Технологія біосинтезу амінокислот

Зміст

Промисловий синтез амінокислот 4

Мікробіологічний синтез глутамінової кислоти 5

Мікробіологічний синтез лізину, метіоніну, треонина і ізолейцину 6

Мікробіологічний синтез триптофану 11

Вступ

Амінокислоти - це органічні кислоти, що містять одну або декілька аміногруп, з біологічною - найважливіші азотвмісні речовини в живій клітині. До теперішнього часу в природі виявлено більше 300 амінокислот (на початок століття їх було відкрито 17, до середини - 60, а до 1965 року вже більше 170).

Амінокислоти (окрім гліцину) мають асиметричний вуглецевий атом і існують в двох дзеркальних ізомерних формах, званих енантіомерами, L- і D-конфігурації. Енантіомери володіють однаковими хімічними властивостями. Їх хімічний синтез завершується зазвичай здобуттям D,L-ізомерів, які досить складний розділити на індивідуальні ізомери хімічною дорогою, що необхідне для подальшого використання амінокислот, оскільки всі молекули білків організму складаються з L- ізомерів. Тому доцільніше використовувати при виробництві амінокислот біологічний синтез, при якому використовувані мікроорганізми утворюють амінокислоти в біологічно активній L-формі.

В даний час більш всього розробки присвячені здобуттю лізину (продуценти Brevibacterium lactofermentum і бактерії роду Corynebacterium), також запропоновані способи біотехнологічного здобуття ізолейцину, треоніну (при використанні E. coli). Більшість досліджених штамів мікроорганізмів незалежно від їх систематичного положення переважно нагромаджують глутамінову кислоту. Значно менше штамів і в меншій кількості виділяють аспарагінову кислоту, лейцин, валін, ізолейцин, лізин.

Використання мутантів мікроорганізмів

Звичайні мікроорганізми не здатні синтезувати необхідні амінокислоти в потрібній кількості, тому роботи по мікробному синтезу амінокислот полягали в прямій селекції штамів мікроорганізмів, здатних нагромаджувати амінокислоти в значних кількості при зростанні на середовищах з великою кількістю вуглецю і меншою кількістю вуглецю. В цьому випадку амінокислоти накопичуються в результаті порушення рівноваги між вуглецевим і метаболізмом і асиміляцією азоту. Згодом були використані мутанти мікроорганізмів. Багато хто з них продукує одні амінокислоти, але є дефіцитними по інших амінокислотах і вітамінах. Для здобуття мутантів мікроорганізмів використовують хімічні і фізичні мутагени. До хімічних мутагенів відносяться етиленамін, новоембіхін, діетилсульфат, радіоактивні ізотопи, важкий водень, сильні окислювачі (HNO3, KmnO4); до фізичних – рентгенівські промені, ультрафіолетові промені, температурна дія. Для здобуття будь-якої амінокислоти шляхом мікробного синтезу необхідно, аби вибраний мікроорганізм володів таким обміном речовин, який забезпечував би ефективне перетворення джерела вуглецю на одну амінокислоту. Зазвичай така особливість мікроорганізму настільки несприятлива для його виживання, що мутанти, що спонтанно виникають в природних умовах, неминуче повинні відсіятися в процесі природного відбору. Пошуки відповідних мікроорганізмів йдуть по двох основних лініях. По-перше, мікроорганізми різних видів – дріжджі, бактерії, гриби – перевіряють на їх здатність нагромаджувати бажану амінокислоту в культуральній рідині. По-друге, найбільш активні штами намагаються потім поліпшити, застосовуючи різні мутагенні чинники.[4,c.12]

У групу мутантів мікроорганізмів із зміненими біологічними властивостями входять мутанти ауксотрофів і продуценти біологічно активних речовин. Мутантами ауксотрофів називають мутанти, що втратили здатність у зв'язку з порушенням нормальних біосинтетичних процесів самостійно синтезувати ті або інші амінокислоти, пурини, піримідини, вітаміни. Дефіцитність мутантів ауксотрофів по певних речовинах пов'язана з порушенням нормального ходу біосинтетичних реакцій і блокуванням окремих етапів синтезу. В результаті блокування здобуття кінцевих продуктів стає неможливим і відбувається накопичення речовин, що отримуються в реакціях, передуючих блоку. Мутанти ауксотрофів є патологічними формами, нездібними існувати в звичайних умовах, тому їх культивування вимагає підтримки особливих умов.

Здатність мікроорганізмів виділяти в культуральну рідину продукти обміну, у тому числі і амінокислоти, відома з кінця минулого століття, проте інтенсивне вивчення позаклітинного накопичення амінокислот мікроорганізмами, як вказувалося вище, почалося в 60-і роки нашого століття. Склад амінокислот, що нагромаджуються різними мікроорганізмами в середовищах, досить одноманітний. Це — глутамінова і аспарагінова кислоти, аланин, лейцин, ізолейцин, гліцин, серін, фениланін, лізин. Найчастіше зустрічаються продуценти глутамінової кислоти і аланина. Свіжовиділені з природних субстратів штами мікроорганізмів найчастіше виділяють аланин і глутамінову кислоту.

При мікробіологічному синтезі утворюються L-амінокислоти, що є продуктами життєдіяльності спеціально підібраних і отселектованих штамів мікроорганізмів, які здатні нагромаджувати в культуральній рідині не менше 60 г/л амінокислоти, що синтезується. Найчастіше для мікробіологічного синтезу амінокислот використовують ауксотофні штами мутантів, які отримують методами звичайної селекції і генної інженерії. За допомогою мутагенних чинників в таких штамів ауксотрофів індукується мутація, в результаті якої припиняється або інгебуеться синтез один з продуктів, що роблять регуляторний вплив на ферментні системи, що каталізують утворення даної амінокислоти в клітках мутанта і в культуральній рідині підвищується.

На основі культивування мікроорганізмів з метою здобуття чистих препаратів амінокислот застосовують промислові технології, що включають одно- і двоступінчатий синтез амінокислот. При одноступінчатому синтезі в промислових культиваторах вирощують регуляторні мутанти ауксотрофів, що є надпродуцентами тих або інших амінокислот. Після завершення робочого циклу їх вирощування культуральну рідину відділяють від кліток мікроорганізмів, згущують і отримують з неї товарною продукт з високою концентрацією синтезованої мікробами амінокислоти. В процесі двоступінчатого синтезу амінокислоти спочатку отримують її попередник, а потім за допомогою ферментів мікроорганізмів перетворюють попередника на амінокислоту, при цьому утворюються лише L- ізомери. Як джерело ферменту можуть бути використані або суспензія кліток мікроорганізмів, або отриманий після руйнування цих кліток ферментний розчин.[4,c.22]

Глутамінова кислота в значних кількостях присутня в мікробних клітках і бере участь в утворенні різних продуктів їх метаболізму. Глутамат натрію широко використовують як приправи до їжі, а глутамінову кислоту застосовують для лікування трофічних порушень обміну речовин. Для виробництва L-глутомата використовують культури Brevibacterium. Оптимальним є використання середовища, що містить 10% глюкози, накопиченню L-глутомата сприяють енергійна аерація і перемішування, середня температура інкубації 300, рН 6,0 – 8,0. У культуральну рідину періодично додають сечовину. Як джерела цукру використовують сирий гідролізат деревини і мелясу. Всі бактерії потребують біотвані як чинника зростання і вихід L-глутомата в їх культурах залежить від концентрації біотвань в середовищі.

Схема біосинтезу L-глутомата[3,c.12]

Глутамінова кислота грає вельми важливу роль в обміні речовин організмів, оскільки лежить на дорогах синтезу різних з'єднань.

Білки зерна, пшениці, ячменю, кукурудзи і інших злакових культур не збалансовані за змістом незамінних амінокислот і, перш за все, лізину. Тому для задоволення потреб тваринництва в лізині в нашій країні і низці інших країн організовано його великомасштабне виробництво. У основу виробництва покладені технології з використанням одноступінчатого мікробіологічного синтезу, які включають промислове культивування мутантів ауксотрофів бактерій з роду Corynebacterium, здібних до надсинтезу цієї амінокислоти. Зазвичай в диких штамів, з яких отримані мутанти ауксотрофів, надсинтезу лізину не спостерігається, оскільки у них діють механізми саморегуляції. У клітках бактерій амінокислота лізин синтезується з аспарагінової кислоти через ряд проміжних етапів, пов'язаних з утворенням напівальдегіду аспарагінової кислоти, дигідропиколиної кислоти , що є безпосереднім попередником лізину. апівальдегід аспарагінової кислоти є також одним з попередників в синтезі амінокислот – треоніну, метіоніну і ізолейцину (схема 1). Процес синтезу амінокислот (лізину, треоніну, метіоніну і ізолейцину) починається фосфорилуваням аспарагінової кислоти за участю аллостеричного ферменту аспартаткінази, активність якого інгибуеться спільною дією двох амінокислот – лізину і треоніну, якщо вони накопичуються в клітках бактерій в надлишковій концентрації. Якщо знизити концентрацію однієї з цих амінокислот, то синтез інший здійснюватиметься навіть за умови, коли вона накопичується в досить високій концентрації.

Схема 1 [1,c.37]

Для зняття регуляції синтезу лізину необхідно припинити утворення треонина на стадії перетворення напівальдегіду аспарагінової кислоти в гомосерин, що каталізує ферментом гомосериндегидрогеназой. Останнє досягається за допомогою мутагенезу. Досліди показують, що клітки мутантів, не створюючі гомосериндегидрогенази, при їх культивуванні на штучному живильному середовищі забезпечують високий вихід лізину. Дефіцитні амінокислоти, які не синтезуються клітками (гомсерин, треонин, метіонін) мутантів, вводяться до складу живильного середовища в такій кількості, аби вони не були регулювальниками синтезу лізину. В процесі приготування живильного середовища для культивування виробничих штамів мутантів ауксотрофів, що володіють здібністю до надсинтезу амінокислоти лізину, як джерело вуглецю зазвичай використовують суміші, що включають оцетову кислоту і бурякову мелясу, як джерело азоту – солі амонія, сечовину, кукурудзяний екстракт, гідролізат дріжджів. Окрім дефіцитних амінокислот, які не синтезуються клітками мутантів, в живильне середовище також додають необхідні для життєдіяльності мікроорганізмів макро- і мікроелементи і вітаміни. В процесі культивування мікроорганізмів забезпечується подача стерильного повітря за допомогою спеціальних турбінних мішалок, для запобігання спінюванню субстрата і клітинної суспензії в середу культивування додають піногасник. Посівний матеріал, призначений для виробничої ферментації, спочатку вирощують в посівних апаратах при 28 – 32С, рН 7 – 7,2 протягом 18 – 24 ч, а потім отримана таким дорогою суспензія кліток подається у виробничих ферментери ємкістю 50 – 100 м3, в яких підтримується постійний режим аерації, необхідний тиск, контроль за всіма компонентами і параметрами середовища. Час ферментації 55 – 72 ч. Накопичення в культуральній рідині лізину починається після 25 – 30 ч вирощування промислової культури і до кінця ферментації досягає 40 – 50 г/л. Культуральну рідину відділяють від культури кліток продуцента фільтруванням і використовують для здобуття препаратів лізину. На основі промислової культури бактерій, що синтезують лізин, організовано виробництво декількох видів товарної продукції: рідкий концентрат лізину (ЖКЛ), сухий кормовий концентрат лізину (ККЛ), висококонцентровані кормові і високоочищені кристалічні препарати для харчової і медичної промисловості. Рідкий концентрат лізину отримують дорогою упарюванням культуральної рідини на вакуумній установці до концентрації сухої речовини 40%. Для запобігання деградації лізину в процесі нагрівання в культуральну рідину додають бісульфіт натрію і соляну кислоту до рН 4,5 – 5,0, внаслідок чого утворюється сіль – монохлоргідрат лізину. Для здобуття сухого концентрату лізину сушать гарячим повітрям на распилительної сушарці при 90?С до вологості препарату 4 – 8 %. В цілях зниження гігроскопічності препарату в нього додають наповнювачів: мясокостну муку, негашене вапно, бентонит, пшеничні висівки. Найчастіше як наповнювач використовують висівки, які додають в ЖКЛ після упарювання. Отриману в результаті ретельного перемішування пасту висушують на вальцово-ленточної сушарці і гранулюють. Гранульований препарат ККЛ негігроскопічний, містить 7 -10% лізину. Для здобуття очищеного висококонцентрованого препарату лізину культуральну рідину після фільтрування підкисляють соляною кислотою до рН 1,6 – 2,0. Утворився в результаті взаємодії з соляною кислотою розчин монохлоргідрату лізину направляють на колонки з катіонітом, де відбувається сорбція амінокислоти і відділення її від культуральної рідини. Потім проводять десорбцію амінокислоти шляхом елюювання 0,5 – 5%-ным розчином аміаку. Елюат упарюють під вакуумом при 60?С до концентрації сухої речовини 30 – 50%, що після чого підкисляє соляною кислотою розчин монохлоргідрату висушують і використовують як кормовий концентрат. Шляхом перекристалізації отриманої солі можна отримати препарати лізину з вмістом монохлоргідрату 97 – 98%. В процесі виробництва лізину окрім основного продукту вживання знаходять також побічні продукти і відходи. Так, після відділення культуральної рідини в осіданні залишаються клітки бактерій – продуцентів, фосфати і інші компоненти живильного середовища, які після висушування можуть бути використані як кормова білкова добавка. Технологічні стоки і промивні води після виділення монохлоргідрату лізину, амінокислоти, що містять в розчиненому стані, інші коштовні компоненти культуральної рідини, залишковий лізин, об'єднують і отриману суміш упарюють, а потім висушують з наповнювачем до вологості 10%, в результаті отримують кормовий препарат з високим вмістом білків (до 40%) і незамінних амінокислот. У ряді країн (Японія, США) для здобуття лізину застосовується хімико-ензиматичний метод, що дозволяє створити високоефективні технології, що поєднують достоїнства хімічного і мікробіологічного синтезу. Ці технології засновані на ферментативній конверсії в лізин, який отримують шляхом хімічних реакцій з циклогексану. В результаті хімічного синтезу утворюється рацемічна суміш D- і L-капролактама. Ця суміш прямує в реактор з ферментом гідролазою-капролактама, який каталізує перетворення L- капролактаму на L-лизин. D-ізомер капролактаму далі перетворюється на L-ізомер за допомогою специфічної рацемази. При такій технології здобуття лізину його вміст в реакційній суміші після закінчення робочого циклу досягає понад 150 г/л. Продуцентами гідролази служать деякі штами дріжджів з пологів Cryptococcus, Candida, Trichosporon. Дріжджі вирощуються в лужному середовищі на оптимізованій для синтезу ферменту живильному середовищу, що містить активатори, – Mn2+, Mg2+, Zn2+. Для ферментативної реакції перетворення капролактаму в лізин може використовуватися клітинна суспензія дріжджових кліток з активним ферментом, клітинний екстракт (після руйнування і відділення кліток) або очищений фермент. Рацемазу, що каталізує перетворення D-капролактама на L-ізомер, отримують з бактерій Achromobacter, Flavobacterium і ін. Процеси ізомеризації D-капролактама в L-ізомер і перетворення L –капролактама в лізин можна проводити одночасно. Для цього у водний розчин D,L-капролактама вводиться необхідна кількість дріжджових і бактерійних кліток, задаються оптимальні режими температури, рН, аерації. На виході з реактора утворюється переважно один продукт - L-лизин, який виділяють з суміші і далі виділяють і сушать. Окрім викладеної вище технології здобуття чистих препаратів лізину розробляються та інші, що поєднують в собі використання хімічного синтезу для здобуття попередників лізину і ензиматичне перетворення їх в лізин на кінцевій стадії виробництва, що дозволяє значно інтенсифікувати виробничий процес і понизити собівартість продукції.

Разом з лізином розроблені промислові технології здобуття кормових і високоочищених препаратів іншої незамінної амінокислоти – триптофану. Для виробництва цієї амінокислоти застосовують як одноступінчатий синтез за допомогою бактерійних мутантів ауксотрофів з порушеною регуляцією синтезу амінокислот, так і двоступінчатий синтез, що включає спочатку здобуття попередника триптофану, а потім його ферментативне перетворення на кінцевий продукт – триптофан. У бактерій і багатьох інших організмів амінокислота триптофан утворюється з еритрозо-фосфату і фосфоенолпировіноградної кислот через ряд послідовних реакцій, що включають освіту шикимовою і хоризмовою кислот, а безпосереднім попередником триптофану в процесі його синтезу є антранілова кислота. Синтез триптофану аллостерическі інгібуеться кінцевими продуктами, які діють на ферменти, що каталізують початкові етапи перетворень, пов'язані з утворенням хоризмовой кислоти. Для зсуву метаболічних реакцій по шляху переважного утворення триптофану необхідно блокувати перетворення хоризмовой кислоти на префеновую( схема 2). Це досягається дією мутагенних чинників. У мутантів із зниженою активністю ферментів, що каталізують перетворення хоризмовой кислоти на префеновую, спостерігається підвищений синтез амінокислоти триптофану, проте для нормального розвитку цих мутантів в живильне середовище необхідно додавати дефіцитні амінокислоти – фенилаланіл і Тирозин – в кількостях, що не викликають регуляторне інгібівання ферментів синтезу триптофану. Для промислового здобуття триптофану розроблені технології на основі використання мутантів ауксотрофів бактерій Basccillus sibtilis з порушеним синтезом фенилаланина і Тирозину.

Схема 2 [2,c.11]

Всі технологічні організовані приблизно за такою ж схемою, як і здобуття лізину за допомогою мутантів коринебактерий. Ферментація триває 48 годин при 37°С, концентрація триптофану в культуральній рідині досягає 10 г/л. Після відділення культуральної рідини від кліток бактерій вона упарюється і висушується при 110-120°С. Висушений продукт називають кормовим концентратом триптофану (ККТ). При здобутті висококонцентрованих препаратів триптофану культуральну рідину піддають додатковому очищенню. Спочатку її підкисляють соляною кислотою до рН 1,0 і потім центрифугування відділяють осад, що утворився. Далі цетрифугат, що містить триптофан, пропускають через іоно-обмені колонки з катіонітом, в результаті відбувається скріплення амінокислоти і, таким чином, відділення її від культуральної рідини. Після промивання колонок виробляють десорбцію триптофану 5%-ным розчином аміаку в суміші ізопропанола і води. Елюат направляють на вакуумний випаровувач, після чого кристалізують амінокислоту при 4 – 8?С. Виділену в кристалічному вигляді сіль триптофану промивають етанолом і висушують під вакуумом при 60?С. Висушений кристалічний препарат містить не менше 99% триптофану у вигляді його хлориду. Осад після відділення культуральної рідини, що містить клітки культури бактерій, також висушують і використовують як високобілкову кормову добавку, що містить, крім того, підвищену кількість триптофану. Синтез триптофану в нашій країні виробляється переважно за двоступінчатою схемою. Спочатку методом хімічного синтезу отримують попередник триптофану – антранілову кислоту, яку потім за участю ферментів мікробного походження перетворюють на триптофан. Біохімічне перетворення антранілової кислоти на триптофан проходить в три етапи. На першому етапі з антранілової кислоти за участю фосфорибозилфосфата утворюється аміноглікозид – антранілова кислота, яка в результаті внутрішньомолекулярного перегрупування і декарбоксилювання перетворюється на індол-глицерофосфат. На останньому етапі під дією ферменту триптофансинтетази з індол-глицерофосфата і амінокислоти серину утворюється триптофан. У зв'язку з тим, що як активна група у ферменту триптофансинтетази служить пиридоксальфосфат, від наявності в середовищі цього кофермента залежить швидкість перетворення антранілової кислоти в триптофан. Як джерело ферментів для вказаних реакцій використовуються дріжджі C. Utilis. Виробничий процес біохімічного перетворення антранілової кислоти в триптофан проводиться в дві стадії. На першій стадії виробляється нарощування біомаси дріжджів, ферментів, що є продуцентами. Живильне середовище для вирощування дріжджів готується з бурякової меляси, сечовини і мінеральних солей. Ферментація продовжується протягом 24 ч при 30?С. Далі у ферментер починають вводити спиртний 5%-ный розчин антранілової кислоти і 50%-ный розчин сечовини. Через 3 – 4 ч після додавання антранілової кислоти у ферментер додатково подається вуглецевий субстрат – меляса у вигляді 25%-ного розчину. На подальших етапах ферментації періодично виробляється подача антранілової кислоти і сечовини через кожних 6 ч і розчину меляси – через кожних 12 ч. Тривалість ферментації близько 120 ч, а з врахуванням часу нарощування біомаси дріжджів – 144 ч. Вміст триптофану в культуральній рідині складає 0,3 – 0,5 % або приблизно 6 г/л.

Висновок

В даний час в тваринництві стоїть проблема балансування кормових раціонів по повноцінному протеїну. Натуральні корми, використовувані в тваринництві, мають не оптимальний амінокислотний склад. Для доведення концентрації амінокислот в кормовому раціоні до оптимуму потрібне додавання препаратів чистих амінокислот, особливо незамінних, отриманих промисловим способом. В світі щорічний виробляється не менше 300 тыс.т. кормових препаратів незамінних амінокислот. У харчовій промисловості також використовуються амінокислоти, отримані шляхом мікробіологічного синтезу, наприклад, глутамінова кислота. Деякі амінокислоти, наприклад метіонін, використовуються у фармацевтичній промисловості для виробництва дієтичних харчових добавок. Метіонін останнім часом застосовується в якості підгодівлі в птахівництві.

Список використовуваної літератури

Біосинтез амінокислот організмами. Рубан Е.Л. і ін. М.: Наука, 1968

Сільськогосподарська біотехнологія. Під ред. Шевелухи В.С., М.: Вища школа, 1998

А.Н.Несмеянов, Н.А.Несмеянов «Начала органической химии», т.1, 2.

Б.А.Павлов, А.П.Терентьев «Курс органической химии». Высшая школа.М.2003

Химическая энциклопедия, т. 1.Высшая школа М.2005

Дж.Робертс, М.Касерио «Основы органической химии».М.2003

Шабаров Ю.С. «Органическая химия» Донецк.2001

16

16

16

16

16

16

16

16