротина).

Задача настоящей работы - исследование качественного и количественного состава каротиноидного комплекса желтка куриных яиц рынка Белгородской области и возможности повышения содержания лютеина и зеаксантина в желтке куриных яиц за счет использования кормовых добавок на основе природных ксантофиллов с использованием хроматографических и спектрофотометрических методов.

Экспериментальная часть

Желток отделяли от белка и гомогенизировали. Навеску желтка в диапазоне 0,45 - 0,55 г смешивали с 9,5 мл растворителя, разминали коагулят до видимого обесцвечивания. Экстракт отделяли и отжимали на стеклянном фильтре, покрытом фильтровальной бумагой, под вакуумом. Экстракт переносили в мерную колбу (вместимостью 10 мл) и доводили до метки тем же растворителем. При содержании каротиноидов более 50 мкг на 1 г желтка проводили повторную экстракцию (10 мл); экстракты объединяли, переносили в мерную колбу на 25 мл, доводили до метки тем же растворителем.

Для ВЭЖХ исследований при обращенно-фазовом варианте использовали растворы, полученные экстракцией ацетоном; при нормально-фазовом варианте к ацетоновому экстракту добавляли 10 мл гексана, воду (около 50 мл), 10 %-ный раствор хлорида натрия в воде, отделяя нижний слой в делительной воронке. Гексановый слой сушили добавлением прокаленного сульфата натрия.

Спектрофотометрические измерения производили с использованием КФК-3а и кварцевых кювет длиной оптического пути 1 см.

Для исследований использовали хроматографическую систему, состоящую из насоса Altex 110A, детектора LCD2563 (X = 436 нм) и интегратора Shimadzu C-R3A. Колонки: 250x4 мм Диасфер-110-С18 (6 мкм) (ЗАО «БиоХимМак СТ») - для обращенно-фазовой ВЭЖХ (ОФ), 250x4,6 мм ZorbaxSil (5 мкм) - для нормально-фазовой ВЭЖХ (НФ). Подвижные фазы: 0 - 20

об.       %         ацетонитрила            в          ацетоне          (ОФ);

25 об.% ацетона в гексане (НФ). Скорость элюента - мл/мин.

В работе использовали ацетон,      1-бутанол, ацетонитрил, гексан квалификации

ч.         или ч.д.а. для экстракции и для ВЭЖХ определений.

Для исследования накопления ксантофиллов при введении в качестве подкормки ксантофилл содержащего концентрата (ORO GLO 20 DRY, Kemin Europa NV, Belgium) было выбрано частное хозяйство, исходная продукция которого отличалась в лучшую сторону (~ 40 мкг лютеина и зеаксантина на 1 г) по сравнению с продукцией птицефабрик и многих частных хозяйств.

Результаты и обсуждение

Для оценки накопления каротиноидов часто применяют различные цветовые шкалы (наиболее распространенной из которых является веер Рош [3 - 6]). Несмотря на очевидную простоту визуального сопоставления окраски, остается много вопросов, на которые невозможно получить ответы. Так, хорошо известно, что в желтке может накапливаться ряд веществ (апо- каротеналь или апо-этиловый эфир каротиновой кислоты [7]), придавая продукту скорее эстетическую ценность. В плане определения соотношения между ксантофиллами не очень информативны спектрофотометрические методы, поскольку спектры лютеина и зеаксантина довольно близки, и практически бесполезно использование цветовых шкал.

Лепестки цветков бархатцев (Tagetes sp.) содержат в основном диэфиры лютеина и зеаксантина [8]. С использованием обращенно-фазовой ВЭЖХ, экстрактов лепестков цветков этого растения и их частичных гидролизатов [8] в качестве стандартов нами было установлено, что более чем в 50 исследованных образцах желтков практически отсутствовали (не более 0,5 % от суммы каротиноидов) диэфиры лютеина и зеаксантина; содержание моноэфиров и Р-каротина не превышало 2,0 % и 2,5 % соответственно. При этом возникает вопрос о целесообразности часто используемого омыления на предварительном этапе определения [9, 10], тем более, что любые манипуляции с каротиноидами следует проводить с учетом высокой лабильности этих соединений.

Наиболее информативна при исследовании каротиноидов желтка яиц нормально-фазовая ВЭЖХ. Анализируя хроматограммы экстрактов желтка (рис. 1), можно сделать вывод о том, что кроме лютеина и зеаксантина в желтках весьма заметно присутствие других веществ (до 25 % по площадям пиков), относимых к изомерам этих ксантофиллов и их метаболитам [11, 12]. Соотношение лютеин : зеаксантин варьировало в значительных пределах, но наиболее характерным является соотношение ~ 4:1.

Отметим, что разделение и количественное определение лютеина и зеаксантина возможно и при использовании обращенно-фазовой ВЭЖХ (в подвижных фазах, обогащенных ацетонитрилом). Но метод может быть использован только после отделения жиров (или омыления), экстрагируемых вместе с каротиноидами, поскольку при высоком содержании ацетонитрила в ацетоне жиры выпадают в осадок, сорбируя значительную часть каротиноидов.

Рис.1. Разделение каротиноидов экстракта желтка куриных яиц.

Условия: колонка 250x4,6 мм ZorbaxSil (5 мкм); подвижная фаза: 25% ацетона в гексане,

1 мл/мин; детектор: 436 нм. Экстракты: из желтков яиц 1 - экспериментальных; 2 - птицефабрики «Майская», племенное; 3 - птицефабрики «Северное»; Л -лютеин; З - зеаксантин

При исследовании желтков яиц, выпускаемых птицефабриками, в течение всего 2004 года было найдено, что содержание каротиноидов в среднем составляло 20 мкг на 1 г желтка с большими относительными вариациями как в сторону увеличения (до 30 мкг на 1 г), так и в сторону уменьшения (до 7 мкг на 1 г). В желтке яиц частных хозяйств ксантофиллов заметно   больше           (в         среднем          30            мкг      на

1 г), но с еще большими вариациями, что свидетельствует о различии рационов кормления.

При использовании концентратов ксантофиллов в качестве подкормок в рационе кур было установлено, что уже через две недели их содержание в желтке оказалось более высоким (рис. 2). К концу эксперимента среднее содержание суммы ксантофиллов превысило 110 мкг на 1 г (а в отдельных образцах - более 150 мкг на 1 г).

Рис.2. Накопление ксантофиллов в желтке куриных яиц при введении в корм добавок ОРО ГЛО:

1 - среднее содержание в продукции птицефабрик;

2 - максимальное содержание в продукции частных хозяйств

Для серийных исследований в данной работе использовался спектрофотометрический метод. По указанным выше причинам мы сочли бессмысленным дополнительное омыление экстрактов. Известно, что спектральные характеристики каротиноидов зависят от растворителя

. Действительно, при замене ацетона на 1-бутанол наблюдалось небольшое батохромное смещение максимумов (на 2 - 3 нм) поглощения экстрактов. Но параллельное исследование одного и того же образца желтка при экстракции этими растворителями показало, что абсорбция (при 445 нм) в пересчете на одинаковые массы исходного материала различалась не более чем на 2 - 3 %. Это позволило использовать литературное значение коэффициента 1% поглощения (= 2550, [12]) для пересчета содержания каротиноидов на лютеин.

Экстракция ацетоном оказалась эффективной. Полноту экстракции оценивали по полному визуальному обесцвечиванию твердого остатка на фильтре и повторной экстракции остатка. Степень извлечения каротиноидов при однократной экстракции превышала 97.5 %. Однако иногда при этом получался коллоидный раствор и для последующего спектрофотометрирования необходима реэкстракция каротиноидов в гексан, что неизбежно приводит к дополнительным погрешностям. Но было установлено, что в этих случаях замена ацетона на 1-бутанол позволяет получить истинные растворы с аналогичной степенью извлечения каротиноидов. Погрешность спектрофотометрического определения каротиноидов при     экстракции    ацетоном       и 1-бутанолом составила 2,9 % (n=7, P = 0,95) при использовании в качестве результата среднего значения двух параллельных определений.

При анализе ксантофиллов использованного концентрата было установлено, что это соотношение лютеин : зеаксантин существенно больше, чем 4:1 (~ 9:1). Следовательно, этот препарат не может быть максимально эффективным - для накопления нужного количества зеаксантина неизбежен почти двукратный «перерасход» лютеина. Сопоставление соотношения ксантофиллов в концентрате (в виде лютеина и зеаксантина) и цветках бархатцев (в виде их диэфиров) не противоречит гипотезе об их общем происхождении. Запись в инструкции о том, что препарат получен из цветков календулы (состав пигментов которой принципиально иной

), неудивительна. В англоязычной литературе под одним названием «marigold» фигурируют то бархатцы [15], то календула [16]. Однако для лучшей эффективности подкормок необходимо создание препаратов, сбалансированных по соотношению лютеина и зеаксантина. Этим, вероятно, и объясняются работы по получению клонов бархатцев, обладающих повышенным относительным содержанием зеаксантина [17].

Заключение

Такимобразом,         показана эффективность использования комбинации спектрофотометрического и хроматографического методов при исследовании каротиноидного комплекса желтка куриных яиц, которая может быть использована при разработке и проверки эффективности отечественных концентратов на основе природных ксантофиллов.

Установлено, что среднее содержание каротиноидов в продукции птицефабрик и фермерских хозяйств (около 20 мкг на 1 г желтка) заметно ниже, чем в продукции частных хозяйств. В качестве основных каротиноидов во всех исследованных образцах были найдены ксантофиллы (лютеин и зеаксантин). Показана возможность существенного повышения содержания ксантофиллов в желтке яиц при введении в диету концентратов на основе природных ксантофиллов.

Список литературы

Владимиров В.Л., Шапошников А.А., Дейнека Д.В., Вострикова С.И., Дейнека В.И. Исследование каротиноидного состава желтка куриных яиц // Доклады РАСХН. - 2005. - № 6. - С. 46­48.

Schalch W. Possible contribution of lutein and zeaxanthin, carotenoids of the macula lutea, to reducing the risk for age-related macular degeneration: a review // HKJOphtalmol. - 2000. - V.4, №.1. - P.31- 42.

Couch J.R, Farr F.M. The effect of adding canthaxanthin and beta-apo-8’-carotenal to laying diets containing yellow corn and alfalfa on egg yolk pigmentation // Br. Poultry Sci. - 1971. - V.12. - P. 1249-55.

Ishikawa S., Murakami H., Yamazaki M., Takemasa M. Effect of Carrot Leaf Supplementation on Egg Yolk P-Carotene Content and Egg Quality // J. Poult. Sci. - 1999. - V.38. - P.275-283.

Ehtesham A., Chowdhury S.D. Responses of Laying Chickens to Diets Formulated by Following Different Feeding Standards // Pakistan J. Nutr. - 2002. - № 1. - P. 127-131.

Saffarzadeh A., Csapo J. The effect of substituting corn with different levels of Pistacia atlantica seeds on laying hens performance in first phase of egg production. // Acta Agr. Kaposvariensis. - 1999. - V. 3. - P.361-368.

Karunajeeva H., Hughes R.S., McDonald M.W., Shenstone F.S. A           reviewof        factorsinfluencing

pigmentation of egg yolks. // W. Poult. Sci. J. - 1984. - V. 40. - P. 52 -65.

Rivas J.D.L. Reversed-phase HPLC separation of lutein and lutein fatty acid esters from marigold flower petal powder // J. Chromatogr. - 1989. - V. 464. - P.442-447.

Burdick D., Fletcher D. Utilization of Xanthophyll in Fresh-Cut and Field-Wilted, Dehydrated Alfalfa and Coastal Bermudagrass for Pigmenting Egg Yolks. // Poultry Sci. - 1984. - V.63, №1. - P. 946-951.

Jiang Y.H., McGeachin R.B., Bailey C.A. Alpha-tocopherol, beta-carotene, and retinol enrichment of chicken eggs // Poult. Sci. - 1994. - V. 73. - P. 1137-1143.

Khachik F., de Moura F.F., Zhao D.Y., Aebischer C.P., Bernstein P.S. Transformations of selected carotenoids in plasma, liver, and ocular tissues of humans and in nonprimate animal models // Invest Ophthalmol Vis Sci. - 2002. - V. 43. - P. 3383-3392.

Tyczkowski J.K., Schaeffer J.L., Parkhurst C., Hamilton P.B. 3'-Oxolutein, a metabolite of lutein in chickens. Poult. Sci. - 1986. - V. 65. - P. 2135-2141

Rodrigues-Amaya D.B. A Guide to Carotenoid Analysis in Foods. ILSI Press, Washington, D.C. - 63 p.

Pintea A., Bele C., Andrei S., Socaciu C. HPLC analysis of carotenoids in           four     varieties          of Calendula

officinalis L. flowers. // Acta Biol Szeged. - 2003. - V. 47. - P. 37-40.

Perez-Vendrell A.M. Influence of source and ratio of xanthophyll pigments on broiler chicken pigmentation and performance. // Poult Sci. - 2001. - V. 80. - P. 320-326.

Zitterl-Eglseer K., Reznicek G., Jurenitsch J., Novak J., Zitterl W., Franz C. Morphogenetic variability of faradiol monoesters in marigold Calendula officinalis L. // Phytochem Anal. - 2001. - V. 12. - P. 199-201.

USPTO 800323000, Intl Class A01H005/00. Tagetes erecta marigolds with altered carotenoid compositions and ratios.